tóm tắt: Tính đa dạng của hệ vi khuẩn và mối liên quan giữa tình trạng nhiễm một số chủng vi khuẩn đường tiêu hoá với ung thư đại trực tràng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (513.39 KB, 27 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Y DƯỢC LÂM SÀNG 108

NGUYỄN DUY TRƯỜNG

TÍNH ĐA DẠNG CỦA HỆ VI KHUẨN

VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA TÌNH TRẠNG NHIỄM MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HÓA

VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Ngành : BỆNH TRUYỀN NHIỄM VÀ CÁC BỆNH NHIỆT ĐỚI Mã số : 9720109

HÀ NỘI - 2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Y DƯỢC LÂM SÀNG 108

1. GS.TS. LÊ HỮU SONG 2. TS. NGÔ TẤT TRUNG

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Nghiên cứu Khoa học Y Dược Lâm sàng 108.

Vào hồi giờ, ngày tháng năm 20

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Viện NCKH Y Dược Lâm sàng 108

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

CHỮ VIẾT TẮT CHÍNH

1. UTĐTT: Ung thư đại trực tràng 2. ĐTT: Đại trực tràng

3. F. nucleatum: Fusobacterium nucleatum

4. B. fragilis: Bacteroides fragilis

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những bệnh ung thư phổ biến trên thế giới. Theo GLOBOCAN 2020, UTĐTT đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc mới và thứ 2 về tỷ lệ tử vong do ung thư. Quá trình sinh bệnh của UTĐTT trải qua nhiều giai đoạn, xuất phát từ các tế bào biểu mô đại trực tràng lành tính. Các tác nhân truyền nhiễm có liên quan tới khoảng 15 - 20% các loại ung thư, trong đó có UTĐTT. Vi khuẩn đường tiêu hố là ngun nhân chính gây viêm đại tràng và liên quan đến sự tiến triển của UTĐTT. Hệ vi khuẩn tại khối u (intratumoral microbiota) có vai trị quan trọng hình thành đáp ứng miễn dịch tại chỗ của vi môi trường khối u và ảnh hưởng đến tiến triển của UTĐTT. Hệ vi khuẩn tại mô UTĐTT, mô gan và hạch di căn bao gồm các vi khuẩn nội bào đặc hiệu cho từng loại khối u khác nhau. Hiện nay,

Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) và Bacteroides fragilis (B. fragilis) đang được chứng minh là có liên quan nhiều đến UTĐTT

thông qua một số cơ chế như gây tăng sinh có chọn lọc dịng tế bào UTĐTT, giúp tế bào ung thư không bị tiêu diệt bởi tế bào diệt tự nhiên (NK) và tế bào lympho T, tạo ra vi môi trường tiền viêm tại khối u và thúc đẩy quá trình kháng trị với hoá chất ở BN UTĐTT. Đo tải lượng

của F. nucleatum và B. fragilis có thể có giá trị trong tiên lượng và

theo dõi điều trị ở BN UTĐTT.

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về đặc điểm hệ vi khuẩn

tại mô UTĐTT và mô gan, hạch di căn cũng như mối liên quan của F. nucleatum và B. fragilis với UTĐTT. Vì vậy, chúng tơi thực hiện đề

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

tài “Tính đa dạng của hệ vi khuẩn và mối liên quan giữa tình trạng nhiễm một số chủng vi khuẩn đường tiêu hoá với ung thư đại trực tràng” với hai mục tiêu sau:

1. Xác định sự đa dạng hệ vi khuẩn tại mô ung thư đại trực tràng và mô gan, hạch di căn ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.

2. Phân tích mối liên quan giữa tình trạng nhiễm F. nucleatum và B. fragilis với giai đoạn bệnh và nguy cơ ung thư đại trực tràng.

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Lần đầu tiên xác định đặc điểm hệ vi khuẩn tại mô ung thư đại trực tràng, mô gan và hạch di căn từ ung thư đại trực tràng: xác định được ngành, chi, loài chiếm tỷ lệ cao ở cả ba loại mẫu mô ung thư; chỉ số đa dạng sinh học alpha tại mô ung thư đại trực tràng cao hơn tại mô gan di căn.

- Tỷ lệ nhiễm F. nucleatum và B. fragilis tại mô đại trực tràng

ở nhóm ung thư cao hơn nhóm polyp, tại mơ ung thư cao hơn mô lành cạnh ung thư.

- Nhiễm F. nucleatum và B. fragilis làm tăng nguy cơ UTĐTT

lần lượt là 3,2 đến 5 lần so với nhóm khơng nhiễm.

- Trung vị tải lượng tương đối F. nucleatum và B. fragilis tại

mơ UTĐTT ở nhóm ung thư cao hơn nhóm polyp, tại mơ ung thư cao hơn mơ lành cạnh ung thư ở nhóm UTĐTT giai đoạn II và III.

- Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng nhiễm F. nucleatum và B. fragilis là một trong những nguy cơ có thể gây ung thư đại trực tràng.

CẤU TRÚC LUẬN ÁN

Luận án gồm 114 trang (không kể tài liệu tham khảo và phụ lục), 4 chương (đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 32 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 25 trang, kết quả nghiên cứu 26 trang, bàn luận 27 trang, kết luận 2 trang), 29 bảng, 9 biểu đồ, 8 hình, 150 tài liệu tham khảo (2 tiếng Việt, 148 tiếng Anh), 2 phụ lục

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Theo GLOBOCAN 2020, ước tính có khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và 10 triệu ca tử vong do ung thư trên toàn thế giới, trong đó UTĐTT đóng góp khoảng 1,93 triệu (10%) số ca mắc mới và 0,94 triệu (9,4%) ca tử vong. Việt Nam có 16426 ca mắc mới được chẩn đoán UTĐTT, chiếm khoảng 9% trong các loại ung thư, đứng hàng thứ năm lần lượt sau ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày.

1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2.1. Khái niệm

UTĐTT là tổn thương ác tính xuất phát từ đại tràng và trực tràng. Hơn 97% UTĐTT là ung thư biểu mô, các loại ung thư khác hiếm gặp như: U lympho ác tính, sarcoma, carcinoid.

1.2.2. Mơ hình và các con đường phát sinh ung thư đại trực tràng

Năm 1990, Fearon và Vogelstein đề xuất mơ hình biến đổi gen nhiều bước trong cơ chế bệnh sinh UTĐTT. Đầu tiên, gen ức chế khối u APC bị bất hoạt ở tế bào niêm mạc đại tràng lành tính, dẫn tới tăng sinh tế bào và hình thành u tuyến sớm. Tiếp theo là đột biến hoạt hóa

ở gen KRAS và đột biến gen DCC cùng với các gen ức chế khối u khác

ở nhiễm sắc thể 18q làm tiến triển thành u tuyến muộn. Sau đó, đột biến gen p53 dẫn tới hình thành tế bào ung thư biểu mơ. Các đột biến tích lũy khác thúc đẩy tế bào ung thư xâm lấn và di căn.

Các con đường biến đổi di truyền chủ yếu ở bệnh nhân UTĐTT gồm con đường mất ổn định nhiễm sắc thể (CIN: chromosomal instability) chiếm khoảng 80% bệnh nhân UTĐTT, con đường mất ổn định vi vệ tinh (MSI: microsatellites instability) chiếm khoảng 15%

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

bệnh nhân UTĐTT và thay đổi di truyền biểu sinh (epigenetic alterations).

1.2.3. Vai trò của vi môi trường khối u trong bệnh sinh ung thư đại trực tràng.

Vi môi trường khối u (tumor microenvironment) đóng vai trị quan trọng trong sự phát triển, tồn tại, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư nói chung và tế bào ung thư đại trực tràng nói riêng. Vi mơi trường khối u về cơ bản bao gồm tăng sinh mạch khối u, các tế bào xâm nhập khối u, chất nền ngoại bào (extracellular matrix - ECM) và các phân tử khác liên quan.

1.2.4. Đặc điểm hệ vi khuẩn tại tổ chức u và tổ chức di căn ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hệ vi khuẩn đường tiêu hoá là cần thiết trong điều hoà đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Hệ vi khuẩn tại khối u (intratumoral microbiota) có vai trị quan trọng hình thành đáp ứng miễn dịch tại chỗ của vi môi trường khối u và ảnh hưởng đến tiến triển của UTĐTT. Hệ vi khuẩn tại khối u có vai trị khác nhau trong miễn dịch chống lại khối u, có thể là tăng hoặc giảm đáp ứng miễn dịch kháng khối u. Hệ vi khuẩn tại mô UTĐTT, mô gan và hạch di căn bao gồm các vi khuẩn nội bào đặc hiệu cho từng loại khối u khác nhau.

1.3. VAI TRÒ CỦA HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HOÁ TRONG CƠ CHẾ BỆNH SINH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.3.1. Đặc điểm hệ vi khuẩn đường tiêu hoá ở người

Trong hệ vi khuẩn đường tiêu hoá ở người, phần lớn vi khuẩn ở ruột non là vi khuẩn Gr (+), có vai trị lên men carbohydrate, vi khuẩn ở đại trực tràng chủ yếu là vi khuẩn Gr (-), chịu trách nhiệm phân huỷ protein và các amino acid. Hệ vi khuẩn ở đại trực tràng gồm các lồi thuộc 4 ngành chính là Firmicutes (chiếm khoảng 64%), Bacteroidetes

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

(23%), Proteobacteria (8%) và Actinobacteria. Sự phân bố của hệ vi khuẩn đường tiêu hoá phụ thuộc vào nồng độ pH.

1.3.2. Một số cơ chế sinh ung thư đại trực tràng liên quan đến hệ vi khuẩn đường tiêu hoá.

* Tương tác giữa yếu tố môi trường và di truyền

Các yếu tố mơi trường như tiếp xúc khói bụi, ô nhiễm, các chất hóa học và một số thói quen ăn uống: uống nhiều rượu, ăn nhiều chất béo và thịt đỏ, ăn ít chất xơ, cùng với những bệnh rối loạn chuyển hóa như tiểu đường, béo phì dẫn đến rối loạn hệ vi khuẩn đường tiêu hoá (dysbiosis). Loạn khuẩn đường ruột dẫn đột biến gen của các gen ức chế khối u, tiền gen sinh ung thư (proto-oncogenes) và các gen sửa chữa DNA đã thúc đẩy quá trình chuyển dạng của các tế bào biểu mơ đại tràng hình thành UTĐTT.

* Q trình viêm và điều hòa miễn dịch

Sự tương tác giữa hệ vi khuẩn đường tiêu hoá và hệ thống miễn dịch của cơ thể thông qua các thụ cảm thể nhận dạng khuôn mẫu (Pattern recognition receptors- PRRs). Chính sự tương tác này đã tạo ra các chất trung gian gây viêm và hoạt hoá các con đường tín hiệu beta-catenin và STAT thúc đẩy hình thành UTĐTT. Ngồi ra, vi khuẩn đường tiêu hố sinh ra các enzym hoạt hoá các chất gây ung thư làm tổn thương DNA và biến đổi gen từ đó hình thành UTĐTT.

* Sự trao đổi chất của các thành phần trong thức ăn

Các axit béo chuỗi ngắn (SCFAs) như butyrate, propionate và acetate là các chất chuyển hóa được sản xuất từ q trình chuyển hóa của vi khuẩn đường tiêu hoá với các thành phần trong khẩu phần ăn. Chất butyrate có thể ức chế histone deacetylase trong tế bào biểu mô đại tràng và tế bào miễn dịch để điều hòa làm giảm các cytokine gây viêm và gây ra hiện tượng chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các dịng tế bào ung thư đại trực tràng. Hơn nữa, butyrate và propionat

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

có tác dụng kích thích tế bào lympho T tạo ra một chất chống viêm mạnh trong mơ hình động vật.

1.3.3. Vai trị của Fusobacterium nucleatum trong cơ chế bệnh sinh

ung thư đại trực tràng.

F. nucleatum đang được chứng minh là có liên quan nhiều đến

UTĐTT thông qua một số cơ chế như gây tăng sinh có chọn lọc dịng tế bào UTĐTT, giúp tế bào ung thư không bị tiêu diệt bởi tế bào NK và tế bào lympho T, tạo ra vi môi trường tiền viêm tại khối u và thúc đẩy q trình kháng trị với hố chất ở BN UTĐTT. Đo tải lượng của

F. nucleatum có thể có giá trị trong tiên lượng và theo dõi điều trị ở

BN UTĐTT.

Đến nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về mối liên quan

giữa F. nucleatum với UTĐTT. Nghiên cứu của Yan và cộng sự (2017), tải lượng F. nucleatum tại mẫu mô ung thư cao hơn tại mẫu mô lành cạnh ung thư (p < 0.001), bệnh nhân có tải lượng F. nucleatum

thấp có thời gian sống thêm khơng bệnh tốt hơn. Ito và cộng sự (2015),

tỷ lệ phát hiện F. nucleatum tại mẫu mô UTĐTT là 56%, cao hơn tỷ lệ

phát hiện trong các mẫu mô polyp đại trực tràng là 24% (p<0,0001).

Mima và cộng sự (2015), tỷ lệ phát hiện F. nucleatum ở nhóm mơ ung

thư cao hơn nhóm mơ lành cạnh ung thư (13% và 3,4%,p<0,001).

Nghiên cứu của Yamaoka và cộng sự (2018), tải lượng của F. nucleatum tại mẫu mô niêm mạc bình thường thấp hơn tải lượng tại

mơ ung thư (p=0,0031).

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về mối liên quan

giữa tỷ lệ phát hiện và tải lượng tương đối của F. nucleatum với ung

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

có khả năng xuyên qua lớp chất nhầy của ruột và hình thành màng sinh

học trên bề mặt biểu mô đường ruột. B. fragilis sinh ra nội độc tố ruột Bacteroides fragilis toxin (BFT), độc tố này gắn với thụ cảm thể

protein bề mặt ở tế bào biểu mô đại tràng (colonic epithelial cell receptor – CEC receptor) và bắt đầu phân cắt E-cadherin. Sự phân cắt E-cadherin giải phóng và làm tăng β-catenin, tạo thuận lợi cho q trình chuyển dạng trung-biểu mơ. Sự phân cắt E-cadherin cũng tạo điều kiện cho việc tăng sản xuất các chemokines như IL-6, IL-8 và IL-1β, từ đó chúng hoạt hóa các con đường tín hiệu NF-κB và MAPK ở tế bào biểu mô đại tràng, tạo ra đáp ứng viêm trong tế bào và các chất sinh UTĐTT.

Nghiên cứu của Boleij và cộng sự (2015), tỷ lệ phát hiện gen gây

độc bft từ B. fragilis ở nhóm mơ ung thư là cao hơn so với nhóm người

khoẻ mạnh (p=0,04). Tỷ lệ phát hiện gen bft tại niêm mạc đại tràng có xu hướng tăng từ giai đoạn sớm đến giai đoạn muộn ở UTĐTT (p = 0,093). Nghiên cứu của Zhou và cộng sự (2016), tỷ lệ phát hiện gen

bft trong mẫu mô ung thư cao hơn tại mô lành cạnh ung thư (p<0,001). Zamani và cộng sự (2020), tỷ lệ phát hiện gen bft trong mẫu mô

UTĐTT là 81%, trong mẫu mơ đại tràng ở nhóm người khoẻ mạnh là

3,8%. Nghiên cứu của Shariati và cộng sự (2021), tỷ lệ phát hiện B. fragilis tại mẫu mô ung thư là 66%, tại mô lành cạnh ung thư là 60%.

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về mối liên quan

giữa tỷ lệ phát hiện và tải lượng tương đối của B. fragilis với ung thư

đai trực tràng.

1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT 16S rRNA METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HOÁ VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG.

1.4.1. Khái niệm.

- gene 16S rRNA, hiện diện ở hầu hết các vi khuẩn và vi khuẩn

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

cổ. Metagenomics là lĩnh vực nghiên cứu về metagenomes - tập hợp các bộ gene của các sinh vật từ mẫu môi trường.

- 16S rRNA metagenomics nghiên cứu thành phần, đặc điểm của các sinh vật dựa trên giải trình tự và phân tích các vùng trình tự chun biệt thuộc

1.4.2. Ứng dụng 16S rRNA metagenomics nghiên cứu mối liên quan giữa hệ vi khuẩn đường tiêu hoá với ung thư đại trực tràng.

Nghiên cứu của Nakatsu và cộng sự (2015), tại niêm mạc đại tràng ở người khoẻ mạnh có 4 ngành vi khuẩn chính cư trú là Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria và Fusobacteria. Tại mô lành cạnh khối u, chủ yếu gặp 2 ngành chính là Bacteroides và Firmicutes. Tại mơ ung thư, 2 ngành chiếm tỷ lệ cao nhất là Fusobacteria và Firmicutes. Tại

mơ UTĐTT, có 5 chủng vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất là Fusobacterium,

B. fragilis, Gemella, Peptostreptococcus và Parvimonas. Hale và cộng

sự (2018), F. nucleatum và B. fragilis chiếm tỷ lệ cao nhất tại mẫu mô

ung thư và mô lành cạnh ung thư. Nghiên cứu của Wei và cộng sự

(2016), các ngành vi khuẩn chính trong các mẫu mô ung thư là

Proteobacteria (33,8% - 49,4%), Firmicutes (16,9% - 22,7%),Bacteroidetes (21,1% - 27,9%) và Fusobacterium (3,38% - 10,8%).

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào ứng dụng 16S rRNA metagenomics để tìm hiểu mối liên quan giữa hệ vi khuẩn đường tiêu hoá với ung thư đại trực tràng.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

2 1−𝑝

* Tiêu chuẩn lựa chọn

BN lựa chọn vào nghiên cứu thỏa mãn các điều kiện sau:

- BN được chẩn đoán xác định polyp đại trực tràng và UTĐTT bằng xét nghiệm mơ bệnh học. Tiêu chuẩn chẩn đốn polyp ĐTT và UTĐTT theo hướng dẫn của Bộ Y Tế (2018) và WHO (2019). - BN đồng ý tham gia vào nghiên cứu.

- BN có kèm theo ung thư khác.

- BN không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Tại Viện điều trị bệnh tiêu hóa, khoa Giải phẫu bệnh lý và Trung tâm nghiên cứu Y học Việt – Đức thuộc BVTƯQĐ108. Từ tháng 03 năm 2015 đến tháng 12 năm 2020.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Theo phương pháp nghiên cứu mơ tả cắt ngang, có so sánh giữa các nhóm.

2.2.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu

Cỡ mẫu trong nghiên cứu được tính tốn dựa vào cơng thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mơ tả xác định một tỷ lệ.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

- Xét nghiệm định lượng nồng độ CEA.

- Polyp ĐTT: đánh giá về vị trí, kích thước, đặc điểm đại thể. - UTĐTT: đánh giá vị trí, kích thước, mức độ chiếm lòng ĐTT.

Theo phân loại của WHO 2019.

Xác định sự đa dạng hệ vi khuẩn tại mơ UTĐTT và mơ gan, hạch di căn.

Phân tích mối liên quan giữa F. nucleatum và B. fragilis với ung thư

đại trực tràng.

2.2.4. Nguyên vật liệu nghiên cứu

- Hố chất LightCycler® 480 Probes Master Mix – Roche. Hệ thống máy đọc tín hiệu huỳnh quang AriaMx Real-Time PCR; Máy đo quang (NanoPhotometer® P 300, Implen, Germany).

- Hệ thống máy giải trình tự gen thế hệ mới Illumina MiSeq.

2.2.5. Chỉ tiêu nghiên cứu

Đặc điểm về tuổi và giới, vị trí polyp và UTĐTT, giai đoạn bệnh.

* Nồng độ CEA huyết tương.

* Chỉ tiêu mô bệnh học: Đánh giá vi thể polyp ĐTT và UTĐTT theo WHO 2019.

* Chỉ tiêu xét nghiệm 16S rRNA metagenomics:

- Thành phần hệ vi khuẩn tại mẫu mô UTĐTT, mô gan và hạch di căn từ UTĐTT.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

- Chỉ số đa dạng sinh học alpha: thể hiện cấu trúc quần thể sinh vật tại môi trường nhất định và gồm các chỉ số Observer OUT, Chao1, Shannon. Eveness.

- Chỉ số đa dạng sinh học beta: thể hiện sự khác biệt về thành phần và phân bố hệ vi khuẩn giữa các mẫu khác nhau.

- Chỉ thị sinh học (Biomarker analysis):

+ Phân tích LefSe: xác định các đặc trưng (sinh vật, OTU, ASV, gene, chức năng, ...) có thể dùng để giải thích cho sự khác biệt giữa các nhóm mẫu.

+ Phân tích ANCOM-BC: Xác định sự thay đổi cấp log2 về tỷ lệ vi sinh vật giữa các 2 nhóm mẫu và thanh khoảng tin cậy 95%. * Chỉ tiêu xét nghiệm Realtime PCR:

- Tỷ lệ nhiễm F. nucleatum và B. fragilis tại mẫu mô polyp, mô

ung thư và mô lành cạnh khối u đại trực tràng.

- Tải lượng tương đối F. nucleatum và B. fragilis tại mẫu mô

polyp, mô ung thư và mô lành cạnh khối u đại trực tràng.

</div>