Nghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.26 MB, 203 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** </b>

<b>NINH THỊ KIM THU </b>

<b>NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ CỦA HỆ </b>

<b>TIỂU PHÂN NANO PHỐI HỢP </b>

<b>PACLITAXEL VÀ DIHYDROARTEMISININ </b>

<i><b>LUẬN ÁN TIẾN SĨ </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** </b>

<b>NINH THỊ KIM THU </b>

<b>NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ CỦA </b>

<b>HỆ TIỂU PHÂN NANO PHỐI HỢP </b>

<b>PACLITAXEL VÀ DIHYDROARTEMISININ </b>

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 9720202

<b>Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến GS.TS. Chi-Ying F. Huang </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai khác cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào.

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Đầu tiên, tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến hai người thầy của tôi là:

<i><b>GS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến GS. TS. Chi-Ying F. Huang </b></i>

Hai thầy đã chỉ bảo tận tình và hướng dẫn tôi một cách cụ thể, tâm huyết nhất trong suốt q trình tìm hiểu, nghiên cứu và hồn thành luận án.

Tuy nhiên, kiến thức của tơi cịn những hạn chế nhất định nên đã không thể tránh khỏi những thiếu sót và tơi đã nhận được những nhận xét, góp ý quý báu của PGS. TS. Nguyễn Đăng Hòa, GS. TS. Phạm Thị Minh Huệ, PGS. TS. Vũ Thị Thu Giang, PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, TS. Nguyễn Trần Linh, TS. Nguyễn Thị Mai Anh, PGS. TS. Trần Thị Hải Yến, PGS. TS. Nguyễn Thạch Tùng, PGS. TS. Nguyễn Thị Thanh Duyên, TS. Phạm Bảo Tùng, TS. Dương Thị Hồng Ánh, TS. Võ Quốc Ánh, TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh, TS. Đào Văn Nam, TS. Nguyễn Thị Trinh Lan, PGS. TS. Vũ Thùy Dương v..v.. để luận án hồn thiện hơn.

Đồng thời, tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị nghiên cứu viên, kỹ thuật viên của Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường đại học Dược Hà Nội, khoa Bào chế - Công nghệ Dược phẩm - Trường đại học Dược Hà Nội, khoa Y Sinh - Trường đại học Quốc gia Yang-Ming Chiao Tung - Đài Loan, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện luận án vừa qua.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp đang công tác tại Khoa Dược và Ban Giám hiệu - Trường Đại học Y Dược Hải Phịng, nơi tơi công tác, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về thời gian để tôi tập trung học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội cùng các thầy cơ phịng Đào tạo Sau đại học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Luận án này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Quỹ Phát triển khoa học và cơng nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano hướng đích chứa kết hợp paclitaxel và dihydroartemisinin, tác dụng hiệp đồng tăng cường trong điều trị ung thư ” có mã số 108.05- 2017.300.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã là động lực khơng nhỏ giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

<i> Hà Nội, ngày 24 tháng 1 năm 2024 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

1.1.2. Tổng quan về dihydroartemisinin (DHA) ... 6

1.1.3. Cơ chế tác dụng hiệp đồng chống ung thư khi phối hợp PTX và DHA ... 8

1.2. Tổng quan về tiểu phân nano lipid – polyme ... 12

1.1.4. Khái niệm tiểu phân nano lipid – polyme ... 12

1.1.5. Phân loại tiểu phân nano lipid – polyme ... 13

1.1.6. Các tá dược hay sử dụng trong tiểu phân nano lipid – polyme ... 16

1.1.7. Phương pháp bào chế tiểu phân nano lipid – polyme ... 21

1.1.8. Phương pháp tinh chế nano bằng cột lọc tiếp tuyến ... 24

1.1.9. Tính chất và một số chỉ tiêu đánh giá tiểu phân nano ... 25

1.3. Một số nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa paclitaxel và dẫn xuất artemisinin sử dụng chất mang PLGA ... 29

1.3.1. Nghiên cứu ngoài nước ... 29

1.1.10. Nghiên cứu trong nước ... 32

<b>CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 34</b>

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ... 34

2.1.1. Nguyên vật liệu ... 34

2.1.2. Thiết bị ... 36

2.2. Địa điểm nghiên cứu ... 37

2.3. Nội dung nghiên cứu ... 37

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

2.4.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng PTX và DHA ... 38

2.4.2. Phương pháp bào chế và tối ưu hóa cơng thức tiểu phân nano PTX-DHA .. 40

2.4.3. Phương pháp bào chế và đánh giá bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA ... 45

2.4.4. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định ... 51

<i>2.4.5. Phương pháp đánh giá khả năng xâm nhập vào tế bào in vitro ... 52</i>

<i>2.4.6. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro ... 53</i>

<i>2.4.7. Phương pháp đánh giá tác dụng chống ung thư in vivo ... 55</i>

3.2. Kết quả bào chế tiểu phân nano PTX-DHA ... 62

3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về quy trình bào chế ... 62

3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về thành phần cơng thức653.2.3. Kết quả tối ưu hóa cơng thức bào chế tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 71

3.2.4. Kết quả đánh giá đặc tính của tiểu phân nano PTX-DHA... 79

3.4. Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA ... 82

3.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm bột đông khơ chứa tiểu phân nano PTX-DHA ... 82

3.4.2. Quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano DHA/PLGA-LEC ... 88

PTX-3.4.3. Kết quả đánh giá đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 90

3.5. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở đề xuất ... 96

3.6. Kết quả đánh giá độ ổn định ... 97

3.6.1. Kết quả độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano DHA/PLGA-LEC ... 97

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

PTX-3.6.2. Kết quả độ ổn định của hỗn dịch thu được sau khi phân tán bột đông khô

pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 103

<i>3.7. Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào in vitro .. 104</i>

3.7.1. Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào H23 ... 104

NCI-3.7.2. Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào LLC 105<i>3.8. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro ... 106</i>

<i>3.8.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên tế bào </i>H23 ... 107

<i>NCI-3.8.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên tế bào LLC 1093.9. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo ... 109</i>

3.9.1. Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm ... 109

3.9.2. Khả năng ức chế khối u phát triển ... 111

3.9.3. Khối lượng khối u tại thời điểm kết thúc thí nghiệm ... 113

3.9.4. Khả năng kéo dài tuổi thọ của chuột gây u ... 114

3.9.5. Các chỉ số huyết học và hóa sinh tại thời điểm kết thúc thí nghiệm ... 115

<b>CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ... 119</b>

4.1. Về bào chế tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 119

4.1.1. Ảnh hưởng của yếu tố thuộc về quy trình ... 119

4.1.2. Ảnh hưởng của yếu tố thuộc về công thức ... 122

4.2. Về bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 128

4.3. Về đánh giá đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đơng khô ... 133

4.4. Về độ ổn định của bột đông khô pha tiêm ... 137

4.5. Về tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 138

4.5.1. Tác dụng hiệp đồng ức chế tế bào ung thư của PTX và DHA ... 138

4.5.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 141

4.6. Đóng góp mới của luận án ... 145

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

ACN Acetonitril ART Artesunat

CI Chỉ số phối hợp (Combination index) CrEL Cremophor EL

DCM Dicloromethan DHA Dihydroartemisinin DMSO Dimethyl sulfoxid

DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differentiel scanning calorimetry) EE Hiệu suất nano hóa dược chất (Encapsulation efficiency) EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Food and Drug Administration)

<b>HL-60 </b> Ung thư tế bào bạch cầu cấp ở người (human acute leukemia)

<b>KB </b> Ung thư biểu mô miệng ở người (human carcinoma in the mouth) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) ICH Hội đồng quốc tế về hài hịa hóa các u cầu kỹ thuật đối với dược phẩm

sử dụng cho con người (International Conference on Harmonization) KLPT Khối lượng phân tử

KTTP Kích thước tiểu phân trung bình

Lewis lung carcinoma

Nanoparticle (Tiểu phân nano, gọi tắt là nano) PBS Muối đệm phosphat (Phosphate buffer saline) PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) PEG Polyethylen glycol

PLGA Poly (acid lactic-co-glycolic)

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

PVA Polyvinyl alcol PTX Paclitaxel

SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) TB Trung bình

TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TT Thể tích

TEM Hiển vi điện từ truyền qua (Transmission electron microscopy)

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>DANH MỤC CÁC BẢNG </b>

Bảng 1.1. Các hệ vi tiểu phân PLGA trên thị trường ... 18

Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ... 34

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá độ tương thích hệ thống ... 57

Bảng 3.2. Độ đúng của phương pháp HPLC đối với DHA ... 61

Bảng 3.3. Độ đúng của phương pháp HPLC đối với PTX ... 61

Bảng 3.4. Độ chính xác của phương pháp HPLC ... 62

Bảng 3.5. Chỉ số phối hợp của PTX và DHA trên tế bào ung thư NCI-H23 và LLC xử lý bằng phần mềm CompuSyn. ... 66

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của loại chất mang lipid đến một số đặc tính tiểu phân nano .... 67

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt đến đặc tính tiểu phân nano ... 68

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt đến một số đặc tính tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD). ... 68

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA/DC đến một số đặc tính tiểu phân nano ... 69

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ LEC/PLGA đến một số đặc tính tiểu phân nano ... 70

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/pha nước đến một số đặc tính tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD). ... 70

Bảng 3.12. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập ... 71

Bảng 3.13. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa ... 71

Bảng 3.14. Các cơng thức bào chế tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC... 72

Bảng 3.15. Kết quả đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano PTX-DHA/PGLA-LEC ... 73

Bảng 3.16. Công thức tối ưu theo phần mềm MODDE 12.1 ... 78

Bảng 3.17. Kết quả một số đặc tính của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC cơng thức tối ưu ... 78

Bảng 3.18. Một số đặc tính hóa lý của cơng thức PTX-DHA/PLGA-LEC tối ưu ... 79

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô ... 82

Bảng 3.20. KTTP và PDI của mẫu đông khô sử dụng các nồng độ manitol khác nhau (n = 3, TB ± SD). ... 84

Bảng 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đông khô đến chất lượng sản phẩm ... 86

Bảng 3.22. Một số đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa nano PTX-DHA/PLGA-LEC trước và sau khi phân tán trong nước ... 91

Bảng 3.23. Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 97

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

Bảng 3.25. Hàm ẩm, KTTP và phân bố KTTP sau khi phân tán lại của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA bảo quản ở 5 ± 3°C và điều kiện thực. ... 99 Bảng 3.26. Hàm lượng PTX và DHA trong bột đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3<small>o</small>C và điều kiện thực ... 101 Bảng 3.27. Độ ổn định của hỗn dịch nano PTX-DHA sau khi phân tán lại ... 103 Bảng 3.28. Khối lượng khối u tại thời điểm kết thúc thí nghiệm của (A) lô thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg, và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6). ... 113 Bảng 3.29. Thời gian sống sót của chuột bị gây u của (A) lơ thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg, và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6). ... 114 Bảng 3.30. Các chỉ số huyết học tại thời điểm kết thúc thí nghiệm của (A) lơ thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6). ... 115 Bảng 3.31. Các chỉ số hóa sinh tại thời điểm kết thúc thí nghiệm của (A) lơ thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6). ... 117

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ </b>

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của PTX [171], [2] ... 3

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của DHA [14] ... 6

Hình 1.3. Cấu trúc lõi polyme vỏ lipid ngoài cùng gắn PEG của tiểu phân nano lipid – polyme [26]... 13

Hình 1.4. Phân loại nano lipid – polyme gồm: (A) Hệ lipid phân tán trong cốt polyme; (B) hệ lõi polyme, vỏ lipid; (C) hệ lipid – polyme – lipid; (D) hệ bao màng sinh học; và (E) hệ polyme bao liposome [134]. ... 14

Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp và cấu trúc hóa học của PLGA [59] ... 16

Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của PC trong lecithin ... 21

Hình 2.1. Thiết bị lọc tiếp tuyến ... 46

Hình 2.2. Sơ đồ xử lý lọ thủy tinh, nút cao su, nắp nhôm ... 47

Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 48

Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn đơn thành phần, chuẩn hỗn hợp ... 59

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA ... 60

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ PTX ... 60

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của năng lượng siêu âm đến đặc tính của tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD). ... 63

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến đặc tính của tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD). ... 64

Hình 3.6. Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào ung thư NCI-H23 (A) và LLC (B) khi được ủ với PTX, hỗn hợp PTX-DHA ở các tý lệ khác nhau (*p< 0,05, ***p< 0,001). ... 66

Hình 3.7. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Acrysol EL 135 và tỷ lệ PLGA/DC đến KTTP của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ... 75

Hình 3.8. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Acrysol EL 135 và tỷ lệ PLGA/DC đến PDI của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC. ... 76

Hình 3.9. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ lệ PLGA/DC và tỷ lệ dầu/nước đến KTTP nano PTX-DHA/PLGA-LEC. ... 76

Hình 3.10. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ dầu/nước và tỷ lệ PLGA/DC đến LC của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC. ... 77

Hình 3.11. Hình ảnh TEM của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC công thức tối ưu ... 79 Hình 3.12. Đồ thị giải phóng DHA và PTX từ hệ tiểu phân nano theo thời gian ở 2 môi

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

Hình 3.13. Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô với tỷ lệ tá dược tạo bánh 5% (A) và 10% (B), sau khi phân tán lại tại nồng độ tá dược tạo bánh 10%(C) ... 83 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ manitol đến sự thay đổi KTTP và PDI trước và sau khi đông khô ... 84 Hình 3.15. Ảnh hưởng của việc kết hợp các tá dược tạo bánh khác nhau đến sự thay đổi KTTP trước và sau khi đông khô (n = 3, TB ± SD). ... 85 Hình 3.16. Sản phẩm sau đơng khô (A) và sau khi phân tán (B) của các mẫu bột đông khô ở các thời gian sấy sơ cấp 24, 36, và 48 giờ. ... 87 Hình 3.17. Hình ảnh bột đơng khơ pha tiêm trước (A) và sau khi phân tán lại (B) ... 90 Hình 3.18. Hình ảnh TEM của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC sau đơng khơ 92 Hình 3.19. Giản đồ nhiệt vi sai của nguyên liệu (PTX, DHA, LEC, PLGA, manitol (MAN)), hỗn hợp vật lý (PM), và bột đông khơ (NANO) ... 93 Hình 3.20. Phổ XRPD của ngun liệu (PTX, DHA, PLGA, MAN), hỗn hợp vật lý chứa PTX, DHA, PLGA, LEC (HHVL), HHVL + MAN, và bột đơng khơ chứa nano PTX-DHA/PLGA-LEC (NANO) ... 94 Hình 3.21. Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (PTX, DHA), hỗn hợp vật lý (HHVL), bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC (NANO) ... 95 Hình 3.22. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng dược chất từ bột đơng khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA sau khi phân tán lại trong môi trường đệm pH 5,0 và đệm pH 7,4 (n = 3, TB ± SD). ... 96 Hình 3.23. Phổ XRD của PTX, DHA, hỗn hợp vật lý (PTX,DHA, HHVL) và bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ở các thời điểm bảo quản khác nhau ở 5 ± 3°C sau 3, 6, 12 tháng (T3, T6, T12) ... 100 Hình 3.24. Hình ảnh TEM của tiểu phân nano PTX-DHA trong bột đông khô sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C ... 102 Hình 3.25. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng dược chất từ bột đơng khơ pha tiêm sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C ... 102 Hình 3.26. Đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-153 trên dòng tế bào NCI-H23 bằng (A) Kính hiển vi quét laser đồng tiêu cự, (B) Hệ thống dòng chảy (Flow cytometry). ... 105 Hình 3.27. Đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-153 trên dòng tế bào LLC bằng hệ thống dịng chảy (Flow cytometry) ... 106 Hình 3.28. Ảnh hưởng của PTX, DHA, dung dịch hỗn hợp PTX-DHA và tiểu phân nano ở các nồng độ PTX khác nhau lên (A) tỷ lệ sống sót (%), (B) biểu hiện của p-H2AX và (C) sự kết tụ α-tubulin tương ứng của tế bào NCI-H23. ... 108

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Hình 3.29. Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào LLC khi được ủ với PTX, dung dịch hỗn hợp PTX-DHA và tiểu phân nano ở các nồng độ PTX khác nhau (n = 6) ... 109 Hình 3.30. Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm (g/con) của (A) lô thử với liều PTX là 2,5 mg/kg và 5 mg/kg và (B) lô thử với liều PTX là 7,5 mg/kg (nano:hỗn dịch nano PTX-DHA, free: dung dịch hỗn hợp PTX/DHA) theo thời gian ... 110 Hình 3.31. Thể tích khối u theo thời gian của (A) lơ thử với liều 2,5 mg PTX/kg và 5 mg PTX/kg và (B) lô thử với liều 7,5 mg PTX /kg (nano:hỗn dịch nano PTX-DHA, free: dung dịch hỗn hợp PTX/DHA); (C) phần trăm ức chế khối u của tất cả các lô thử nghiệm (n = 6). ... 112

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Paclitaxel (PTX) là một hoạt chất thu được từ dịch chiết cây thông đỏ (tên khoa học <i><b>Taxus wallichiana Zucc., họ Thơng đỏ Taxaceae</b></i>) có tác dụng độc tế bào. Năm 1992, PTX đã được FDA phê duyệt để điều trị ung thư buồng trứng, sau đó là nhiều bệnh ung thư khác như ung thư vú, ung thư phổi [62]. Mặc dù vậy, việc sử dụng PTX bị hạn chế mạnh mẽ do độc tính cao và chỉ tồn tại trong thời gian ngắn. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng những thất bại này chủ yếu là độc tính khơng chọn lọc trên tế bào ung thư và tính khơng đồng nhất của các tế bào khối u, dẫn đến tình trạng kháng thuốc [143]. Hiện tại, liệu pháp phối hợp thuốc đang thể hiện là biện pháp linh hoạt để giải quyết các vấn đề nêu trên nhằm ngăn chặn sự phát triển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư hiệu quả hơn. Các tác nhân chống ung thư khó có thể đạt được lợi ích tối đa trong điều trị ung thư. Chúng được đi kèm với các loại thuốc bổ sung theo cách nhắm mục tiêu khác chống lại các tế bào ung thư. Cụ thể, sự kết hợp giữa PTX và carboplatin hoặc vinorelbine, được áp dụng trên lâm sàng để điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, cho thấy hiệu quả điều trị đáng kể so với liệu pháp đơn trị liệu [182].

Trong khi đó, dihydroartemisinin bên cạnh tác dụng chống sốt rét được chứng minh, cịn có tác dụng chống lại nhiều loại tế bào ung thư vú, ung thư buồng trứng và ung thư khối u ác tính. Đáng chú ý, nó sở hữu đặc tính chọn lọc thuận lợi là gây độc cho tế bào ung thư nhưng lại an tồn đối với các tế bào bình thường, đặc biệt trong trường hợp hóa

<i>trị liệu kết hợp, điều này sẽ có lợi cho khả năng tương thích sinh học sau khi dùng in </i>

<i>vivo [188], [158], [77]. Dựa trên lý do này, sự phối hợp giữa paclitaxel và </i>

dihydroartemisinin có thể nâng cao hiệu quả điều trị, giảm tác dụng phụ và tránh hiện tượng kháng thuốc khi sử dụng PTX đơn thuần.

Tuy nhiên, PTX thực tế không tan trong nước (< 0,5 mg/l) với đặc tính thấm kém (thuốc BCS loại IV), dẫn đến chỉ số điều trị thấp [47], [89], [156]. Hiện nay, các công thức PTX được bán trên thị trường thường xuyên được sử dụng là Taxol®. Taxol® sử dụng hỗn hợp dung môi ethanol và Cremophor EL (tỷ lệ 50:50) [81]. Các dung mơi được sử dụng để hịa tan loại thuốc này làm cho PTX khó dung nạp khi sử dụng và bệnh nhân thường cần dùng thêm với thuốc chống viêm trước khi điều trị để giảm thiểu phản ứng với dung mơi. Hơn nữa, nó cịn gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng như giảm

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

bạch cầu, dễ bị nhiễm trùng, phản ứng dị ứng, rụng tóc, nơn mửa và tiêu chảy, cùng nhiều tác dụng phụ khác [58], [149]. Để tránh những nhược điểm này, các công thức bào chế mới không chứa hoặc chứa lượng nhỏ tối thiểu Cremophor EL đang được quan tâm. Hệ mang thuốc kích thước nano có thể khắc phục được hạn chế tan kém của PTX đồng thời tránh những tác động bất lợi do sử dụng Cremophor EL với lượng lớn. Trên thế giới đã có hỗn dịch tiêm Abraxane™ chứa tiểu phân nano paclitaxel albumin, được FDA cấp phép lưu hành vào năm 2005 và châu Âu cấp phép sau đó vào năm 2008 [107], nhưng vẫn chưa có thuốc tiêm nano PTX với chất mang PLGA, cũng chưa có thuốc tiêm phối hợp PTX với thuốc khác.

Hệ nano được coi là hệ thống phân phối thuốc đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư do kéo dài thời gian lưu thông trong máu, tích lũy thuốc ở các vị trí khối u và giảm độc tính phụ thơng qua hiệu ứng tăng cường tính thấm và lưu giữ (EPR). Đồng thời, hệ nano có thể tối đa hóa tác dụng chống ung thư và giảm tác dụng phụ. Bên cạnh đó, hệ nano đã được phát triển như một phương pháp sáng tạo bao gói nhiều dược chất kết hợp vào một hệ duy nhất [80], [119], [54].

<b> Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin” với mục tiêu sau: </b>

<i> 2. Bào chế được bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA quy mơ phịng thí nghiệm. </i>

<i> 3. Đánh giá được tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro và thăm dò tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm của bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<b>CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về dược chất </b>

<b>1.1.1. Tổng quan về paclitaxel (PTX) Công thức cấu tạo </b>

- Công thức cấu tạo:

- Tên khoa học: (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-1,2a,3,4,4a,6,9,10,11,12, 12a, 12b-Dodecahydro-4,6,9,11,12,12b-hexahydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-7,11-methano-5H-cyclodeca[100]-benz[1,2-b]oxet-5-on 6,12b-diacetat, 12-benzoat, 9-ester with (2R,3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserin.

- Tên khác: 5b, 20-Epoxy-1,7b-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2a,4,10b,13a-tetrayl 4,10-diacetat 2- benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropa noat].

- Công thức phân tử: C<small>47</small>H<small>51</small>NO<small>14 </small>

- Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [171], [2]

Hình thức: Dạng tinh thể, màu trắng hoặc gần như trắng.

Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và dễ tan trong methylen clorid [25].

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/mL trong methanol có góc quay cực từ - 49,0° đến - 55,0° ở dạng khan [25], [171].

Trong dung dịch nước, độ ổn định của PTX bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, nồng độ dược chất và pH do xảy ra phản ứng thủy phân ở C<small>10</small>-acetat [162], [46].

<b> Phương pháp định lượng </b>

Do PTX có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 230 nm, nên sử dụng được phương pháp

<i><b>đo quang phổ hấp thụ tử ngoại [84] hoặc HPLC [171] để định lượng PTX trong các mẫu </b></i>

nghiên cứu xây dựng công thức.

Sau khi truyền, thuốc phân bố rộng vào các mơ và dịch cơ thể, có thể bị ảnh hưởng bởi liều và thời gian truyền. Tỷ lệ gắn với protein là 89% đến 98% và không bị thay đổi khi dùng cùng với cimetidin, ranitidin, dexamethason hoặc diphenhydramin. Paclitaxel được chuyển hóa tại gan thơng qua cytochrom P450; isoenzym CYP2C8 và CYP3A4, và tạo ra chất chuyển hóa chủ yếu là 6α-hydroxypaclitaxel. Độ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0 - 15,6 lít/giờ/m<small>2</small>). Độ thanh thải khi thời gian truyền từ 1 đến 6 giờ là 5,8 đến 16,3 lít/giờ/m<small>2</small> và trong trường hợp tiêm truyền trong 24 giờ là 14,2 đến 17,2 lít/giờ/m<small>2 [1]. </small>

Paclitaxel là một thuốc chống ung thư. PTX làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các ống vi thể và làm ổn định các ống vi thể sẵn có do ức chế q trình giải trùng hợp. Do đó, ức chế sự tái cấu trúc bình thường của mạng ống vi thể rất quan trọng ở gian kỳ của quá trình phân bào và cả với hoạt động của ty lạp thể. PTX cũng gây tạo thành các cấu trúc bất thường trong các ống vi thể trong quá trình phân bào, kết quả là phá vỡ các nhiễm sắc thể. Tuy chưa được nghiên cứu kỹ nhưng do cơ chế tác dụng của nó, PTX được coi là chất gây ung thư và độc đối với gen. PTX có thể ức chế sự tăng sinh tế bào và điều hòa đáp ứng miễn dịch [1], [162].

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<b> Tác dụng không mong muốn </b>

Hầu hết các người bệnh dùng paclitaxel đều bị rụng tóc. Gần 90% bệnh nhân bị suy tủy, khi liều càng cao, tần suất tiêm truyền càng lớn và thời gian tiêm truyền càng dài thì nguy cơ càng cao. Tuy nhiên, khi dừng thuốc, bệnh nhân nhanh chóng phục hồi [1], [162].

<b> Chỉ định, liều dùng, chống chỉ định và độc tính cấp Chỉ định </b>

Ðiều trị ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường bằng các muối anthracyclin và muối platinum đã thất bại hay bị chống chỉ định [1], [162]. Ðiều trị ung thư vú di căn khi liệu pháp thông thường với các anthracyclin đã thất bại hoặc khơng thích hợp [1], [162].

Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [2], [148].

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Có thể tiếp tục dùng thuốc cho người bệnh bị blốc nhĩ - thất cấp I và phải theo dõi điện tâm đồ. Ở người bệnh có rối loạn dẫn truyền nặng hơn thì phải ngừng dùng paclitaxel và cần điều trị trợ tim thích hợp [1], [162].

Việc pha thuốc để truyền tĩnh mạch phải do người có kinh nghiệm tiến hành, ở một phịng pha chế thích hợp, tn thủ quy trình pha chế thuốc độc tế bào. Khi pha thuốc cần phải mang găng tay và tiến hành thận trọng để tránh thuốc tiếp xúc với da và niêm mạc. Nếu da bị tiếp xúc với thuốc thì phải cọ rửa kỹ da bằng nước và xà phòng; nếu niêm mạc bị tiếp xúc với thuốc thì phải dùng nước súc rửa thật kỹ [1].

<b>1.1.2. Tổng quan về dihydroartemisinin (DHA) Công thức cấu tạo </b>

- Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử của DHA: C15H24O5

Tên khoa học epoxy-12H-pyrano[4,3,-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol.

Khối lượng phân tử của DHA: 284,35 g/mol [29].

DHA là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, khơng mùi, rất ít tan trong nước và trong dầu. DHA tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether, cloroform.

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

Năng suất quay cực của DHA trong dung môi cloroform [α] = 140-146° (C = 1,0026). C<small>12</small> là một carbon bất đối tạo ra 2 đồng phân quang học α và β. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta chứng minh được DHA tồn tại chủ yếu dạng α, nhưng trong dạng dung dịch thì tồn tại cả 2 dạng.

Nhiệt độ nóng chảy : 145 – 150°C [29].

Các dẫn chất của artemisinin đều rất không ổn định hóa học, bị thủy phân dưới sự có mặt của ion sắt, chất khử sinh học. Trong 3 dẫn chất chính của artemisinin (gồm: artemether, artesunate và dihydroartemisinin), DHA là dẫn chất kém ổn định nhất [172]. DHA ổn định ở pH 2 – 6; môi trường pH < 2 hoặc pH > 6 thúc đẩy sự thủy phân của DHA [131]. Tạo phức với β-cyclodextrin cải thiện độ ổn định của DHA [17].

<b> Phương pháp định lượng </b>

Theo Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển quốc tế 2020, DHA nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột C18 (100 × 4,6 mm, 3 µm), pha động là hỗn hợp ACN và nước theo tỷ lệ 60:40 (tt/tt), bước sóng phát hiện 216 nm [29], [179]. Trên thế giới, các tác giả định lượng DHA theo phương pháp HPLC trong các điệu kiện sau:

<i><b>Bảng 1.1. Các nghiên cứu định lượng DHA theo phương pháp HPLC. </b></i>

<b>Nghiên cứu Đối tượng định lượng Điều kiện định lượng </b>

Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2013) [175].

Hệ 3 thành phần DHA với hydroxypropyl-β-cyclodextrin và lecithin

- Cột C18 (150×4,6 mm, 5 µm). - Nhiệt độ 20<small>o</small>C.

- Pha động: ACN : H<small>2</small>O 65:35 (tt/tt). - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

- Bước sóng phát hiện: 210 nm. Nghiên cứu

của Wang và cộng sự (2016) [176].

Nano PLGA chứa phức hợp của DHA và phospholipid.

- Hệ thống HPLC Agilent 1200 với detector DAD.

- Cột Agilent XDB – C18 (150×4,6 mm, 5 µm).

- Pha động: ACN: đệm phosphate pH 3, 50:50 (tt/tt) (dung dịch NaH<small>2</small>PO<small>4</small> điều chỉnh đến pH 3 bằng H<small>3</small>PO<small>4</small>).

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

- Thể tích tiêm: V=20 ml. - Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút. - Bước sóng phát hiện: 210 nm. Nghiên cứu

của Kefeng Liu và cộng sự (2016) [102].

Nano 8arm-PEG-DHA và TF-8arm-PEG-DHA.

- Hệ thống HPLC Agilent 1200, USA. - Cột C18 (250ì4,6 mm, 5 àm). - Pha ng: ACN : H<small>2</small>O 60:40 (tt/tt). - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 210 nm.

DHA có khả năng liên kết với protein huyết tương 44-93 %. Thời gian bán thải của DHA xấp xỉ 45 phút đến 1 giờ qua con đường glucuronyl hóa ở ruột và gan. Thuốc được thải hồn tồn khỏi vịng tuần hồn trong 8-10 giờ [3]. Khơng có sự khác biệt về các thơng số dược động học theo giới tính [124].

<b> Tác dụng không mong muốn </b>

Một số tác dụng phụ được báo cáo sau khi uống gồm: chóng mặt, ù tai, giảm hồng cầu lưới, giảm bạch cầu trung tính, tăng enzyme gan và hiếm gặp một số bất thường về điện tim.

Hiếm gặp phản ứng quá mẫn nghiêm trọng typ 1 (tỷ lệ xấp xỉ 1/3000 trường hợp) khi dùng dihydroartemisinin hay các dẫn xuất nhóm artemisinin [3].

<b>1.1.3. Cơ chế tác dụng hiệp đồng chống ung thư khi phối hợp PTX và DHA </b>

Phối hợp thuốc đã được sử dụng rộng rãi và trở thành lựa chọn hàng đầu để điều trị

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

các loại thuốc có các cơ chế tác dụng khác nhau, do đó làm giảm khả năng phát triển của các tế bào ung thư kháng thuốc. Khi kết hợp các loại thuốc có tác dụng khác nhau, mỗi loại thuốc có thể được sử dụng với liều lượng tối ưu mà không gây ra tác dụng phụ không thể dung nạp. Đặc biệt, điều trị kết hợp thuốc hữu ích cho những người mắc bệnh ung thư giai đoạn muộn không phù hợp với xạ trị hoặc điều trị bằng phẫu thuật (ví dụ, những người mắc bệnh ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, ung thư thực quản hoặc ung thư bàng quang khơng thể loại bỏ hồn tồn bằng phẫu thuật) [147].

PTX làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các ống vi thể và làm ổn định các ống vi thể sẵn có do ức chế q trình giải trùng hợp. Trong khi đó DHA được chứng minh có tác dụng chống khối u với hai cơ chế tiêu diệt tế bào ung thư. Cơ chế thứ nhất nhờ vào việc tạo ra các gốc tự do oxy hoạt tính thơng qua sự phân cắt đồng nhất của cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R’). Cơ chế thứ hai thông qua sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid và sự thu lấy nước xảy ra sau đó, dẫn đến sự hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton. Hai cơ chế chống ung thư trên đều cho thấy tác dụng dược lý của DHA có liên quan và phụ thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể. Các gốc tự do có thể oxy hóa lipid, gây tổn thương màng tế bào, protein và ADN, gây ra sự tự chết của tế bào ung thư [35], [187]. Với cơ chế tác động như trên, khi phối hợp PTX và DHA có thể giúp tăng cường tác dụng chống ung thư hơn so với dùng từng dược chất đơn lẻ.

Một trong những cơ chế nữa được xem xét khi phối hợp thuốc là phối hợp các thuốc tác động lên giai đoạn phát triển khác nhau của tế bào ung thư. Tế bào có 4 giai đoạn phát triển chính gồm: G0 = giai đoạn nghỉ (không tăng sinh tế bào); G1 = giai đoạn tổng hợp tiền DNA; S = tổng hợp DNA; G2 = sau tổng hợp DNA; M1 = phân bào có tơ. Thời gian nhân đơi là thời gian cần thiết để một tế bào hoàn thành một chu kỳ phân chia và tạo ra 2 tế bào mới. Các tế bào ung thư, đặc biệt là những tế bào có nguồn gốc từ tủy xương hay hệ bạch huyết có thể có thời gian nhân đơi ngắn hơn và thường có tỷ lệ tế bào ở pha G0 (pha nghỉ) ít hơn. Tế bào u ban đầu tăng sinh theo quy luật hàm số mũ sau đó đạt đến giới hạn khi số tế bào chết đi gần như tương đương với số tế bào mới sinh ra. Tốc độ tăng sinh tế bào chậm dần có thể liên quan tới sự cạn kiệt chất dinh dưỡng và oxy vốn cần thiết cho sự tăng trưởng nhanh của khối u. Nhiều loại thuốc chống ung thư,

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

chẳng hạn như thuốc chống chuyển hóa như PTX, có hiệu quả nhất khi các tế bào đang ở giai đoạn phân chia mạnh. Một số loại thuốc chỉ có tác dụng trong một giai đoạn cụ thể của chu kỳ tế bào và cần duy trì sử dụng trong thời gian dài để ngăn các tế bào phân chia trong giai đoạn nhạy cảm tối đa như artemisinin và dẫn xuất. Artemisinin và dẫn chất được biết làm ngăn chặn sự phân chia tế bào ở giai đoạn sớm, cụ thể là giai đoạn G1/G2, trong khi PTX lại tác động ở pha trung gian. Đây là cơ sở quan trọng để thiết lập thử nghiệm đánh giá tác dụng chống ung thư khi phối hợp hai thuốc với nhau [71]. Những nỗ lực đã được thực hiện trong thế kỷ qua để phát triển chiến lược đánh giá tác dụng hiệp đồng khi nghiên cứu phối hợp thuốc. Trong đó phần mềm Compusyn của Chou và Talalay cho chỉ số CI thống nhất, tin cậy và được trích dẫn nhiều nhất. Tác dụng hiệp đồng của các thuốc đã được xác định bằng chỉ số phối hợp (CI) theo phương pháp Chou và Talalay (CI < 1,0 hiệp đồng tăng cường, CI = 1,0 là hiệp đồng cộng và CI > 1,0 đối kháng).

Trong nước và trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về việc phối hợp PTX và DHA. Cụ thế, vào năm 2014, Yi Chen và các cộng sự nghiên cứu cho kết quả DHA tác dụng hiệp đồng với paclitaxel trong ức chế tế bào ung thư buồng trứng do cùng tác dụng tại kháng thể FOXM1 thông qua con đường truyền tin Raf/MEK/MAPK [26]. Yin Chen và các cộng sự đã chứng minh DHA làm tăng khả năng ức chế của PTX và cisplatin trên các tế bào ung thư buồng trứng SKOV3 và OVCAR3. Tế bào được ủ với riêng từng hoạt chất paclitaxel/cisplatin/DHA hoặc kết hợp trong 72 giờ, sau đó độc tính trên tế bào được đánh giá bởi thử nghiệm sulfarodamin B. Kết quả nghiên cứu cho thấy DHA có tác dụng hiệp đồng tăng cường với PTX (giá trị CI từ 0,6 đến 0,73) và có tác dụng hiệp đồng cộng cùng với cisplatinum (giá trị CI từ 0,98 đến 1,11) trên tế bào SKOV3. Ngồi ra liều thấp DHA (0,5 µM) làm tăng đáng kể tác dụng hiệp đồng tăng cường của sự kết hợp paclitaxel và cisplatinum trên tế bào SKOV3 (giá trị CI từ 0,4 đến 0,83) [26]. Năm 2017, Trần Ngọc Bảo và các cộng sự đã tiến hành bào chế nano chứa artesunat (ART) phối hợp với PTX và nghiên cứu tác dụng hiệp đồng của 2 hoạt chất đó trên dịng tế bào ung thư vú. Tác dụng hiệp đồng của hai thuốc được xác định bằng chỉ số phối hợp (CI), dựa vào đó để lựa chọn tỷ lệ ART và PTX tốt ưu nhất. Kết quả cho thấy tất cả

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

giữa 2 hoạt chất. Nghiên cứu cũng thấy tiểu phân nano ART-PTX có độc tính tế bào mạnh trên ba dòng tế bào ung thư vú. Sự kết hợp của ART và PTX cho kết quả đầy hứa hẹn đối với liệu pháp chống ung thư, đặc biệt là điều trị ung thư vú [165].

Năm 2018, Zin Tao và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống di căn của docetaxel

<i>(DTX) phối hợp với DHA. Tác giả tiến hành xác định độc tính in vitro với DTX và DTX </i>

phối hợp với DHA ở dạng tự do với nồng độ DTX thay đổi từ 0,001 đến 100 µg/mL. Kết quả cho thấy ở nồng độ dưới 10 µg/mL, DTX gây độc tế bào 4T1 nhẹ sau 48h, trong khi đó DTX phối hợp với DHA làm tăng đáng kể tác dụng độc trên dòng tế bào 4T1. Giá trị IC50 của DTX và của DTX phối hợp DHA trên dòng tế bào 4T1 lần lượt là 86,7; 56,7 µg/mL. Kết quả này cho thấy sự phối hợp giữa DTX và DHA gây ra tác dụng hiệp đồng trên tế bào 4T1. Cơ chế của tác dụng hiệp đồng này liên quan tới việc giảm biểu hiện của p-AKT, NF-kB và MMP-2 [165].

Năm 2020, Zhe Li và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của artesunat đối với chức năng của lysosome và mối quan hệ của nó với việc kháng thuốc ở các tế bào ung thư. Kết quả cho thấy chức năng của lysosome được tăng cường đáng kể ở tế bào kháng thuốc paclitaxel (A549/TAX). Khi ủ A549/TAX với artesunat (2,5 – 50 µM) cho thấy chức năng lysosome của tế bào bị ức chế và mức độ ức chế phụ thuộc vào liều artesunat, từ đó gây ra q trình chết tế bào. Đồng thời tế bào A549/TAX có chức năng lysosome càng được tăng cường thì artesunat càng gây ức chế mạnh hơn. Kết quả trên cho thấy artesunat hoặc các chất có khả năng ức chế chức năng lysosome khác có tiềm năng tác dụng trên tế bào ung thư đã kháng thuốc gây ra bởi chức năng lysosome tăng cường [97].

Dựa trên những dữ liệu thực nghiệm được công bố, DHA và dẫn xuất cho thấy tác dụng hiệp đồng chống ung thư với nhóm taxol. DHA có độc tính thấp và sự kết hợp của chúng với thuốc hóa trị cổ điển như PTX có thể làm giảm tác dụng khơng mong muốn ở các mơ bình thường, nhưng lại tăng hiệu quả điều trị tế bào ung thư.

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<b>1.2. Tổng quan về tiểu phân nano lipid – polyme 1.1.4. Khái niệm tiểu phân nano lipid – polyme </b>

Trong vài thập kỷ gần đây, ngày càng có nhiều chế phẩm hệ nano được thử nghiệm lâm sàng – bao gồm: liposome, nano polyme, nanolipid rắn, dendrimers, nano kim loại (vàng, bạc, silica), trong đó một số lượng nhỏ đã được chấp nhận sử dụng trong lâm sàng. Trong số các hệ tiểu phân đó, hệ tiểu phân nano thể hiện tính ưu việt nhất là liposome và nano polyme [123].

Năm 1986, Dior giới thiệu liposome làm mỹ phẩm trên thị trường nhưng vài năm sau liposome đã được mở rộng ra thị trường dược phẩm. Liposome là những vi cầu hoặc nano cầu có hai lớp lipid lưỡng cực, mang cả thuốc kỵ nước và ưa nước, giúp bảo vệ dược chất khỏi môi trường bên ngoài. Liposome được ứng dụng rộng rãi trong vận chuyển thuốc vì tính tương thích sinh học và an tồn thuận lợi của chúng. Một số cơng thức liposome được đưa ra thị trường như liposome daunorubicin (DaunoXome), liposome amphotericin B (Ambisome), liposome morphine (DepotDur). Nhưng việc ứng dụng của liposome bị hạn chế vì hiệu suất thấp đối với các thuốc ít tan trong nước. Trong khi đó nano polyme có khả năng mang các thuốc kỵ nước cao hơn so với liposome, đồng thời việc giải phóng thuốc và kéo dài thời gian tuần hồn trong máu có thể được kiểm sốt bằng cách chọn polyme thích hợp. Tuy nhiên, nano polyme vẫn gặp phải vấn đề về thời gian tuần hồn cũng như tính tương thích sinh học.

Do các hạn chế của liposome và nano polyme, nano lipid-polyme có nhiều ưu điểm hơn so với liposome và nano polyme được ra đời. Nano lipid-polyme là một hệ vận chuyển thuốc với hiệu suất mang thuốc cao, khả năng kiểm sốt giải phóng thuốc tốt, ổn định khi phân phối trong hệ tuần hồn, phân bố đến mơ, tế bào, phân tử đích [123]. Nano lipid-polyme là hệ nano chứa đồng thời 2 thành phần polyme và lipid chứa dược chất ở kích thước nano, kết hợp các tính năng của nano polyme và liposome. Cấu trúc của nano polyme-lipid được thể hiện ở Hình 1.3.

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<i>Hình 1.3. Cấu trúc lõi polyme vỏ lipid ngoài cùng gắn PEG của tiểu phân nano lipid – polyme [26]. </i>

Loại hệ nano này thường bao gồm ba thành phần chức năng riêng biệt: (i) lõi polyme kỵ nước, nơi thuốc ít tan trong nước kém được bao gói; (ii) lớp lipid bao quanh lõi hoạt động như một lớp vỏ có tương thích sinh học cao, đóng vai trò là hàng rào phân tử để lưu giữ thuốc bên trong lõi; và (iii) lớp tàng hình polyme ưa nước bên ngoài vỏ lipid để tăng cường độ ổn định của hệ nano, tránh nhận diện đại thực bào và tăng thời gian tuần hoàn trong máu [123].

<b>1.1.5. Phân loại tiểu phân nano lipid – polyme </b>

Dựa trên sự sắp xếp của lipid và polyme, hệ nano này được phân loại thành các nhóm khác nhau. Trong đó lipid và polyme có thể tồn tại theo các cấu trúc:

- Lõi polyme ở trong, lớp vỏ lipid ở ngoài - Lõi lipid ở trong, lớp vỏ polyme ở ngoài - Phân tán đồng thời

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<i>Hình 1.4. Phân loại nano lipid – polyme gồm: (A) Hệ lipid phân tán trong cốt polyme; (B) hệ lõi polyme, vỏ lipid; (C) hệ lipid – polyme – lipid; (D) hệ bao màng </i>

<i>sinh học; và (E) hệ polyme bao liposome [134]. i. Hệ lõi polyme, vỏ lipid </i>

Đây là loại nano được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm. Cấu trúc của hệ gồm phần lõi là polyme được bao phủ bởi lớp lipid đơn hoặc lipid kép. Khả năng mô phỏng sinh học của lipid và lợi thế cấu trúc của lõi polyme phân hủy sinh học cùng tạo ra hệ mang thuốc tiên tiến. Hệ được ứng dụng đầu tiên trong thiết bị y sinh và chế phẩm sinh học [161]. Tiếp theo đó hệ cũng được ứng dụng để vận chuyển thuốc, protein, gen, kháng thể và vaccin với liều lượng giảm, độc tính thấp và sinh khả dụng tăng. Khả năng duy trì giải phóng dược chất phụ thuộc vào nồng độ, loại và độ dày của polyme ở lõi và lipid ở vỏ được sử dụng [79].

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

cải thiện khả năng tải thuốc ion này. Tính ổn định của hệ được tăng cường hơn nữa bởi lớp vỏ lipid bên ngoài [153].

Phương pháp tiếp cận khác đã được nghiên cứu trong trường hợp hệ nano lõi polyme

<i>vỏ lipid khơng đảm bảo độ ổn định in vivo đó là sử dụng màng tế bào hồng cầu (RBC) </i>

để bao gói thêm lớp lipid bên ngồi. Việc bao gói này làm cho hệ nano có tính tương

<i>thích sinh học tốt, đảm bảo độ ổn định in vivo tối đa, đồng thời hàng rào lipid dày đặc </i>

giúp kéo dài giải phóng dược chất. Tuy nhiên, do hồng cầu từ các nguồn máu khác nhau chứa các kháng nguyên khác nhau, nên có thể xảy ra phản ứng chéo [153].

<i>iii. Hệ vỏ polyme bao lõi liposome </i>

Để bảo vệ liposome cũng như cải thiện độ ổn định, giảm rò rỉ thuốc, tăng cường giải phóng thuốc tới đích, liposome được bao phủ polyme ở bên ngồi. Đầu tiên liposome được hình thành, sau đó chúng được bao phủ lớp polyme ở ngoài bề mặt, do đó sự giải phóng thuốc có thể được biến đổi. Lee và cộng sự đã gói doxorubicin và cisplatin trong cùng tiểu phân nano nhằm đưa thuốc tới tế bào ung thư [95]. Đầu tiên Doxorubicin được gói trong liposome, tiếp đó acid polyacrylic và liên kết diamine liên kết chéo để tạo thành lớp lưới polyme bao quanh liposome doxorubicin. Nhóm carboxylic tự do bên ngoài lớp vỏ được gắn với cisplatin. Hệ nano tạo thành ít gặp các vấn đề về độ ổn định, đồng thời giảm liều dùng cũng như tác dụng không mong muốn cũng được giảm đáng kể [95].

<i>iv. Hệ lipid phân tán trong cốt polyme </i>

Hệ nano này có cốt polyme trong đó các phân tử lipid được phân bố ngẫu nhiên trong cốt polyme [134].

<i>v. Hệ lipid – polyme – lipid </i>

Loại hệ nano này có lớp lipid bao gồm PEG-lipid và lipid trung tính bao quanh một lớp polyme bên trong, lớp polyme này có thể tương tác với lớp lipid cation. So với nano polyme, do lớp lipid cation bên trong chứa các thuốc anion nên nano này có thể mang được đồng thời hai loại thuốc. Ví dụ, việc đồng phân phối cả si-RNA và thuốc phân tử nhỏ vào trong cùng một hệ nano được thực hiện để gây độc tế bào ung thư kháng thuốc [134].

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

<b>1.1.6. Các tá dược hay sử dụng trong tiểu phân nano lipid – polyme </b>

Polyme được sử dụng nhiều nhất là polyme tương thích sinh học bao gồm: acid poly(lactic-co-glycolic) (PLGA), dextran sulfat, polyethylenimin, polyme có nguồn gốc từ dầu đậu nành,… Còn lipid được sử dụng là những lipid đã được phép sử dụng trong dược phẩm như phospholipid, polyethylen glycol (PEG)–lipid, lipid chiết xuất từ sản phẩm thực phẩm (lecithin) hoặc được tìm thấy trong cơ thể (acid béo nội sinh) [189]. Sau đây là 2 tá dược PLGA đại diện cho nhóm tá dược polyme và lecithin đại diện nhóm tá dược lipid.

<b> Vài nét sơ lược về acid poly(lactic-co-glycolic) (PLGA) </b>

PLGA là một copolyme được tổng hợp từ hai monome khác nhau đó là acid lactic (LA) và acid glycolic (GA) với tỷ lệ hai acid này khác nhau (Hình 1.5).

Tỷ lệ của poly (acid lactid) (PLA) và poly (acid glycolid) (PGA) sử dụng cho quá trình tổng hợp polyme khác nhau sẽ thu được các PLGA khác nhau; ví dụ PLGA 75:25 thì sẽ dùng 75% acid lactic và 25 % acid glycolic trong quá trình tổng hợp. Cơ chế tổng hợp khác nhau và các thơng số kiểm sốt trong q trình tổng hợp ảnh hưởng mạnh đến tính chất lý-hóa của PLGA thu được sau quá trình tổng hợp [59]. PLGA thừa hưởng các đặc tính nội tại của các monome cấu thành, cùng với khối lượng phân tử polyme, ảnh

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

của chúng. PGA là polyme ưa nước dạng tinh thể, trong khi đó PLA cứng hơn và kỵ nước; do đó PLGA trùng hợp với tỷ lệ PLA cao hơn ít ưa nước hơn, hấp thụ ít nước hơn và do đó thời gian phân hủy dài hơn [146]. Trong nước, PLGA phân hủy sinh học bằng cách thủy phân liên kết ester giải phóng ra acid lactic và acid glycolic. Acid lactic và acid glycolic đều được chuyển hóa qua chu trình Kreb’s cho sản phẩm cuối cùng là khí carbonic và nước, riêng acid glycolic một phần được đào thải nguyên dạng qua thận, nên hai acid này ít gây độc tính đối với cơ thể [112]. Thời gian phân hủy của PLGA thay đổi tùy thuộc vào khối lượng phân tử và tỷ lệ đồng trùng hợp. PLGA hịa tan trong một số dung mơi phổ biến như: các dẫn chất clorid, tetrahydofuran, aceton, dicloromethan hoặc ethyl acetat. Tất cả những đặc tính của PLGA đã được khai thác trong một số ứng dụng trong việc tăng độ tan, tăng thời gian lưu, tăng hiệu quả đưa thuốc nói chung, và trong hệ phân phối thuốc nói riêng. PLGA được FDA Hoa Kỳ và cơ quan y tế Châu Âu (EMA) chấp thuận cho việc bào chế các dạng thuốc ứng dụng trên cơ thể con người [38].

PLGA là một trong những polyme được nghiên cứu nhiều nhất trong thiết kế và xây dựng hệ mang thuốc do khả năng phân hủy sinh học, tính an tồn sinh học, tương thích sinh học cũng như linh hoạt trong thiết kế cơng thức. PLGA có thể bào chế tạo ra các hình dạng, kích thước và bao gói các phân tử với kích thước khác nhau. Kích thước của tiểu phân nano có thể được xác định ở một mức độ nhất định bởi nồng độ polyme được sử dụng để tổng hợp chúng [59]. Đặc biệt, PLGA làm chất mang trong tiểu phân nano giúp tối ưu hóa sinh khả dụng của thuốc được bao gói do bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy nhanh chóng trong dịch sinh học, giúp vận chuyển thuốc tới đích hoặc tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập nội bào, dẫn đến giảm tác dụng không mong muốn của thuốc [38].

Tiểu phân nano PLGA (PNP) được ứng dụng cho nhiều nhóm thuốc như: rối loạn tế thần kinh, ung thư, chống viêm, tác động lên hệ thống miễn dịch, tim mạch, thuốc có nguồn gốc sinh học như protein, vaccine, acid nucleic. Hơn nữa, PNP có thể dùng được qua đường tiêm, đường uống [121], đường hít [49], tạo sự đa dạng trong việc lựa chọn đường dùng để đảm bảo sinh khả dụng tối ưu của thuốc. Sự phát triển của PNP được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu được trình bày trong các tài liệu chuyên ngành,

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

đồng thời được phát triển tiếp tục trên thử nghiệm lâm sàng hoặc được FDA chấp thuận đưa ra thị trường. Các PNP được FDA chấp thuận được liệt kê trong bảng dưới đây:

<i>Bảng 1.2. Các hệ vi tiểu phân PLGA trên thị trường </i>

<b>Hoạt chất Chỉ định phê duyệt </b>

<b>Năm phê duyệt </b>

Lupron Depot<small>®</small>

Abbot Laboratorie,

Takeda

1989

[18]

Sandostatin Lar<sup>®</sup>

PLGA/ vi cầu

Octreotide

acetate To đầu chi Novartis 1998 <sup>[190] </sup>

PLGA/ vi cầu

Triptorelin pamoate

Ung thư tuyến

tiền liệt <sup>Allergen </sup> <sup>1998 </sup>

[190]

PLGA/ vi cầu

Minocycline HCl

Hỗ trợ trong viêm nha chu

methyl-2-Leuprolide acetate

Ung thư tuyến

tiền liệt <sup>Tolmar </sup> <sup>2002 </sup>

[23]

Risperdal Consta<small>®</small>

PLGA/ vi

cầu <sup>Risperidone </sup>

Tâm thần phân liệt

Janssen Pharmaceuti

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

PLGA/ vi cầu

Exenatide synthetic

Tiểu đường tuyp 2

AstraZeneca

[190]

Signifor Lar<small>®</small>

PLGA/ vi cầu

Pasireotide

pamoate To đầu chi Novartis 2014 <sup>[190] </sup>

PLGA/ vi cầu

Triamcinolone

Viêm xương khớp

Flexion therapeutics

Inc

2017

[122]

Bydureon Bcise<sup>®</sup>

PLGA/ vi

cầu <sup>Exenatide </sup>

Tiểu đường tuyp 2

AstraZeneca

[190]

Triptodur Kit<sup>®</sup>

PLGA/ vi cầu

Triptorelin

pamoate <sup>Dậy thì sớm </sup> <sup>Arbor </sup> <sup>2017 </sup>

[190]

PLGA/ tiểu phân

nano

Buprenorphine

Nghiện các chất dạng thuốc phiện

Với các nhược điểm đó của PLGA, các nhà khoa học đã nghiên cứu nhiều biện pháp, trong đó có biện pháp phối hợp với lipid, tạo hệ nano với đặc điểm hóa lý linh hoạt giảm bớt những hạn chế của nano polyme PLGA, tăng tác dụng điều trị và giảm thiểu tác dụng không mong muốn [111], [114]. Nhiều loại lipid đã được xác định để cải thiện đáng kể tiềm năng điều trị của PNP [75]. Hệ nano PLGA-lipid thể hiện sự kết hợp giữa đặc tính sinh học của lipid và lợi thế cấu trúc của các hạt nano. Hệ nano có tính ổn định

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

tốt, hiệu suất mang thuốc cao, đồng thời lớp lipid phủ bên ngoài làm chậm sự phân hủy PLGA bằng cách hạn chế sự thấm của nước vào trong, do đó tạo điều kiện cho sự giải phóng thuốc đồng đều và liên tục. Ngoài ra, lớp bao lipid bên ngồi lớp polyme mơ phỏng giống như giao diện của lớp bề mặt sinh học, giúp tăng khả năng nhập bào và tăng nồng độ thuốc tại mơ đích [6].

Liu và các cộng sự đã chứng minh rằng nano lipid-polyme với lõi PLGA và vỏ được hình thành từ 1,2-dilauryl phosphatidylcholin khi được nạp coumarin cho khả năng nhập bào hiệu quả hơn khi so sánh với nano polyme chỉ sử dụng PLGA [104]. Trong số các lipid khác nhau, lecithin đã nhận được nhiều quan tâm của các nhà khoa học vì nó hiện diện nhiều trong cơ thể như một thành phần thiết yếu của màng tế bào. Nó được nghiên cứu rộng rãi trong nghiên cứu phân phối thuốc vì tính tương thích sinh học và đã được chấp nhận sử dụng trong các đường dùng thuốc chính như tiêm, uống, trên da. Năm 2016, Seby Elsy Varghese và cộng sự đã bào chế nano polyme lipid (Lecithmer<small>®</small>) sử dụng chất mang là PLGA và lecithin. Cấu trúc vỏ lõi của Lecithmer được thể hiện rõ ràng từ hình ảnh cryo-TEM. Lecithmer làm hệ mang hai dược chất là Daunorubicin (DNR) và lornoxicam (LNX) đã được đánh giá về hoạt tính chống ung thư và chống viêm. Lecithmer mang DNR và LNX có KTTP trung bình lần lượt là ∼335 nm và

<i>∼282,7 nm. Q trình giải phóng DNR in vitro từ Lecithmer chậm hơn so với nano </i>

PLGA, đồng thời DNR giải phóng ở pH 5,5 (80,96 %) cao hơn đáng kể so với pH 7,4 (55,95%). DNR Lecithmer cho thấy khả năng gây độc tế bào vượt trội trên các tế bào K562 hồng cầu ở người. Nghiên cứu dược động học ở chuột Wistar khi sử dụng DNR-Lecithmer đường tiêm cho thể tích phân bố cao hơn, tốc độ thải trừ thấp hơn và thời gian bán thải dài hơn (81,68 L, 0,3535 giờ<small>-1</small>, 1,96 giờ tương ứng) so với DNR ở dạng dung dịch (57,46 L, 0,4237 giờ<sup>-1</sup>, 1,635 giờ). Với những kết quả thu được, Lecithmer được coi là một hệ nano đầy hứa hẹn để vận chuyển thuốc qua đường tiêm [174].

<b> Vài nét sơ lược về lecithin (LEC) </b>

Lecithin là một từ phổ biến để chỉ phospholipid (PL) tự nhiên [135]. Lecithin là một hỗn hợp các phosphatid không tan trong aceton, bao gồm chủ yếu là phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylinositol (PI),

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Thành phần của lecithin thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của lecithin và mức độ tinh chế. Ví dụ, lecithin lịng đỏ trứng chứa 80,5% phosphatidylcholin và 11,7% phosphatidylethanolamin, trong khi lecithin đậu nành chứa 21% phosphatidylcholin, 22% phosphatidylethanolamin và 19% phosphatidylinositol, cùng với các thành phần khác [171], [152].

Trong đó, R1, R2 là các gốc acid béo.

<i>Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của PC trong lecithin </i>

Lecithin tan trong các dung mơi ether, cloroform và các acid béo, tan ít trong benzen, không tan trong các dung môi phân cực [152].

Lecithin được ứng dụng rỗng rãi với vai trị nhũ hóa, gây phân tán, ổn định trong các chế phẩm bơi ngồi da, uống hoặc tiêm. Ngồi ra, lecithin cịn thường được sử dụng trong các hệ nano vận chuyển thuốc khác nhau như liposome, micell, nano lipid rắn, nano lipid-polyme và nhũ tương nano [152], [174].

<b>1.1.7. Phương pháp bào chế tiểu phân nano lipid – polyme </b>

Phương pháp bào chế tiểu phân nano lipid – polyme bao gồm: phương pháp bào chế hai bước và phương pháp bào chế một bước.

<b> Phương pháp bào chế hai bước </b>

Phương pháp bào chế hai bước là phương pháp đầu tiên được sử dụng đề bào chế nano lipid-polyme. Khi bào chế nano lipid-polyme, các nano polyme đã được tạo ra sẵn sẽ được phối hợp, bao bọc bởi các lớp lipid thông qua tương tác tĩnh điện hoặc hấp phụ bề mặt.

Phương pháp bào chế hai bước được phân thành hai loại:

A) Phối hợp nano polyme trực tiếp vào màng lipid đã được làm khô

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

B) Phối hợp nano polyme với các liposome đã được tạo sẵn trước đó bằng phương pháp hydrat hóa màng film.

Trong cả hai loại này, nano được tạo thành nhờ năng lượng bên ngoài tạo thành từ q trình xốy lắc và/hoặc siêu âm hoặc gia nhiệt ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của thành phần lipid. Trên thực tế, do lipid có bản chất sơ nước hay các chất mang có bản chất lipid thường khơng có thế zeta cao nên cần phối hợp thêm các chất diện hoạt ion hóa để thuận lợi cho quá trình hình thành các tương tác tĩnh điện, tạo cấu trúc nano polyme-lipid [6].

Mặc dù phương pháp bào chế hai bước thiết kế được hệ mang PLGA-lipid thông minh để vận chuyển các loại thuốc khác nhau nhưng có một số nhược điểm không thể tránh khỏi. Việc yêu cầu chuẩn bị riêng biệt bước tạo hạt nano PLGA và bước hình thành sẵn liposome/nanocapsule, dẫn tới mất nhiều thời gian và tốn năng lượng, tăng chi phí sản xuất. Trong bối cảnh này, việc điều chỉnh phương pháp hai bước thành phương pháp một bước khơng cần phải có tiểu phân nano polyme tạo sẵn là phương pháp thay thế phổ biến và hiệu quả nhất [60]. Ngoài ra, trong q trình bào chế, dược chất có thể bị rị rỉ ra mơi trường bên ngồi (đặc biệt là các dược chất tan trong nước) trước khi lớp vỏ lipid được hình thành, nên thời gian bào chế kéo dài sẽ dẫn đến sự giảm hiệu suất nano hóa [28].

Ngoài hai phương pháp quy ước đã đề cập ở trên, một số phương pháp khác cũng đã được thực hiện để bào chế nano. Ví dụ, nano polyme có kích thước khoảng 400 – 500 nm bào chế bằng phương pháp phun sấy, được phân tán trong DCM chứa lipid (như tripalmitin, tristearin, cetyl alcol). Hỗn dịch này sau đó được phun sấy lại để tạo các tiểu phân có kích thước trung bình 0,9 – 1,2 µm [69].

<b> Phương pháp bào chế một bước </b>

Phương pháp bào chế một bước chỉ yêu cầu phối hợp lipid và polyme, sau đó các phân tử tự định hình để hình thành cấu trúc nano, khơng địi hỏi nano polyme và/hoặc liposome có sẵn như phương pháp bào chế hai bước.

Phương pháp sử dụng phổ biến nhất là phương pháp kết tủa nano và nhũ hóa bốc hơi

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

diện hoạt ion hoặc không ion (PVA, DMAB, poloxamer, Tween 80…) làm chất ổn định trong quá trình bào chế nano giống như vai trò của chúng trong nano polyme thông thường [123].

Đối với phương pháp kết tủa nano, polyme và dược chất được hòa tan trong dung mơi đồng tan với nước (ví dụ aceton, EtOH), cịn lipid/lipid-PEG được phân tán trong nước. Phải làm nóng pha nước cao hơn nhiệt độ chuyển từ gel sang lỏng để lipid phân tán đồng nhất. Sau đó dung dịch polyme được thêm từ từ vào pha nước, kết hợp với đồng nhất hóa. Do q trình khuếch tán dung môi, polyme bị kết tủa lại, lipid sẽ tự động kết tập quanh các nano polyme. Đầu sơ nước của các lipid sẽ kết tập với tiểu phân polyme, ngược lại, đầu thân nước sẽ hướng ra phía pha nước, tạo ra nano lipid-polyme. Lipid sử dụng trong phương pháp này thường là lipid-PEG, khi đó phần lipid sẽ hướng vào trong cấu trúc nano, phần đầu PEG sẽ hướng ra phía pha nước. Chỉ tiêu quan trọng nhất trong công thức là tỷ lệ khối lượng lipid và polyme.

Đối với phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi, được chia thành 2 cách là phương pháp nhũ hóa đơn và phương pháp nhũ hóa kép.

Phương pháp nhũ hóa đơn được sử dụng cho những dược chất khơng hịa tan trong nước. Trong phương pháp này, pha dầu có chứa polyme/lipid và dược chất được nhũ hóa trong pha nước chứa lipid hoặc dung dịch chất diện hoạt trong điều kiện siêu âm hoặc khuấy liên lục, một nhũ tương D/N được hình thành với lipid tự kết tập quanh lõi polyme tương tự như trong phương pháp kết tủa nano. Tiếp theo, lõi polyme được hình thành do sự bay hơi của dung môi hữu cơ và lipid bao quanh lõi polyme đó [123], [28], [22].

Phương pháp nhũ hóa kép được sử dụng cho các loại dược chất hòa tan trong nước. Đầu tiên, pha nước chứa dược chất được nhũ hóa trong pha dầu chứa polyme và lipid để tạo nhũ tương nước/dầu. Nhũ tương nước/dầu tiếp tục được nhũ hóa trong pha nước chứa lipid-PEG, nhũ tương kép nước/dầu/nước được hình thành. Sau đó, dung mơi pha dầu được bay hơi để tạo ra nano [123].

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

<b>1.1.8. Phương pháp tinh chế nano bằng cột lọc tiếp tuyến </b>

Bất kể phương pháp bào chế, sản phẩm nano vẫn bị lẫn một lượng tạp chất nhất định, một số trong đó có thể gây độc và có thể xuất hiện trong thành phẩm cuối cùng. Các tạp chất này bao gồm dung môi hữu cơ như dichloromethane, chất hoạt động bề mặt, chất nhũ hóa hoặc chất ổn định, dư lượng monome, muối và phân tử polymer khối lượng phân tử lớn [100].Sự hiện diện của các tạp chất này không chỉ gây ra hiện tượng không dung nạp mà cịn cũng có thể làm thay đổi các đặc tính hóa lý và giải phóng của nano. Do đó, việc tinh chế nano là một bước cần thiết để kiểm sốt chất lượng và đặc tính của nano.

Một loạt các phương pháp đã được sử dụng để tinh chế nano. Kỹ thuật ly tâm hoặc siêu ly tâm thường được sử dụng để loại bỏ các dung môi hữu cơ, thuốc tự do hoặc chất ổn định tự do như polyvinyl (PVA) và chất điện giải. Ly tâm hoặc siêu ly tâm, kết hợp với rửa các hạt nano bằng mơi trường thích hợp như nước khử ion, là phương pháp phổ biến nhất để loại bỏ một lượng lớn tạp chất trong quá trình [88], [137]. Tuy nhiên, tác động của lực ly tâm có thể gây ra hiện tượng vón cục và nano khó phân tán lại. Đồng thời, nano nổi trên bề mặt cũng bị thất thốt nếu lực ly tâm khơng đủ, dẫn đến hiệu suất thu được thấp [96].Kỹ thuật lọc tiếp tuyến là một phương pháp lọc mới khắc phục được nhược điểm của các phương pháp lọc trên. Mặc dù nghiên cứu về quy trình này cịn hạn chế nhưng kỹ thuật này có tiềm năng trở thành một kỹ thuật tinh chế hiệu quả với tác động bất lợi tối thiểu lên kích thước hạt nano và khả năng nạp thuốc.

Lọc tiếp tuyến là một kỹ thuật lọc trong đó dung dịch ban đầu đi dọc theo bề mặt của cột lọc. Sự chênh lệch áp suất giữa hai bên màng lọc sẽ đẩy các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn lỗ lọc đi qua cột lọc. Các tiểu phân có kích thước lớn hơn lỗ lọc được giữ lại và đi dọc theo cột, chảy ngược trở lại bình chứa nguyên liệu.

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

(a) (b)

<i>Hình 1.7. Cơ chế lọc của cột lọc tiếp tuyến (a) Nguyên tắc hoạt động của thiết bị lọc tiếp tuyến, </i>

<i>(b) Nguyên tắc lọc của màng lọc tiếp tuyến </i>

Các thông số trong quá trình lọc tiếp tuyến gồm: thơng số của màng lọc (vật liệu tạo màng, kích thước lỗ lọc, chiều dài cột…), áp suất lọc…

Hệ tiểu phân nano là hệ siêu vi tiểu phân, mắt thường khơng nhìn thấy được. Trong khi đó thì các tính chất và đặc điểm của tiểu phân lại gắn rất chặt với sự phân bố và tác dụng của tiểu phân trong cơ thể. Vì vậy kiểm sốt, đánh giá được tính chất của hệ tiểu phân trong quá trình bào chế và sử dụng là hết sức quan trọng [9].

Đây là thông số quan trọng ảnh hưởng đến đặc tính lý học của hệ như hình dạng, bề mặt và phân bố khơng gian. Hình dạng bên ngoài của tiểu phân nano được quan sát bằng các kính hiển vi điện tử và quang phổ hiện đại như sau [9]:

Kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning electron microscopy) là một phương pháp để quan sát trực tiếp các tiểu phân nano, chụp được ảnh tiểu phân có kích thước 10 nm,

</div>