nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của dịch chiết bacillus subtilis kp3 trên mô hình tế bào

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM </b>

------

<b>BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP </b>

<i>Đề tài:</i>

<b>NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA </b>

<i><b>CỦA DỊCH CHIẾT BACILLUS SUBTILIS KP3 </b></i>

<b>KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC </b>

<b>CHUYÊN NGÀNH: VI SINH- SINH HỌC PHÂN TỬ </b>

CBHD: PGS. TS Trần Cát Đơng SVTH: Phan Thị Diệu

MSSV: 1253010054

Khóa: 2012 - 2016

<i><b>Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016</b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i>

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS Trần Cát Đông và Ths. Vũ Thanh Thảo đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em kiến thức chuyên môn cũng như kiến thức thực tế trong suốt q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã dạy em những kiến thức, bài học quý báu để làm hành trang bước vào tương lai.

Em cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Nguyễn Ngọc Phương, chị Dương Thị Hoài Mến và các anh chị, các bạn trong Phịng thí nghiệm Vi sinh Cơng nghệ Dược đã giúp đỡ và cho em những lời khuyên bổ ích về chun mơn trong q trình nghiên cứu.

Con cảm ơn cha mẹ, gia đình đã ln là nguồn động lực cho con hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.

Sau cùng, em xin kính chúc sức khỏe và thành công đến quý thầy cô, anh chị và các bạn.

Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên

Phan Thị Diệu

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

1.1.2. Những yêu cầu của probiotic ... 4

1.2. Một số vi sinh vật thường sử dụng làm probiotic ... 5

1.3. Gốc tự do và chất chống oxi hóa (COXH) ... 6

1.3.1. Gốc tự do ... 6

1.3.2. Chất COXH ... 6

1.3.3. Vi khuẩn có khả năng sinh chất COXH ... 9

<i>1.4. Khái quát về Bacillus ... 10</i>

1.4.1. Phân loại và đặc điểm ... 10

<i>1.4.2. Bacillus sinh chất COXH ... 12</i>

1.5. Nghiên cứu về tác động của chất COXH trên mơ hình tế bào ... 14

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 16

2.1. Đối tượng nghiên cứu ... 16

2.2. Vật liệu, thiết bị ... 17

2.2.1. Mơi trường và hóa chất ... 17

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ... 17

2.3. Lên men thu nhận bào tử ... 18

<i>2.3.1. Thu nhận bào tử Bacillus subtilis KP3 ... 18</i>

2.3.2. Làm sạch bào tử ... 18

2.3.3. Định lượng số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống ... 20

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu ii </i>

2.4. Chiết chất COXH ngoại bào, nội bào ... 21

2.4.1. Chất COXH ngoại bào ... 21

2.4.2. Chất COXH nội bào ... 21

2.5. Khảo sát khả năng gây độc tế bào của các chất COXH... 22

2.6. Khảo sát hoạt tính COXH trên mơ hình tế bào ... 23

2.6.1. Chuẩn bị tế bào ... 23

2.6.2. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford ... 24

2.6.3. Xác định khả năng COXH tổng (FRAP) ... 24

2.6.4. Xác định hàm lượng glutathion (GSH) ... 25

2.6.5. Xác định hoạt tính enzym superoxid dismutase (SOD)... 26

2.6.6. Xác định hoạt tính glutathion peroxidase (GPx) ... 28

2.6.7. Xác định hoạt tính enzym catalase (CAT) ... 29

2.7. Phân tích thống kê ... 30

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 31

<i>3.1. Lên men thu bào tử Bacillus subtilis KP3 ... 31</i>

<i>3.1.1. Kiểm tra hình thái chủng B. subtilis KP3 ... 31</i>

<i>3.1.2. Thu nhận bào tử vi khuẩn B. subtilis KP3 ... 31</i>

3.2. Chiết chất COXH ngoại bào, nội bào ... 32

3.2.1. Chất COXH ngoại bào ... 32

3.2.2. Chất COXH nội bào ... 32

3.3. Khả năng COXH của chất thử trên mơ hình tế bào ... 33

3.3.1. Thử nghiệm độc tính của chất thử trên mơ hình tế bào ... 33

3.3.2. Hoạt tính COXH trên mơ hình tế bào ... 36

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu iii </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu iv </i>

HDL High-density lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng cao) IC<small>50</small> Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) MDA Malonyl dialdehyde

MTT 3-[4,5-dimethylthiazolyl-2]-2,5-diphenyltetrazolium bromide NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

OD Optical density (Mật độ quang) PBS Phosphat Buffer Saline

RNS Reactive Nitrogen Species (Gốc nitơ hoạt động) ROS Reactive Oxygen Species (Gốc oxy hoạt động) SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SOD Superoxide dismutase TPTZ Ferric tripyridyl triazine TSA Trypticase Soy Agar TSB Tryptic Soya Broth

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu v </i>

<b>DANH MỤC BẢNG </b>

Bảng 1.1 Các chủng vi sinh vật thường sử dụng làm probiotic ... 5

<i>Bảng 2.1 Khả năng COXH của B. subtilis KP3 ... 16</i>

Bảng 2.2 Quy trình định lượng protein ... 24

Bảng 2.3 Quy trình xác định hoạt tính chống oxi hóa tổng ... 25

Bảng 2.4 Quy trình xác định hàm lượng GSH ... 26

Bảng 2.5 Quy trình xác định hoạt tính SOD ... 27

Bảng 2.6 Quy trình xác định hoạt tính GPx ... 28

Bảng 2.7 Quy trình xác định hoạt tính CAT ... 29

<i>Bảng 3.1. Mật độ và tỉ lệ bào tử chủng Bacillus subtilis KP3 sau lên men ... 32</i>

<i>Bảng 3.2 Khối lượng chất COXH ngoại bào và nội bào của B. subtilis KP3 ... 33</i>

Bảng 3.3 Giá trị trung bình OD<small>570</small> và tỉ lệ ức chế tế bào MCF-7 trong thử nghiệm MTT (n=3) ... 34

Bảng 3.4. Chỉ số COXH tổng FRAP (nmol/mg pro), hàm lượng GSH (nmol/mg pro) và hoạt tính enzym SOD, GPx, CAT (U/mg pro) trên tế bào MCF-7 ... 36

<b>DANH MỤC HÌNH </b>

<i>Hình 3.1 Hình thái Bacillus subtilis KP3 ... 31</i>

<i>Hình 3.2 Bào tử Bacillus subtilis KP3 trước và sau khi tán siêu âm ... 33</i>

Hình 3.3 Giá trị OD<small>570</small> theo nồng độ của doxorubicin trong thí nghiệm MTT ... 35

Hình 3.4 Giá trị OD<small>570</small> theo nồng độ chất thử nghiệm trong thí nghiệm MTT ... 35

<b>DANH MỤC SƠ ĐỒ </b>

Sơ đồ 2.1 Quy trình lên men thu bào tử ... 18

Sơ đồ 2.2 Quy trình làm sạch bào tử ... 19

Sơ đồ 2.3 Quy trình kiểm tra mật độ vi sinh vật có trong mẫu ... 20

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 1

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

<i>Gốc tự do là những nguyên tử hay phân tử có một hoặc nhiều electron chưa bắt </i>

cặp ở lớp vỏ ngoài cùng [14]. Tất cả các phân tử sinh học trong cơ thể chúng ta đều có nguy cơ bị tấn cơng bởi các gốc tự do. Trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do ln được duy trì cân bằng với chất chống oxi hóa; tuy nhiên, khi tiếp xúc với các điều kiện hóa lý bất lợi, ơ nhiễm mơi trường, khói thuốc lá, tia cực tím, bức xạ, hóa chất độc hại hoặc khi cơ thể ở trạng thái bệnh làm tăng số lượng gốc tự do [18]. Sự mất cân bằng giữa các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxi hóadẫn đến “stress oxi hóa”. Stress oxi hóa là căn nguyên phát sinh bệnh tật. Hiện có hơn 60 loại bệnh ở người liên quan đến mất cân bằng gốc tự do; trong đó có ung thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm [18]. Do đó, việc nghiên cứu về chất chống oxi hóa nhằm hạn chế số lượng các gốc tự do để phòng ngừa một số bệnh tật là rất cần thiết.

Các chất chống oxi hóa ngoại sinh cung cấp cho cơ thể có thể được tổng hợp (butylated hydroxyanisol (BHA), butylated hydroxytoluen (BHT)), chiết xuất từ động thực vật (vitamin C, vitamin E, carotenoid, flavonoid,…) hay chiết xuất từ vi sinh vật như carotenoid, bacillithiol, peroxiredoxin. So với các chất chống oxi hóa tổng hợp, việc sử dụng các chất chống oxi hóa tự nhiên an tồn và ít tác dụng phụ hơn [49]. Trước đây, các chất chống oxi hóa tự nhiên thường được chiết từ thực vật, mặc dù chứa hàm lượng các chất chống oxi hóa cao nhưng lại dễ lẫn dung mơi hoặc tạp chất trong quá trình tách chiết, đồng thời chịu nhiều ảnh hưởng từ các yếu tố mơi trường, quỹ đất,… Trong khi đó, việc sử dụng nguồn cung cấp chất chống oxi hóa từ vi khuẩn có nhiều ưu thế hơn so với từ thực vật như: vi sinh vật có khả năng sinh chất chống oxi hóa phân bố rộng trong tự nhiên, dễ ni cấy với quy mơ lớn, ít tốn kém, tăng trưởng nhanh, tuy nhiên lại chưa được quan tâm nhiều. Các nghiên cứu gần đầy đã chứng

<i>minh Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus [44] có khả năng sinh chất chống oxi </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 2

<i>hóa có tác dụng trên in vitro, tuy nhiên các chất này có hoạt tính trên mơ hình tế bào hoặc trên in vivo hay khơng cần phải được chứng minh. </i>

Phịng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.

<i>HCM đã phân lập và sàng lọc được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis KP3 có hoạt tính chống oxi hóa, đồng thời có các đặc điểm của probiotic trên in vitro [3] [4]. Tuy nhiên, </i>

các nghiên cứu về tác động của các chất chống oxi hóa chiết từ chủng này trên mơ hình

<b>tế bào chưa được thực hiện. Do đó, tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng chống </b>

<i><b>oxi hóa của dịch chiết Bacillus subtilis KP3 trên mơ hình tế bào”. </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>1.1.1. Tác dụng của probiotic </b>

-

Ngăn ngừa và điều trị tiêu chảy

<i>Tiêu chảy do Rotavirus: nhiều nghiên cứu chứng minh hiệu quả của Lactobacillus rhamnosus GG và Bifidobacterium lactis BB-12, Lactobacillus reuteri SD 2222 trong </i>

phòng ngừa và điều trị tiêu chảy cấp tính gây ra bởi Rotavirus ở trẻ em [47, 57, 58]. Tiêu chảy liên quan đến kháng sinh: Tiêu chảy là tác dụng phụ thường gặp ở khoảng

<i>20% bệnh nhân dùng kháng sinh, một số chủng probiotic như Saccharomyces boulardii [47], Enterococcus faecium và Lactobacillus được chứng minh có hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy tốt </i>[40].

- Tác động trên <i>Helicobacter pylori </i>

<i>Helicobacter pylori là nguyên nhân chính gây viêm dạ dày mãn tính và loét dạ dày tá tràng. Các nghiên cứu cho thấy probiotic có tác dụng ức chế in vitro, cải thiện và làm giảm H. pylori gây viêm dạ dày ở động vật; ngoài ra probiotic còn làm giảm tác dụng phụ khi điều trị H. pylori bằng kháng sinh [35]. </i>

- Bệnh viêm đường ruột

Viêm loét dạ dày và bệnh Crohn là hai bệnh viêm ruột thường gặp. Nhiều nghiên cứu sơ bộ cho thấy phản ứng tích cực khi sử dụng probiotic trên bệnh nhân viêm ruột,

<i>làm giảm biểu hiện ex vivo [11],</i>tăng đáp ứng miễn dịch [38] và cải thiện các chức

<i>năng ruột [26]. Chủng Escherichia coli (Nissle 1917) cho hiệu quả tương đương </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 4 mesalazin trong ngăn ngừa tiến triển viêm loét đại tràng [17]. Tuy nhiên, ứng dụng probiotic trong bệnh Corhn thì chưa cho kết quả khả quan [55].

- Ung thư

Sự phát triển của khối u đường ruột có thể được phịng ngừa hoặc kìm hãm bởi Lactobacilli. Lactobacilli liên kết với các hợp chất gây đột biến và ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn chuyển đổi các tiền chất gây ung thư thành các chất gây ung thư trong đường ruột [11] đồng thời làm giảm nguy cơ ung thư nhờ khả năng cân bằng hệ vi sinh đường ruột, giảm β – glucoronidase và mức độ các chất gây ung thư khác [37].

- Nhiễm trùng phẫu thuật

<i>Các nghiên cứu cho thấy L. fermentum RC-14 có thể ức chế đáng kể sự nhiễm S. areus và vi khuẩn gây nhiễm trùng phẫu thuật [20]. </i>

- Viêm đường tiết niệu

<i>Các sản phẩm trao đổi chất khác nhau của Lactobacillus có tác dụng đối kháng, </i>

chống lại các mầm bệnh trong đường tiết niệu và âm đạo (biosurfactant ức chế sự bám dính; acid, bacteriocin và hydro peroxid ức chế sự tăng trưởng, các phân tử kết dính

<i>ngăn chặn sự lây lan của mầm bệnh) [51]. Hai chủng Lactobacillus GG và Lactobacillus rhamnosus GR-1 đã được chứng minh có hiệu quả bảo vệ đường tiết </i>

niệu [24, 55].

- Không dung nạp lactose

Ở những người thiếu hụt enzym β–galactosidase không thể hấp thu được lactose; gây đau bụng, đầy hơi, tiêu chảy và nơn ói. Khi bổ sung các chủng vi khuẩn sinh

<i>lactase như Lactobacillus, Bifidobacterium và Streptococcus vào chế độ ăn hàng ngày </i>

giúp tăng cường hấp thu lactose [52].

<b>1.1.2. Những yêu cầu của probiotic </b>

Một chủng vi sinh vật được dùng làm probiotic phải đáp ứng được các yêu cầu sau: - Là tế bào có khả năng sinh tồn cao, chịu được acid và pH thấp.

- Có khả năng tồn tại ở ruột non ngay cả khi chủng probiotic này không phải là chủng sẵn có trong ruột.

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 5 - Bám dính tốt vào niêm mạc ruột, tránh được tác động của nhu động ruột.

- Có khả năng tương tác hoặc gửi tín hiệu đến tế bào miễn dịch liên kết với ruột. - Nên có nguồn gốc từ con người.

- Không gây bệnh.

- Khả năng chịu đựng được các quá trình xử lý chế phẩm.

- Phải có khả năng ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất tại chỗ.

- Có khả năng đề kháng kháng sinh cao, càng nhiều kháng sinh càng tốt nhưng tuyệt đối khơng được có khả năng chuyển gen đề kháng này cho các vi khuẩn đường ruột, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh [27].

<b>1.2. Một số vi sinh vật thường sử dụng làm probiotic </b>

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu

<i>thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Bên cạnh vi khuẩn, nấm men Saccharomyces boulardii cũng được sử dụng như probiotic [29]. Một số chủng vi sinh </i>

vật thường sử dụng làm probiotic được tóm tắt trong Bảng 1.1 [8].

<b>Bảng 1.1 Các chủng vi sinh vật thường sử dụng làm probiotic Chi </b>

<i>B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. longum </i>

<i>Ent. faecalis Ent. faecium Lactoc. lactis Leuc. mesenteoides Ped. acidilactici Sporolactobacillus inulinus </i>

<i>Strep. thermophilus </i>

<i>Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus clausii Bacillus pumilus Escherichia coli Propionibacterium freundenreichii </i>

<i>Saccharomyces cerevisiae </i>

<i>LAB: Lactic acid bacteria </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 6

<b>1.3. Gốc tự do và chất chống oxi hóa (COXH) </b>

<b>1.3.1. Gốc tự do </b>

<i>Gốc tự do là những nguyên tử hay phân tử có một hoặc nhiều electron chưa bắt </i>

cặp ở lớp vỏ ngoài cùng [14],chúng chủ yếu có nguồn gốc từ oxi (Reactive oxygen species/ROS) và nitơ (reactive nitrogen species/RNS). Gốc tự do được tạo ra bởi các hệ thống nội sinh, ngoại sinh khác nhau hoặc được tạo ra khi cơ thể tiếp xúc với điều kiện hóa lý khác nhau hay ở các trạng thái sinh lý bệnh. Gốc tự do giúp duy trì cân bằng nội môi ở cấp độ tế bào trong các mô khỏe mạnh và đóng vai trị quan trọng như các phân tử tín hiệu, kết tập tiểu cầu, co giãn mạch máu,…Tuy nhiên, trong một số trường hợp làm tăng gốc tự do như stress thể chất hay tâm lí (thay đổi mơi trường sống, áp lực công việc, quá căng thẳng,…), mắc các bệnh nhiễm khuẩn, ảnh hưởng của ô nhiễm môi trường, tổn thương mô [31, 54],…gây ra sự mất cân bằng giữa các gốc tự do và hoạt động của chất COXH trong cơ thể gây ra các tác động xấu lên tế bào như hoạt hóa q trình apoptosis, peroxid hóa lipid, oxi hóa protein và ADN theo hướng bất lợi, liên quan đến lão hóa và một số bệnh trên người [18].

Một số gốc tự do thường gặp trong cơ thể: O<small>2•- </small>(gốc superoxyd), HO^•(gốc hydroxyl), RO^•(gốc alkoxyl), LO^•(gốc lipoxyl), LOO^• (gốc lipoperoxyd),…[49].

<b>1.3.2. Chất COXH </b>

Chất COXH là những chất phản ứng với gốc tự do tạo ra trong q trình oxi hóa nên ngăn cản hay làm chậm quá trình này. Chúng có tác dụng bắt giữ, làm giảm số lượng các gốc tự do và ức chế các phản ứng oxi hóa khác giúp bảo vệ cơ thể. Chất COXH khi hiện diện với lượng nhỏ, có thể làm chậm hoặc ức chế sự khởi đầu phản ứng oxi hóa bằng cách phản ứng với gốc lipid hoặc ức chế các bước dây duyền thông qua phản ứng với các gốc peroxyl hoặc gốc alkoxyl [53]. Dựa vào nguồn gốc, chất COXH được chia thành chất COXH nội sinh và chất COXH ngoại sinh.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 7 1.3.2.1. Chất COXH nội sinh

Hệ thống COXH nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào và giữ một vai trị quan trọng trong việc duy trì sự sống. Tế bào sống luôn bị tổn hại bởi các gốc tự do sinh ra trong các q trình sinh lí và các q trình bệnh lí. Do đó, việc duy trì hệ thống COXH nội sinh nhằm bảo vệ tế bào là điều cần thiết, trong đó quan trọng nhất là các enzym sau:

- Glutathion peroxidase (GPx)

Glutathione peroxidase xúc tác sự khử các hydro peroxid và peroxid hữu cơ trong tế bào. Phản ứng này đóng vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do. Các thành phần lipid của tế bào rất dễ phản ứng với các gốc tự do, dẫn đến sự peroxid hóa lipid. Enzym này ngăn cản việc hình thành các gốc tự do tạo thành trong các quá trình tổng hợp diễn ra trong cơ thể [19].

- Catalase

Catalase hiện diện hầu hết ở các tế bào của động vật có vú hoặc tế bào có hệ thống cytochrom ở động vật khơng có vú. Enzym này hoạt động mạnh nhất trong gan, thận.

Catalase xúc tác rất mạnh phản ứng phân hủy H<small>2</small>O<small>2</small> thành H<small>2</small>O và xúc tác phản ứng giữa H<small>2</small>O<small>2 </small>và chất cho proton (AH<small>2</small>) [18].

- Superoxid dismutase

Superoxid dismutase có hai đồng phân là Mn-SOD trong ty thể và Cu, Zn-SOD trong bào tương (trong đó Cu tham gia vào quá trình xúc tác, Zn tham gia vào sự ổn định enzym). SOD có nồng độ cao nhất ở gan, thận và hồng cầu, với chức năng xúc tác phản ứng “dismutation” superoxid thành H<small>2</small>O<small>2 </small>[18]:

2H<small>2</small>O<small>2 </small> catalase

<small> </small>2H<small>2</small>O + O<small>2 </small>

2H<small>2</small>O<small>2</small> + AH<small>2 </small> catalase

<small> </small>2H<small>2</small>O + A

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 8 O<small>2•-</small> + O<small>2•-</small> + 2H⁺ ^SOD H<small>2</small>O<small>2 </small>+ O<small>2 </small>

1.3.2.2. Chất COXH ngoại sinh

Chất COXH ngoại sinh có thể có nguồn gốc tự nhiên (vitamin C, vitamin E, flavonoid, beta caroten,…) hoặc được tổng hợp (vitamin C tổng hợp, vitamin E tổng hợp, butylated hydroxyanisol (BHA), butylated hydroxytoluen (BHT),…).

Vitamin C là một chất COXH mạnh hoạt động trong môi trường nước của cơ thể - cả nội bào lẫn ngoại bào. Vitamin C giúp ổn định cấu trúc collagen, tăng khả năng làm lành vết thương, giúp loại bỏ các gốc tự do, chống xơ vữa, tăng cường miễn dịch và ngăn cản sự xâm nhập của gốc tự do vào phân tử cholesterol HDL (high-density lipoprotein),... Ngoài ra vitamin C còn giúp phục hồi vitamin E từ dạng oxi hóa (dạng kích thích) về dạng khử, góp phần làm tăng hoạt tính COXH của vitamin E trong cơ thể [13, 49].

Vitamin E là một vitamin tan trong dầu có khả năng COXH cao, giúp ngăn chặn chuỗi phản ứng của các gốc tự do trong cơ thể, bảo vệ màng tế bào khỏi tổn thương bởi các gốc tự do, khả năng COXH của vitamin E chủ yếu là ngăn chặn sự peroxid hóa lipid [43].

Flavonoid là nhóm hợp chất polyphenol rất phổ biến trong giới thực vật; chúng có khả năng trung hòa các gốc tự do và làm chậm đáng kể sự khởi đầu của q trình peroxid hóa lipid, tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp do đó ngăn chặn sự peroxid hóa lipid, ức chế sự tạo thành các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzym như xanthin oxidase, cyclooxygenase, lipogenase,…[23].

Nhóm chất COXH tổng hợp tác động như những chất ngắt mạch phản ứng giữa các gốc tự do.

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 9

<b>1.3.3. Vi khuẩn có khả năng sinh chất COXH </b>

Hiện nay, sự gia tăng ngày càng nhiều của các gốc tự do do các tác nhân bên ngồi như khói thuốc, tia phóng xạ, tia tử ngoại,…làm tăng stress oxi hóa trong cơ thể, trong khi số lượng các chất COXH hiệu quả có thể bổ sung vào chế độ ăn hàng ngày lại rất hạn chế; do đó, việc tìm kiếm thêm các chất COXH mới là rất cần thiết và hữu dụng. Con đường sản xuất chất COXH từ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn chưa được quan tâm nhiều, mặc dù nguồn vi sinh vật có thể sinh chất COXH phân bố nhiều trong tự nhiên. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn làm nguồn cung cấp các chất COXH có nhiều ưu thế như vừa cung cấp chất COXH cho cơ thể, vừa có tác dụng của probiotic giúp nâng cao sức khỏe của vật chủ, dễ nuôi cấy với quy mơ lớn, tăng trưởng nhanh, ít tốn kém. Vì vậy, việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất chất COXH đang được quan tâm nghiên cứu.

Một số chất COXH từ vi khuẩn như carotenoid, bacillithiol, peroxiredoxin được biết đến như những chất có khả năng đánh bắt các gốc tự do, duy trì sự cân bằng oxi hóa khử trong tế bào, giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại các peroxyd độc hại [22] [28].

Một báo cáo về nghiên cứu của Wu và cộng sự (2014) phân tích khả năng COXH của vi khuẩn acid lactic (LAB). Hoạt động COXH của tế bào và các thành phần khác nhau của tế bào được đánh giá khả năng đánh bắt gốc tự do superoxid, việc giảm năng

<i>lượng và tổng khả năng COXH. Kết quả cho thấy LAB có khả năng bảo vệ in vitro tế </i>

bào Caco-2 khỏi tổn thương do stress oxi hóa gây ra bởi H<small>2</small>O<small>2</small> ở liều thấp (100 μmol/L) thông qua hoạt tính COXH của dịch ngoại bào và dịch ly giải tế bào. Dịch ngoại bào

<i>của Lactobacillus delbrueckii có hoạt động COXH cao nhất. Khả năng đánh bắt gốc tự </i>

do superoxid của dịch ly giải tế bào của chủng này là 42,4±0,32%, khả năng COXH tổng của dịch ngoại bào là 4,32±0,36 (U/mg protein) cao hơn đáng kể so với nhóm chứng âm (p<0,01) [62].

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 10

<i>Một báo cáo khác về hoạt tính COXH của xạ khuẩn Streptomyces eri 12 do Zhong và cộng sự (2011) nghiên cứu cho thấy Streptomyces eri 12 có khả năng đánh </i>

bắt gốc tự do DPPH là 4,54% ở nồng độ 30 µg/ml, 13,33% ở nồng độ 60 µg/ml, 31,91% ở nồng độ 120 µg/ml, 61,70% ở nồng độ 240 µg/ml, 81,26% ở nồng độ 360 µg/ml, giá trị EC<small>50</small> = 842,18±161,24 µg/ml. Tuy những giá trị này thấp hơn 200 lần so với chứng dương là vitamin C (EC<small>50</small> = 4,81 µg/ml) nhưng chứng tỏ xạ khuẩn cũng có tiềm năng sinh chất COXH [63].

Nghiên cứu của Lee và cộng sự (2010) trên một số chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ kim chi – thực phẩm lên men truyền thống của Hàn quốc cho thấy, trong

<i>điều kiện lên men, L. brevis BJ20 sinh chất COXH có hoạt tính mạnh, khả năng đánh </i>

bắt DPPH, superoxid và khả năng ức chế xanthine oxidase cao hơn so với chứng dương là BHA. Khả năng đánh bắt DPPH là 87,7% ở nồng độ 50 µg/ml, 92,8% ở nồng độ 100 µg/ml; hoạt động đánh bắt gốc superoxid đạt 96,2% ở nồng độ 100 µg/ml [33].

Như vậy, nguồn vi sinh vật sinh chất COXH rất đa dạng và có tiềm năng lớn trong việc sản xuất và cung cấp chất COXH tự nhiên cho con người.

<i><b>1.4. Khái quát về Bacillus </b></i>

<b>1.4.1. Phân loại và đặc điểm </b>

<i>Theo phân loại khoa học của Bergey (1948), Bacillus subtilis thuộc: </i>

Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae

<i>Chi: Bacillus [21] </i>

<i>Bacillus là trực khuẩn, Gram dương; sinh bào tử hiếu khí hay kỵ khí tùy ý; tuy nhiên </i>

một số chủng trong chu trình sống có thể chuyển dạng thành gram âm. Tế bào hình

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 11 que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 – 7 µm; thường di động, roi điển hình nằm ở hai bên thân. Có khả năng hình thành nội bào tử, một tế bào chỉ sinh một bào tử; bào tử dạng hình trụ, oval, trịn, thỉnh thoảng có hình bầu dục. Các bào tử có khả năng chịu nhiệt, lạnh, khô, bức xạ, chất khử trùng và men phân giải do có lớp vỏ bằng calci dipicolinat [1, 48].

<i>Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong một thời gian dài ở điều kiện bất </i>

lợi, nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn như đất, nước, thức ăn…

<i>Đặc điểm chung của chi Bacillus: </i>

- Có nội bào tử, hiếu khí có thể bắt buộc hay tùy ý. Dưới một số điều kiện đặc biệt (có HCO<small>3</small>^- trong bình kỵ khí hoặc mơi trường CO<small>2</small><i>), B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis và B. megaterium tạo ra một vỏ polypeptid nhìn thấy được khi nhuộm tế bào với xanh polychrom methylen. Tuy nhiên, cũng có một số lồi Bacillus khơng tạo bào tử như B. thermoamylovorans, B. halodenitrificans. </i>

- <i>Hình que, roi điển hình nằm ở hai bên thân, thường di động trừ B. anthracis và B. mycoides. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 12

<i><b>1.4.2. Bacillus sinh chất COXH </b></i>

Hiện nay, ngoài các nghiên cứu về khả năng sinh chất COXH từ vi khuẩn của các

<i>chủng thuộc chi Lactobacillus hay Bifidobacterium, một hướng nghiên cứu mới trong công tác tìm kiếm và phân lập chất COXH là các chủng Bacillus được quan tâm với </i>

một số nghiên cứu sau:

Theo nghiên cứu của Kadaikunnan và cộng sự (2015) thực hiện trên chủng

<i>Bacillus amyloliquefaciens kết quả cho thấy chủng này có khả năng sinh chất COXH, </i>

sinh trưởng trong điều kiện môi trường chứa 1,0 mM H<small>2</small>O<small>2</small>, khả năng đánh bắt gốc hydroxyl đạt 56,84%, khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH đạt 67,33% với 2,5 ml dịch vi khuẩn ở mật độ 10<small>8</small> CFU/ml [30].

Kumar và cộng sự (2013) đã chiết được hợp chất cyclo (d-Tyr-d-Phe) từ vi

<i>khuẩn Bacillus sp. N có hoạt tính chống khối u đáng kể trên tế bào ung thư phổi, giá trị </i>

IC<small>50</small> = 10 mM và hợp chất này không gây độc trên tế bào nguyên bào sợi bình thường ở nồng độ dưới 100 mM. Khả năng đánh bắt gốc tự do của cyclo (d-Tyr-d-Phe) là gần tương đương với hydroxyanisole butylated (BHA) [45].

<i> Trong nghiên cứu của Lee và cộng sự (2012) thực hiện trên Bacillus subtilis </i>

CSY191 phân lập từ doenjang (đậu tương lên men truyền thống của Hàn Quốc) cho thấy chủng này có khả năng sinh hợp chất surfactin. Kết quả thí nghiệm MTT cho thấy khả năng ức chế tăng trưởng của surfactin đối với dòng tế bào ung thư vú ở người (MCF-7) phụ thuộc vào liều, với IC<small>50</small> khoảng 10 µg/ml ở 24 h. Trong thời gian lên men với chủng CSY191, nồng độ surfactin tăng lên từ 0,3 mg/kg đến 48,2 mg/kg trong vòng 48 giờ lên men [34].

<i> Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2011) tiến hành trên Bacillus simplex XJ-25 </i>

được phân lập từ đất cát trong sa mạc Gurban Tonggut, Tân Cương, Trung Quốc có hoạt tính COXH mạnh, chủ yếu là các chất COXH ngoại bào. Hoạt tính COXH được đánh giá bằng các phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH, khả năng khử ion Fe<small>3+</small> và

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 13

<i>khả năng bảo vệ chống lại tổn thương màng lipid. Kết quả Bacillus simplex XJ-25 có </i>

khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH là 92,86% đối với dịch nuôi cấy và 8,00% đối với dịch chiết nội bào, hoạt tính khử Fe<small>3+</small> là 26 U/ml đối với dịch ngoại bào và 1,23 U/ml đối với dịch nội bào, khả năng bảo vệ màng lipid của dịch chiết ngoại bào là 41,81% [60].

Một nghiên cứu khác của Khaneja và cộng sự (2009) đã chứng minh nhiều

<i>chủng Bacillus như B. marisflavi, B. indicus, B. firmus, B. altitudinis và B. safensis có </i>

khả năng tạo bào tử giàu carotenoid cho hiệu quả kháng tia UV, bảo vệ tế bào tốt hơn các chủng khơng có khả năng này. Carotenoid là nhóm chất màu hữu cơ cấu trúc terpenoid được tìm thấy trong lục lạp và sắc lạp ở thực vật và các sinh vật quang hợp khác bao gồm một số nấm và vi khuẩn; ở thực vật, carotenoid có vai trị hấp thu năng lượng ánh sáng cho quang hợp, bảo vệ diệp lục không bị phá hủy bởi ánh sáng; đối với vi khuẩn, carotenoid giúp bảo vệ bào tử khỏi tác hại của bức xạ mặt trời [50].

Kết quả nghiên cứu của Newton và cộng sự (2009) cho thấy bacillithiol từ Bacilli có cấu trúc tương tự như mycothiol (MSH) - một thiol có vai trò thay thế glutathion ở nhiều vi khuẩn. Bacillithiol tham gia duy trì sự cân bằng oxi hóa - khử tế bào nhờ chức năng bảo vệ cystein khỏi các tác nhân oxi hóa [44].

Nghiên cứu của Kodali và cộng sự (2008) đã chứng minh exopolysaccharide

<i>(EPS) được chiết từ vi khuẩn B. coagulans RK-02 có hoạt tính COXH in vitro. EPS có </i>

hoạt tính đánh bắt gốc tự do tương đương với chứng dương là vitamin C và vitamin E. Tỉ lệ ức chế quá trình oxi hóa acid linoleic của EPS và vitamin C được xác định là 74% và 92%. Hoạt tính đánh bắt gốc tự do của EPS đạt 72,4%, thấp hơn chứng vitamin C nồng độ 500 µg/ml có hoạt tính đánh bắt 90%. Khả năng đánh bắt DPPH của EPS và vitamin C lần lượt là 82,2% và 92%; khả năng ức chế q trình peroxid hóa lipid là 53%, chỉ thấp hơn vitamin E 12% [32].

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 14

<b>1.5. Nghiên cứu về tác động của chất COXH trên mơ hình tế bào </b>

Hoạt tính COXH không thể xác định trực tiếp mà được xác định thông qua tác động của các chất COXH trong việc kiểm sốt mức độ oxi hóa trong qua trình oxi hóa. Các yếu tố của q trình oxi hóa bao gồm cơ chất, yếu tố oxi hóa, nhân tố khởi đầu, trung gian và sản phẩm cuối cùng; khả năng COXH có thể xác định thông qua một trong các yếu tố trên [10]. Hoạt tính COXH có thể xác định thông qua việc định lượng malonyl dialdehyde (MDA), sản phẩm cuối cùng của q trình peroxid hóa lipid. MDA được hình thành trong q trình oxi hóa như một sản phẩm của các gốc oxi tự do và được chấp nhận là một chỉ số của quá trình peroxid hóa lipid. Hoạt tính oxi hóa cũng có thể được xác định thông qua hàm lượng của các chất COXH nội sinh như glutathion (GSH) hoặc hoạt tính các enzym COXH trong tế bào như glutathion peroxidase (GPx), superoxid dismustase (SOD), catalase (CAT),… [9].

<i>Theo kết quả nghiên cứu của Li và cộng sự (2012) thực hiện trên Enterococcus faecium 1 (EF1) cho thấy chủng này có khả năng làm giảm tác hại của q trình oxi </i>

hóa và có tác động COXH trên dòng tế bào Caco-2 dưới điểu kiện stress oxi hóa cảm ứng bởi H<small>2</small>O<small>2</small>. Dịch ly giải tế bào sau 48h làm tăng khả năng COXH tổng, khả năng chống gốc superoxid tự do, hoạt tính CAT, SOD, GPx và làm giảm hàm lượng MDA, cụ thể hoạt tính SOD và hàm lượng GSH tăng lên 63,43% cao hơn so với chứng âm là 36,05% [36].

Một số tác nhân trị liệu ung thư bị giới hạn trong việc sử dụng do tác dụng gây độc của nó trên các tế bào bình thường và các mơ. Do đó, việc thử nghiệm độc tính và sàng lọc các chất chống ung thư là cần thiết. Dịng tế bào người ni cấy được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc các chất chống ung thư giả định. Việc sử dụng mơ hình tế bào

<i>in vitro rất quan trọng đối với vấn đề ổn định các kết quả và tính lặp lại khi sàng lọc chất chống ung thư và các phương pháp in vitro tạo thành điều kiện tiên quyết quan trọng để thử nghiệm in vivo [16]. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 15 Trong một nghiên cứu của Ou và cộng sự (2012) thực hiện trên tế bào Hep-G2

<i>cho thấy dịch chiết tế bào vi khuẩn acid lactis có tác dụng làm giảm đáng kể tert-butyl hydroperoxid (t-BHP) gây cảm ứng nhiễm độc gan, hay nói cách khác là có tác dụng bảo vệ tế bào Hep-G2, chống lại q trình oxi hóa do t-BHP gây ra. Những tác động </i>

tích cực này là thông qua việc điều chỉnh hàm lượng GSH, làm giảm sự tích lũy ROS, ức chế phản ứng peroxid hóa lipid và cải thiện hoạt động các enzym COXH [46].

Nghiên cứu của Choi và cộng sự (2005) thực hiện trên một số chủng

<i>Lactobacillus cho thấy các chủng này có khả năng COXH trên các dòng tế bào ung thư khác nhau ở người, trong đó L. acidophilus 606 và L. casei ATCC 393 khơng gây độc </i>

trên nguyên bào sợi phôi người [16].

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 16

<b>CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>2.1. Đối tượng nghiên cứu </b>

<i>Đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis KP3 phân lập từ mẫu </i>

đất ở Krôngpa, Gia Lai, đã được chứng minh khả năng sinh chất COXH, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Vi sinh Cơng nghệ Dược - Khoa Dược - Đại học Y Dược

<i>TP. HCM [3, 4]. B. subtilis KP3 có khả năng đối kháng với S. aureus, nhạy cảm với methicillin với đường kính vùng ức chế từ 7 mm, đối kháng với S. marcescens với đường kính vùng ức chế là 9 ± 0,3 mm, đối kháng với S. dysenteria với đường kính </i>

vùng ức chế là 4 ± 0,5 mm. KP3 có tỉ lệ sống sót ở pH 2 là 66% và muối mật 0,5% là 61%. Chủng này nhạy cảm với kháng sinh, không mang các gen mã hóa độc tố gây nơn mửa và tiêu chảy. Chủng có khả năng ức chế sự gia tăng MDA và giảm hoạt tính của enzym SOD, catalase, GPx khi gây độc gan với CCl<small>4</small> ở liều 10⁹ bào tử/kg thể trọng

<i>trong 4 tuần [5]. Khả năng COXH của các chất chiết từ B. subtilis KP3 được trình bày </i>

Chất COXH ngoại bào 0,25 0,11 Chất COXH nội bào thân dầu 0,85 0,75 Chất COXH nội bào thân nước 0,40 0,31

- Dòng tế bào sử dụng cho các thí nghiệmnlà tế bào ung thư vú ở người (MCF-7) do Phịng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược - Khoa Dược - Đại học Y Dược TP. HCM cung cấp.

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 17

<b>2.2. Vật liệu, thiết bị </b>

<b>2.2.1. Môi trường và hóa chất </b>

- Đậu khơng dầu. - Ethanol, chloroform.

- Môi trường TSA (Trypton Soy Agar). - Môi trường TSB (Trypton Soy Broth).

- Môi trường DMEM (Eagle Minimal Essential Media). - FCS (Fetal Calf Serum).

- MTT (3-[4,5-dimethylthiazolyl-2]-2,5-diphenyltetrazolium bromide).

- DMSO (dimethyl sulfoxide), PBS (phosphate buffer saline), SDS (sodium dedocyl sulfate), TCA (trichloroacetic acid), acid acetic, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), ammonium molybdate (NH<small>4</small>Mo<small>7</small>O<small>24</small>), đệm phosphate (KH<small>2</small>PO<small>4</small>).

- Glutathion (GSH), glutathion reductase (GR), lysozym. - Thuốc thử Ellman (DNTB).

- Thuốc thử Bradford. - Pyrogallol.

- Tris-HCl, H<small>2</small>O<small>2</small>, MgSO<small>4</small>, KCl, FeSO<small>4</small>, MnCl<small>2</small>, Ca(NO<small>3</small>), NaOH, NaCl.

<b>2.2.2. Dụng cụ và thiết bị </b>

- Máy vortex Labnet

- Tủ an toàn sinh học class II Esco - Tủ sấy Memmert

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 18 - Máy tán siêu âm Vibracell

- Cân điện tử Sartorius TE412 - Cân phân tích Sartorius BP211S - Máy đo pH Crison Basic 20<small>+</small>

- Máy ly tâm Sigma 6K15

- Máy siêu ly tâm Hermile 236HK

- Các dụng cụ khác: đĩa petri, đĩa 96 giếng, erlen, becher, ống nghiệm, pipet, micropipet, eppendorf, que cấy, falcon, đèn cồn…

<b>2.3. Lên men thu nhận bào tử </b>

<i><b>2.3.1. Thu nhận bào tử Bacillus subtilis KP3 </b></i>

<small>Kiểm tra bào tử Chủng vi khuẩn </small>

<small>Ria chủng trên đĩa TSA Tăng sinh trên môi trường TSB </small>

<small>Tạo bào tử bằng môi trường thạch đậu nành bổ sung khoáng </small>

<small> Sau 48 giờ Thu sinh khối </small>

<b>Sơ đồ 2.1 Quy trình lên men thu bào tử </b>

<i>Để thu bào tử cho thử nghiệm, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis KP3 được nuôi </i>

cấy trên môi trường thạch đậu bổ sung khoáng ở 37ºC, 48 giờ.

<b>2.3.2. Làm sạch bào tử </b>

Sau khi thu nhận, bào tử được làm sạch theo phương pháp Nicholson và Setlow [56]:

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 19

<small>Thu bào tử đã làm sạch Thu sinh khối </small>

<small>Ly tâm 10000g/ 10 phút, ở 4oC Rửa bào tử </small>

<small>¼ thể tích ban đầu KCl 1 M/ NaCl 0,5 M Ly tâm 10000g/ 10 phút, ở 4oC Ủ bào tử </small>

<small>¼ thể tris-HCl 50 mM, pH 7,2, chứa lysozym 50 µg/ml Ủ ở 37oC/ 60 phút </small>

<small>Rửa bào tử lần 1 </small>

<small>NaCl 1 M Ly tâm 10000g/ 10 phút, ở 4oC Rửa bào tử lần 2 </small>

<small>Nước khử khoáng Ly tâm 10000g/ 10 phút, ở 4oC Rửa bào tử lần 3 </small>

<small>SDS 0,05% Ly tâm 10000g/ 10 phút, ở 4oC Rửa bào tử 4 lần </small>

<small>Nước khử khoáng Ly tâm 10000g/ 10 phút, ở 4oC </small>

<small>Kiểm tra mật độ bào tử </small>

<b>Sơ đồ 2.2 Quy trình làm sạch bào tử </b>

- Ly tâm sinh khối 10000g/10 phút, ở 4<small>o</small>C.

- Rửa bào tử với ¼ thể tích ban đầu KCl 1M/NaCl 0,5 M, ly tâm 10000g/10 phút, ở 4<small>o</small>C.

- Phân tán bào tử trong ¼ thể tích Tris- HCl 50 mM, pH 7,2 có chứa lysozym 50 µg/ml. Ủ ở 37^oC/ 60 phút.

- Rửa bào tử với NaCl 1 M, ly tâm 10000 g/10 phút, ở 4<small>o</small>C.

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<i>SVTH: Phan Thị Diệu </i> 20 - Rửa bào tử với nước cất, ly tâm 10000g/10 phút, ở 4^oC.

- Rửa bào tử với SDS 0,05%, ly tâm 10000g/10 phút, ở 4<small>o</small>C.

- Rửa bào tử với nước cất, ly tâm 10000g/10 phút, ở 4<small>o</small>C, thực hiện 3 lần.

- Kiểm tra độ sạch của bào tử bằng kính hiển vi và mật độ bào tử bằng phương pháp đếm sống.

<b>2.3.3. Định lượng số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống </b>

<b>Mục đích: </b>

Phương pháp này nhằm xác định lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Số lượng khuẩn lạc tối đa được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA (Food and Drug Administration - Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm<small>)</small> là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Để giảm thiểu sự sai số, mỗi nồng độ thực hiện lặp lại 2 đĩa. Đơn vị hình thành khuẩn lạc là CFU (Colony forming unit).

<b>Thực hiện: </b>

Pha loãng mẫu cho đến khi đạt nồng độ tới hạn (10<small>-4</small>, 10^-5, 10^-6…) Từ mỗi nồng độ tới hạn, hút 0,1 ml cho vào bề mặt thạch Dùng que cấy trang dàn đều trên bề mặt thạch đến khi khơ hồn toàn

Ghi tên mẫu, thời gian thực hiện, úp ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 37 <small>o</small>C/24 giờ Chọn các đĩa có số khuẩn lạc khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa để đếm

Tính mật độ VSV có trong mẫu (CFU/ml)

<b>Sơ đồ 2.3 Quy trình kiểm tra mật độ vi sinh vật có trong mẫu </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

V: Thể tích dịch mẫu cấy trong đĩa (ml) f<small>i</small>: Độ pha loãng tương ứng

<b>2.4. Chiết chất COXH ngoại bào, nội bào </b>

<b>2.4.1. Chất COXH ngoại bào </b>

Chất COXH ngoại bào tan trong nước nên không cần chiết trên cả 2 phân đoạn tan trong nước và trong dầu. Chất COXH ngoại bào được chiết bằng dung mơi ethanol. Quy trình thực hiện như sau:

- <i>Ni cấy B. subtilis KP3 trên 3 lít mơi trường TSB 37</i><small>o</small>C, 24 giờ. - Dịch vi khuẩn ni cấy đem ly tâm 10.000g trong vịng 15 phút. - Đông khô dịch sau ly tâm trong 48 giờ. Thu cắn sau đông khô. - Thêm 100 ml ethanol vào 10g cắn đông khô.

- Ly tâm, thu dịch nổi và cô quay tới cắn để thử nghiệm.

<b>2.4.2. Chất COXH nội bào </b>

Chất COXH nội bào bao gồm chất COXH nội bào tổng và chất các phân đoạn COXH nội bào thân dầu (phân đoạn chloroform), thân nước (phân đoạn ethanol).

<i>Chiết chất COXH nội bào tổng </i>

- Chiết chất COXH trên 2 x 10<small>12</small> bào tử vi khuẩn.

</div>