Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch protein artemia thủy phân bằng enzyme nội tại và enzyme bổ sung

i

LỜI CÁM ƠN

Qua thời gian thực hiện đề tài em đã được sự giúp đỡ tận tình của thầy
cô, bạn bè và gia đình. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến mọi người.
Em xin gửi lời cám ơn thầy Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cô Nguyễn Hồng
Ngân đã trực tiếp hướng dẫn em trong suốt trong thời gian thực hiện đề tài.
Đồng thời gửi lời cám ơn đến các thầy cô trong khoa Chế Biến đã truyền đạt
cho em những kiến thức để em có đủ hành trang hoàn thành đề tài này.Em
cũng xin gửi lời cám ơn đến các thầy cô phòng thí nghiệm Công nghệ Chế
biến Thủy sản, phòng thí nghiệm Hóa sinh- Vi sinh, phòng thí nghiệm Công
nghệ Sinh học đã tạo điều kiện tốt cho em trong suốt quá trình thực tập.
Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn đến gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện
thuận lợi cho em thực hiện đề tài.
Sinh viên
Đỗ Thị Kim Sa












ii

MỤC LỤC
Trang
Lời cám ơn i
Mục lục ii
Danh mục chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
Lời mở đầu 1
Chương I. Tổng quan 3
1.1. Protein thủy phân 3
1.1.1. Giới thiệu 3
1.1.2. Thành phần hóa học 4
1.1.3. Đặc điểm, tính chất 5
1.1.4. Phương pháp sản xuất protein thủy phân 5
1.1.5. Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học Artemia 6
1.2. Artemia 7
1.2.1. Giới thiệu 7
1.2.2. Tình hình nuôi Artemia ở Việt Nam 9
1.2.3. Thành phần hóa học và sử dụng Artemia ở Việt Nam 10
1.3. Gốc tự do và khả năng chống oxy hóa 11
1.3.1. Gốc tự do và oxy hóa 11
1.3.2. Chất chống oxy hóa 13
Chương II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 15
2.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.1. Artemia 15
2.1.2. Enzyme 17
iii

2.1.3. Hóa chất 17

2.2. Phương pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Bố trí thí nghiệm 18
+ Thí nghiệm 1: Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy
phân A. franciscana

bằng enzyme nội tại 18
+ Thí nghiệm 2: Lựa chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình thủy
phân protein Artemia 20
+ Thí nghiệm 3: Xác định tỷ lệ enzyme protease bổ sung so với
nguyên liệu 22
+ Thí nghiệm 4: Xác định thời gian thủy phân thích hợp cho quá
trình thủy phân protein A. franciscana 24
+ Thí nghiệm 5: Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá
trình thủy phân protein A. franciscana 26
2.2.2. Phương pháp phân tích 28
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 28
Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 29
3.1. Thành phần hóa học của nguyên liệu A. franiciscana 29
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
enzyme nội tại 30
3.3. Ảnh hưởng của các loại enyme protease đến khả năng chống oxy hóa của
dịch thủy phân protein của A. franciacana 33
3.4. Tỷ lệ enzyme protease bổ sung so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình
thủy phân protein A. franciscana 34
3.5. Thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân protein A. franciscana 36
3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy
phân protein A. francicana 38
iv

Chương IV.Kết luận và đề xuất 40

4.1. Kết luận 40
4.2. Đề xuất ý kiến 40
Tài liệu tham khảo 41
Phụ lục


















v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐC: Đối chứng.
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.
HUFA: Acid béo chưa bão hòa bậc cao (Highly Unsaturated Fatty Acids)
(có mạch từ 20 carbon trở lên và có từ 4 – 6 nối đôi).
MUFA: Acid béo bão hòa một nối đôi ( Mono Unsaturated Fatty Acids).

PUFA: Các acid béo chưa bõa hòa có nhiều nối đôi (Poly Unsaturated Fatty
Acids) có từ 2 nối đôi trở lên.
SFA: Các acid béo bão hòa (Saturated Fatty Acids).
TFA: tổng số acid béo (Total Fatty Acids).

















vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Nhiệt độ và pH tối thích của các chế phẩm protease thương mại 17
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của A. franciscana nguyên liệu (% so
với nguyên liệu ướt) 29
Bảng 3.2. Thành phần acid amin của mẫu A. franciscana nguyên liệu 29
Bảng 3.3. Thành phần acid béo của A. franciscana nguyên liệu 30

vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân protein 3
Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi enzyme 3
Hình 1.3. Sơ đồ vòng đời của Artemia 8
Hình 2.1. Hình ảnh Artemia franciscana 15
Hình 2.2. Quy trình thu và xử lý mẫu 16
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm
thủy phân protein A. franciscana bằng enzyme nội tại theo thời gian 19
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình

thủy phân protein A. franciscana 21
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ enzyme thích hợp cho quá trình
thủy phân protein A. franciscana 23
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian thích hợp cho quá trình thủy
phân protein A. franciscana 25
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy
phân protein A. franciscana 27
Hình 3.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch thủy phân protein A.
franciscana bằng enzyme nội tại 31
Hình 3.2. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
enzyme nội tại 31
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các loại enzyme khác nhau đến khả năng khử gốc
tự do DPPH của dịch thủy phân protein A. franciscana 33
Hình 3.4. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
các loại enzyme protease bổ sung khác nhau 33
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến khả năng khử gốc tự do
DPPH của dịch thủy phân protein A. franciscana 35
viii

Hình 3.6. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
enzyme protease bổ sung với tỷ lệ khác nhau 35
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng khử gốc tự do
DPPH của dịch thủy phân protein A. franciscana 37
Hình 3.8. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân A. franciscana với enzyme
bổ sung trong khoảng thời gian khác nhau 37
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử gốc tự do DPPH của
dịch thủy phân protein A. franciscana 38
Hình 3.10. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana
trong các khoảng thời gian thủy phân khác nhau 39

1

LỜI MỞ ĐẦU
Cơ thể con người và động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp chất dinh
dưỡng có trong thức ăn để có thể tiến hành trao đổi chất duy trì sự sống, tăng
cường sinh trưởng và phát triển. Protein là nguồn cung cấp nitơ cho cơ thể
người và động vật. Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc
đa phân mà các đơn phân là acid amin, chúng kết hợp với nhau thành một
mạch dài nhờ các liên kết peptid. Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ các
nhóm amino acid thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là
sự thủy phân protein. Sự thủy phân protein diễn ra rất chậm chạp khi ở điều
kiện thường, nhưng khi có mặt của enzyme sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân,
cắt mạch thành nhiều phân tử nhỏ hơn (amino acid là chính). Tùy theo mức
độ và thời gian thủy phân mà thành phần trong dịch thủy phân sẽ có sự khác
nhau. Dịch thủy phân protein có chứa các thành phần peptid, đây là nguồn
cung cấp dinh dưỡng cho người. Thông thường các peptid là những tác nhân
điều hòa hoạt tính của các phân tử khác. Sự điều hòa này thông qua mối
tương tác của peptid với các phân tử chịu sự điều hòa. Như vậy có các peptid
với hoạt tính hoocmon, các peptid khác với hoạt tính kháng khuẩn… một số
peptid được cơ thể tổng hợp trực tiếp, một số là sản phẩm của quá trình thủy
phân của các phân tử protein. Vì vậy peptid của quá trình thủy phân có hoạt
tính sinh học cao cụ thể hơn là dịch thủy phân protein có hoạt tính chống oxy
hóa cao.
Artemia là tên của một loài giáp xác nhỏ sống ở những vùng nước mặn
có biên độ mặn rộng từ vài phần nghìn đến 250‰. Trong tự nhiên người ta

thường gặp Artemia sống ở các hồ nước mặn. Từ những năm 30 của thế kỷ
trước, người ta biết đến Artemia là do phát hiện thấy Artemia chính là loại
động vật giàu protein nên rất thích hợp cho việc dùng làm thức ăn để ươm
nuôi các loài động vật thủy sản như tôm, cá, động vật thân mềm…
2

Hiện nay việc nghiên cứu chế biến Artemia còn rất hạn chế, dạng chủ
yếu sử dụng Artemia là làm thức ăn cho ấu trùng cá, tôm, cua, vì trong thành
phần của Artemia có chứa hàm lượng protein, các acid béo cao. Thực trạng
khai thác sử dụng protein từ Artemia còn hạn chế nên cần được mở rộng
nghiên cứu theo hướng khác, đặc biệt là hướng nghiên cứu ứng dụng dịch
thủy phân protein từ Artemia nhằm khai thác có hiệu quả nguồn protein giá trị
này. Được sự phân công của Ban chủ nhiệm Khoa Chế biến em đã thực hiện
đề tài ”

Nghiên cứu khả năng chống Oxy hóa của dịch protein Artemia thủy
phân bằng enzyme nội tại và enzyme

bổ sung
” để hiểu rõ hơn về hoạt tính
chống oxy hóa của dịch protein thủy phân và có hướng sử dụng hiệu quả
hơn protein có trong nguyên liệu Artemia. Đề tài thành công sẽ góp phần
làm cơ sở cho việc sử dụng dịch thủy phân protein từ Artemia phục vụ
cho lợi ích chống oxy hóa thường gặp ở người, nâng cao khả năng sử
dụng Artemia trong đời sống con người.

3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 . Protein thủy phân
1.1.1. Giới thiệu
Qúa trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương
trong hợp chất hữu cơ thành các đơn phân dưới tác dụng của chất xúc tác có
sự tham gia của nước trong phản ứng.

H
2
N-CH-CO-NH-CH-CO-NH- H
2
N-CH-COOH+ H
2
N-CH-NH-


Hình 1.1. Phản ứng thủy phân protein
Enzyme protease xúc tác dụng và chuyển hóa cơ chất qua 3 giai đoạn
- Giai đoạn 1: enzyme kết hợp cơ chất tạo phức hợp enzyme- cơ chất ES
không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp.
- Giai đoạn 2: tạo phức chất hoạt hóa, là giai đoạn xảy ra sự biến đổi cơ chất
dưới tác dụng của 1 số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và

làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động. Một số liên kết
trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
- Giai đoạn 3: là giai đoạn tạo thành sản phẩm và giải phóng enzyme. Đây là
giai đoạn cuối của quá trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và
enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu.

Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi enzyme
R
1
R
2
H
2
O
Protease
R
1

R
2

Acid amin peptid


H
2
O

ES
E+ S

EP + H-P
+

E+ P- OH+ H-P
+

4

Enzyme có bản chất là protein, có khả năng tương tác lên liên kết nhị
dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử cơ chất, làm cho
các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra khi có yếu tố nước tham gia.
Cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ chất thủy phân: giai đoạn đầu có
sự hình thành phức hợp trung gian ES, sự tạo thành này có thể theo 2 kiểu
sau:
- Kiểu thứ nhất: là kiểu hình thành đơn giản, tâm ái nhân của ái nhân(-)
của gen tương tác nhanh với 1 trong 2 ngyên tử tích điện dương của liên kết
nhị dương. Sau khi tương tác sẽ làm thay đổi mật độ electron và làm suy yếu
liên kết nhị dương tạo điều kiện cắt đứt liên kết. Các nhà nghiên cứu kiểu cơ
chế này xảy ra khi tâm ái của enzyme mạnh và sự khuyết điện tử của liên kết
nhị dương lớn.
- Kiểu thứ 2: lúc đầu các nguyên tử khuyết điện tử trong liên kết trong
liên kết nhị dương chưa thể đính trực tiếp vào tâm ái nhân của trung tâm hoạt
động của enzyme mà cơ chất gắn vào tâm ái nhân bằng một phản ứng hóa học
nào đó giữa tâm ái nhân ở trung tâm hoạt động enzyme với một nhóm hóa học
ở vị trí liền kề với liên kết nhị dương trong cơ chất. Dưới ảnh hưởng của trung
tâm hoạt động của enzyme sẽ dần dần làm tăng mức độ khuyết điện tử vốn đã
tồn tại trước đó, bằng cách tạo liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí
gần gũi với liên kết nhị dương. Nhờ vậy, làm cho sự phân bố điện tử trong
phân tử bị thay đổi theo chiều hướng cần thiết khiến cho liên kết nhị dương
được tăng cường và có thể tương tác với các ái nhân của trung tâm hoạt động

của enzyme và tiến hành làm yếu liên kết, dẫn đến liên kết bị thủy phân khi
có yếu tố nước tham gia.
1.1.2. Thành phần hóa học
Nguyên liệu Artemia giàu acid amin, đặc biệt là các acid amin không
thay thế rất có lợi cho cơ thể, ngoài ra nguyên liệu có nhiều khoáng, acid
5

béo… nên khi thủy phân thu dịch thì dịch thủy phân được coi là sản phẩm có
giá trị dinh dưỡng cao có nhiều tiềm năng sử dụng phục vụ cho con người.
1.1.3. Đặc điểm, tính chất
Thực chất của quá trình sản xuất protein thủy phân chính là quá trình
thủy phân protein để tạo ra các peptid và acid amin dưới tác động của hệ
enzyme nội tại và enzyme bổ sung. Một vài peptid từ phành phần protein thủy
phân đã được tìm thấy có khả năng chứa chất oxy hóa, và độ hoạt động sinh
học.
1.1.4. Phương pháp sản xuất protein thủy phân
Để sản xuất protein thủy phân người ta thường sử dụng hệ enzyme có
sẵn trong nguyên liệu hoặc bổ sung enzyme để thủy phân protein thành các
phần peptid, acid amin và thu hồi chúng. Trong đó có 2 cách làm, đó là ủ xi lô
và bổ sung enzyme protease.
Phương pháp ủ xi lô: thủy phân nguyên liệu nhờ các enzyme có sẵn
trong nguyên liệu, ngoài ra còn có sự hỗ trợ của acid hữu cơ được bổ sung
vào. Chất lượng của protein thu được theo phương pháp nay chủ yếu phụ
thuộc vào hàm lượng các acid amin.
Trong vài giờ đầu của quá trình thủy phân, lượng acid amin thiết yếu
tăng lên, Tuy nhiên không nên kéo dài giai đoạn thủy phân vì khi đã đạt đến
hiệu suất tối đa, tiếp tục thủy phân trong môi trường acid sẽ làm giảm hiệu
suất của các acid amin thiết yếu. Phương pháp này có ưu điểm là tận dụng
được enzyme protease có sẵn trong bản thân nguyên liệu, phương pháp đơn
giản, không sử dụng máy móc thiết bị phức tạp nên dễ thực hiện.

Phương pháp bổ sung enzyme protease: cũng giống như phương pháp ủ
xi lô là lợi dụng hoạt động thủy phân protein của protease để thu hồi protein.
Tuy nhiên, để giảm thời gian thủy phân người ta bổ sung protease với hàm
lượng nhất định để đẩy mạnh tốc độ phản ứng thủy phân.
6

Ngoài ra người ta còn dùng phương pháp thủy phân bằng acid, kiềm.
Người ta thường dung acid HCl 6N dư thừa ở nhiệt độ 100-120
o
C trong
khoảng 24 giờ. Sản phẩm chủ yếu thu được là các amino acid tự do ở dạng
hydrogenclograte. Và người ta cũng có thể thu được amino acid bằng cách
thủy phân với NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu
được hầu hết là các amino acid nhưng đều bị racemic hóa.
1.1.5. Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học
Thành phần của protein thủy phân gồm các peptid và các acid amin khi
sự phân giải protein được gây ra bởi protease nội tại và enzyme bổ sung. Nó
dường như là thành phần của ứng dụng khoa học dinh dưỡng của thủy phân
protein không tinh chế, nó có thể giúp ích chút ít hơn peptid tinh chế từ sự hút
của oligopeptid được tăng lên sự có mặt của đường và amino acid. Hơn nữa
nó cũng cho thấy rằng thủy phân ứng dụng chất chống oxy hóa cao chủ động
hơn peptid tinh chế. Peptid từ thực phẩm được coi là hợp chất an toàn và có
lợi cho sức khỏe, chúng có cấu trúc đơn giản, có nhiều tính chất ổn định.
Nhiều hơn chúng đưa ra giá trị dinh dưỡng và nhiều chức năng bên cạnh chức
năng chống oxy hóa của chúng. Có sự ức chế quá trình peroxid lipid, lọc sạch
các gốc tự do và kìm hãm sự chuyển đổi ion kim loại của các peptid chống
oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa của peptid có liên quan kết cấu của chúng,
cấu trúc và tính không ưa nước. Với sự hiện diện ở vị trí thích hợp của các
amino acid cấu thành các peptid trong chuỗi peptid giữ một vai trò quan trọng
trong phạm vi chống oxy hóa của peptid. Liên kết peptid phản ánh cấu trúc rõ

ràng cụ thể của peptid, đồng thời cũng được khẳng định là có ảnh hưởng
phạm vi chất chống oxy hóa. Hình thể của peptid cũng có thể ảnh hưởng đến
hoạt động chống oxy hóa. Có nghiên cứu cho thấy sự thay thế của L- His
bằng D- His trong một peptid chống oxy hóa làm giảm mật độ hoạt động. Họ
đã kết luận vị trí đặt của nhóm imido như chìa khóa ảnh hưởng hoạt động
7

chống oxy hóa. Ngoài ra hoạt động chống oxy hóa và mật độ hoạt động sinh
học có thể ảnh hưởng bởi điều kiện phụ thuộc bổ sung vào, như mật độ thủy
phân, loại enzyme protease, cấu trúc peptid… khối lượng phân tử cũng có thể
ảnh hưởng hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt động chất chống oxy hóa của peptid
có khối lượng phân tử 500-1500 Da thì tốt hơn peptid trên 1500 Da và peptid
dưới 1500 Da.
1.2 . Artemia
1.2.1. Giới thiệu
Phân loại:
Ngành chân khớp Arthropoda
Lớp giáp xác Crustacea
Lớp phụ chân mang Branchiopoda
Bộ Anostttraca
Họ Artemiidae
Giống Artemia

Chúng thường sống ở biển tự nhiên hoặc được nuôi trong ruộng muối.
Artemia không có tự nhiên ở khu vực Đông Nam Á và nước ta nói riêng do
ảnh hưởng của chế độ gió mùa, thủy vực không có độ mặn cao lại có nhiều
sinh vật dữ. Thực tế Artemia được tìm thấy ở hơn 300 địa điểm hồ nước mặn
trên khắp thế giới, gồm các loài có quan hệ với nhau:
♦ Artemia Tunisiana: Châu Âu- Bắc Châu Phi
♦ Artemia Salina: Lymington (Anh)

♦ Artemia Franciscana: Châu Mỹ (Bắc- Trung- Nam)
♦ Artemia Urmiana: Iran
♦ Artemia Persililis: Argentina
8

♦ Artemia của các dòng địa lý có khả năng thích ứng với biên độ nhệt độ
6-35
0
C và thành phần ion môi trường gồm ít clorit, sunfat, cacbonat.
Đã có nhiều nghiên cứu về Artemia,Seale (1933), Rollefson (1939) khám phá
ra ấu trùng Naupli của Artemia có kích thước 0.4mm là một loại thức ăn lý
tưởng cho sự tăng trưởng của ấu trùng tôm, cá. Sử dụng trực tiếp ấu trùng của
Artemia được nhiều tác giả ghi nhận: O.Kinne (1977) cho rằng ấu trùng cá,
giáp xác tôm, cua đều sử dụng với số lượng lớn. Vanolst (1976) nhận thấy
giai đoạn ấu trùng của nhiều đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cũng sử
dụng Naupli như khẩu phần ăn cơ bản.
Artemia ăn lọc không có tính chọn lựa, thức ăn chủ yếu là các hạt lơ lững
trong nước và các sinh vật cỡ như tảo và vi khuẩn.
Vòng đời:









Hình 1.3. Sơ đồ vòng đời của Artemia

Sự phát triển của Artemia bắt đầu từ khi trứng bào xác được ngâm vào
nước biển ( 35‰). Sau 1-2h chúng hút nước và trương phồng lên có dạng
hình cầu, lúc này phôi bắt đầu phân cắt và sự phân chia kéo dài đến khi ấu thể
được hoàn chỉnh, thường sau 20-24h Naupli xuất hiện, ấu trùng Artemia vừa
14 ngày
ĐK thuận lợi
ĐK không
thuận lợi
Artemia
trưởng thành
Ấu trùng Naupli
0.4mm

Naupli
100-300con/4-
5 ngày trong
vaì tháng
Trứng bào xác khô
Đẻ trứng
Trứng bào xác
100-300 trứng/4-
5 ngày
Có thể dự
trữ trong
nhiều năm
9

mới đẻ hay mới nở có kích thước 400 - 500 µm, con trưởng thành dài không
quá 20mm. Artemia trưởng thành có chiều dài khoảng 10-20mm, có hình ống
kéo dài, 2 mắt kép có cuống, bộ máy tiêu hóa thẳng, 1 cặp râu cảm giác và 11

đôi chân bơi. Trong quá trình phát triển Artemia trải qua 15 lần lột xác, sau
mỗi lần thay đổi cả về hình dạng lẫn kích thước. Artemia có thể sinh sản lần
đầu sau 8 ngày phát triển, thường là sau 12-15 ngày. Mỗi lần đẻ khoảng 100-
300 trứng hoặc con, với chu kỳ đẻ 4-5 ngày /lần. Trong điều kiện tốt Artemia
sống được vài tháng (6 tháng).
Con đực có 1 đôi càng hình móc rất đặc thù ở vùng đầu, con cái không
có phần phụ này nhưng dễ nhận biết bởi sự hiện diện của 2 buồng trứng nằm
phía sau đôi chân bơi thứ 11. Với chu trình biến thái ngắn, sau 14 ngày chúng
có thể đạt giai đoạn trưởng thành và tham gia sinh sản, tùy theo điều kiện môi
trường Artemia có sự sinh trưởng và sinh sản khác nhau, có dòng đơn tính,
dòng lưỡng tính, đẻ con hay đẻ trứng. Khi nồng độ muối cao hơn 70‰ (hàm
lượng oxy thấp) và dinh dưỡng kém, nhiệt độ cao thì Artemia có xu hướng đẻ
trứng bào xác.
Trong nuôi thương phẩm Artemia trưởng thành được quan tâm nhiều
hơn do kích thước lớn hơn 20 lần và trọng lượng nặng hơn 500 lần ấu trùng
mới nở. Hơn nữa thành phần của Artemia trưởng thành hiện diện đủ các acid
amin thiết yếu, Naupli thường khuyết histidine, methionine, phenylalanine,
threonine. Nhu cầu trong ăn uống, sinh hoạt của con người ngày càng được
nâng cao, do đó nên có hướng sử dụng hiệu quả loại nguyên liệu này, để mở
ra hướng mới trong việc sử dụng nguyên liệu phục vụ cho lợi ích của con
người.
1.2.2. Tình hình nuôi Artemia ở Việt Nam
Artemia không phân bố tự nhiên ở Việt Nam, nhưng do giá trị dinh
dưỡng cao và là loại thức ăn không thế thiếu được trong sản xuất thủy sản nên
10

được nhiều đơn vị nghiên cứu trong nước quan tâm đến. Từ đầu thập niên 80,
Artemia du nhập vào Việt Nam dưới dạng thức ăn dùng cho nuôi ấu trùng
tôm càng xanh, sau đó Artemia được nuôi thử nghiệm ở Cam Ranh- Khánh
Hòa (1982), trường Đại học Cần Thơ tiến hành nuôi thử nghiệm Artemia thu

trứng bào xác trên đồng muối Vĩnh Châu- Bạc Liêu, Phan Thiết (1991), Vũng
Tàu (1995). Hiện nay Artemia đã trở thành một đối tượng nuôi phổ biến ở
đồng muối của diêm dân vùng ven biển Sóc Trăng, Bạc Liêu và trở thành
vùng trọng điểm cung cấp trứng bào xác Artemia có chất lượng cao cho thị
trường trong và ngoài nước vì tuy khối lượng nhỏ nhưng độ đạm và chất dinh
dưỡng rất cao, rất phù hợp cho cua con, tôm bột, cá bột.

1.2.3. Thành phần hóa học và sử dụng Artemia ở Việt Nam
Artemia là loại nguyên liệu có giá trị dinh dưỡng cao, là nguồn thức ăn
chủ yếu cho ấu trùng tôm, cua, cá, ốc có ảnh hưởng tới đến sự sinh trưởng
và tỷ lệ sống của ấu trùng. Bản thân nguyên liệu đã có thành phần acid amin
và acid béo cao. Có thể sử dụng ấu trùng Artemia ngay hoặc dùng dần trước
24 giờ sau khi trứng nở, tùy theo sự phù hợp kích cỡ từng giai đoạn của ấu
trùng. Ta phải sử dụng trước 24 giờ sau khi trứng nở vì sau 24 giờ sau khi nở
thì ấu trùng Artemia sẽ tiêu thụ hết khoảng 25-30 % năng lượng dự trữh, làm
giảm chất dinh dưỡng có trong nguyên liệu. Ở đồng muối ven biển đồng bằng
sông Cửu Long Artemia đã được nuôi trên diện tích khoảng 400-500 ha, sản
lượng 5-6 tấn trứng bào xác có chất lượng ổn định, đáp ứng nhu cầu trong
nước, tham gia xuất khẩu.
Sản phẩm thủy phân Artemia cung giống như các loại thủy sản khác,
thành phần peptid sẽ được tạo thành trong dịch thủy phân. Đây là nguồn chất
chống oxy hóa tự nhiên rất tốt cho người, bên cạnh đó dịch thủy phân có
thành phần acid amin một nguồn dinh dưỡng tốt cho người đặc biệt là các
acid amin không thay thế. Cần triệt để mở rộng hướng sử dụng loại nguyên
11

liệu đầy dinh dưỡng này. Qúa trình thủy phân sẽ cắt mạch protein tạo các
peptid, các acid amin có hoạt tính chống oxy hóa cao, cũng như hàm lượng
acid béo cao. Đây sẽ là hứa hẹn nguồn cung cấp một sản phẩm có giá trị dinh
dưỡng cao. Là hướng sử dụng mới cho loại nguyên lệu này thay vì chỉ sử

dụng làm thức ăn cho ấu trùng.
1.3 . Gốc tự do và khả năng chống oxy hóa
1.3.1. Gốc tự do và oxy hóa
Trong cơ thể con người, thường xuyên diễn ra nhiều sinh quá trình xây
dựng hoặc huỷ hoại. Có những chất tưởng như là thực phẩm chính của tế bào
nhưng đồng thời cũng lại làm hại tế bào. Có những phân tử gây ra tổn
thương thì cũng có những chất đề kháng lại hành động phá phách này. Gốc tự
do, oxygen và chất chống oxy hóa là một thí dụ. Những phân tử này có liên
hệ với nhau và ảnh hưởng tới cơ thể con người rất nhiều, nhất là ở giai đoạn
cuối của cuộc đời.
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con
người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do
mỗi ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi
cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ.
Nếu không bị kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như
ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị
nhiễm.
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau
đây: trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải
chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lạp
thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự
do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được.
Trong tiến trình hóa già, gốc tự do có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già
12

được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào. Các gốc tự do là
một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già và sự chết cuả các sinh vật.
Lúc đó gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng
cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng,
mất khả năng sản xuất năng lượng.

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của
những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường,
thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp,
nước có nhiều chlorine và ngay cả oxygen.

Những năm gần đây người ta đề cập nhiều đến gốc tự do và các chất
chống oxy hóa. Gốc tự do là những chất độc hại được sinh ra trong quá trình
chuyển hóa ở trong cơ thể hoặc có thể các gốc tự do ở ngoài môi trường xâm
nhập vào cơ thể, chúng có khả năng oxy hóa cao, phát sinh những phản ứng
dây chuyền làm tổn hại đến tế bào, tổ chức, gây nhiều loại bệnh tật và làm
tăng quá trình lão hóa của con người. Còn nhà khoa học Hoa Kỳ D.Harman
đưa ra trong luận thuyết về cơ chế tích tuổi thì gốc tự do là những phân tử hay
những mảnh vỡ của phân tử có một điện tích đơn lẻ ở ngoài quỷ đạo vùng
ngoài. Do có sự có mặt của gốc tự do, nên chúng có thuộc tính đặc biệt quan
trọng là có khả năng oxy hóa rất cao. Nếu vì một lý do nào đó, số lượng gốc
tự do tăng lên bất thường, vượt khỏi tầm khống chế bình thường của hàng rào
bảo vệ các chất chống oxy hóa thì chúng sẽ khởi động những phản ứng dây
chuyền oxy hóa các chất nền trong cơ thể. Các gốc tự do sau khi gây tổn
thương màng tế bào sẽ dẫn đến nhiều tổn thương khác như biến đổi cấu trúc
các protein, ức chế hoạt động các men, biến đổi cấu trúc và thuộc tính của nội
tiết tố.

Trong cơ thể khỏe mạnh gốc tự do sinh ra có giới hạn, không quá thừa
để gây hại. Bởi vì bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống
13

oxy hóa cân bằng lại, vô hiệu hóa các gốc tự do có hại. Chỉ khi nào gốc tự do
sinh ra quá nhiều (do ô nhiễm môi trường, tia cực tím từ ánh nắng, khói thuốc
lá, viêm nhiễm trong cơ thể, thậm chí là do dùng một số loại dược phẩm) và
hệ thống chất oxy hóa nội sinh không đủ sức cân bằng, cơ thể sẽ sinh ra rối

loạn bệnh lý. Đối với những người có tuổi, cần đặc biệt chú ý tới hoạt động
của các gốc tự do trong cơ thể.

Người ta đã chứng minh, khi có sự tăng quá
nhiều gốc tự do sẽ gây ra tình trạng viêm nhiễm ở các cơ quan, các bệnh lý
như tim mạch, ung thư và nhất là sớm bị lão hóa
.
Do đó cơ thể nên tăng sự
sinh các chất chống oxy hóa có hại bằng cách có chế độ ăn uống hợp lý (ăn
nhiều rau quả, trái cây…), bảo vệ môi trường, thường xuyên vận động, không
sử dụng các chất kích thích có hại cho sức khỏe như rượu, bia, thuốc lá…


1.3.2. Chất chống oxy hóa
Các nhà khoa học đã tìm ra được những chất chống lại các gốc tự do,
những chất đó gọi là chất chống oxy hóa. Chất chống oxy hóa được chia
thành hai loại tùy thuộc vào việc chúng hòa tan trong nước hoặc lipid. Các
hợp chât này có thể được tổng hợp trong cơ thể hoặc đưa vào cơ thể qua thức
ăn, các loại thực phẩm bổ sung.

Chất chống oxy hóa được sử dụng rộng rãi như thành phần trong chế
độ ăn uống để duy trì sức khỏe và ngăn ngừa bệnh ung thư và bệnh tim mạch.
Chất chống oxy hóa cũng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm giúp bảo về
chống lại sự hư hỏng của thực phẩm.
Hội nghị Quốc Tế và chống các gốc tự do đã nhất trí đưa ra những chất
có tác dụng chống oxy hóa là vitamin E, Bêta Caroten, vitamin C, Selen.
Ngoài ra chế độ ăn giàu acid béo đơn không no như Olesic có khả năng hạn
chế oxy hóa .
Những thực phẩm giàu vitamin: giá đỗ, hành tây, dầu thực vật.
14

Những thực phẩm giàu Bêta Caroten: gấc, cà rốt, bí đỏ, đu đủ, xoài, các
loại rau có màu xanh thẫm (rau ngót, rau muống, rau dền, rau đay, mồng tơi).
Những thực phẩm giàu Selen: tỏi ta, tôm đồng, gạo, ngô vàng, thịt lợn
nạc, lòng đỏ trứng.
Những thực phẩm giàu vitamin C: tất cả các loại rau, quả, nhiều nhất là
rau ngót, cà chua, rau thơm. Các loại quả như bưởi, cam, quýt, chuối.
Dầu thực vật giàu acid béo không no: dầu đậu tương, dầu lạc, dầu
vừng, dầu hướng dương, dầu gan cá.



















15

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Artemia
Artemia được chọn để nghiên cứu trong đề tài này có tên khoa học là
Artemia franciscana.
Hệ thống phân loại như sau:
Ngành: Arthropoda
Lớp: Crustacea
Lớp phụ: Brachiopoda
Bộ: Anostraca
Họ: Artemidae
Giống: Artemia
Loài: Artemia franciscana









Hình 2.1. Hình ảnh Artemia franciscana
16

Artemia franciscana sử dụng trong nghiên cứu này là đối tượng nuôi
thương phẩm được thu nhận từ trại nuôi ở Tân Ngọc- Ninh Ích- Ninh Hòa-
Khánh Hòa. Quy trình thu mẫu và xử lý mẫu được trình bày ở hình 2.2.

Hình 2.2. Quy trình thu và xử lý mẫu
Nguyên liệu từ trại nuôi được bảo quản sống trong các túi nilong có
chứa nước. Do thời gian vận chuyển ngắn (khoảng 1 giờ) nên không cần sục
khí. Nguyên liệu được đưa đến phòng thí nghiệm, sau đó nguyên liệu được
cho vào rổ có lót vải sạch bên trong để khi rửa nguyên liệu không rơi ra ngoài
qua các lỗ rổ vì nguyên liệu rất nhỏ. Nguyên liệu được rửa sạch dưới vòi nước
Artemia

Bảo quản sống
Vận chuyển về phòng
thí nghiệm
Sốc lạnh
Đưa vào thí nghiệm
Bảo quản đông
Xác định thành phần
hóa học

17

chảy khoảng 10 phút, chú ý nhặt sạch rác, các động vật thủy sinh lẫn trong
nguyên liệu. Sau đó sốc lạnh bằng nước đá trong khoảng 5 phút, để ráo rồi
cho vào túi PE (100g/túi) đem bảo quản đông, trước khi làm thí nghiệm mẫu
được đưa đi rã đông ở nhiệt độ phòng.
2.1.2. Enzyme
Enzyme Protease sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm Neutrase,
Flavourzyme, Protamex. Đây là các chế phẩm protease thương mại của hãng
Novozymes, Đan Mạch. Nhiệt độ và pH tối thích của các enzyme sử dụng
được thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.1. Nhiệt độ và pH tối thích của các chế phẩm protease thương mại
Enzyme Số đơn vị hoạt
độ (AU/g)
t
o
opt
(
o
C) pH
opt
Protamex 1,5 50 7-8
Neutrase 1,5 40-50 7
Flavourzyme 1,5 50-55 6-7,5

2.1.3. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này là hóa chất phân tích, bao gồm:
- Methanol
- 2,2- diphenyl-1-picryhyrazyl (DPPH)
- Đệm phosphate

- Potassium ferricyanide
- Trichloro acetic acid
- Ferric chlorid