đánh giá sự methyl hóa gen e cadherin trên ung thư biểu mô vòm họng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.27 MB, 50 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ SỰ METHYL HÓA GEN

E-CADHERIN TRÊN UNG THƯ BIỂU

MƠ VỊM HỌNG

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CHUN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

SVTH: NGÔ ĐÔNG KHA MSSV: 1253012153

Khóa: 2012 – 2016

Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2016

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

Thúy, cô đã truyền đạt cho chúng em những kiến thức quý báo về sinh học phân tử, những vấn đề ứng dụng của sinh học phân tử trong cuộc sống. Cô cũng chính là người đã truyền cho em ngọn lửa nghiên cứu từ khi em bắt đầu học chuyên ngành Vi sinh-Sinh học phân tử.

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Lao Đức Thuận, thầy đã luôn đồng hành, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp. Thầy luôn nhiệt huyết với nghề giáo và đam mê nghiên cứu đã tiếp thêm tinh thần nghiên cứu khoa học cho em và các bạn.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Trương Kim Phượng, cô đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báo trong nghiên cứu. Cảm ơn cô đã luôn giúp đỡ và hỗ trợ chúng em thực hiện đề tài.

Con xin dành lời tri ân sâu sắc nhất đến ba mẹ. Ba mẹ đã luôn ở bên cạnh động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con học tập. Con sẽ luôn cố gắng để khơng phụ lịng mong mỏi của ba mẹ

Xin cảm ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu đã luôn bên cạnh và chia sẻ công việc với nhau trong suốt thời gian qua. Cảm ơn các bạn sinh viên ptn SHPT đã sắp xếp thời gian hợp lí để cùng nhau hồn thành đề tài.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh cơ sở 3 Bình Dương, Ban lãnh đạo Khoa Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, về tinh thần và thời gian để em có thể học tập và hồn thành khóa luận tốt nghiệp tại trường.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2016.

NGƠ ĐƠNG KHA

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

1.3.2. DNA methyl hoá. ... 5

1.4. Tổng quan về gen CDH1 (Epithelial-Cadherin). ... 6

1.4.1. Gen Epithelial-Cadherin (E-Cadherin). ... 6

1.4.2. Cấu tạo của protein E-cadherin. ... 7

1.4.3. Chức năng của gen E-cadherin. ... 8

1.4.3.1. E-cadherin điều hịa tín hiệu Wnt/β-catenin... 8

1.4.3.2. E-cadherin điều hịa tín hiệu PI3K/Akt. ... 9

1.4.3.3. E-cadherin điều hòa hoạt động Rho-family GTPase... 10

1.4.3.4. E-cadherin ức chế hoạt động của NF-κB. ... 10

1.4.4. Sự methyl hóa gen E-cadherin. ... 11

1.5. Phương pháp phát hiện methyl hóa DNA. ... 11

1.6. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). ... 12

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

1.8. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. ... 14

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. ... 15

2.3.1. Tách chiết DNA bộ gen từ mẫu mơ sinh thiết vịm họng. ... 18

2.3.2. Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA đã tách chiết. ... 19

2.3.3. Biến đổi Bisulfite. ... 19

2.3.4. Khảo sát sự methyl hóa gen E-cadherin trong các mẫu DNA đã tách chiết. .. 20

2.3.5. Định tính bằng phương pháp Realtime. ... 20

2.3.6. Giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu. ... 21

III. KẾT QUẢ-THẢO LUẬN. ... 22

2.1. Quá trình khai thác cơ sở dữ liệu. ... 22

2.1.1. Kết quả khai thác cơ sở dữ liệu. ... 22

2.1.1.1. Tần số methyl trên các loại mẫu. ... 23

2.1.2. Kết quả thu nhận trình tự. ... 25

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

2.1.3. Kết quả khảo sát mồi. ... 27

2.2. Kết quả thực nghiệm. ... 30

3.2.1. Kết quả tinh sạch DNA. ... 30

3.2.2. Kết quả khuếch đại với trình tự gen bị methyl... 31

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh và tỉ lệ tử vong trên các bệnh ung thư tại Việt Nam

năm 2012. ... 3

Hình 1.2. Giải phẫu vịm họng. ... 3

Hình 1.3. Giai đoạn 3 của Ung thư vịm họng. ... 5

Hình 1.4. Quá trình xúc tác của enzyme DNA methyltransferase. ... 6

Hình 1.5. Vị trí gen E-cadherin trên nhiễm sắc thể số 16 ... 6

Hình 1.6. Cấu trúc của E-cadherin và các con đường tín hiệu. ... 8

Hình 1.7. Con đường điều hịa tín hiệu Wnt/β-catenin. ... 9

Hình 1.8. Con đường điều hịa tín hiệu PI3K/Akt. ... 10

Hình 1.9. Con đường điều hịa hoạt động Rho-family GTPase. ... 10

Hình 1.10. Methyl hóa DNA và điều hịa biểu hiện của gen. ... 11

Hình 1.11. Phương pháp MSP ... 12

Hình 1.12. Cơ chế biến đổi bisulfite . ... 12

Hình 1.13. Nguyên tắc của phương pháp PCR. ... 13

Hình 3.1. Tần số methyl hóa và unmethyl trung bình có trọng số của gen cadherin trên các loại mẫu khác nhau. ... 23

Hình 3.2. Tần số methyl hóa và unmethyl trung bình có trọng số của gen cadherin trên mẫu bệnh và mẫu lành. ... 25

E-Hình 3.3. Định vị gen E-cadherin trên nhiễm sắc thể số 16. ... 25

Hình 3.4. Các yếu tố phiên mã trên vùng promoter của gen. ... 26

Hình 3.5. Kết quả Annhyb cặp mồi Methyl với trình tự promoter. ... 29

Hình 3.6. Chu trình nhiệt tham khảo từ tài liệu. ... 29

Hình 3.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime-PCR... 30

Hình 3.8. Kết quả điện di mẫu biến đổi bisulfite với cặp mồi methyl. ... 31

Hình 3.9. Kết quả định lượng Realtime. ... 32

Hình 3.10. Kết quả phân tích nhiệt độ nóng chảy. ... 33

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1. Thơng tin tóm tắt từ các nghiên cứu tham khảo. ... 22

Bảng 3.2. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen E-cadherin phân theo loại mẫu. ... 23

Bảng 3.3. Bảng tần số methyl và unmethyl trung bình có trọng số của gen cadherin trên mẫu ung thư và mẫu bình thường. ... 24

E-Bảng 3.4. Trình tự mồi thu nhận từ tài liệu tham khảo. ... 27

Bảng 3.5. Thông tin đánh giá mồi qua chương trình IDT. ... 28

Bảng 3.6. Giá trị OD từ các mẫu DNA. ... 30

Bảng 3.7. So sánh kết quả giữa phương pháp Realtime PCR và phương pháp MSP điện di. ... 32

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC VIẾT TẮT

CAS Cellular apoptosis susceptibility

CpG Cytosine phosphodiester guanine

ERK Extracellular signal-regulated kinase

LRP5,6 Low-desity lipoprotein receptor related 5,6 MAPK Mitogen-activated protein kinasesMEK Mitogen- Extracellular signal-regulated kinaseMSP Methylation specific-Polymerase Chain ReactionNCBI National center for biotechnology information

Ptdins(3,4,5)P3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Rho Ras homolog gene family Rac1 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thống kê của GLOBOCAN, năm 2012 ở Việt Nam, ung thư vòm họng xếp thứ 8 trong số các bệnh ung thư phổ biến nhất. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư vòm họng ở nam chiếm khoảng 66% trong tổng số các trường hợp mắc bệnh. Có 2.885 trường hợp bệnh nhân tử vong do ung thư vòm họng, chiếm 3% trong tổng số trường hợp tử vong do ung thư.

Năm 2008, Chou và cộng sự phát hiện có nhiều yếu tố dẫn đến ung thư vòm họng như: yếu tố môi trường, yếu tố di truyền, virus, đột biến gen… Sự methyl hóa DNA được phát hiện trong mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư vòm họng trước

khi điều trị có tỉ lệ methyl hóa lần lượt trên gen CDH1 (Epithelial-cadherin) chiếm 46%, gen p16INK4α chiếm 42%, gen DAPK chiếm 20%, p15 chiếm 20% và gen

RASSF1A chiếm 5%.

CDH1 (Epithelial-Cadherin – E-cadherin) là một gen ức chế khối u, có vai trò

quan trọng trong tế bào thường và tế bào ung thư. E-cadherin mã hóa cho một loại

protein màng có chức năng liên kết và giữ các tế bào dính lại với nhau, ngồi ra gen cịn có chức năng truyền tín hiệu điều tiết các quá trình cơ bản của tế bào như: di

chuyển, tăng sinh, biệt hóa và q trình apoptosis. Ở tế bào bình thường, gen

E-cadherin là một trong những gen cần thiết chỉ sự hình thành và duy trì biểu mơ. Nhưng

ở tế bào bệnh, E-cadherin đóng vai trị quan trọng trong việc chuyển hóa các tế bào

ung thư ác tính bằng cách truyền tín hiệu giữa các tế bào, đặc biệt trong sự phát triển của khối u. Năm 2003, Tsao S.W. và cộng sự đã công bố rằng sự methyl hóa vùng

promoter của gen E-cadherin đã được tìm thấy từ 11-83% của các mẫu khối u, riêng

ung thư vòm họng chiếm 68%.

Từ những dẫn liệu liên quan đến ung thư vòm họng cũng như sự biểu hiện, vai

trò chức năng của gen E-Cadherin đó là tiền đề xây dựng đề tài “ĐÁNH GIÁ SỰ

METHYL HÓA GEN E-CADHERIN TRÊN UNG THƯ BIỂU MÔ VỊM

HỌNG

.

” với mục đích đánh giá sự methyl hóa của gen E-cadherin để chẩn đốn tình

trạng tiến triển bệnh ung thư vịm họng. Tình trạng methyl hóa của gen E-cadherin có

thể làm dấu chứng sinh học tiềm năng ứng dụng trong việc chẩn đốn sớm ung thư vịm họng.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

1.1.2. Tình hình ung thư vịm họng trên thế giới và Việt Nam. 1.1.2.1. Tình hình trên thế giới.

Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới WHO từ năm 2007 đến năm 2012, trên tồn thế giới ước tính có khoảng 14,1 triệu trường hợp mới mắc bệnh ung thư, 8,2 triệu trường hợp tử vong và 32,6 triệu trường hợp bệnh nhân sống cùng với ung thư. WHO dự đoán rằng số trường hợp mắc bệnh ung thư sẽ tăng đến 22 triệu trường hợp vào năm 2032 [54]. Ở các nước đang phát triển, tỉ lệ nam giới mắc bệnh ung thư cao hơn 15% so với các nước nghèo, ở nữ giới là 8,0% so với các nước nghèo [54]. Trong số 23 loại ung thư được WHO thống kê, ung thư phổi chiếm tỉ lệ cao nhất, có hơn 1,2 triệu trường hợp ung thư chiếm 16,8% trong tổng số các trường hợp ung thư trên thế giới. Ung thư vòm họng xếp thứ 19, có 60.896 trường hợp và chiếm 0,8% trên tổng số các trường hợp ung thư. Số trường hợp tử vong do ung thư vòm họng là 35.756 trường

hợp chiếm 0,8% trong tổng số các trường hợp tử vong do ung thư.

1.1.2.2. Tình hình tại Việt Nam.

Theo thống kê Globocan, vào năm 2012, bệnh ung thư vòm họng được xếp thứ 8 về mức độ nguy hiểm trên 15 loại ung thư phổ biến ở Việt Nam, với 4.931 trường hợp nhiễm bệnh chiếm 3,9% trên tổng số các bệnh ung thư. Tỉ lệ nam giới mắc bệnh ung thư vòm họng cao hơn nữ giới, cụ thể có 3.301 trường hợp nam giới mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm 4,7%, tỉ lệ này ở nữ giới chiếm 3% trong tổng số các trường hợp ung thư ở Việt Nam. Trong số 2.885 ca tử vong do ung thư ung thư vịm họng có 1.931

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

trường hợp tử vong ở nam giới, chiếm 3,3% trong tổng số các ca tử vong do ung thư ở Việt nam, trong khi đó có 954 trường hợp tử vong ở nữ chiếm 2,7% trong tổng số các ca tử vong do ung thư. Ngồi ra, số trường hợp mắc bệnh ung thư vịm họng được dự đốn trong vịng 5 năm tới, tính từ năm 2012, sẽ là 12.177 trường hợp chiếm 5,7% trên

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

1.1.3.2. Nguyên nhân gây bệnh ung thư vịm họng.

Trên thế giới có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về ngun nhân gây bệnh UTVH [7][10][35][39]. Theo nghiên cứu của Lo K.W. và cộng sự (2004) về nguyên nhân gây UTVH bao gồm các ngun nhân chính sau do yếu tố mơi trường, do nhiễm virus và do yếu tố di truyền [35].

a/ Yếu tố môi trường.

Theo nghiên cứu của Yu M.C. và cộng sự năm 2002, các loại thực phẩm truyền thống như cá muối, trứng muối, rau cải muối chua và một số loại thực phẩm khác có chứa nitrosamine, là yếu tố quan trọng gây UTVH [51]. Ngoài ra, yếu tố phi thực phẩm như thuốc lá hoặc tiếp xúc với formaldehyde, hai yếu tố này đang được xem xét vì nghi ngờ chúng cũng là nguyên nhân gây bệnh UTVH [35]. Theo nghiên cứu của Nurhantari và cộng sự (2003) nghiên cứu trên 56 mẫu UTVH trong đó có 36 mẫu ung thư của nam giới chiếm 64% và 26% của phụ nữ [37].

b/ Nhiễm Epstein Barr virus.

Epstein-Barr Virus (EBV) thuộc họ Herpesvirus gây bệnh ở người. Bộ gen của virus ở dạng mạch đơi có chiều dài là 184-kb, mã hóa khoảng 100 protein [23]. Theo nghiên cứu của Bruce J.P. và cộng sự (2015), có ít nhất 90% trường hợp mắc bệnh UTVH liên qua đến sự xâm nhiễm của virus EBV [7]. Cơ chế sinh bệnh ung thư vòm họng của EBV rất phức tạp, liên quan đường truyền tín hiệu và những thay đổi trong biểu hiện của nhiều loại protein, cụ thể như q trình điều hịa chu trình chết của tế bào (apoptosis), quá trình tăng sinh tế bào và khả năng kết dính đã bị rối loạn [10].

c/ Yếu tố di truyền- sự thay đổi biểu sinh (Epigenetics).

Sự thay đổi di truyền là nguyên nhân gián tiếp gây UTVH [35]. Ví dụ, gen p53

có chức năng ức chế khối u. Sự thay đổi trong cấu trúc gen dẫn đến gen mất chức năng ức chế khối [14]. Sự thay đổi biểu sinh bao gồm sự methyl hóa DNA, biến đổi protein histone và biến đổi microRNA [12]. Hiện tượng methyl hóa của gen sinh u (oncogene) và gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) là một nguyên nhân quan trọng gây bệnh

UTVH. Các gen như RASSF1A, p16INK4α có chức năng ức chế khối u nhưng sự methyl hóa khác thường (hypomethylation) phá vỡ nhiều chức năng của gen, dẫn đến sự tăng sinh bất thường của tế bào [28][30].

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.2. Các giai đoạn của bệnh UTVH.

Bệnh UTVH tiến triển qua bốn giai đoạn [55]. Giai đoạn 1: Ung thư hình thành trong vịm họng hoặc đã di căn vào vùng hầu họng hay khoang mũi. Giai đoạn 2: Giai đoạn này tế bào ung thư di căn sang các khu vực khác xung quanh vòm họng (được gọi là parapharyngeal) nhưng tế bào ung thư chưa di căn vào xương. Giai đoạn 3: Các

tế bào ung thư đã di căn vào xoang mũi hoặc vào xương gần mũi họng.

Hình 1.3. Giai đoạn 3 của Ung thư vịm họng.

Giai đoạn 4: Khối u di căn ngày một nhiều hơn vào các khu vực sau: vào hệ thống thần kinh trong não (Các dây thần kinh gần mũi họng và kiểm soát chuyển động mắt, khứu giác…), phần dưới cổ họng, mắt hay các mô xung quanh, các không gian gần xương má và răng.

1.3. Epigenetics.

1.3.1. Định nghĩa về Epigenetics.

Epigentics là những biến đổi về mặt di truyền trong biểu hiện của gen không liên quan đến những biến đổi về trình tự DNA [12][10][50] Các kiểu thay đổi epigenetics như methyl hóa DNA, biến đổi histone và sự can thiệp của các phân tử nhỏ như miRNA, RNAi (RNA interference-RNA can thiệp) [40]. Epigenetics thay đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể dẫn đến thay đổi quá trình phiên mã của các gen trong bộ gen [12]

1.3.2. DNA methyl hoá.

Methyl hóa DNA là hiện tượng gắn thêm một gốc methyl –CH3 ở vị trí carbon số 5 của vòng cytosine đứng trước guanines (được gọi là dinucleotide) thành dạng 5-methylcytosine bằng sự thay đổi của liên kết cộng hóa trị. DNA methyl hóa được hình thành và duy trì bởi các enzyme xúc tác như enzyme DNA methyltransferases (DNMTs) [15]. Quá trình methyl hóa DNA xảy ra ở vị trí C trong dinuleotide CpG.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Các CpG không phân bố rộng khắp bộ gen người mà thường tập trung thành các đảo CpG. Các đảo CpG này có kích thước khoảng 0,5-4kb và thường được tìm thấy trong vùng 5’-promoter kéo dài đến exon đầu tiên của gen (nơi khởi đầu phiên mã) [15][29].

Hình 1.4. Q trình xúc tác methyl hóa DNA của ezyme DNA methyltransferase [52]. Sự methyl hóa cytosines được thực hiện bởi enzyme DNA methyltransferase chuyển hóa nhóm methyl từ chất cung cấp methyl S-adenosylmethinonine (SAM) đến vị trí C5 của cytosine tạo ra 5-methylcytosine và S-adenosylhomocystine (SAH) [1]. Hệ enzyme sử dụng xúc tác cho phản ứng methyl hóa DNA gồm ba loại enzyme DNA methyltransferase 1, 3A, 3B (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) [16]. Nhóm enzyme

DNA methyltransferase (DNMTs) gồm hai nhóm de novo methyltranfarase (các chuỗi

DNA bị methyl hóa tại các dinucleotide CpG) và nhóm remain methyltranfarase (một mạch DNA bị methyl hóa tại các dinucleotide CpG). Trong đó DNMT1 thuộc nhóm

remain methyltranfarase, DNMT3A và DNMT3B thuộc nhóm de novo

methyltranfarase [1][15][16].

1.4. Tổng quan về gen CDH1 (Epithelial-Cadherin). 1.4.1. Gen Epithelial-Cadherin (E-Cadherin).

Gen nằm ở vị trí 16q22.1 trên nhiễm sắc thể số 16 của bộ gen người. Gen

E-cadherin có chiều dài 105.250bp. Mã số truy cập trên Genbank là NG_008021.

Hình 1.5. Vị trí gen E-cadherin trên nhiễm sắc thể số 16 [56].

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

cadherin hay còn gọi là CDH1 thuộc họ adherin, là một gen ức chế khối u. cadherin có chức năng kết dính (adhesion), chức năng này quan trọng trong tế bào

E-bình thường và tế bào ung thư. Gen E-cadherin mã hóa cho glycoprotein xuyên màng

và liên kết màng. Các protein này tham gia vào cấu trúc liên kết giữa các tế bào điều này được xem như “chìa khóa” cấu tạo nên hình thái của các cơ quan trong cơ thể [6].

Trong tế bào bình thường, E-cadherin có vai trị quan trọng trong việc hình thành và duy trì cấu trúc của biểu mô [22]. Trong tế bào ung thư, E-cadherin có khả năng

liên kết các tế bào ung thư lại với nhau tạo thành khối mô bền vững (adenoma), việc này giúp hạn chế sự di căn của các tế bào. Khi tế bào ung thư chuyển từ lành tính sang ác tính, khả năng liên kết giữa các tế bào trong khối mơ khơng cịn nữa, tế bào ung thư rời khỏi khối mô ban đầu di chuyển theo hệ bạch huyết và xâm lấn vào các mô xung quanh, hiện tượng này gọi là hiện tượng di căn của tế bào ung thư ác tính [5][11][40].

1.4.2. Cấu tạo của protein E-cadherin.

E-cadherin là một glycoprotein xuyên màng làm trung gian liên kết cho các tế bào bình thường và như một chất kiềm chế sự di căn trong các tế bào khối u. E-cadherin bao gồm các sợi protein, tiểu phần α-catenin, β-catenin, γ-catenin, p120 CAS ở trong nội bào. Bên ngồi khoảng khơng gian ngoại bào là các tiểu phần CAD được nối với nhau tại vị trí liên kết với ion Ca2+, đầu N của tiểu phần CAD chứa các motif HAV là nơi để tương tác với các phân tử E-cadherin khác ở các tế bào lân cận [11]. Việc này giúp các tế bào liên kết với nhau một cách chặt chẽ.

Các phân tử E-cadherin liên kết với nhau theo kiểu “khóa kéo” (zipper-like

fashion). Ví dụ như: E-cadherin sẽ liên kết chọn lọc với E-cadherin và đầu amin 113

của hai cấu tử E-cadherin đóng vai trị quan trọng cho liên kết màng. Các catenin tương tác với các cadherin thông qua domain của tế bào chất. Sự biến đổi cấu tạo phân tử của cadherin làm mất liên kết với catenin làm cho phức hợp này không thể tương tác với sợi actin, sự tương tác giữa các protein cadherin và khung xương của tế bào (cytoskeletal) thông qua catenin tạo tính ổn định cao trong liên kết giữa các tế bào [27].

Mức độ biểu hiện E-cadherin tỷ lệ nghịch với sự tiến triển bệnh ung thư, khối u UTVH chuyển sang di căn khi mức độ biểu hiện mRNA E-cadherin và protein thấp hơn các khối u lành tính [11]. Việc ức chế hoạt động của E-cadherin ở UTVH là do sự methyl hóa vượt mức của vùng promoter xung quanh đảo CpG của phân tử E-cadherin [26].

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Hình 1.6. Cấu trúc của E-cadherin và các con đường tín hiệu [46].

1.4.3. Chức năng của gen E-cadherin.

Trong tế bào bình thường E-cadherin đóng vai trị thiết yếu trong sự hình thành, duy trì cấu trúc chức năng kết dính của [5]. E-cadherin tham gia kiểm sốt q trình hình thành và di chuyển của tế bào Langerhans [6]. Ngồi ra, E-cadherin cịn có chức

năng ức chễ hệ thống cảm ứng tolerogenic trong tủy xương có nguồn gốc từ tế bào

đuôi gai (DCs) [6].Ở tế bào ung thư, E-cadherin làm chậm quá trình di căn của khối u

bằng cách liên kết chặt chẽ các tế bào ung thư lại với nhau [54]. Phức hợp catenin của

E-cadherin trong tế bào chất tham gia vào đường truyền tín hiệu nội bào như

Wnt/β-catenin, PI3K/Akt, Rho GTPase và tín hiệu NF-κB [5][6][11].

1.4.3.1. E-cadherin điều hịa tín hiệu Wnt/β-catenin.

Khi ligand Wnt không liên kết với thụ thể Frizzled và đồng thụ thể LRP5 hoặc LRP6 thì β-catenin bị phosphoryl hóa bởi CK1 kinase và GSK-3β kinase. Tuy nhiên, khi tín hiệu Wnt liên kết với thụ thể, q trình phosphoryl hóa β-catenin sẽ bị ức chế, dẫn đến sự tích tụ β-catenin tự do trong tế bào chất. β-catenin tự do sẽ di chuyển đến nhân, hình thành phức hợp các yếu tố phiên mã hoạt động và biểu hiện gen Wnt mục tiêu [43].

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Hình 1.7. Con đường điều hịa tín hiệu Wnt/β-catenin [11].

1.4.3.2. E-cadherin điều hịa tín hiệu PI3K/Akt.

PI3K tham gia vào sự sống, sự biệt hóa và khả năng vận động của tế bào. Kích hoạt PI3K trung gian thường được liên kết với protein kinase B hoặc Akt. Tại các vị trí

liên kết của E-cadherin sản xuất ra PtdIns(3,4,5)P3 kích hoạt chọn lọc các protein chứa

vùng domain đồng đẳng pleckstrin, bao gồm cả Akt. Sự kích hoạt PI3K/Akt song song với điều chỉnh giảm tín hiệu MEK/ERK thúc đẩy ngăn chặn quá trình tăng trưởng, biệt hóa và chu trình tế bào [31].

Sự hiện diện của E-cadherin ức chế PI3K/Akt tín hiệu, giảm Cyclin D1 (CD1) và tăng hàm lượng p27Kip1 là ức chế sự tăng trưởng của tế bào. Giảm sự biểu hiện của E-

cadherin làm tích tụ β-catenin trong nhân kích hoạt phiên mã dẫn đến tăng Egr1, biểu

hiện phosphatase and tensin homolog (PTEN) và giảm tín hiệu PI3K/Akt. Để kích hoạt tín hiệu PI3K/Akt phải cố định được β-catenin bằng cách ức chế GSK3β, cho phép tăng trưởng tế bào .

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Hình 1.8. Con đường điều hịa tín hiệu PI3K/Akt [32].

1.4.3.3. E-cadherin điều hòa hoạt động Rho-family GTPase.

Nhóm Rho-family GTPases bao gồm 20 tín hiệu phân tử nội bào, trong đó tín hiệu có thơng tin tốt nhất là RhoA, Rac1 và Cdc42 [6]. Trong phức hợp cấu trúc catenin, những p120-catein tự do trong tế bào chất có khả năng ức chế RhoA nhưng

khả năng này bị mất đi khi p120-catenin liên kết với E-cadherin. Mặt khác, mất biểu hiện E-cadherin và giải phóng p120-catenin kích hoạt tín hiệu Rac1-MAPK thúc đẩy

quá trình biến đối tế bào [45].

Hình 1.9. Con đường điều hòa hoạt động Rho-family GTPase [19].

1.4.3.4. E-cadherin ức chế hoạt động của NF-κB.

Khi E-cadherin và phức hợp catenin biểu hiện vượt mức làm giảm hoạt động của

NF-κB. Nguyên tắc kích hoạt con đường NF-κB liên quan đến dimer p65 và p50. Các yếu tố phiên mã NF-κB là yếu tố chính quy định gen kháng viêm trong các đại thực

bào và CDs. Trong tế bào biểu mô, E-cadherin và phức hợp catenin ức chế mạnh chức

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

catenin như vị trí đặc hiệu. Bất hoạt E-cadherin và p120-catenin kích hoạt được hoạt

động của NF-κB và quá trình viêm [6].

1.4.4. Sự methyl hóa gen E-cadherin.

Methyl hóa DNA trong vùng promoter của gen E-cadherin có liên quan đến việc

quy định biểu hiện của gen. Q trình methyl hóa bất thường dẫn đến việc gen sự im lặng, thơng qua đó ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình phiên mã [34].

Hình 1.10. Methyl hóa DNA và điều hịa biểu hiện của gen [41].

Sự methyl hóa bất thường của gen E-cadherin làm mất tính kết dính biểu mơ của

E-cadherin bằng cách phá vỡ sự liên kết giữa các tế bào dẫn đến di căn khối u [38].

1.5. Phương pháp phát hiện methyl hóa DNA.

Methylation specific-Polymerase Chain Reaction (MSP) là phương pháp dùng để phát hiện sự methyl hóa bất thường trên gen [24]. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao với bất kỳ vị trí CpG nào trên đảo CpG. Phương pháp MSP có thể nhanh chóng xác định tình trạng methyl hóa của bất kỳ nhóm CpG trên đảo CpG [24]. MSP thực chất là phương pháp PCR nhưng khác ở chỗ mạch khuôn DNA trong MSP được xử lý sodium bisulfite và khuyếch đại với cặp mồi methyl và unmethyl. Quá trình xử lý sodium bisulfite được sử dụng để phân biệt giữa cytosine và 5-methylcytosine trong DNA. Quá trình biến đổi này sẽ thay đổi Cytosine khơng bị methyl hóa thành Uracil, trong khi đó tại vị trí 5-methylcytosine khơng bị biến đổi [22].

Tất cả các phương pháp biến đổi bisulfite đều cần đến phương pháp khếch đại PCR để kiểm tra kết quả [2]. Dựa trên sản phẩm khuếch đại có thể phân biệt đươc DNA có bị methyl hóa hay khơng bị methyl hóa. Đặc biệt, mồi được sử dụng trong

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

phương pháp MSP được thiết kế có nhiều cytosine, đảo CpG và vị trí bắt cặp CpG ở đầu 3’ của mồi.

Hình 1.11. Phương pháp MSP

Trên mạch DNA bị methyl hóa, tại vị trí cytosine thuộc CpG, cytosine được gắn thêm gốc –CH3 thành dạng 5-methylcytosine. Sau quá trình biến đổi bisulfite, các cytosine có gắn –CH3 khơng bị methyl hóa nên mồi methyl được thiết kế đặc hiệu để bắt cặp với vùng CpG có nhiều cytosine bị methyl hóa nhất. Ngược lại, trên mạch DNA khơng bị methyl hóa, vị trí cytosine sẽ chuyển thành uracil sau quá trình biến đổi bisulfite, mồi unmethyl đặc hiệu với vùng trình tự khuếch đại được sản phẩm unmethyl.

Hình 1.12. Cơ chế biến đổi bisulfite .

1.6. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).

PCR là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp nhanh một đoạn

DNA với độ nhạy rất cao. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA

polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh [53]

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành dạng mạch đơn. - Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.

Hình 1.13. Nguyên tắc của phương pháp PCR.

1.7. Phương pháp Realtime.

Theo Heil C.A. và cộng sự (1996) đã công bố rằng phương pháp Real time PCR là phương pháp định tính gen mục tiêu một cách chính xác. Realtime khơng u cầu PCR xử lí mẫu trước đó để ngăn ngừa sự tạp nhiễm trong quá trình thực hiện PCR do đó kết quả kiểm tra Realtime sẽ nhanh hơn, tiết kiệm thời gian và chính xác hơn phương pháp định lượng thông thường [25].

Ngun tắc định tính bằng Realtime dựa vào mẫu dị và hai tín hiệu huỳnh quang là đầu phát huỳnh quang (FAM) và đầu dập tắt (TAMRA). Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, đầu phát huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ đầu dập tắt huỳnh quang. Trong quá trình kéo dài của chu kỳ PCR, các đầu dò được phân cắt do sự hoạt động của enzyme DNA polymerase 5’-3’, đầu phát huỳnh quang bị phân cắt giải phóng ra mơi trường một lượng huỳnh quang, các bản sao càng nhiều dẫn đến lượng quang phổ phát xạ huỳnh quang càng lớn [25]. Ngoài ra, theo công bố của Valasek M.A. và cộng sự (2005), điểm đặc biệt của Realtime-PCR chính là khả năng theo dõi quá trình khuếch

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

đại DNA trong suốt thời gian thực hiện bằng các công cụ và thành phần hóa học sử dụng trong phản ứng. Chất hóa học đặc biệt được thường dùng để nhuộm DNA như SYBR Green I, EtBr,… [47]

1.8. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.

Theo nghiên cứu của Ganji S.M và cộng sự (2014) về sự methyl hóa của gen

E-cadherin trên tế bào vảy ung thư dạ dày, nhóm tác giả sử dụng 44 mẫu tế bào vảy ung

thư, phát hiện sự methyl hóa bằng phương pháp MSP và định lượng bằng phương

pháp Real Time PCR. Kết quả cho thấy 24/44 mẫu có gen E-cadherin bị methyl hóa,

chiếm 54,4% trong tổng số tế bào nghiên cứu [21]. Cùng hướng nghiên cứu đó, Asokan G.S. và cộng sự đã khảo sát 10 mẫu tế bào vảy ở vùng thực quản, cũng sử

dụng phương pháp MSP đã phát hiện 6/4 có gen E-cadherin bị methyl hóa, chiếm 60%

trong tổng số mẫu [2].

Năm 2008, Ayadi W. và cộng sự đã nghiên cứu về sự methyl hóa bất thường tại

vùng promoter của các gen p16INK4α, DLEC1, BLU và E-cadherin trên mẫu sinh thiết

UTVH từ các bệnh nhân ở Tunisian. Nhóm tác giả thu nhận 44 mẫu mô sinh thiết, tiến

hành kiểm tra bằng phương pháp MSP. Kết quả cho thấy rằng, 35/44 mẫu có gen

E-cadherin bị methyl hóa vùng promoter, chiếm 79,5% trong tổng số mẫu nghiên cứu

[3]. Theo nghiên cứu của Marsit C.J. và cộng sự (2008), nhóm tác giả thu nhận 340 mẫu tế bào vảy ung thư, sử dụng phương pháp MSP để phát hiện. Kết quả có 112 mẫu

có gen E-cadherin bị methyl hóa, chiếm 33% trên tổng số mẫu khảo sát [36].

Một nghiên cứu khác của Chang H.W. và cộng sự (2000) về việc đánh giá sự methyl hóa của các gen gây ức chế khối u được xem như là một dấu chứng bằng các mẫu như dịch ở miệng và hầu họng, mẫu dịch phết, mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân UTVH. Nhóm tác giả sử dụng phương pháp MSP để kiểm tra. Kết quả cho thấy rằng,

tần số methyl hóa vượt mức gen E-cadherin trong mẫu sinh thiết là 53% (16/30), mẫu

dịch phết là 27% (10/37), mẫu dịch ở vùng miệng và hầu họng là 43% (19/43), mẫu máu ngoại vi là 53% (16/30) và một số gen khác [8].

Ngoài ra, năm 2004 nhóm nghiên cứu của Wong T.S và cộng sự đã sử dụng phương pháp Realtime PCR để định lượng methyl hóa vượt mức của các gen mục tiêu trên bệnh ung thư vòm họng. Trong 41 mẫu bệnh phẩm ung thư và 43 mẫu huyết thanh bình thường sự methyl hóa của gen E-cadherin lần lượt là 46% và 9% [48].

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1. Vật liệu.

Các phần mềm được sử dụng phục vụ cho việc khảo sát trong nghiên cứu:

2.1.1. Phần mềm offline.

Phần mềm Annhyb-4.944, phiên bản năm 2011: kiểm tra vị trí bắt cặp và sản

phẩm tạo thành của mồi.

Phần mềm Chromas Lite: đọc kết quả giải trình tự để phân tích với ngân hàng

gen.

Phần mềm MedCalc: phân tích tần số methyl hóa trong thực nghiệm.

2.1.2. Phần mểm online.

Trang web www.idtdna.com: xác định các thông số của mồi.

Trang web www.tfbind.hgc.jp: xác định các nhân tố phiên mã.Trang web

www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed: khai thác dữ liệu.

Trang web www.ncbi.nlm.nih.gov: khai thác dữ liệu, lấy trình tự gen khảo sát. Trang web www.genecards.org: thu nhận trình tự promoter của gen.

Trang web www.urogene.org/methprimer: để xác định các đảo CpG và thu nhận trình tự đã biến đổi bisulfite.

Trang web www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast: so sánh trình tự với ngân hàng cơ

sở dữ liệu NCBI, tìm trình tự tương đồng

2.1.3. Bộ mẫu.

Mẫu mô sinh thiết và mẫu dịch phết từ bệnh nhân được chẩn đốn ung thư vịm

họng làm mẫu khảo sát sự methyl hóa của gen E-cadherin. Mẫu đã được chẩn đốn

dương tính với ung thư vịm họng bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Mẫu dịch phết từ người không mắc bệnh (đã được chẩn đốn là âm tính với ung thư vòm họng) được dùng làm mẫu đối chứng. Mẫu sau khi lấy từ bệnh nhân được bảo quản trong dung dịch PBS trữ ở -20oC. Nguồn mẫu được cung cấp bởi bệnh viện Chợ Rẫy – 201B Nguyễn Chí Thanh, Phường 12, Tp.Hồ Chí Minh, Việt Nam.

2.1.4. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất. 2.1.4.1. Dụng cụ

Các dụng cụ thơng thường trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Các dụng cụ chính bao gồm: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, pipetteman, đầu típ, ống đong, erlen,…

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

2.1.4.2. Thiết bị

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

Máy lý tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức Bộ điện di DNA (Biorad)

Bể ổn nhiệt (Multitemp III) Cân kỹ thuật (Satorious, Đức) Tủ hút khí độc (Ascent Max)

Máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS, Smart Spec, Biorad) Máy luân nhiệt (My-Cycle Thermal, Biorad)

Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, Biorad) Lị vi sóng (Sharp)

2.1.4.3. Hóa chất

a. Hóa chất cần thiết cho quy trình tách chiết:

Tris-HCl pH 1M. EDTA 0,5M. SDS 10%.

NaCl 0,5M (đã hấp). Dung dịch H2O (đã hấp). Proteinase K 1mg/ml.

PCI: Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25/24/1). TE 1X buffer (Tris 1M pH 8,0 và EDTA 0,5M). Ethanol 70%.