chức năng của microrna 144 trong thoái hóa khớp

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.3 MB, 64 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ hồchíminh

---x0x---

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ hồchí MINH

---x0x---

si NGUYỄN

THỊQUẾ

ANH

Giảng

viên

hướngdẫn: TS.

LÊTHỊTRÚC

LINH

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Nguyễn Thị Quế Anh

Ngày sinh: 2/3/1999 Nơi sinh: Phú Yên

Chuyên ngành: Y Dược Mã học viên : 1753010005

Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thơng tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Thị Trúc Linh

Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Quế Anh Lớp: YD71

Ngày sinh: 2/3/1999 Nơi sinh: Phú Yên Tên đề tài: Chức năng của microRNA-144 trong thối hóa khớp

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: Đồng ý

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng 2 năm 2022

Người nhận xét

Lê Thị Trúc Linh

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi lời cám ơn đến giảng viên hướng dẫn là TS. Lê Thị Trúc Linh, người đã tạo điều kiện thực hiện và hướng dẫn tận tình cho em trong suốt q trình em thực hiện khóa luận. Trong khoảng thời gian nghiên cứu dưới sự dìu dắt của cơ, em đã có cơ hội tiếp xúc gần hơn với khoa học và ngày càng có cái nhìn rõ ràng hơn về cơng việc nghiên cứu của mình. Từ đó, em đã đúc kết được cho bản thân những kiến thức bổ ích, cũng như đánh giá được những khiếm khuyết mình cần cải thiện. Ngồi những kiến thức và kinh nghiệm được cơ truyền đạt, thì những thành tựu mà cơ đã gây dựng và đóng góp cho khoa học cũng chính là nguồn động lực to lớn cho em ngày càng say mê vào công việc nghiên cứu và học hỏi.

Tiếp đó, em xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè những người đã luôn yêu thương, động viên, chia sẽ cũng như hỗ trợ mọi mặt cho em trong học tập và cuộc sống. Ngoài ra, em cũng xin đặc biệt gửi lời cám ơn đến chị ThS Hồ Thị Bích Phượng, chị Nguyễn Thị Phương Diệu đã luôn bên cạnh hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong thời gian em làm việc ở phịng thí nghiệm Y Dược.

Ngồi ra, em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến Trung Tâm Cơng Nghệ Sinh Học Tp Hồ Chí Minh, nơi đã tạo điều kiện tốt nhất cho em có được không gian và đầy đủ cơ sở vật chất sử dụng trong thời gian làm việc tại đây.

Lời nói cuối cùng, em xin gửi lời tri ân đến tất cả những Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học của Trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh, những người đã đi cùng em từ lúc em còn non nớt bước vào trường cho đến bây giờ em đã hoàn thành xong khóa luận tốt nghiệp, có tên là: “Xác Định Chức Năng Của MicroRNA-144 Trong Thối Hóa Khớp”.

Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm của bản thân cịn nhiều thiếu sót, em tin ràng những lời nhận xét từ Thầy Cơ sẽ là những góp ý cần thiết để em có thể chỉnh sửa, bổ sung và hoàn thiện đề tài này.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

1. TỔNG QUAN VỀ THỐI HĨA KHỚP ... 4

1.1 Định nghĩa, triệu chứng của bệnh thối hóa khớp ... 4

1.2 Ngun nhân dẫn đến bệnh thối hóa khớp ... 5

2. PHÂN TỬ MICRORNA ... 6

2.1 Giới thiệu phân tử microRNA ... 6

2.2 Sinh tổng hợp miRNA ... 6

2.3 Cơ chế hoạt động của phân tử ... 7

2.4 Một số phân tử miRNA biểu hiện ở bệnh thối hóa khớp ... 9

2.5 Phân tử microRNA-144 ... 10

PHẦN II: ... 12

1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ... 12

1.1 Mẫu tế bào, vi khuẩn và mơi trường ni cấy sử dụng cho thí nghiệm 12 1.2 Vector pmiRGlo ... 12

1.3 Hóa chất ... 12

1.4 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm ... 13

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 14

2.1 KHẢO SÁT IN SILICO DỰ ĐỐN GEN ĐÍCH CỦA PHÂN TỬ MICRORNA-144 ... 14

2.1.1 Thu thập thông tin của phân tử microRNA và gen đích bằng các cơng cụ Tin sinh ... 14

2.1.2 Dự đốn gen đích của phân tử miRNA-144 ... 14

2.1.3 Chọn lọc, kiểm tra mồi Real-Time PCR của gen đích THBS1 ... 15

2.1.4 Thiết kế mồi khuếch đại PCR vùng 3’UTR chứa vị trí bắt cặp và 3’UTR bị đột biến vị trí bắt cặp của gen đích THBS1 ... 15

2.2. THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH CHỨC NĂNG CỦA PHÂN TỬ MICRORNA-144 ... 16

2.2.1 Kiểm tra khả năng biểu hiện của gen đích THBS1 bằng Real-Time PCR ... 16

2.2.2 Tạo dịng bằng bộ kít Infusion-Clonning ... 19

2.2.3 Kiểm tra khả năng biểu hiện của gen đích THBS1 bằng phương pháp phát huỳnh quang-Luciferase Assay ... 21

PHẦN III: ... 22

1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO DỰ ĐỐN GEN ĐÍCH ... 22

1.1 Kết quả dự đốn gen đích của phân tử miRNA ... 22

1.2 Gen đích tiềm năng của miRNA-144 trong thối hóa khớp-THBS1 . 23 2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VÀ KHẢO SÁT KIỂM TRA CẶP MỒI ... 27

2.1 Kết quả chọn lọc và khảo sát cặp mồi Real-Time PCR của gen đích 27 2.2 Kết quả thiết kế mồi khuếch đại Clonning cho gen đích THBS1 ... 28

3. KẾT QUẢ REAL - TIME PCR KIỂM TRA BIỂU HIỆN CỦA GEN ĐÍCH ... 28

3.1 Kết quả Real- Time PCR trên tế bào chondrocytes ... 28

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

3.2 Kết quả Real- Time PCR trên tế bào sụn thối hóa khớp và sụn bình

thường ... 31

4. KẾT QUẢ CLONNING GEN ĐÍCH -THBS1 ... 36

4.1 Kết quả Radient khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của bộ mồi gen đích 36 4.2 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của gen đích THBS1 ... 37

4.3 Kết quả cắt và tinh sạch vector pmirGlo ... 37

4.4 Kết quả thu plasmid pmirGlo có gắn chèn gen đích THBS1 ... 37

5. KẾT QUẢ LUCIFERASE KIỂM TRA BIỂU HIỆN CỦA GEN ĐÍCH ĐỐI VỚI PHÂN TỬ MICRORNA-14 ... 39

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số phân tử miRNA có sự biểu hiện liên quan đến thối hóa khớp.

Bảng 3.1 Vị trí bắt cặp của miR-144 trên vùng 3’UTR của THBS1 Bảng 3.2 Các thông số của bộ mồi gen đích THBS1

Bảng 3.3 Các thơng số của bộ mồi thiết kế PCR Clonning gen đích THBS1

Bảng 3.4 Giá trị Ct của nhóm chứng nội 18S

Bảng 3.5 Giá trị Ct của nhóm mẫu với gen đích THBS1

Bảng 3.6 Bảng phân tích số liệu tương quan giữa THBS1 và 18S bằng công thức 2∆∆Ct

-Bảng 3.7 Giá trị Ct của mẫu sụn bình thường Bảng 3.8 Giá trị Ct của mẫu sụn thối hóa

Bảng 3.9 So sánh giá trị 2-∆∆CT của mẫu sụn thối hóa và sụn bình thường

Bảng 3.10 Bảng số liệu nồng độ và độ tinh sạch của plasmid THBS1

Bảng 3.11 Bảng số liệu nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pmirGlo cut XhoI

Bảng 3.12 Bảng số liệu nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pmirGlo - THBS1 Bảng 3.13 Bảng kết quả số liệu giữa hai mẫu tế bào chuyển gen pmirGlo-THBS1 ở

mẫu đối chứng và mẫu xử lý với 144-mimic

Bảng 3.14 Bảng kết quả số liệu giữa hai mẫu tế bào chuyển gen pmirGlo-THBS1 bị

đột biến ở mẫu đối chứng và mẫu xử lý với 144-mimic

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Hình 3.4 Hoạt động của THBS1 lên TGF- β

Hình 3.5 Con đường tín hiệu hoạt động của phân tử đích THBS1 thơng qua TGF- β/

Smad

Hình 3.6 Hình ảnh Melting Curve của nhóm chứng nội 18S gen đích THBS1

Hình 3.7 Kết quả thống kê phân tích tương quan mức độ biểu hiện giữa phân tử

miRNA-144 với

Hình 3.8 Kết quả thống kê phân tích tương quan mức độ biểu hiện giữa sụn bình

thường và sụn thối hóa

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm radient của gen THBS1 với bộ mồi THBS1-R và

THBS1- F

Hình 3.10 Kết quả sàng lọc tế bào E. coli DH5α có chứa pmiRGlo-THBS1 trên mơi

trường chọn lọc chứa 50 μg/ml Ampicillin

Hình 3.11 Kết quả điện di kiểm tra sàng lọc khuẩn lạc

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Hình 3.12 Hình ảnh kết quả phân tích thống kê sự thay đổi biểu hiện của tế bào

chuyển gen pmirGlo - THBS1 ở mẫu đối chứng và mẫu xử lý với 144-mimic

Hình 3.13 Hình ảnh kết quả phân tích thống kê sự thay đổi biểu hiện của tế bào

chuyển gen pmirGlo - THBS1 đột biến ở mẫu đối chứng và mẫu xử lý với 144-mimic

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BMPs: Bone morphogenetic protein

CT: cycle threshold

DALYs: Disability Adjusted Life Years

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium

HDAC5: Histone deacetylase 5

IGF-1: Insulin-like Growth Factor -1

IL-1β: Interleukin 1 β

MCSFR: Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor

MMP13: Matrix Metallopeptidase 13

MRI: Magnetic Resonance Imaging

OARSI: Osteoarthritis Research Society International

PPARA: Peroxisome Proliferator Activated Receptor Alpha

TGF-β: Transforming growth factor beta 1

TNF-α: Tumor necrosis factor α

THBS1: Thrombospondin 1

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thối hóa khớp là một bệnh mãn tính có tính chất tích lũy lâu dài. Bệnh có liên quan đến sự thay đổi của q trình tái cấu trúc lớp sụn bọc bảo vệ bên ngoài khớp. Nguyên nhân dẫn đến bệnh thường do tuổi tác, chế độ sinh hoạt không lành mạnh dẫn đến béo phì, tai nạn ngồi ý muốn dẫn đến chấn thương khớp và một phần do di truyền có sẵn trong gia đình (Haq, Murphy et al. 2003). Phạm vi mắc bệnh khá rộng, hầu như xuất hiện trên mọi lĩnh vực nghề nghiệp, giới tính, lứa tuổi và đặc biệt được ghi nhận nhiều ở những người cao tuổi (Laupattarakasem, Laopaiboon et al. 2008), tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có loại thuốc nào phù hợp trong việc điều trị. Người bệnh ở những giai đoạn cuối phải tiến hành tháo khớp, phí thực hiện khá cao và sau phẫu thuật bệnh nhân trở thành người tàn tật, thành gánh nặng của gia đình và xã hội.

Từ năm 2000 đến năm 2015, Sebbag và cộng sự đã tiến hành thực hiên một cuộc khảo sát đánh giá mức độ gánh nặng của các bệnh rối loạn cơ xương trên toàn cầu. Tỷ lệ người sống cùng với tàn tật do rối loạn cơ xương tăng từ 11,8% ở năm 2000 lên 13,5% vào năm 2015. Các bệnh liên quan đến rối loạn xương khớp được xem là nguyên nhân thứ hai dẫn đến tăng tỷ lệ người sống cùng với tàn tật trên thế giới (Kloppenburg and Berenbaum 2020). Vào năm 2016, Hiệp hội Nghiên cứu xương khớp quốc tế (OARSI) đã mơ tả thối hóa khớp như là một bệnh nghiêm trọng (Breedveld 2004) do mức độ gánh nặng bệnh tật lên toàn cầu (Hawker 2019). Năm 2017, có khoảng 303 (James, Abate et al. 2018) triệu người trên thế giới bệnh thoái hóa khớp. Một thống kê mới nhất của Hiệp hội nghiên cứu gánh nặng bệnh tật toàn cầu đã báo cáo cho thấy mức độ nghiêm trọng của các bệnh liên quan đến rối loạn cơ xương chiếm khoảng 6,8% DALYs (James, Abate et al. 2018) và con số này được đánh giá lớn hơn nhiều so với những lần khảo sát trước. Ước tính có khoảng 10-15% người trưởng thành có triệu chứng thối hóa khớp. So với nam giới thì tỷ lệ phụ nữ bị thối hóa khớp chiếm phần lớn trong tổng số (Organization , Organization 2019). Nguy cơ bị thối hóa khớp ngày càng gia tăng do sự già hóa của dân số và do lối sống thiếu kiểm soát dẫn đến phát sinh nhiều

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

nguyên nhân khác. Theo Liên hợp quốc, đến năm 2050 người trên 60 tuổi sẽ chiếm hớn 20% dân số thế giới (Lutz, Sanderson et al. 2008). Chiếm 20% trong số đó có khoảng 15% có triệu chứng thối hóa khớp và hơn 1/3 số này bị sẽ bị tàn tật. Điều này có nghĩa là vào năm 2050, có khoảng 130 triệu người bị thối hóa khớp trên tồn thế giới, ước tính có 40 triệu người trong số đó bị tàn tật do thối hóa khớp. Trong chuẩn đốn, thối hóa khớp thường được kiểm tra bằng những phương pháp như: chụp X-quang, chụp MRI và nội soi (Lohmander and Roos 2007). Bên cạnh đó, những hạn chế trong chuẩn đốn lâm sàng vẫn cịn tồn đọng khi những cơng cụ chuẩn đốn này chưa có tính chuẩn đốn chính xác cao ở những giai đoạn sớm, cũng như độ nhạy và độ đặc hiệu chỉ đạt mức tương đối. Đối với việc điều trị bệnh ở hiện tại, người bị thối hóa khớp chỉ có thể điều trị cải thiện tạm thời hoặc sử dụng thuốc giảm đau. Kết hợp với điều trị là thay đổi chế độ ăn uống, sinh hoạt, làm việc hợp lý, giảm tác động lên khớp. Tuy nhiên, đối với những nguyên nhân mắc bệnh do di truyền, độ tuổi và giới tính lại là những yếu tố khơng thể thay đổi được. Trước tình hình đó, việc tìm kiếm một phương pháp chuẩn đốn sớm hiệu quả, an toàn là cần thiết lúc này. Mục tiêu đầu tiên là xác định được dấu ấn sinh học sớm của bệnh, giúp bệnh nhân có được phác đồ điều trị hợp lý, nhằm kiểm soát tối đa những nguy cơ rủi ro của bệnh, tiết kiệm chi phí điều trị và làm tăng tỷ lệ phục hồi khớp của người bệnh.

Những năm gần đây, phân tử microRNA (miR) đang là một đối tượng mà nhiều nghiên cứu hướng đến. Qua sàng lọc và thực nghiệm đã chỉ ra một số miR có vai trị quan trọng trong thối hóa khớp như: miR-140 (Miyaki, Sato et al. 2010), miR-455 (Hu, Zhao et al. 2019), miR29 (Le, Swingler et al. 2016). Trong thí nghiệm

xác định gen CRAT có liên quan đến sự rối loạn trong bệnh thối hóa khớp thì phát hiện miR-144 tăng biểu hiện nhằm ức chế khả năng sinh bệnh của gen CRAT (Song, Kang et al. 2017). Năm 2018, miR-144 được báo cáo tăng biểu hiện trong

tế bào chondrocytes (Le, Ho et al. 2018). Những kết quả trên có thể thấy miR-144 có sự liên quan đến q trình phát triển của bệnh thối hóa khớp. Một trong những phương pháp hiệu quả để tìm hiểu về chức năng của miR là xác định gen đích của nó. Những nghiên cứu này bước đầu đã xác định được khoảng 16.000 vị trí đích

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

của miR-144 bằng cách sàng lọc các mRNA trong tế bào thối hóa khớp có biểu hiện tăng hoặc giảm (Le, Swingler et al. 2016). Đây là một trong những cơ sở quan trọng để tiến hành nghiên cứu cũng như thực hiện các thí nghiệm chứng minh chức năng điều hòa của phân tử miR với phân tử gen đích của miR này trên bệnh nhân thối hóa khớp tại Việt Nam.

Đó là nguyên nhân tại sao đề tài “ Xác Định Chức Năng Của MicroRNA-144 Trong Thối Hóa Khớp” được thực hiện. Đề tài tiếp nối từ những thành tựu nghiên cứu trước với mục tiêu bổ sung thêm vào bộ cơ sở dữ liệu các dấu ấn sinh học mới và tiềm năng trong chuẩn đoán sớm, từ đó làm tiền đề cho các thử nghiệm lâm sàng trong việc điều trị bệnh thối hóa khớp ở người Việt Nam.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Phần I TỔNG QUAN

1. TỔNG QUAN VỀ THỐI HĨA KHỚP

1.1

Định nghĩa, triệu chứng của bệnh thối hóa khớp

Thối hóa khớp là một bệnh về khớp rất phổ biến, thường xuất hiện nhiều ở người trung niên và người cao tuổi. Bệnh lý của thối hóa khớp liên quan đến sự mất sụn khớp khu trú và những ảnh hưởng đồng thời ở xương dưới sụn, bao gồm sự phát triển của xương ngoài, tế bào xương và tăng độ dày của vỏ xương (bệnh xơ cứng xương) (Aigner, Sachse et al. 2006, Loeser, Goldring et al. 2012). Các cấu trúc mô mềm trong và xung quanh khớp cũng bị ảnh hưởng. Những ảnh hưởng cấu trúc này bao gồm sơ hóa màng hoạt dịch, dãn dây chằng và teo các cơ nối (Loeser, Goldring et al. 2012).

Hình 1.1: Giải phẩu khớp bình thường và khớp bị thối hóa

Thối hóa khớp có ảnh hưởng rất lớn đến cuộc sống. Phần lớn các khớp bị ảnh hưởng thường là các khớp cần sự hoạt động linh hoạt như khớp bàn tay, khớp cột sống hay những khớp có vai trò chống đỡ cơ thể như khớp gối, khớp háng. Trong đó, những người bị thối hóa khớp háng và khớp gối có tỷ lệ thay khớp rất cao hơn hết do áp lực trọng lượng cơ thể. Người mới bị thối hóa khớp thường nhận rất khó nhận biết

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

do khơng thể chuẩn đốn bằng các phương thức chụp hình xương. Bệnh thối hóa khớp ở những giai đoạn đầu thường có những triệu chứng sau: các khớp hoạt động thiếu linh hoạt, sưng viêm tấy đỏ kéo dài, khi cử động khớp cọ sát phát thành tiếng nghe được (Batongbakal , Bertrand, Cromme et al. 2010).

1.2 Nguyên nhân dẫn đến bệnh thối hóa khớp

Thối hóa khớp là một bệnh hình thành do nhiều yếu tố khác nhau được chia làm 2 nguyên nhân chính, bao gồm: nguyên nhân thứ phát và nguyên nhân nguyên phát (Hsu and Siwiec 2020). Các nguyên nhân thứ phát được xác định từ những nguyên nhân bên ngoài và xác định được như: yếu tố di truyền từ gia đình, béo phì, chấn thương, tuổi tác, giới tính và nhưng tác động gây ảnh hưởng đến khớp khác (Haq, Murphy et al. 2003). Các nguyên nhân nguyên phát được hiểu là những sự thay đổi sinh hóa trong cơ thể và quá trình lão hóa xảy ra trong các khớp mà chưa biết cơ chế phân tử cụ thể. Trong đó, sự lão hóa gây ra sự mất cân bằng của con đường đồng hóa và dị hóa. Những nguyên nhân này góp phần thúc đẩy mạnh q trình mịn sụn, viêm bao hoạt dịch và hình thành các gai xương.

Sụn khớp được cấu tạo từ chondrocytes và lớp đệm ngoại bào (Extracellular ECM) được tạo ra bởi tế bào chondrocytes (Aigner, Sachse et al. 2006, Umlauf, Frank et al. 2010). Lớp đệm ngoại bào có thành phần chính là nước, collagen và proteoglycan (Umlauf, Frank et al. 2010). Những nguyên nhân do chấn thương, thay đổi chuyển hóa dẫn đến mất cân bằng của con đường đồng hóa hoặc dị hóa gây rối loạn hoạt động của tế bào chondrocytes khi bị kích thích bằng những cytokines và nhân tố như TGF-β, BMPs, IGF-1, TNF-α, IL-1β, Wnt3a (Aigner, Sachse et al. 2006, Umlauf, Frank et al. 2010, Loeser, Goldring et al. 2012). Khi đó, tế bào thực hiện tổng hợp enzyme maxtrix metalloproteinase (MMPs) và agrecanase (ADAMTS family) để phân hủy lớp đệm ngoại bào (ECM) (Umlauf, Frank et al. 2010). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, sự rối loạn của các con đường tín hiệu như TGF-β signaling (Verrecchia and Mauviel 2002), Wnt signaling (Ke, Zhou et al. 2008, Zhu, Tang et al. 2009, Nalesso, Sherwood et al. 2011) hay q trình dị hóa như NFκβ signaling có

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

matrix-liên quan đến thoái hoá khớp (Goldring 2000, Gravallese, Manning et al. 2000, Bondeson, Wainwright et al. 2006).

2. PHÂN TỬ MICRORNA

2.1 Giới thiệu phân tử microRNA

MicroRNA (miR) là một phân tử RNA nhỏ có kích thước khoảng 20-25 nucleotide. MiR có khả năng điều hịa biểu hiện gen bằng cách tăng hoặc giảm để quy định tính trạng bệnh (Ying, Chang et al. 2008). Khi sự thay đổi của miR có ảnh hưởng đến một bệnh cụ thể thì việc điều chỉnh tăng giảm biểu hiện của miR này có thể giúp thay đổi tiến triển bệnh. Hiện nay, phân tử miR được biết đến như là một liệu pháp sử dụng trong việc sửa chữa và tái tạo mô. Mỗi chức năng đặc trưng của tương tác miR- mRNA trong từng chu trình sinh học cụ thể sẽ hỗ trợ xác định các phân tử mục tiêu cho quá trình điều trị. Ở người và động vật, nhiều nghiên cứu đã xác định được một số phân tử đích tiềm năng cho việc điều chỉnh biểu hiện thối hóa khớp, trong đó bao gồm: protease, phân tử truyền tín hiệu tế bào và các yếu tố phiên mã (Wu, Tian et al. 2014). Nắm bắt được cơ chế hoạt động của phân tử miR cũng như tính chất của từng phân tử liên quan đến bệnh góp phần xác định nguyên nhân và định hướng chuẩn đoán cũng như điều trị bệnh thối hóa khớp.

2.2 Sinh tổng hợp miRNA

MiR được hình thành qua hai quá trình, trong nhân và ngồi nhân. Trong nhân, DNA thực hiện quá trình phiên mã tạo ra miR sơ cấp (primary miR) nhờ sự hoạt hóa của emzyme RNA polymerase II. MiR sơ cấp được tạo ra có cấu trúc kẹp tóc và chuỗi nucleotide poly A. Sau đó, miR sơ cấp bị Drosha (một loại RNAase II), Drosha cofactor và DGCR8 cắt vùng cấu trúc kẹp tóc tạo ra miR thứ cấp (precursor miR), có kích thước khoảng 70-100 nucleotide. Tiếp đó, Exportin-5 vận chuyển phân tử miR thứ cấp ra ngoài tế bào chất và tiếp tục bị Dicer (RNAase III) cắt các đoạn phân tử poly A trở thành một phân tử miR mạch đơi có kích thước ngắn khoảng 20-25 nucleotide. Phân tử này là phức hợp 2 mạch miR và miR* bổ sung với nó, phân tử này tiếp tục bị tháo xoắn bằng emzyme Helicase và tạo ra miR trưởng thành và một miR* (Winter, Jung et al. 2009, Vishnoi and Rani 2017).

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Hình1.2: Con đường sinh tổng hợp miRNAs

2.3 Cơ chế hoạt động của phân tử

MiR trưởng thành tương tác với phức hợp RISC có chứa protein Arganaute (Ago-2) và gắn lên vùng 3’ khơng mã hóa (3’UTR) của mRNA, dẫn đến ức chế quá trình phiên mã, dịch mã. Cách thức nhận biết và gắn đặc hiệu của miR lên mRNA phụ thuộc vào vị trí trung tâm là vùng trình tự từ 2-8 nucleotide tính từ đầu 5’ hay cịn gọi là seed site (Vishnoi and Rani 2017). Có tất cả 5 kiểu bắt cặp của miR và mRNA và được chia làm 2 loại là loại cận biên (marginal type) và loại cổ điển (canonical type). Dạng bắt cặp cận biên bao gồm kiểu bắt cặp 6 mer liên kết hoàn tồn với gen đích trên mRNA từ vị trí 2-7 nucleotide và kiểu bắt cặp offset 6 mer bị thay thế vị trí bắt cặp ở vị trí số 2 sang vị trí số 8 ( nằm ngồi vùng trung tâm); Loại thứ 2 là bắt cặp cổ điển bao gồm 3 dạng: Dạng 7mer-A1 là dạng bắt cặp hoàn toàn với vùng trung tâm từ 2-7 nucleotide, dạng 7mer-m8 là dạng bắt cặp từ vị trí 2-8 nucleotide và dạng tối ưu nhất là 8mer có sự bắt cặp hoàn hảo từ 1-8 nucleotide. Hiệu quả của các kiểu được sắp theo chiều giảm dần hiệu quả như sau: 8mer>> 7mer-m8> 7mer-A1>> 6mer> không bắt cặp (Lewis, Burge et al. 2005, Ebert, Neilson et al. 2007).

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Hình 1.3: Các kiểu bắt cặp của miRNA và mRNA mục tiêu

Ngồi ra cịn có các vị trí bắt cặp từ vị trí nucleotide thứ 13-16, được gọi là 3’ hỗ trợ và 3’ bắt cặp bổ sung lần lượt góp phần đóng góp cho hiệu quả tương tác của miR: mRNA và hỗ trợ bám bù cho bắt cặp bổ sung ở vùng trung tâm, hỗ trợ nhận diện được mục tiêu chính xác với với sự liên kết hồn tồn với vùng trung tâm (Bartel 2009). Mỗi kiểu bắt cặp khác nhau miR sẽ biểu hiện điều hoà khác nhau với mức độ khác nhau. Khi miR bắt cặp hoàn toàn vào vị trí đích của mRNA sẽ dẫn đến sự phân hủy hoàn toàn phân tử mRNA làm mất chức năng của gen đó. Khi miR bắt cặp khơng hồn tồn lên vị trí trung tâm làm ức chế mRNA làm giảm biểu hiện gen. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu nào chỉ ra chức năng rõ ràng của từng kiểu bắt cặp cụ thể.

Ngoài khả năng gắn lên vùng 3’UTR của mRNA thì một số nghiên cứu đã chứng minh khả năng điều hòa biểu hiện của miR trên vùng 5’UTR hoặc một số vùng mã hóa khác (Lee, Ajay et al. 2009).

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

2.4 Một số phân tử miRNA biểu hiện ở bệnh thối hóa khớp

Nhiều nghiên cứu so sánh mơ của khớp bình thường và khớp bị thối hóa đã chứng minh được vai trị biểu hiện của miR trong thối hóa khớp. Một thí nghiệm so sánh mực độ biểu hiện của miR trên bệnh nhân thoái hóa khớp và người bình thường (Iliopoulos, Malizos et al. 2008, Jones, Watkins et al. 2009, Díaz-Prado, Cicione et al. 2012) cho thấy khi sàng lọc 365 miRs, Illopoulos và các cộng sự tìm thấy 16 miRs, trong đó 9 miRs tăng và 7 miR giảm biểu hiện trong mơ sụn của bệnh nhân thối hóa khớp. Trong số 16 miRs, một số miR được chứng minh có liên quan đến chứng béo phì và chứng viêm: miR-9 ức chế biểu hiện MMP13; miR-9, miR-98, miR-146 ức chế biểu hiện của TNF, miR-22 được chứng minh có mức độ biểu hiện liên quan đến khối lượng của cơ thể, có đích trực tiếp là PPARA và BMP-7 cả ở mức độ phiên mã và dịch mã. Khi tăng biểu hiện của miR-22 hoặc ức chế PPARA và BMP-7 bằng siR, mức độ IL-1 và MMP-13 đều tăng (Iliopoulos, Malizos et al. 2008). Những kết quả trên cho thấy biểu hiện bất thường của miR có tác động đến thối hóa khớp. Tính chất biểu hiện của các miR đã chứng minh được sắp xếp và tóm tắt vào bảng sau:

Bảng 1.1: Một số phân tử miRNA có sự biểu hiện liên quan đến thối hóa khớp.

miRNA Biểu hiện Chức năng trong sụn Tài liệu tham khảo 22 Tăng Phản ứng viêm và lão hóa (Iliopoulos, Malizos et

485-5p Tăng Ức chế quá trình biệt hóa tế bào sụn và phản ứng viêm

(Chen, Zhang et al. 2018)

483 Tăng Thúc đẩy quá trình viêm, điều chỉnh biểu hiện của BMP7, TGF-β,

IL1- β và MMP-3

(Díaz-Prado, Cicione et al. 2012)

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

140 Giảm Ảnh hưởng đến quá trình phát triển xương, sụn và cân bằng nội mô

(Miyaki, Nakasa et al. 2009, Miyaki, Sato et al. 2010)

210 Giảm Thúc đẩy quá trình biệt hóa ngun bào xương bằng cách ức chế hoạt động của TGF-β

(Mizuno, Tokuzawa et al. 2009)

2861 Giảm Thúc đẩy q trình biệt hóa xương thông qua ức chế HDAC5

(Hu, Liu et al. 2011)

223 Tăng Thúc đẩy quá trình appotosis của tế bào chondrocytes có liên quan đến NF1A và MCSFR

(De Palma, Cheleschi et al. 2018) (Murata, Yoshitomi et al. 2010) 155 Tăng Thúc đẩy quá trình viêm (Murata, Yoshitomi et

al. 2010, Soyocak, Kurt et al. 2017) 335 Tăng Điều chỉnh quá trình biệt hóa sụn (Kopańska, Szala et

al. 2017)

2.5 Phân tử microRNA-144

Ở người, 144 nằm trên chromosome 17, nằm gần kề với 4732 và 451a/b. Trình tự bảo tồn của miR-144 được xác định có ở trên người, chuột, gà và cá ngựa vằn. Theo mô tả của cơ sở dữ liệu miRBase ( phân tử miRNA-144 trưởng thành có chứa hai đoạn trình tự hsa-miR-144-3p và has-miR-144-5p.

miR-Hình 1.4: Vị trí của phân tử miRNA-144

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Thông qua kiểm tra biểu hiện trên các mô xương và sụn, miR-144 được xác định có biểu hiện tăng gấp 5 lần ở tế bào xương của khớp thối hóa so với tế bào bình thường (Jones, Watkins et al. 2009). Tiếp đó, sự tăng biểu hiện của miR-144 được phát hiện

có khả năng ức chế hoạt động của gen CRAT trong quá trình sinh bệnh thối hóa khớp (Song, Kang et al. 2017). Một số đích trực tiếp của miR-144 đã được chứng minh bao gồm: Smad4 (Huang, Geng et al. 2016), ROCK-1 va ROCK-2 (Wang, Zhou et al.

2015), TAGLN (Zhao, Huang et al. 2014), FZD4 (Sun, Wu et al. 2019), TET2 (Li, Liu

et al. 2020). Năm 2018, TS Trúc Linh và cộng sự cũng đã chứng minh miR-144 tăng biểu hiện ở khớp của chuột và tăng biểu hiện trên tế bào chodrocytes người ở giai đoạn cuối của bệnh thối hóa khớp (Le, Ho et al. 2018). Tuy nhiên, các phần mềm Tin-Sinh học phân tích gen đích của miR-144 cho thấy miR có rất nhiều gen đích. Cho thấy những hiểu biết về chức năng của miR-144 cịn hạn chế, vì thế để hiểu rõ chức năng của miR-144 cần phân tích trong một điều kiện cụ thể như trường hợp này là ở bệnh thối hóa khớp và trên tế bào chondrocytes

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

PHẦN II:

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Tế bào Chondrosarcoma SW1353 được cung cấp từ bộ sưu tập nuôi cấy của Hoa Kì.

Tế bào thứ cấp chondrocytes của người được lấy từ sụn khớp gối của bệnh nhân thoái hóa khớp. Mãnh sụn được ủ với collagennase trong 18 giờ ( Sigma,Singapore) và tiếp theo rửa bằng môi trường Eagle Modified Dulbecco (Themo Fisher, Mỹ) để tách tế bào thứ cấp chondrocytes.

Các tế bào được nuôi trong DMEM (Thermo Fisher, USA) được bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bò (Thermo Fisher, Mỹ), 100 unit/mL penicilin và 100 μg/mL streptomycin (Thermo Fisher, Mỹ) và ủ ở 37oC và 5% (v/v) CO2 để tăng sinh.

Chủng E.coli Dh5α được sử dụng làm tế bào vật chủ trong quá trình tăng sinh vector pmiRGlo có gắn chèn 3’UTR của THBS1. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường

Luria Bertani (LB) có bổ sung ampicinlin để chọn lọc.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Thành phần phản ứng trong q trình tạo dịng gồm emzyme cắt giới hạn XhoI (Takara, Nhật), các kháng sinh (Sigma, Mỹ) bộ kít In-Fusion HD Cloning plus (Takara, Nhật Bản), Zymoclean Gel DNA Recovery Kits (Zymo Research).

Thành phần phản ứng Luciferase gồm Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher, Mỹ), bộ kít Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Mỹ).

1.4 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 KHẢO SÁT IN SILICO DỰ ĐOÁN GEN ĐÍCH CỦA PHÂN TỬ MICRORNA-144

2.1.1

Thu thập thơng tin của phân tử microRNA và gen đích bằng các cơng cụ Tin sinh

Trình tự has-miR-144-3p trưởng thành (miR-144-3p) được lấy từ miRBase

( Trình tự 3’UTR của THBS1 được tải về từ Ensembl

Genome Browser ( Gen đích tiềm năng của miR-144-3p đã được dự đoán bằng một số chương trình tin sinh học như TargetScanHuman ( miRDB ( và miRmap ( . Trình tự các vị trí trung tâm (seed site) của miR-144-3p là “AGCCAG” (6 mer-seed site), “ATACTGT” (7 mer-m8), “TACTGTA” (7 mer-A1) và “CAGCCAGA” (8 mer-seed site) được tìm kiếm trên

vùng 3’UTR của THBS1.

2.1.2

Dự đốn gen đích của phân tử miRNA-144

2.1.2.1 Phương pháp dự đốn mRNA đích của phân tử miRNA-144

Dựa trên danh sách khảo sát gen đích của phân tử miR-144, tiến hành tìm hiểu các tính chất cơ bản của gen đích trên cơ sở dữ liệu NCBI (National Central for Biotechnology Information) ( và các công bố khoa học uy tín. Tiến hành sàng lọc và thu thập thơng tin những gen đích có liên đến bệnh thối hóa khớp. Tiếp đó, các gen đích tiềm năng tiếp tục được kiểm tra khả năng bắt cặp ở các vị trí trung tâm (seed site) trên vùng 3’UTR.

2.1.2.2 Xác định chức năng của gen đích dự đốn

Dựa trên các cơng bố khoa học trước đó, tiến hành tìm kiếm, thu thập thơng tin về vị trí, chức năng, chiều hướng biểu hiện trong thối hóa khớp của gen đích được dự đốn bằng những từ khóa: tên gen, chondrocytes, thối hóa khớp (osteoarthritis).

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

2.1.3

Chọn lọc, kiểm tra mồi Real-Time PCR của gen đích THBS1

Đoạn mồi được sử dụng trong nghiên cứu này được kế thừa từ những nghiên cứu trước và được kiểm tra các chỉ tiêu vật lý để đảm bảo tính đặc hiệu cao bằng công cụ IDT DNA ( Cặp mồi được chọn đảm bảo chiều dài nằm trong khoảng 17-20 nt, có nhiệt độ nóng chảy dao động từ 50-70oC trong đó nhiệt độ của hai mồi không chênh lêch quá 5oC. Đoạn mồi phải đảm bảo %GC nằm trong khoảng 40-60% đồng thời phải cho thấy khả năng hai mồi tự bắt cặp và bắt cặp kẹp tóc xảy ra là thấp nhất.

2.1.4

Thiết kế mồi khuếch đại PCR vùng 3’UTR chứa vị trí bắt cặp và

3’UTR bị đột biến vị trí bắt cặp của gen đích THBS1

Đoạn trình tự 3’UTR của THBS1 được lấy về từ trang Ensembl Genome Browser

( Tiến hành kiểm tra và chọn lọc những đoạn 3’UTR của các vùng transcrip có thể chứa gen. Các vị trí bắt cặp được xác định trên đoạn 3’UTR của gen đích dự đoán bằng phần mền Annhyb. Lần lượt đánh dấu vị trí bắt cặp theo từng kiểu bắt cặp. Tiến hành khoanh vùng đoạn mRNA trên 3’UTR cần khuếch đại. Đoạn gen cần khuếch đại được thiết kế mồi bằng phần mềm Primer 3 ( Primer được thiết kế đảm bảo chiều dài nằm trong khoảng 20-30 nt, có nhiệt độ nóng chảy dao động từ 50-70oC trong đó nhiệt độ của hai mồi không chênh lêch quá 5oC. Để đảm bảo %GC nằm trong khoảng 40-60%, 2 cặp mồi sẽ được thêm một đoạn nucleotide khoảng 15 nt có trình tự ở mồi F: GCTCGCTAGCCTCGA và ở mồi R: CGACTCTAGACTCGA. Đồng thời, đoạn trình tự 15 nt này giúp hỗ trợ đoạn 3’UTR khuếch đại được dễ dàng nhận biết và bám trên vòng vector pmiRGlo khi tạo dòng. Cặp mồi khuếch đại đoạn 3’UTR được thiết kế gây đột biến tại vị tri bắt cặp đầu tiên trên 3’UTR. Đoạn mồi sau khi được thiết kế cần tiến hành radient để xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu để tối đa hóa hiệu suất phản ứng.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

2.2. THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH CHỨC NĂNG CỦA PHÂN TỬ MICRORNA-144

2.2.1 Kiểm tra khả năng biểu hiện của gen đích THBS1 bằng

Real-Time PCR

Khả năng điều hòa biểu hiện của miR-144 lên gen đích THBS1 được kiểm tra bằng 2

thí nghiệm dùng phương pháp Real-Time PCR. Thí nghiệm đầu tiên, kết quả so sánh giữa mẫu được xử lý với mimic-144 với mẫu chứng trên tế bào Chondrosarcoma. Thí nghiệm thứ 2 là kết quả so sánh giữa mẫu sụn tại vị trí thối hóa và sụn bình thường của mỗi bệnh nhân trong số 29 bệnh nhân.

2.2.1

.

1 Ni cấy tế bào

Trước khi tiến hành thí nghiệm, các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để ổn định dịng tế bào. Các tế bào cần có sự phát triển đều khỏe mạnh và không bị nhiễm.

Các tế bào được nuôi trong DMEM (Thermo Fisher, USA) được bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bò (Thermo Fisher, USA), 100 unit/mL penicilin và 100 μg/mL streptomycin (Thermo Fisher, USA) và ủ ở 37oC và 5% (v/v) CO2 để tăng sinh. Khi tế bào tăng sinh đạt khoảng 80%, tiếp tục cấy trang vào đĩa 24 giếng với nồng độ 5x104 tế bào/mL. Tế bào sau khi nuôi qua đêm tiến hành xử lý với mimic-144 (10mM) và negative control (10mM) mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Quá trình xử lý tế bào đến lúc thu mẫu đảm bảo nằm trong khoảng 48 tiếng. Các bước xử lý và thu nhận mẫu cần đảm bảo mức độ tương đối chất lượng tế bào giữa các mẫu.

2.2.1.2 Tách chiết RNA từ tế bào

RNA từ tế bào được nuôi cấy sau khi được thu nhận được bảo quản bằng cách sử dụng TRIzolTM Reagent (Invitrogen, USA) ở nhiệt độ -80oC. RNA được tách bằng phương pháp Phenol/ Chloroform.

Quy trình tách RNA từ tế bào bằng phương pháp Phenol/Chloroform:

• Bề mặt và các dụng cụ thực hiện thí nghiệm được lau sạch bằng RNAase.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

ã Mu gm V àl Trizol + t bo chuẩn bị được rã đơng và đặt trên đá. • Thêm 1/5V µl Chloroform và ly tâm 13000rpm/4

o

C/10p. Sau đó thu dịch nổi, đảm bảo khơng có cặn.

• Thêm 1/2V µl Isopropanol và lắc đều. Cho ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút rồi ly tâm 13000 rpm/ 4

o

C/10p. Hút bỏ dịch, thu tủ.

• Rửa tủa bằng V µl Ethanol 75% rồi ly tâm 13000 rpm/ 4

o

C/10p. Lặp lại 2 lần.

• Để khơ ở nhiệt độ phịng. Sau đó, bổ sung 10 µl H

2

O và trữ ở - 80

o

C.

Nồng độ của RNA được đo bằng Nanodrop. Độ tinh khiết của RNA được xác định bằng tỷ lệ A260/280 (trong khoảng 1,7-1,9) và A260/230 (trong khoảng 1,8-2) qua đo OD.

2.2.1.3 Reverse transcriptase và Real- time PCR kiểm tra biểu hiện của các gen mục tiêu trong tế bào

RNA sau khi kiểm tra bằng Nanodrop tiếp tục được chuẩn về cùng một nồng độ để đảm bảo tính tương quan và sai số thấp nhất từ các mẫu. Mẫu được chuyển đổi mRNA sang cDNA bằng SuperScript II RT (Thermo Fisher,USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

RNA 7,1

Để xác định sự biểu hiện của mRNA THBS1 sử dụng bộ SensiFAST SYBR No-ROX

Kit (hãng Bioline) với bộ mồi (Phù Sa). Mồi xuôi là CAACTCAGGGCAGGAAGACT-3' và mồi ngược là 5'-GGGCTGGGTTGTAATGGAAT-3' (Zhu, Yang et al. 2019). Vị trí 18S được sử dụng làm chuẩn để kiểm tra mức độ tương quan giữa các mẫu. Phản ứng real-time PCR được thực hiện trên LightCycler® 96 System (Roche, USA).

5'-Thành phần phản ứng Real-Time

Primer F 0,4 Primer R 0,4 2X Sensi Mix 5

Chu trình nhiệt:

95oC/ 120s 95oC/5s

40 chu kỳ 56oC/30s

2.2.1.4 Thống kê phân tích số liệu

Định lượng tương đối THBS1 giữa các nghiệm thức bằng công thức 2-∆∆CT. Dữ liệu được phân tích bằng phương pháp thống kê để so sánh 2 mẫu bằng phần mềm GraphPad Prism version 6.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

2.2.2 Tạo dịng bằng bộ kít Infusion-Clonning

Thí nghiệm được thực hiện nhằm mục đích tạo ra vector pmiRGlo có chứa vùng

3’UTR của THBS1 có các vị bắt cặp với miR-144 và vector pmiRGlo có chứa vùng 3’UTR của THBS1 bị đột biến vị trí bắt cặp thứ nhất với miR-144.

2.2.2.1 Radient kiểm tra nhiệt độ bắt cặp tối ưu của bộ mồi gen đích

Bộ mồi khuếch đại gen đích được tiến hành kiểm tra nhiệt độ bắt cặp tối ưu thực tế sau khi nhận từ nơi sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel Agarose.

Thành phần phản ứng PCR:

5X buffer phire tag 1 dNTP (100mM) 0.1 Genomic DNA ( 15ng/uL) 1 Emzyme phire tag 0.1 H2O 2.3 Primer mix 0.5

2.2.2.2 Khuếch đại và tinh sạch sản phẩm insert của gen đích

Gen đích được khuếch đại bằng bộ mồi và chu trình nhiệt đặc hiệu đã kiểm tra bằng emzyme phire Tag polymerase. Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

pháp Phenol/Chloroform và kiểm tra độ tinh sạch bằng Nanodrop. Độ tinh sạch được xác định bằng chỉ số A260/280 (x>1,7) và A260/230 (1,8<x>2).

2.2.2.3 Chuẩn bị vector pmirGlo

Vector pmirGlo được cắt bằng emzyme XhoI qua đêm ở 37oC. Sản phẩm cắt được chia làm 2 phần, bao gồm mẫu kiểm tra và mẫu sử dụng. Cả hai mẫu được điện di kiểm tra trên gel Agarose, riêng mẫu kiểm tra được chiếu dưới ánh sáng UV để quan sát vị trí. Đối với mẫu để sử dụng tiến hành đối chiếu vị trí băng sản phẩm và cắt khoanh vùng với mẫu kiểm tra. Phần gel có sản phẩm sử dụng được thu nhận và tinh sạch bằng bộ kit Zymoclean.

Quy trình tinh sạch gel bằng Zymoclean:

• Đoạn gel có chứa sản phẩm được cân xác định V. • Thêm 3V dung dịch ADB và ủ 55oC/10 phút cho tan.

• Chuyển dịch qua cột Zymo Spin ly tâm 13000rpm/1 phút. Sau đó, loi b dch. ã Cho 200 àl DNA Wash buffer vào cột rồi ly tâm 13000rpm/30s. Loại bỏ dịch,

lặp lại 2 lần.

• Chuyển cột vào eppendorf và thêm 6 µl DNA Elution buffer. Ly tâm 13000rpm/1 phút.

2.2.2.4 Gắn chèn sản phẩm insert vào vector pmirGlo

Sản phẩm insert và vector pmirGlo đã cắt với XhoI được pha loãng về cùng một nồng độ (50ng/µl). Thực hiện phản ứng nối vector và insert với tỷ lệ 1:3 với 5X In-Fusion HD emzyme premix.

2.2.2.5 Cấy truyền và tăng sinh trên tế bào vật chủ E. Coli

Tế bào vật chủ được sử dụng là chủng E. Coli Dh5α. Cho tế bào vật chủ và sản phẩm

In- Fusion theo tỉ lệ 50:1 tiếp xúc trên đá khoảng 30 phút. Tiếp đó, tế bào cần sốc nhiệt nhanh để sản phẩm In-Fusion đi vào và đặt lên đá ngay lập tức để tế bào khép lại. Tế bào sau khi được cấy truyền được nuôi lắc 37oC trong môi trường LB lỏng để phục hồi tế bào hoàn toàn. Cuối cùng, các tế bào được cấy lên đĩa mơi trường LB có bổ sung Ampicillin để sàng lọc các khuẩn lạc được cấy truyền thành công. Khuẩn lạc

</div>

chức năng của microrna 144 trong thoái hóa khớp

<b>---x0x---</b>

<b>---x0x---</b>

<b> THỊQUẾ</b>

<b>Giảng</b>

<b>hướngdẫn: TS.</b>

<b>LINH</b>

<b>GIẤY XÁC NHẬN </b>

<b>LỜI CÁM ƠN </b>

<b>DANH MỤC BẢNG </b>

<b>DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT </b>

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

<b>Phần I TỔNG QUAN </b>

<b>1. TỔNG QUAN VỀ THỐI HĨA KHỚP </b>

<b>Định nghĩa, triệu chứng của bệnh thối hóa khớp </b>

<b>1.2 Nguyên nhân dẫn đến bệnh thối hóa khớp </b>

<b>2. PHÂN TỬ MICRORNA </b>

<b>2.1 Giới thiệu phân tử microRNA </b>

<b>2.2 Sinh tổng hợp miRNA </b>

<b>2.3 Cơ chế hoạt động của phân tử </b>

<b>2.4 Một số phân tử miRNA biểu hiện ở bệnh thối hóa khớp </b>

<b>2.5 Phân tử microRNA-144 </b>

<b>PHẦN II: </b>

<b>VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU </b>

<b>1.4 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm </b>

<b>2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>2.1 KHẢO SÁT IN SILICO DỰ ĐOÁN GEN ĐÍCH CỦA PHÂN TỬ MICRORNA-144 </b>

<b>Thu thập thơng tin của phân tử microRNA và gen đích bằng các cơng cụ Tin sinh </b>

<b>Dự đốn gen đích của phân tử miRNA-144 </b>

<i><b>Chọn lọc, kiểm tra mồi Real-Time PCR của gen đích THBS1 </b></i>

<b>Thiết kế mồi khuếch đại PCR vùng 3’UTR chứa vị trí bắt cặp và </b>

<i><b>3’UTR bị đột biến vị trí bắt cặp của gen đích THBS1 </b></i>

<b>2.2. THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH CHỨC NĂNG CỦA PHÂN TỬ MICRORNA-144 </b>

<i><b>2.2.1 Kiểm tra khả năng biểu hiện của gen đích THBS1 bằng </b></i>

<b>Real-Time PCR </b>

<i><b>2.2.1</b></i>

<i><b>1 Ni cấy tế bào </b></i>

<i><b>2.2.1.2 Tách chiết RNA từ tế bào </b></i>

• Bề mặt và các dụng cụ thực hiện thí nghiệm được lau sạch bằng RNAase.

ã Mu gm V àl Trizol + t bo chuẩn bị được rã đơng và đặt trên đá. • Thêm 1/5V µl Chloroform và ly tâm 13000rpm/4

C/10p. Sau đó thu dịch nổi, đảm bảo khơng có cặn.

• Thêm 1/2V µl Isopropanol và lắc đều. Cho ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút rồi ly tâm 13000 rpm/ 4

C/10p. Hút bỏ dịch, thu tủ.

• Rửa tủa bằng V µl Ethanol 75% rồi ly tâm 13000 rpm/ 4

C/10p. Lặp lại 2 lần.

• Để khơ ở nhiệt độ phịng. Sau đó, bổ sung 10 µl H

O và trữ ở - 80

C.

<i><b>2.2.1.3 Reverse transcriptase và Real- time PCR kiểm tra biểu hiện của các gen mục tiêu trong tế bào </b></i>

<i><b>2.2.1.4 Thống kê phân tích số liệu </b></i>

<b>2.2.2 Tạo dịng bằng bộ kít Infusion-Clonning </b>

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về