phân tích đặc điểm phân tử đột biến trên exon 8 gen ldlr bằng phương pháp pcr kết hợp giải trình tự đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của người việt nam

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.6 MB, 70 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ: ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 8 GEN

LDLR BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ ĐỐI VỚI

MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA NGƯỜI VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

GVHD: ThS. Trương Kim Phượng SVTH: Mai Thị Tiền Phi

MSSV: 1553010147 KHĨA: 2015 - 2019

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý Thầy Cô khoa công nghệ sinh học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh, và q thầy cơ chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học – y dược đã truyền dạy kiến thức giúp em thực hiện đề tài này.

Em xin cảm ơn PGS.TS. Lê Huyền Ái Thuý, ThS. Lao Đức Thuận và ban quản lý phòng thí nghiệm sinh học phân tử, cũng như các anh chị khóa 14 và các bạn thực tập tại Phòng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em tận tình để em có thể hồn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp.

Em xin cảm ơn chân thành đến ThS Trương Kim Phượng là người trực tiếp hướng dẫn em thực hiện đề tài. Cảm ơn cơ vì luôn ở bên truyền dạy kiến thức và truyền sự nhiệt huyết để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp một cách tốt nhất.

Sau cùng con cảm ơn Ba Mẹ, chị em trong nhà đã luôn ở bên yêu thương, chia sẻ và động viên con trong suốt quá trình học tập.

Em xin cảm ơn!

Sinh viên

Mai Thị Tiền Phi

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

DGGE Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis

FDB Familial Defective Apolipoprotein B-100

IDL Intermediate density lipoprotein

LDLR Low-density lipoprotein receptor

LDLRAP1 Low-density lipoprotein receptor adaptor protein 1 MEDPED Make early diagnosis to prevent early deaths

PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type9 RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SSCP Single Strand Conformational Polymorphism

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Bảng I.1 Tiêu chí chẩn đốn FH của DLCN ... 4

Bảng I.2 Tiêu chí chẩn đoán FH của Simon Broome ... 4

Bảng I.3 Tiêu chí chẩn đốn FH của MEDPED ... 5

Bảng II.1 Tiêu chí chọn mơ hình thống kê ... 10

Bảng II.2 Thành phần phản ứng PCR ... 14

Bảng II.3 Chu trình luân nhiệt trong phản ứng PCR với cặp mồi LDLR_F2 và LDLR_R2 ... 14

Bảng III.1 Bộ dữ liệu cơng trình nghiên cứu đoàn hệ đột biến gen LDLR ... 17

Bảng III.2. Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện tính chất đột biến gen LDLR trên một số phân hạng nghiên cứu ... 20

Bảng III.3 Kết quả phân tích tính chất đột biến một số exon gen LDLR ... 22

Bảng III.4 Trình tự các cặp mồi khuếch đại exon 8 gen LDLR ... 24

Bảng III.5 Thơng số vật lí của các cặp mồi được khảo sát bằng công cụ Oligo analyzer IDT 3.1 ... 24

Bảng III.6 Kết quả phân tích độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu NC_000019.10 bằng công cụ BLAST ... 25

Bảng III.7 Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu NC_000019.10 và NG_009060.1 bằng công cụ Annhyb ... 25

Bảng III.8 Đặc điểm phân tử vùng trình tự exon 8 và intron 8 gen LDLR trên một số mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) ... 28

Bảng III.9 Một số dạng biến thể trên intron 8 đã được công bố ... 41

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC HÌNH

Hình I.1 Minh họa gen LDLR ... 6

Hình II.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp ... 11

Hình III.1 Sơ đồ quy trình phân tích tổng hợp đối với gen LDLR ... 16

Hình III.2 Kết quả phân tích tính chất đột biến trên gen LDLR theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên ... 19

Hình III.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị của bộ mẫu dữ liệu đồn hệ khi phân tích chỉ số PR trên gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm FH ... 20

Hình III.4 Đồ thị “Forest plot” phản ánh tỷ lệ đột biến trên exon 8 ... 23

Hình III.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR ... 27

Hình III.6 Dạng đột biến 22320T>G trên mẫu (1) (thể dị hợp) ... 29

Hình III.7 Dạng đột biến 22320T>G trên mẫu (2) (thể dị hợp) ... 30

Hình III.8 Dạng đột biến 22320T>G trên mẫu (3) (thể dị hợp) ... 31

Hình III.9 Dạng đột biến 22321G>C trên mẫu (1) (thể dị hợp) ... 32

Hình III.10 Dạng đột biến 22321G>C trên mẫu (2) (thể dị hợp) ... 33

Hình III.11 Dạng đột biến 22321G>C trên mẫu (3) (thể dị hợp) ... 34

Hình III.12 Dạng đột biến 22322C>A trên mẫu (1) (thể dị hợp) ... 35

Hình III.13 Dạng đột biến 22322C>A trên mẫu (2) (thể dị hợp) ... 36

Hình III.14 Dạng đột biến 22322C>A trên mẫu (3) (thể dị hợp) ... 37

Hình III.15 Dạng đột biến 22323A>G trên mẫu (1) (thể dị hợp) ... 38

Hình III.16 Dạng đột biến 22323A>G trên mẫu (2) (thể dị hợp) ... 39

Hình III.17 Dạng đột biến 22323A>G trên mẫu (3) (thể dị hợp) ... 40

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

ĐẶT VẤN ĐỀ ... VI

I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ... 1

I.1.BỆNHTĂNGCHOLESTEROLCĨTÍNHCHẤTGIAĐÌNH(FAMILIALHYPERCHOLESTEROLEMIA-FH) ... 1

I.1.1. Cholesterol và Lipoprotein ... 1

I.1.2.Bệnh lý Familial Hypercholesterolemia ... 2

I.2.GENLOWDENSITYLIPOPROTEINRECEPTOR(LDLR) ... 5

I.3.PHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCHĐẶCĐIỂMPHÂNTỬVÀMỘTSỐBỆNHLÝDITRUYỀN ... 6

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 8

II.1.VẬTLIỆU ... 8

II.2.PHƯƠNGPHÁP ... 8

II.2.1. Khai thác dữ liệu (Data – mining) và trích xuất dữ liệu vào phân tích tổng hợp ... 8

II.2.2. Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) ... 9

II.2.3. Phương pháp khảo sát trên máy tính (In silico) ... 11

II.2.4. Phương pháp thực nghiệm ... 12

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 16

III.1.KẾTQUẢTHUTHẬPDỮLIỆUVÀPHÂNTÍCHTỔNGHỢPGENLDLR ... 16

III.2.PHÂNTÍCHTỶLỆXUẤTHIỆNTÍNHCHẤTĐỘTBIẾNTRÊNGENLDLRTRÊNBỘDỮLIỆUNGHIÊNCỨUĐỒNHỆ... 16

III.3.KHẢOSÁTINSILICOGENLDLR ... 23

III.3.1.Kết quả thu thập trình tự gen LDLR ... 23

III.3.2.Kết quả thu thập dữ liệu mồi của trình tự exon 8 trên gen LDLR ... 23

III.4.KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM ... 26

III.4.1.Kết quả tách chiết DNA ... 26

III.4.2.Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 8 gen LDLR .... 26

III.4.3.Phân tích kết quả giải trình tự bằng cơng cụ tin sinh ... 27

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Familial hypercholesterolaemia (FH) - bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình là một dạng bệnh lý rối loạn di truyền, gồm các triệu chứng lâm sàng như tích tụ LDL trong máu, nồng độ cao cholesterol trong da, gân và động mạch vành dẫn tới chứng xơ vữa động mạch vành (Atherosclerotic Cardiovascular Disease -

ASCVD) (Marais et al., 2004; Maglio et al., 2014). Nồng độ cholesterol trong máu

cao bất thường là do suy giảm chức năng của thụ thể LDL hoặc rối loạn chức năng

của Apolipoprotein B-100 (Zakharova et al., 2005).

Mặc dù FH thường được xem là dạng bệnh hiếm gặp nhưng tần số mắc bệnh FH

trên thế giới vào khoảng 1/500 (Marais et al., 2004). Đến năm 2016, nhiều công bố nghiên cứu ghi nhận trên thế giới tăng lên khoảng 1/250 (Henderson et al., 2016; Abul-Husn et al., 2016; Benito-Vicente et al., 2018). FH được chia làm hai loại:

HoFH (Homozygous FH) - thể đồng hợp và HeFH (Heterozygous FH) - thể dị hợp

(Henderson et al., 2016). Trong đó, tần số mắc bệnh thể HoFH trong khoảng 1/160.000 – 300.000 và thể HeFH trong khoảng là 1/200 – 1/250 (Henderson et al.,

2016).

Theo nghiên cứu của Klose và cộng sự (2014), Wiegman và cộng sự (2015) và Maya và cộng sự (2017) ghi nhận bệnh lý FH là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến bệnh xơ vữa động mạch và nhồi máu cơ tim. Theo các nghiên cứu của Abul-Husn và cộng sự (2016) và Benito-Vicente và cộng sự (2018) cho thấy nguyên nhân dẫn đến FH chủ yếu là do tính chất đột biến điểm xuất hiện trên các gen mã hóa protein

tham gia vào cơ chế chuyển hóa cholesterol trong máu: Low density lipoprotein receptor (LDLR), Apolipoprotein B (APOB) và Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). Trong đó, các dạng đột biến xuất hiện trên gen LDLR chiếm hơn 90% đột biến được tìm thấy ở các bệnh nhân FH (Benito-Vicente et al., 2018), đột biến được thống kê ở gen ApoB là khoảng 5% và gen PCSK9 là <1% (Henderson et al., 2016).

Gen LDLR có chiều dài là 45 kb (kilobases) bao gồm 18 exon và 17 intron, nằm

trên nhiễm sắc thể 19p13.1 – 13.3 và có khoảng 2000 dạng đột biến trên gen này

dẫn tới bệnh lý FH (Benito-Vicente et al., 2018). Các dạng đột biến hiện diện trải

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

dài ở hầu hết trên tất cả các exon, điển hình là ở exon 4 (19.5%), exon 8 (8.3%)

(Shu et al., 2017), exon 7 (11.7%), exon 10 (11%) (Al-Khateeb et al., 2011).

Kế thừa kết quả của cùng nhóm nghiên cứu, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa

luận tốt nghiệp: “PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ: ĐỘT BIẾN TRÊN

EXON 8 GEN LDLR BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH

TỰ ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA NGƯỜI VIỆT NAM”.

Mục tiêu: Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh

tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình thơng qua phương pháp phân tích

tổng hợp và khảo sát thực nghiệm về tần số xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR

trên các mẫu bệnh phẩm máu của các quần thể bệnh nhân trên thế giới và ở Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu:

- Khai thác dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu NCBI và Google Scholar về đặc điểm của

các đột biến trên gen LDLR với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia

đình và một số bệnh lý liên quan khác.

- Xác định sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình bằng phương pháp phân tích tổng hợp Meta – analysis.

- Khảo sát thực nghiệm, ứng dụng phương pháp PCR – giải trình tự nhằm khảo sát

tính chất đột biến trên exon 8 gen LDLR đối với mẫu bệnh phẩm máu của bệnh

nhân Việt Nam.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

I.1. Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH)

I.1.1. Cholesterol và Lipoprotein

Cholesterol là thành phần chủ yếu trong cấu trúc màng tế bào, là tiền chất để gan

sản xuất acid mật và ruột sản xuất lypoprotein trong tế bào nhân thật (Marais et al.,

2004).

Lipoprotein là một phức hợp của lipid và protein chuyên biệt, có chức năng vận chuyển chất béo (triglyceride, cholesteryl ester…) từ gan theo hệ bạch huyết tới các tế bào đích để cung cấp năng lượng cho các q trình sinh hóa diễn ra trong tế bào người. Thêm vào đó, lipoprotein có vai trị tham gia vào cơ chế đông máu, làm lành

vết thương và một số cơ chế miễn dịch (Wansan et al., 1998). Lipoprotein được

chia thành các dạng như sau:

- Lipoprotein mật độ cao (High density lipoprotein – HDL) gồm 3 phân lớp HDL – 1, HDL – 2, HDL – 3 với sự khác nhau về kích thước và tỷ lệ protein và chất béo. HDL mang cholesterol (HDL – C) dư thừa trong thể dịch (máu) sẽ được hấp thu vào gan theo cơ chế “vận chuyển cholesterol ngược”. HDL có thể cản trở q trình vận chuyển cholesterol tới các mô theo phương thức liên kết với các thụ thể LDL

(LDLR) gan trên bề mặt tế bào (Clark et al., 1986).

- Lipoprotein mật độ thấp (Low density lipoprotein – LDL) chiếm khoảng 60 - 70% tổng lượng cholesterol trong huyết tương, là chất mang cholesterol chủ yếu trong huyết tương và có khả năng thấm qua thành mạch. Khi có sự liên kết giữa LDL – Cholesterol với thụ thể LDL trên bề mặt gan và các cơ quan khác sẽ chuyển cholesterol về lại tế bào gan. Thiếu hụt thụ thể LDL dẫn đến giảm sự chuyển hóa cholesterol, gây tăng bất thường lượng choleterol trong máu. Do đó, khi có sự bất hoạt hoặc suy giảm chức năng của thụ thể LDL dẫn đến bệnh lý FH với các triệu chứng như nồng độ cholesterol trong máu tăng cao khoảng 350 – 500mg/dL, xuất

hiện gân xanthoma và bệnh tim mạch vành (Clark et al., 1986).

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

- Lipoprotein mật độ rất thấp (Very low density lipoproteins – VLDL) là loại lipoprotein chính được tiết ra từ gan và có chức năng chính trong việc vận chuyển

triglyceride nội sinh từ gan đến các tế bào mô trong cơ thể (Wansan et al., 1998).

- Lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate density lipoprotein – IDL) là loại lipoprotein được hình thành bởi cholesteryl ester và triglyceride trong cơ chế vận chuyển và thối biến triglyceride. Sau đó, IDL được biến đổi và chuyển vào gan

thông qua cơ chế tương tác với thụ thể LDL, hoặc biến đổi thành LDL (Wansan et al., 1998).

I.1.2. Bệnh lý Familial Hypercholesterolemia

Familial Hypercholesterolemia (FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, thường do các dạng đột biến tập trung trên các gen mã hóa protein chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu. Biểu hiện đặc trưng của bệnh FH là nồng

độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (350 – 500mg/dL) (Clark et al.,

1986). Nghiên cứu đoạt giải Nobel năm 1985 của Brown và Goldstein – nhóm tác giả đầu tiên chứng minh được nồng độ LDL tăng bất thường trong huyết tương có

liên quan đến đột biến trên gen LDLR (Pears et al., 2015).

Bệnh FH được xác định chủ yếu dựa vào nồng độ LDL trong máu, cụ thể nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HoFH trong khoảng 650 – 1000 mg/dL, nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HeFH trong khoảng 350 – 550

mg/dL (Goldberg et al., 2011). Nồng độ cholesterol ở bệnh nhân FH ở độ tuổi

trưởng thành (trên 20 tuổi) ≥ 190mg/dL và ở độ tuổi trẻ em ≥ 160mg/dL (Goldberg

et al., 2011).

Bệnh FH thể đồng hợp (Homozygous FH – HoFH) thường có tần số là 1/160.000 – 300.000, bệnh FH thể dị hợp (Heterozygous FH – HeFH) lại có tần số người mắc

phải là 1/200 – 250 (Henderson et al., 2016). Một số báo cáo khoa học ghi nhận

nguy cơ mắc bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Disease – CAD) ở những bệnh nhân FH thể dị hợp không được chữa trị cao gấp 13 lần so với những người

không mắc FH (Harada-Shiba et al., 2018), nguy cơ dẫn đến bệnh tim mạch vành

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

sớm (Coronary Heart Disease – CHD) ở các trường hợp mắc FH cao gấp là 20 lần

so với những người không mắc FH (Goldberg et al., 2011).

Công bố khoa học của Ahmad và cộng sự (2016) cho thấy có khoảng 1,5 triệu người có thể mắc bệnh lý FH tại Hoa Kỳ. Theo công bố khoa học của Bellgard và cộng sự (2017), ước tính có hơn 65.000 người mắc FH ở Úc, tuy nhiên số trường hợp được chẩn đoán không nhiều. Ở Đức, tần suất mắc bệnh FH khoảng 1/500

(Klose et al., 2014). Tần suất số người mắc FH kiểu dị hợp ở Nhật Bản là 1/200 – 500 (Harada-Shiba et al., 2018).

- Nghiên cứu của Di Taranto và cộng sự (2015) xác định FH được chia làm 2 loại dựa vào kiểu hình là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia – ADH), và dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia – ARH).

- Cơng trình nghiên cứu của Pears và cộng sự (2015) xác định các nguyên chính dẫn đến bệnh FH ở dạng FH – ADH bao gồm:

(1) Đột biến xuất hiện trên gen thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor – LDLR) dẫn đến LDLR không tương tác với LDL – C, dẫn đến cholesterol không

chuyển vào gan, làm tăng nồng độ cholesterol trong huyết tương.

(2) Đột biến xuất hiện trên gen Proprotein Convertase Subtilisin / Kexin type 9 (PCSK9) dẫn đến sự sai hỏng protein PCSK9, gây nên sự thoái biến các thụ thể

LDL trên tế bào gan.

(3) Đột biến điểm trên gen Apolipoprotein B – 100 (APOB – 100) dẫn đến thể Apolipoprotein bị khiếm khuyết dẫn đến sự ngăn cản liên kết giữa LDL với LDLR trong tế bào gan. Hệ quả là sự gia tăng nồng độ cholesterol trong máu (Myant et al., 1993; Pears et al., 2015). Các dạng đột biến này tạo nên bệnh lý FH thuộc thể

khiếm khuyết Apolipoprotein B – 100 có tính chất gia đình (Familial Defective Apolipoprotein B – 100 – FDB).

Theo công bố khoa học của Alonso và cộng sự (2018), tỷ lệ đột biến xuất hiện trên

các bệnh nhân FH lần lượt là > 80% trên gen LDLR, 5 – 10% trên gen APOB và

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

< 1% trên gen PCSK9 (Alonso et al., 2018). Bên cạnh đó, cịn có tính chất đột biến xảy ra trên một số gen ở trạng thái allele lặn dẫn đến bệnh lý FH, gồm có: Low – density lipoprotein receptor adaptor protein 1 (LDLRAP1), APOE, SREBP2, STAP1 và LIPA (Alonso et al., 2018).

- Việc chẩn đoán bệnh FH thường dựa vào sự biểu hiện bệnh theo các tiêu chí: LDL – C ≥ 180 mg/dL; biểu hiện u vàng (xanthoma) trên gân và da và tiền sử mắc

bệnh FH hoặc CAD sớm trong gia đình (Harada-Shiba et al., 2018).

- Hiện nay, trên thế giới thường áp dụng một số tiêu chí chẩn đốn FH theo hệ thống của “Make Early Diagnosis to Prevent Early Deaths – MEDPED” của Hoa Kì, “Simon Broome” của Anh và “Dutch Lipid Clinic Network – DLCN” của Hà

Lan (Ahmad et al., 2016). Các thông tin chi tiết của các bộ tiêu chí chẩn đốn được

trình bày ở Bảng I.1, I.2 và I.3.

Bảng I.1 Tiêu chí chẩn đốn FH của DLCN (Pećin et al., 2017)

Tiền sử gia đình

Thế hệ thứ nhất có người mắc bệnh tim mạch sớm 1 Thế hệ thứ nhất có nồng độ cholesterol cao hơn 95% theo

Xuất hiện xanthoma ở cung giác mạc ở bệnh nhân dưới 45

Các kết quả kiểm tra sinh hóa

Nồng độ cholesterol mmol/L (mg/dL): ≥ 8,5 (330)

6,5 – 8,4 (250 – 329) 5,0 – 6,4 (190 – 249) 4,0 – 4,9 (155 – 189)

8 5 3 1 Phân tích DNA Đột biến trên các gen chức năng LDLR, APOB, PCSK9 8

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Tiêu chí Mơ tả

Khẳng định mắc bệnh FH Tổng cholesterol/LDL – C

Người lớn: > 7,5(mmol/ dL)/ > 4,9(mmol/ dL)

Trẻ em: > 6,7(mmol/ dL)/ > 4,0(mmol/ dL)

Xuất hiện các xanthoma trên gân ở thế hệ thứ nhất hoặc thứ hai

Có thể mắc bệnh FH

Tổng cholesterol/LDL – C

Người lớn: > 7,5(mmol/ dL)/ > 4,9(mmol/ dL)

Trẻ em: > 6,7(mmol/ dL)/ > 4,0(mmol/ dL)

Tiền sử gia đình mắc bệnh tim mạch vành sớm ở thế hệ thứ nhất là <60 tuổi hoặc ở thế hệ thứ hai là < 50 tuổi

Tiền sử gia đình ở thế hệ thứ nhất có tổng cholesterol > 7,5 mmol/ dL ở người lớn hoặc > 6,7 mmol/ dL ở trẻ em

Bảng I.3 Tiêu chí chẩn đốn FH của MEDPED (Pećin et al., 2017)

Tuổi

Nồng độ cholesterol (mmol/ dL) Thế hệ thứ nhất

bị FH

Thế hệ thứ hai bị FH

I.2. Gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR)

Gen LDLR có chiều dài là 45 kb (kilobases), bao gồm 18 exon và 17 intron, nằm trên cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể 19p13.1 – 13.3 (Benito-Vicente et al., 2018). Các dạng đột biến trên gen LDLR là nguyên nhân di truyền chính của FH, với hơn

2000 dạng biến thể xuất hiện trên 90% ở những trường hợp mắc bệnh FH

(Benito-Vicente et al., 2018). Công bố khoa học của Hobbs và cộng sự (1992) và Truong và

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

cộng sự (2018) cho thấy các đột biến trên gen LDLR được chia làm 5 loại, dựa trên

sự ảnh hưởng về chức năng của từng loại đột biến:

- Loại 1: đột biến dẫn đến không biểu hiện protein LDLR.

- Loại 2: đột biến dẫn đến sự sai hỏng cấu trúc protein LDLR trong quá trình vận

chuyển LDLR từ mạng lưới nội chất đến bề mặt tế bào.

- Loại 3: đột biến dẫn đến cản trở sự tương tác đặc hiệu của thụ thể LDL với

APOB.

- Loại 4: đột biến dẫn đến cản trở sự tương tác giữa protein LDLR và LDL.

- Loại 5: đột biến dẫn đến rối loạn quá trình tái thiết lập LDLR trên bề mặt tế bào.

Báo cáo khoa học của Henderson và cộng sự (2016) ghi nhận số lượng đột biến trên exon 4 chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 339 biến thể, bên cạnh đó cịn một số exon có số lượng đột biến đáng kể như exon 8 (106 biến thể), exon 3 (125 biến thể), các exon có số lượng biến thể khoảng 100 – 110 là exon 7, 9, 10, 14…

Hình I.1 Minh họa gen LDLR (Henderson et al., 2016)

I.3. Phương pháp phân tích đặc điểm phân tử và một số bệnh lý di truyền

Theo công bố khoa học của Madieh và cộng sự (2013), một số phương pháp sinh học phân tử phù hợp xác định tính chất đột biến trên gen mục tiêu liên quan đến các bệnh lý di truyền, gồm có:

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

− Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) kết hợp giải trình tự cho phép khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu và xác định các dạng biến thể (đột biến điểm)

xảy ra trình tự DNA mục tiêu (Mahdieh et al., 2013).

− Phương pháp Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) là phương pháp phát hiện các đột biến chưa công bố hoặc các dạng đột biến lệch khung: xóa

hoặc chèn các đoạn trình tự nucleotide (Mahdieh et al., 2013).

− Phương pháp Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis (DGGE) là phương pháp phát hiện nhanh các đột biến điểm, dựa trên nhiệt độ nóng chảy của từng trình tự gen mục tiêu và tốc độ di chuyển trên bản gel trong kỹ thuật điện di trên bản gel

gradient biến tính (Mahdieh et al., 2013).

Ngồi ra, cịn các phương pháp xác định đột biến khác như Allele Specific PCR (AS - PCR), Reverse transcription polymerase chain reaction (RT -

PCR)…(Mahdieh et al., 2013).

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP II.1. Vật liệu

Các trang web và phần mềm sử dụng:

- NCBI ( và Google Scholar

( cơ sở dữ liệu sinh học cho phép tìm kiếm các bài báo nghiên cứu khoa học và thu nhận trình tự nucleotide mục tiêu.

- BLAST ( là công cụ trực tuyến phân tính tương đồng giữa các trình tự, theo phương pháp sắp gióng cột.

- Annhyb: phần mềm được sử dụng để kiểm tra khả năng bắt cặp của các đoạn mồi tham khảo trên trình tự gen cần khảo sát, xác định khả năng bắt mồi, tính chất của mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại.

- MedCalc®: phần mềm thống kê cho phép thực hiện phân tích tổng hợp.

II.2. Phương pháp

II.2.1. Khai thác dữ liệu (Data – mining) và trích xuất dữ liệu vào phân tích tổng hợp

Thu thập bộ dữ liệu khoa học:

- Khai thác dữ liệu từ các bài báo khoa học trên các dịch vụ Pubmed, PubMed central của cơ sở dữ liệu NCBI, ngồi ra cịn sử dụng dịch vụ Google Scholar.

- Sử dụng một số từ khóa thu thập dữ liệu về đặc điểm phân tử bệnh FH: LDLR,

Cholesterol, Familial Hypercholesterol.

Các thông tin được lựa chọn, trích xuất dữ liệu để đưa vào phân tích tổng hợp: Thơng tin loại mẫu trong nghiên cứu, cỡ mẫu, tổng số mẫu xuất hiện tính chất đột biến, dạng đột biến, các phương pháp sinh học phân tử dùng để xác định đột biến

điểm trên gen LDLR.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

- Tổng hợp thông tin và tỷ lệ đột biến của từng exon trên gen LDLR.

II.2.2. Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)

Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta – analysis) được tiến hành dựa vào các thuật toán thống kê trên nguồn dữ liệu gồm hai hoặc nhiều cơng bố khoa học có cùng đối tượng nghiên cứu, được ứng dụng trong lĩnh vực khoa học trong y học, tâm lý học…(Ling., 2002).

Phương pháp phân tích tổng hợp được tiến hành nhằm xác định sự tương quan giữa

tính chất đột biến trên gen LDLR và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình thơng qua một số tham số định lượng như tần số đột biến trên gen LDLR

trên tổng mẫu nghiên cứu và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình, chỉ số “Proportion”, viết tắt là PR% với khoảng tin cậy 95% (Confidence

intervals – CIs), phản ánh mức độ xuất hiện đột biến trên gen LDLR trên bộ mẫu

bệnh phẩm có chỉ số cholesterol cao trong máu thông qua công cụ thống kê Medcalc.

Các bước để thực hiện phân tích tổng hợp (Basu., 2017):

- Xây dựng tiêu chí trích xuất dữ liệu theo thang chuẩn “PICO – Participant – Intervention – Comparator – Outcomes”, Participant được hiểu theo nghĩa đối tượng nghiên cứu, Intervention là sự tác động đến đối tượng nghiên cứu, Comparator là so sánh các đối tượng dưới những tác động khác nhau và cuối cùng là Outcomes: giải quyết, đưa ra kết quả.

- Thu thập nguồn thông tin qua các ngân hàng dữ lệu như NCBI, Google Scholar. - Đọc phần tiêu đề và tóm tắt và của các bài nghiên cứu để nắm rõ được trọng tâm của nghiên cứu.

- Sau đó đọc thơng tin tồn văn của cơng trình nghiên cứu để chọn lọc và trích xuất dữ liệu. Trong khi đó, tiến hành kiểm tra chất lượng (độ tin cậy) của bài nghiên cứu dựa vào tổng quan nghiên cứu, mục tiêu nghiên cứu, hướng tiếp cận nghiên cứu, cỡ mẫu, loại mẫu…

Đánh giá sự khác biệt giữa các bài nghiên cứu, thông qua việc xác định tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu. Dựa vào thuật tốn Chi bình phương, xác định chỉ số bất

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

đồng nhất (Index of Heterogeneity: I2) theo thang giá trị: 0 – 100% (Thorlund et al.,

2012) và hệ thống Cochrane:

- Tính bất đồng nhất thấp: 0% < I2 < 40%. - Tính bất đồng nhất vừa: 30% < I2 < 60%. - Tính bất đồng nhất cao: 50% < I2 < 90%.- Tính bất đồng nhất rất cao: I2 > 75%.

Dựa vào giá trị của I2, từ đó xác định mơ hình phân tích theo dạng mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta – analysis, R) và mơ hình ảnh hưởng cố định (Fixed effects meta-analysis, F), theo tiêu chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals – CIs) nhằm đánh giá tính

tương quan giữa yếu tố nguy cơ (tính chất đột biến trên gen LDLR) và nguy cơ mắc

bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Hunter và Schmidt., 2000). Thông thường, việc lựa chọn mơ hình dựa vào tiêu chí của Cochrane (2014) thể hiện ở bảng II.1.

Bảng II.1 Tiêu chí chọn mơ hình thống kê (Cochrane., 2014) Mơ hình Chỉ số bất đồng nhất Chỉ số đồng nhất

Phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến (Fixed effects meta – analysis) theo phương pháp của Mantel-Haenszel

I2 < 50% P ≥ 0,1

Phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta – analysis) theo phương pháp của DerSimonian.

I2 > 50% P < 0,1

Xuất biểu đồ tương ứng với loại mô hình mẫu nghiên cứu phù hợp thơng qua phần mềm MedCalc. Các bước trích xuất dữ liệu từ các nghiên cứu khoa học được thực hiện như sau:

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Hình II.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp

II.2.3. Phương pháp khảo sát trên máy tính (In silico)

Khảo sát trên máy tính (In silico) với mục đích xác định bộ mồi phù hợp với

phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến nổi trội trên các

exon thuộc gen LDLR. Các bước thực hiện gồm có:

- Thu thập dữ liệu về bộ gen LDLR (phiên bản cập nhật mới) từ cơ sở dữ liệu

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

khảo tiêu chí thiết kế mồi cho phương pháp PCR trong tài liệu Giáo trình Ứng dụng tin học trong Công nghệ sinh học (Lê Huyền Ái Thúy; 2016):

- Chiều dài mồi: thông thường chiều dài mồi nằm trong khoảng 17 – 28 nucleotide, tối thiểu 15 nucleotide.

- Sản phẩm PCR có chiều dài khuếch đại nằm trong khoảng 100 – 600 bp. - Tỷ lệ GC (%) nên nằm trong khoảng 40 – 60%.

- Nhiệt độ nóng chảy của hai mồi khác biệt không quá 5ºC, giới hạn thường gặp từ 50ºC đến 65ºC.

II.2.4. Phương pháp thực nghiệm Thiết bị và hoá chất:

(1) Thiết bị:

- Bể ổn nhiệt - Máy ly tâm lạnh - Tủ thao tác - Tủ lạnh - Máy vortex

- Máy đo quang phổ - Máy PCR

(2) Hóa chất: - Phenol - Chloroform

- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% - NaCl 0,45M

- Tris HCl 10mM (pH = 8,2)

- Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1M (pH = 8) - Ammonium acetate (NH4OAc) 5M

- Ethanol 100% - Ethanol 70%

- Proteinase K (18,5 mg/ml) - Master mix 2X

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

- Bộ mồi

Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến điểm nổi trội trên các vùng exon của

gen LDLR và khả năng mắc bệnh / không mắc bệnh tăng cholesterol trong máu có

tính gia đình, người Việt Nam, gồm một số nội dung thực nghiệm:

(1) Tách chiết DNA bộ gen của bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) bằng phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi; 1987).

- Thu nhận 50 μl mẫu bệnh phẩm vào một eppendorf (1,5 ml).

- Bổ sung 500 µl dung dịch ly giải, gồm có NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2), EDTA 1M (pH = 8), SDS 10%.

- Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều. Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 1 giờ. - Bổ sung một thể tích dung dịch phenol: chloroform (tỉ lệ 1:1), trộn đều. Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/phút trong 3 phút và thu dịch nổi.

- Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu. Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/ phút trong 3 phút và thu dịch nổi.

- Bổ sung 0,25 lần thể tích Amonium Acetate 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (trữ lạnh). Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4o

C và thu tủa.

- Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. - Thu cặn, xử lý để làm khô mẫu DNA bộ gen và bảo quản trong 20 – 50 μl dung dịch Tris-EDTA (pH=8), ở –20oC.

(2) Xác định chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm và độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280. DNA thu nhận đã tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1,8 – 2.

- Công thức xác định nồng độ DNA: C (µg/ml) = 50 x A260 x d

Chú thích:

C: giá trị nồng độ DNA (μg/ml).

A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm. A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm. d: độ pha lỗng (thường từ 30 – 50 lần).

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

(3) Phương pháp PCR

Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 8 gen

LDLR bằng cặp mồi LDLR_F2 và LDLR_R2 được tham khảo bởi nghiên cứu của

Cheng và cộng sự (2018). Thành phần phản ứng và chu trình luân nhiệt được thể hiện ở bảng II.2 và II.3.

Bảng II.2 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl)

- Rót gel vào khn, chờ gel đơng, rút lược.

- Hịa trộn sản phẩm PCR với dung dịch nạp mẫu có bổ sung Gel Red.

- Nạp mẫu vào giếng. Chạy điện di ở hiệu điện thế 70 Vol với thời gian thích hợp khoảng 30 phút.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

- Đọc kết quả bằng máy đọc gel (Gel Doc XR). Dưới tác động của tia UV lên thành phần của dung dịch Gel Red, DNA (sản phẩm PCR) hiển thị thành băng sản phẩm. Kích thước của DNA (sản phẩm PCR) được xác định nhờ vào thang phân tử (50 bp hoặc 100 bp).

(5) Giải trình tự

Chúng tơi tiến hành gửi giải trình tự đối với các sản phẩm PCR cho kích thước dự kiến trong khoảng 300 – 400 bp. Sau đó, chúng tơi thực hiện phân tích các kết quả giải trình tự với trình tự tham chiếu: NC_000019.10 (11.089.362 – 11.133.830), NM_000527.4 (“CDS – coding sequence: trên hệ thống LOVD) và sử dụng phần mềm Chromas Lite phiên bản 2.6.6 và CodonCode, Aligner phiên bản 8.0.2 nhằm xác định các dạng biến thể (tính đa hình/đột biến) xuất hiện trên vùng trình tự mục

tiêu (exon 8) của gen LDLR của trên một số mẫu bệnh phẩm máu của người Việt

Nam.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.1. Kết quả thu thập dữ liệu và phân tích tổng hợp gen LDLR

Dựa vào nguồn dữ liệu trên NCBI và Google Scholar, chúng tơi thu nhận 72 cơng

trình nghiên cứu khoa học liên quan đến bệnh FH và gen LDLR. Sau đó, dựa vào

các tiêu chí trong phân tích tổng hợp, chúng tơi chọn lọc ra 35 công trình nghiên cứu đưa vào quy trình phân tích tổng hợp về tính chất đột biến xuất hiện trên gen

LDLR đối với bệnh FH (Hình III.1).

Hình III.1 Sơ đồ quy trình phân tích tổng hợp đối với gen LDLR

III.2. Phân tích tỷ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen LDLR trên bộ

dữ liệu nghiên cứu đoàn hệ

Dựa vào tiêu chí sàng lọc, trích xuất dữ liệu, chúng tôi chọn lọc 35 cơng trình

nghiên cứu có liên quan đến gen LDLR vào phân tích chỉ số tỷ lệ (Propotion) phản ánh sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh FH. Bộ dữ liệu

khoa học này được nghiên cứu trên bộ mẫu bệnh có chỉ số cao cholesterol trong

máu theo tiêu chuẩn Simon Broome và Dutch Lipid Clinic Network (Pecin et al.,

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

2017). Bộ dữ liệu gồm 35 công trình nghiên cứu đồn hệ với 7.435 mẫu máu của bệnh nhân FH, mô tả chi tiết ở bảng III.1.

Bảng III.1 Bộ dữ liệu cơng trình nghiên cứu đồn hệ đột biến gen LDLR

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Chúng tôi ghi nhận bộ dữ liệu này có tính chất bất đồng nhất rất cao (I2 = 97,43%, P<0,0001). Do đó, chúng tơi chọn mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random Effect model) để xác định chỉ số Proportion, kết quả thể hiện ở Hình III.2, III.3, Bảng III.2 và Phụ lục 5. Chúng tôi ghi nhận chỉ số Proportion xấp xỉ 51,27% (95%CI: 43,699 – 58,812) theo mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên, kết quả này phản

ánh tỷ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen LDLR ở các bệnh nhân FH là 51,27%.

Đồng thời, chúng tôi xuất đồ thị “Funnel plot” để biểu thị tính chất thiên vị của bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp. Kết quả này thể hiện ở Hình III.3.

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành làm rõ chỉ số Proportion tương ứng với tỷ lệ xuất

hiện tính chất đột biến trên gen LDLR ở các bệnh nhân FH, trên một số phân hạng

liên quan đến thông tin của các công bố khoa học: phương pháp sinh học phân tử phân tích đột biến, châu lục các bệnh nhân sinh sống, loại bệnh liên quan đến mẫu và yếu tố di truyền phả hệ.

Trong tổng số 35 cơng trình nghiên cứu đoàn hệ để sử dụng mẫu bệnh phẩm là mẫu máu nên chúng tôi khơng phân tích chỉ số “Proportion” theo loại mẫu. Tiếp theo,

chúng tơi phân tích tính chất đột biến gen LDLR từ các cơng trình nghiên cứu dựa

vào châu lục, phương pháp được trình bày ở Bảng III.4.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Hình III.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị của bộ mẫu dữ liệu

đồn hệ khi phân tích chỉ số PR trên gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm FH

Bảng III.2 Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện tính chất đột biến

gen LDLR trên một số phân hạng nghiên cứu

Chỉ số

Tổng số bài báo

Phân tích ảnh hưởng Tính bất đồng nhất Chỉ số Proportion (Tỷ lệ: %)

Phương pháp

PCR – Giải trình tự 15 62,462 [51,702 – 72,633] R <0,0001 89,74 Khác 20 45,191 [35,910 – 54,645] R <0,0001 97,97

Châu lục

Châu Âu 20 55,599 [45,420 – 65,545] R <0,0001 98,20 Châu Mỹ 4 45,623 [33,921 – 57,594] R =0,0081 74,55 Châu Á 9 38,289 [26,061 – 51,321] R <0,0001 92,78 Châu Phi 2 76,583 [58,953 – 89,334] F =0,7366 0,00

Loại bệnh

FH 32 52,023 [44,276 – 59,721] R <0,0001 97,26 ADH 3 55,582 [27,629 – 81,735] R <0,0001 93,65

Yếu tố phả hệ

Family 7 31,540 [19,305 – 45,241] R <0,0001 94,24 Proband 28 56,125 [47,339 – 64,722] R <0,0001 97,59

Chú thích: R: Random effects model (mơ hình phân tích tổng hợp ngẫu nhiên); F: Fixed effects model (mô hình phân tích tổng hợp bất biến).

-0,4-0,20,00,20,40,60,81,01,2Proportion

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Phân tích theo phương pháp, chúng tôi xác định chỉ số Proportion (95%CI) của phương pháp PCR – giải trình tự và một số phương pháp sinh học phân tử khác lần lượt là 62,462% (95%CI: 51,702 – 72,633) và 45,191% (95%CI: 35,910 – 54,645) theo mơ hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên. Từ đó cho thấy phương

pháp PCR – giải trình tự phát hiện tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen LDLR xấp xỉ

62,462% trong bộ mẫu bệnh phẩm từ các bệnh nhân có chỉ số cao cholesterol trong máu. Bên cạnh đó, Proportion (95%CI) của các phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến khác (SSCP, MLPA, DDGE) xác định đột biến xuất hiện trên gen

LDLR là 45,191% (95%CI: 35,910 – 54,645). Kết quả này cho thấy có thể lựa chọn

phương pháp PCR - giải trình tự hoặc phương pháp khác để phân tích tính đột biến

trên gen LDLR. Tuy nhiên, trong phần nghiên cứu thực nghiệm, dự kiến chúng tơi thực hiện phân tích tính chất đột biến trên exon 8 và các exon khác của gen LDLR

trên một số mẫu bệnh phẩm ở Việt Nam bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự.

Xét về phân hạng chủng tộc

Chỉ số Proportion (95%CI) về tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen LDLR liên quan đến

bệnh FH ở châu Âu, châu Mỹ, châu Á và châu Phi lần lượt là 55,599% (95%CI: 45,420 – 65,545; mơ hình R); 45,623% (95%CI: 33,921 – 57,594; mô hình R) 38,289% (95%CI: 26,061 – 51,321; mơ hình R) và 76,583% (95%CI: 58,953 – 89,334, mơ hình F).

Xét về phân hạng loại bệnh

Chỉ số Proportion (95%CI) về tỷ lệ bệnh liên quan đến đột biến trên gen LDLR là

FH và ADH lần lượt là 52,023% (95%CI: 44,276 – 59,721) và 55,582% (95%CI: 27,629 – 81,735) theo mơ hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên.

Xét về phân hạng phả hệ: “Proband” và “Family”

Phân tích theo phả hệ, chúng tôi xác định chỉ số Proportion (95%CI) của nhóm bệnh nhân có tiền sử bệnh gia đình (“Family”) và nhóm bệnh nhân riêng lẻ (“Proband”)

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

lần lượt là và 31,540% (95%CI: 19,305 – 45,241) và 56,125% (95%CI: 47,339 – 64,722) theo mơ hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên.

Phân tích tỉ lệ xuất hiện đột biến trên một số exon thuộc gen LDLR

Chúng tôi thu thập 35 cơng trình nghiên cứu đồn hệ phân tích đột biến điểm trên

gen LDLR và tập trung khảo sát đột biến điểm trên exon 8 của gen LDLR (Phụ lục

8). Chỉ số Proportion (95%CI) của đột biến trên exon 8 theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Bảng III.3).

Bảng III.3 Kết quả phân tích tính chất đột biến một số exon gen LDLR

Phân tích ảnh hưởng Tính bất đồng nhất Exon N Chỉ số “Proportion” (95%CI) Mơ hình PHI2 (%)

2 12 4,068 (2,245 – 6,399) R <0,0001 78,83 3 13 4,736 (1,996 – 8,566) R <0,0001 87,47 4 22 13,586 (9,879 – 17,778) R <0,0001 82,88 5 15 6,888 (2,961 – 12,289) R <0,0001 92,87 6 13 5,295 (3,189 – 7,895) R <0,0001 76,49 7 15 5,404 (3,137 – 8,241) R <0,0001 81,18

9 18 8,805 (5,707 – 10,835) R <0,0001 72,54

11 11 5,591 (2,678 – 9,484) R <0,0001 87,51 12 16 9,848 (5,139 – 15,869) R <0,0001 92,4

trên exon gen LDLR chúng tôi xác định chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ đột biến xuất hiện trên exon 8 thuộc gen LDLR là 6,047% (95%CI: 3,623 – 9,042), mơ hình

R) là tương đối cao so với chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ đột biến xuất hiện trên

các exon khác thuộc gen LDLR. Kết quả được trình bày ở Bảng III.7 và Hình III.4

Vì vậy, trong nội dung nghiên cứu này chúng tơi tiếp tục thực hiện phân tích tính

chất đột biến trên gen LDLR, cụ thể là exon 8.

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

Hình III.4 Đồ thị “Forest plot” phản ánh tỷ lệ đột biến trên exon 8

III.3. Khảo sát In silico gen LDLR

III.3.1. Kết quả thu thập trình tự gen LDLR

Chúng tơi thu nhận trình tự gen LDLR từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI cập nhật đến

tháng 4/2019, gồm có các trình tự: NC_000019.10 (44.469 bp) và NG_009060.1 (51.450 bp). Chúng tôi tiến hành khảo sát mồi bằng phần mềm BLAST và Annhyb, kết quả phân tích giúp chúng tôi chọn lựa NC_000019.10 (vị trí 11.089.362 –

11.133.830 trên gen LDLR) là trình tự tham chiếu trong nội dung khảo sát bộ mồi

phù hợp với phương pháp PCR – giải trình tự xác định đột biến trên exon 8 gen

LDLR đối với bệnh FH ở bệnh nhân Việt Nam.

III.3.2. Kết quả thu thập dữ liệu mồi của trình tự exon 8 trên gen LDLR

Dựa vào các cơng trình nghiên cứu của Leren và cộng sự (1997), Amsellem và cộng sự (2002), Cheng và công sự (2018) chúng tôi thu thập được các cặp mồi dự kiến phù hợp với quy trình PCR khuếch đại vùng trình tự exon 8 được trình bày ở Bảng III.4.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Bảng III.4 Trình tự các cặp mồi khuếch đại exon 8 gen LDLR

CHIỀU DÀI MỒI

367 Cheng et al., 2018 LDLR_R2 GATATGAGTCTGTGCAAAGTTC 22

Bảng III.5 Thông số vật lí của các cặp mồi được khảo sát bằng công cụ Oligo analyzer IDT 3.1

Dựa vào các tiêu chí về thiết kế mồi cho phản ứng PCR, chúng tôi chọn lọc cặp mồi

LDLR_F2 và LDLR_R2 khuếch đại vùng trình tự exon 8 gen LDLR bằng phần

mềm Annhyb.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

bằng công cụ BLAST và Anhhyb phiên bản 4.946, kết quả trình bày ở Bảng III.6 và Bảng III.7 (phụ lục 3; 4).

Bảng III.6 Kết quả phân tích độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu NC_000019.10 bằng công cụ BLAST

Tên mồi

Điểm số tương

đồng

% độ tương đồng

Độ bao phú

E-value

Trạng thái chuỗi trình tự “query”/”subject”

LDLR_F1 50,1 100 100 11.111.489 – 11.111.513 5e-07 +/+ LDLR_R1 44,1 100 100 11.111.664 – 11.111.6433e-05 +/- LDLR_F2 44,1 100 100 11.111.370 – 11.111.391 2e-05 +/+ LDLR_R2 44,1 100 100 11.111.736 – 11.111.715 2e-05 +/- LDLR_F3 40,1 100 100 11.111.468 – 11.111.487 3e-04 +/+ LDLR_R3 40,1 100 100 11.111.687 – 11.111.668 3e-04 +/-

Chú thích: “Query” là các trình tự mồi ở trạng thái mạch dương (+); “Subject” là các trình tự tương đồng với trình tự mồi, được chọn lọc bởi công cụ BLAST và trạng thái mạch dương (+) hoặc mạch âm (-).

Bảng III.7 Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu NC_000019.10 và NG_009060.1 bằng cơng cụ Annhyb

Tên mồi

LDLR_F1 100 22.128 – 22.152 100 27.109 – 27.133 LDLR_R1 88,46 22.303 – 22.279 88,46 27.284 – 27.260 LDLR_F2 100 22.009 – 22.030 100 26.990 – 27.011 LDLR_R2 100 22.354 – 22.375 100 27.356 – 27.335 LDLR_F3 100 22.107 – 22.126 100 27.088 – 27.107 LDLR_R3 100 22.326 – 22.307 100 27.307 – 27.288

- Mồi LDLR_F2 định vị tại vị trí 22.009 – 22.030 trên trình tự NC_000019.10. - Mồi LDLR_R2 định vị tại vị trí 22.354 – 27.375 trên trình tự NC_000019.10.

Cặp mồi LDLR_F2 – LDLR_R2 khuếch đại trên vùng trình tự: 22.009 – 27.357 với chiều dài sản phẩm 367bp.

Dựa vào các kết quả nêu trên, chúng tôi lựa chọn các cặp mồi phù hợp đưa vào nội

dung nghiên cứu thực nghiệm để khảo sát đặc điểm phân tử vùng trình tự gen LDLR

bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự. Chúng tơi dự kiến sử dụng cặp mồi

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

LDLR_F2 và LDLR_R2 cặp mồi khuếch đại vùng trình tự gen LDLR với sản

phẩm dự kiến với chiều dài 367bp.

III.4. Kết quả khảo sát thực nghiệm

III.4.1. Kết quả tách chiết DNA

Trong nghiên cứu này, bộ mẫu bệnh phẩm máu của các bệnh nhân có biểu hiện cao cholesterol trong máu được thu thập tại một số bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh. Chất lượng DNA bộ gen được kiểm tra theo phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm. Các mẫu bệnh phẩm cho chỉ số đo OD 260/280 trong khoảng xấp xỉ khoảng 1,8 – 2.

III.4.2. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 8 gen LDLR

Tham khảo công bố khoa học của Cheng và cộng sự (2018), chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi LDLR_F2 và LDLR_R2 ở nhiệt độ lai 600C, nhằm

khuếch đại trình tự exon 8 gen LDLR trên các mẫu bệnh phẩm: (1) (2) và (3). Thơng

tin mẫu bệnh phẩm được trình bày ở Phụ lục 7.

Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose (Hình

III.5). Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 8 gen LDLR đều cho băng

sản phẩm sáng, rõ và có kích thước như dự kiến (367 bp).

Kết quả điện di thể hiện ở hình III.5 cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại vùng trình

tự gen LDLR bằng cặp mồi LDLR_F2 và LDLR_ R2 đều cho băng sản phẩm sáng, rõ và có kích thước như dự kiến là 367 bp trên nguồn DNA của mẫu bệnh phẩm (1), (2). Ở giếng (2), băng sản phẩm mờ hơn so với băng sáng ở giếng (1) và (3). Do đó, chúng tơi cần lưu ý kết quả giải trình tự và nếu cần thiết chúng tôi phải thực hiện lại phản ứng PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu cũng như thực hiện lại việc thu nhận DNA bộ gen của mẫu (2). Với số mẫu rất ít (3 mẫu) nhưng các kết quả này phần nào phản ánh bước đầu thiết lập được quy trình tách chiết và PCR khuếch đại vùng

gen mục tiêu: LDLR trên một số mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam.

</div>