Nghiên cứu tạo chế phẩm hệ vi khuẩn nitrate hoá bằng phương pháp cố định trên giá thể bacterial cellulose và đá san hô

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM HỆ VI KHUẨN
NITRATE HOÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH
TRÊN GIÁ THỂ BACTERIAL CELLULOSE VÀ
ĐÁ SAN HÔ




CBHD:
PGS. TS. NGUYỄN THUÝ HƯƠNG
SVTH:
NGUYỄN TẤN ĐỨC
MSSV: 60604107

LƯU HÙNG MINH
MSSV: 60601470



i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài Luận văn Đại Học, chúng tôi đã nhận
được sự hỗ trợ tinh thần và vật chất rất quý báu từ Thầy Cô, bạn bè và gia
đình. Nhờ sự động viên, chỉ dẫn và giúp đỡ của mọi người nên chúng tôi
đã vượt qua những khó khăn để hoàn thành tốt nhất đề tài này.
Trước hết xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn Thuý Hương –
Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa TPHCM đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo dõi sát tiến trình thí
nghiệm. Cô đã giúp chúng tôi có cách tiếp cận tốt hơn khi giải quyết
những vấn đề trong quá trình phân lập giống và thử nghiệm hoạt tính chế
phẩm.
Xin cảm ơn ThS. Lê Tiến Dũng, trường Trung học Thuỷ Sản TPHCM
vì đã giúp chúng tôi rất nhiều về hoá chất và dụng cụ trong quá trình thực
hiện lên men hệ vi khuẩn nitrate hoá. Trong thời gian thử nghiệm chế
phẩm với Thầy ở Cần Giờ, chúng tôi có cơ hội tiếp xúc với người nuôi
tôm và qua đó rút ra những bài học quý báu trong việc ứng dụng chế phẩm
vi sinh vào thực tế.
Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô và các anh chị phụ trách
Phòng Thí Nghiệm 102, 108 và 117 của Bộ môn Công nghệ Sinh Học,
Đại học Bách Khoa TPHCM đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và hỗ trợ
chúng tôi sử dụng trang thiết bị thuận lợi và hiệu quả.
Chúng tôi gửi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến Cha, mẹ và
anh chị em trong gia đình vì đã hỗ trợ rất nhiều về tinh thần cũng như vật
chất, giúp chúng tôi có thể an tâm làm thí nghiệm trong thời gian vừa qua.
Ngoài ra, chúng tôi xin ghi nhận và trân trọng sự hỗ trợ nhiệt tình của
các anh chị làm luận văn Cao Học, các bạn sinh viên cùng lớp, các bạn
sinh viên khoá 07 và 08 trong việc hỗ trợ tài liệu, phụ giúp thí nghiệm và
trao đổi, tranh luận về tiến trình thí nghiệm cũng như khả năng ứng dụng
trong tương lai.

ii

TÓM TẮT
Ở các trại ương tôm giống, việc nuôi tôm ở mật độ cao cùng với lượng thức ăn thừa không
được sử dụng đã làm tăng lượng ammonia tự do (NH
3
) trong môi trường nước. Điều này dẫn đến
ấu trùng tôm bị ngộ độc, làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển, năng suất thu hoạch kém
và ô nhiễm môi trường. Đề tài này được thực hiện nhằm tạo ra một loại chế phẩm vi sinh hiệu
quả để xử lý ammonia trong nước nuôi tôm giống. Các bước tiến hành như sau: phân lập hệ vi
khuẩn nitrate hoá từ chế phẩm thương mại; lên men thu sinh khối hệ vi khuẩn nitrate hoá; cố định
vi khuẩn lên các loại giá thể khác nhau và xác định hoạt tính chế phẩm. Hai loại giá thể dùng để
cố định là Baterial Cellulose (BC) đại diện cho nhóm chất mang có bản chất hữu cơ; và giá thể đá
san hô (CR) đại diện cho nhóm chất mang có bản chất vô cơ.
Kết quả cho thấy sau một tháng theo dõi ở tỉ lệ xử lý 1/1000 trong nước biển, chế phẩm BC
có mật độ vi khuẩn 92.10
11
cfu/g có hiệu quả xử lý 35% và hoạt tính trung bình 0,43 mg N-
NH
4
+
/g/L.ngày. Trong khi đó chế phẩm đá san hô tuy có mật độ vi khuẩn thấp hơn, khoảng
74.10
9
cfu/g nhưng hiệu quả xử lý đến 38% và hoạt tính trung bình là 0,45 mg N-NH

4
+
/g/L.ngày.
Xét về khả năng tái sử dụng thì chế phẩm đá san hô tốt hơn về mặt hiệu quả xử lý và cấu trúc giá
thể ổn định.
Chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm là Nitrosomonas mobilis và Nitrobacter vulgaris
được phân lập từ chế phẩm thương mại. Ngoài ra, 6 chủng khác đã được ghi nhận về đặc điểm đại
thể, vi thể đồng thời lưu trữ lại dùng cho các nghiên cứu định danh giống vi khuẩn nitrate hoá
về sau.








iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC BẢNG ix
DANH MỤC ĐỒ THỊ x
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu cần đạt 3
1.3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Quy trình nuôi tôm giống 4
2.1.1 Yêu cầu chung về môi trường nuôi 4
2.1.2 Chu kỳ phát triển của tôm giống 4
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tôm giống 6
2.2 Hệ vi khuẩn nitrat hóa 7
2.2.1 Đặc điểm chung 7
2.2.2 Vi khuẩn oxi hoá ammonia 9
2.2.3 Vi khuẩn oxi hoá nitrite 17
2.2.4 Khả năng bám dính trên chất mang của nhóm vi khuẩn nitrat hóa 23
2.3 Quá trình nitrate hoá 24
2.3.1 Quá trình oxi hoá ammonia ở Nitrosomonas sp. 27
2.3.2 Quá trình oxi hoá nitrite ở Nitrobacter sp. 29
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hoá 33
2.4 Lên men thu sinh khối vi khuẩn 34


iv

2.5 Kỹ thuật cố định tế bào 37
2.5.1 Chất mang cố định tế bào 37
2.5.2 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 38
2.5.3 So sánh tế bào cố định và tế bào tự do 39
2.6 Giá thể hữu cơ bacterial cellulose (BC) 40
2.6.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 40
2.6.2 Vai trò của bacterial cellulose đối với Acetobacter xylinum 41
2.6.3 Các đặc điểm cấu trúc BC 42
2.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo BC 43
2.7 Tổng quan về đá san hô 45
2.7.1 Giới thiệu về san hô 45

2.7.2 Cấu tạo san hô 46
2.7.3 Sinh sản của san hô 47
2.7.4 San hô nhân tạo và đá san hô 49
2.8 Các nghiên cứu liên quan 50
2.8.1 Cố định hệ vi khuẩn nitrate hoá lên bột gỗ 50
2.8.2 Cố định hệ vi khuẩn nitrat hóa trên đất sét 52
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 54
3.1 Vật liệu 54
3.1.1 Giống vi sinh vật 54
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 54
3.1.3 Hoá chất 54
3.1.4 Các loại môi trường 54
3.2 Sơ đồ thí nghiệm 55
3.2.1 Xây dựng bộ sưu tập giống 55
3.2.2 Tạo chế phẩm vi sinh xử lý ammonia và nitrite 56
3.2.3 Giải thích sơ đồ 57
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 57
3.3.1 Khảo sát đặc điểm sinh học 57
3.3.2 Lên men thu sinh khối 61
3.3.3 Tạo giá thể 63
3.3.4 Phương pháp tạo chế phẩm vi sinh 67
3.3.5 Các phương pháp vi sinh 68
3.3.6 Các phương pháp hoá lý 70
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 76


v

4.1 Kết quả xây dựng bộ sƣu tập giống 76
4.1.1 Giống vi khuẩn CKL-1a 76

4.1.2 Giống vi khuẩn CKL-2a 77
4.1.3 Giống vi khuẩn PKL-2 78
4.1.4 Giống vi khuẩn PKL-3 79
4.1.5 Giống vi khuẩn PKL-5 79
4.1.6 Giống vi khuẩn PKL-6 80
4.1.7 Giống vi khuẩn NKL-1 80
4.1.8 Giống vi khuẩn NKL-2 81
4.2 Khảo sát quá trình cố định tạo chế phẩm 82
4.2.1 Giá thể BC 82
4.2.2 Giá thể đá san hô 85
4.2.3 Sơ kết về quá trình cố định vi khuẩn 89
4.3 Thử nghiệm chế phẩm 89
4.3.1 Chế phẩm dạng lỏng 89
4.3.2 Chế phẩm BC 93
4.3.3 Chế phẩm đá san hô 97
4.3.4 Khả năng tái sử dụng 100
4.3.5 Sơ kết hiệu quả giữa các loại chế phẩm 104
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 106
5.1 Kết luận 106
5.1.1 Về bộ sưu tập giống 106
5.1.2 Về khảo sát chế phẩm 106
5.2 Kiến nghị 107
TÀI LIỆU THAM KHẢO 109
PHỤ LỤC 1 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CHẾ PHẨM 112
PHỤ LỤC 2 CÁC ỨNG DỤNG CỦA BACTERIAL CELLULOSE 116
PHỤ LỤC 3 PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN NITRATE HOÁ 118

vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT
AMO
Ammonia monooxygenase
NO
2
-
OR
Nitrite oxidoreductase
HAO
Hydroxylamine oxidoreductase
ETC
Electron transport chain
RET
Reverse electron transport
PMF
Proton motive force
BC
Bacterial cellulose
CR
Coral rock
TAN
Total ammonia nitrogen (NH
3
+ NH
4
+
)
cyt

cytochrome




vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1. Phương pháp dòng chảy qua lớp đệm 2
Hình 1-2. Phương pháp dòng chảy chìm. 2
Hình 2-1. Vòng đời phát triển của tôm sú. 5
Hình 2-2. Chu trình ammonia trong bể nuôi tôm. 7
Hình 2-3. Cây phát sinh loài của hệ vi khuẩn oxi hoá ammonia (màu xanh) và oxi hoá nitrite
(màu đỏ) dựa trên phân tích 16S rRNA. 9
Hình 2-4. Tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi quang học và điện tử . 15
Hình 2-5. Tế bào Nitrosomonas eutropha dưới kính hiển vi điện tử 16
Hình 2-6. Tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử 16
Hình 2-7. Tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử 17
Hình 2-8. Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng que ngắn 21
Hình 2-9. Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10 21
Hình 2-10. Tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử. Lớp vỏ bên ngoài (S) được cấu
tạo gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với nhau 22
Hình 2-11. Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê. 22
Hình 2-12. Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp introcytoplasmic và carboxysome. 23
Hình 2-13. Hướng di chuyển electron dựa trên thế khử của các chất trong tế bào. Những chất khử
luôn là chất cho điện tử, và các chất oxi hoá luôn là chất nhận điện tử. 26
Hình 2-14. Hai giai đoạn của quá trình nitrate hoá. 27
Hình 2-15. Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas. 31
Hình 2-16. Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrobacter 32
Hình 2-17. Kiểu sinh trưởng tế bào vi sinh vật ở một nồi lên men theo mẻ. Sáu pha của chu trình

sinh trưởng là (1) thích nghi, (2) tăng tốc, (3) log, (4) chậm dần, (5) ổn định, và (6) suy vong. 35
Hình 2-18. Hình thái tế bào Acetobacter xilinum. 41
Hình 2-19. BC được tạo từ môi trường tĩnh (a) và môi trường lắc (b). 43
Hình 2-20. Cấu tạo của một polip san hô. 47
Hình 2-21. Cấu trúc đá san hô dưới kính hiển vi điện tử (x 8500). 49
Hình 2-22. Chế phẩm sau khi cố định, kích thước 300-1500µm. Thời gian cố định lần lượt là A:
6h, B: 12h, C: 24h và D: 72h. 51
Hình 2-23. Thiết bị cố định dạng khuấy đảo, dung tích 50L. Sau 4 ngày cố định, khả năng nitrate
hoá của chế phẩm đạt cao nhất. 51
Hình 2-24. Đồ thị thể hiện hoạt lực nitrate hoá của chế phẩm theo thời gian. 51
Hình 2-25. Đồ thị thể hiện hoạt lực phân giải ammonia của chế phẩm ở (a) tỉ lệ 1:4000 (1 viên
trong 4L nước thải), và (b) tỉ lệ 1:10000 (1 viên trong 10L nước thải). 53
Hình 2-26. Cấu trúc lỗ xốp của viên đất sét sử dụng để cố định vi khuẩn. (a) bề mặt bên ngoài
(x100), (b) cấu trúc lỗ bên trong (x600), (c) cấu trúc lỗ ngay trung tâm hạt (x50). 53
Hình 3-1. Qui trình phân lập hệ vi khuẩn nitrate hoá. 58


viii

Hình 3-2. Lên men vi khuẩn nitrate hoá. 2 bình có màu hồng nhạt bên trái lên men Nitrosomonas
S1; bình còn lại lên men Nitrobacter B1. 63
Hình 3-3. BC xử lý tốt và kém. 66
Hình 3-4. Do môi trường bị ô nhiễm và nhiệt độ tăng nên san hô chết (dead coral) ngoài tự nhiên
rất nhiều. Ảnh chụp từ bãi biển Ninh Chử, tỉnh Ninh Thuận. 66
Hình 3-5. Mẫu chuẩn độ từ vàng sang cam. 71
Hình 3-6. Hoá chất dùng để định lượng ammonia. 72
Hình 3-7. Đường chuẩn N-NH
4
+
73

Hình 3-8. Đường chuẩn NO
2
-
75
Hình 2-19. (a) Hệ vi sợi ở BC và (b) ở thực vật, độ phóng đại x5000 117




ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Các môi trường khác nhau dùng nuôi cấy vi khuẩn oxi hoá ammonia. Môi trường 1, 2 và
3 đề xuất tương ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và Krinmel và Harms (1982)
đối với vi khuẩn phân lập từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi Watson (1965) đối với vi khuẩn phân
lập từ biển và môi trường 5 đề xuất bởi Koops và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân lập từ
nước lợ. Tất cả các môi trường đều cần 5 g/l CaCO
3
hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm pH. 11
Bảng 2. Đặc điểm hình thái-sinh hoá của vi khuẩn oxi hoá ammonia. 12
Bảng 3. Các môi trường khác nhau cho vi khuẩn oxi hoá nitrite: môi trường A (khoáng vô cơ) đề
xuất bởi Bock (1893), phân lập vi khuẩn từ đất; môi trường B (khoáng vô cơ) đề xuất bởi Watson
và Waterbury (1971), phân lập vi khuẩn từ biển; môi trường C (hỗn hợp) đề xuất bởi Bock (1983)
và môi trường C (hữu cơ) nhưng không cho NaNO
2
. Chỉnh pH sau khi đã hấp tiệt trùng, thường
sử dụng NaHCO
3
10%. 18
Bảng 4. Đặc điểm hình thái-sinh hoá của vi khuẩn oxi hoá nitrite. 19

Bảng 5. Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các hợp chất vô cơ so với từ glucose (-686
kcal/mol). 24
Bảng 6. Ưu và nhược điểm của một số phương pháp cố định tế bào. 39
Bảng 7. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn nitrate hoá phân lập từ bể ương. 53
Bảng 8. Kết quả khảo sát khả năng phân giải ammonia (mg N-NH
4
+
/L) của giá thể BC. 82
Bảng 9. Kết quả khảo sát khả năng phân giải ammonia (mg N-NH
4
+
/L) của giá thể đá san hô. 85
Bảng 10. Kết quả phân giải ammonia (mg N-NH
4
+
/L) của chế phẩm dạng lỏng. 89
Bảng 10. Kết quả phân giải nitrite (mg NO
2
-
/L) của chế phẩm dạng lỏng 91
Bảng 12. Kết quả phân giải ammonia (mg N-NH
4
+
/L) của chế phẩm BC. 93
Bảng 12. Kết quả phân giải nitrite (mg NO
2
-
/L) của chế phẩm BC. 95
Bảng 13. Kết quả phân giải ammonia (mg N-NH
4

+
/L) của chế phẩm CR. 97
Bảng 13. Kết quả phân giải nitrite (mg NO
2
-
/L) của chế phẩm CR. 99
Bảng 10. Tiêu chuẩn về hàm lượng cho phép ammonia, nitrite và nitrate trong ao nuôi tôm giống
và tôm thương phẩm. 113
Bảng 11. Hệ số chuyển đổi của N-NH
3
trong nước ứng với nhiệt độ và pH. 114
Bảng 12. Các trường hợp xảy ra khi phân lập giống theo cách 1. 119
Bảng 13. Các trường hợp xảy ra khi phân lập giống theo cách 3. 119
Bảng 14. So sánh ưu và nhược điểm của 2 phương pháp phân lập giống. 120




x

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 1. Kết quả phân giải ammonia của giá thể BC được cố định ở các chế độ bẫy hấp phụ. 83
Đồ thị 2. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển. 84
Đồ thị 3. Kết quả phân giải ammonia của giá thể BC được cố định ở các tỉ lệ khối lượng so với
dịch vi khuẩn khác nhau. 84
Đồ thị 4. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển. 85
Đồ thị 5. Kết quả phân giải ammonia của giá thể đá san hô được cố định ở các chế độ bẫy hấp
phụ khác nhau. 87
Đồ thị 6. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển. 87
Đồ thị 7. Kết quả phân giải ammonia của giá thể đá san hô được cố định ở các tỉ lệ khối lượng so

với dịch vi khuẩn khác nhau. 88
Đồ thị 8. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển. 88
Đồ thị 9. Biến động ammonia sau 27 ngày xử lý với các tỉ lệ chế phẩm khác nhau. 90
Đồ thị 10. Hoạt tính trung bình của 1g chế phẩm dạng lỏng (1 ml) ứng với các tỉ lệ khác nhau. . 91
Đồ thị 11. Biến động nitrite sau 27 ngày xử lý với các tỉ lệ chế phẩm khác nhau. 92
Đồ thị 12. Biến động ammonia sau 27 ngày xử lý với các tỉ lệ chế phẩm khác nhau. 94
Đồ thị 13. Hoạt tính trung bình của 1g chế phẩm BC ứng với các tỉ lệ xử lý khác nhau. 95
Đồ thị 14. Biến động nitrite sau 27 ngày xử lý với các tỉ lệ chế phẩm khác nhau. 96
Đồ thị 15. Biến động ammonia sau 27 ngày xử lý với các tỉ lệ chế phẩm khác nhau. 98
Đồ thị 16. Hoạt tính trung bình của 1g chế phẩm BC ứng với các tỉ lệ xử lý khác nhau. 98
Đồ thị 17. Biến động nitrite sau 27 ngày xử lý với các tỉ lệ chế phẩm khác nhau. 99
Đồ thị 18. So sánh mức độ phân giải ammonia và nitrite giữa chế phẩm BC ban đầu và tái sử
dụng lần thứ nhất. 101
Đồ thị 19. So sánh mức độ phân giải ammonia và nitrite giữa chế phẩm đá san hô ban đầu và tái
sử dụng lần thứ nhất. 102
Đồ thị 21. Biến động ammonia và nirtite của 2 mẫu nước biển được xử lý cùng lượng BC. 103
Đồ thị 22. Biến động ammonia và nirtite của 2 mẫu nước biển được xử lý cùng lượng giá thể đá
san hô. 103
Đồ thị 23. Kết quả phân giả của chế phẩm dạng lỏng, BC và đá san hô ở tỉ lệ 1/1000. 104
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU


1

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trước tình hình biến đổi khí hậu diễn ra ngày một gay gắt như hiện nay, việc
hướng đến những quy trình chăn nuôi, trồng trọt theo hướng sinh thái, thân thiện với
môi trường là một đòi hỏi nóng bỏng của xã hội, đặc biệt là ở Việt Nam, khi mà nông
nghiệp vừa là truyền thống lâu đời vừa là đòn bẩy kinh tế đưa cả nước thoát nghèo và

thoát khủng hoảng như lịch sử đã minh chứng. Thời điểm tháng 4/2010, các tỉnh khu
vực ven biển và đồng bằng sông Cửu Long đã gánh chịu sự hạn hán, nhiễm mặn
nghiêm trọng gây nguy hại đến an ninh lương thực của cả nước và trên thế giới. Bài
toán cho một nền nông nghiệp bền vững hiện đang đặt ra cho các nhà khoa học, nhà
quản lý ở Việt Nam phải giải quyết nhanh, mạnh và kịp thời, nếu không những hệ luỵ
tiếp theo từ sự suy giảm nông nghiệp sẽ rất khó lường.
“Con tôm ôm cây lúa” hiện là mô hình nông nghiệp sinh thái được đánh giá cao
về hiệu quả kinh tế lẫn tác động tích cực lên môi trường, khi luân canh giữa vụ tôm và
vụ lúa thì các chất dinh dưỡng trong vụ tôm sẽ được lúa hấp thụ và do đó giảm bớt
nhiều chi phí hoá chất bón phân. Ngoài ra, nuôi tôm thịt trong điều kiện quảng canh
như vậy sẽ hạn chế dịch bệnh, đảm bảo tôm phát triển bình thường và tận dụng tốt
nguồn nước đang bị xâm mặn như hiện nay.
Bên cạnh mô hình nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh, thì mô hình nuôi
tôm công nghiệp với mật độ cao ở nước ta vẫn là nguồn cung cấp chính cho xuất khẩu.
Thái Lan là nước có lượng tôm xuất khẩu lớn nhất thế giới, sản lượng lên đến 250.000
tấn/năm, theo sau đó là các nước trong khu vực Đông Nam Á với hệ thống nuôi tôm
công nghiệp quy mô lớn, dẫn đến 80% lượng tôm trên thế giới được sản xuất từ khu
vực này. Để đáp ứng nhu cầu về con giống, các trang trại nhân giống tôm đã áp dụng
hình thức nuôi với mật độ rất dày đặc cả tôm giống lẫn lượng thức ăn, vì nuôi trong
những bể cô lập (trung bình thể tích 4 m
3
) nên thức ăn thừa tồn đọng trong bể rất lớn,
khi đó lượng thức ăn này bị phân huỷ ra các hợp chất thứ cấp và cuối cùng về
ammonia do các nhóm vi khuẩn amon hoá thực hiện, chính lượng ammonia này sẽ gây
ảnh hưởng xấu đến chất lượng tôm giống về sau [29].
Để tôm phát triển tốt, cần kiểm soát lượng khí NH
3
tự do trong nước nhỏ hơn 0,1
ppm (ứng với N-NH
4

+
là 1,33-1,53 mg/L ở pH 8,0 và nhiệt độ 28-30
0
C), nếu lượng
ammonia tự do tăng cao sẽ làm tôm ngộ độc, bắt mồi kém, sinh trưởng chậm và dễ
nhiễm bệnh. Thông thường người nuôi thường xuyên luân chuyển đến 40% lượng
nước trong bể để giảm nồng độ các chất thải độc hại, việc làm này đã gây ra tình trạng
phú dưỡng cho các nguồn nước lân cận, dẫn đến tăng nguy cơ xuất hiện tảo độc và vi
sinh vật gây bệnh. Do vậy, việc quản lý nguồn nước trong các trang trại (tôm giống và
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU


2

tôm thịt) là một yêu cầu tiên quyết trong việc nâng cao sản lượng và hạn chế thiệt hại
đến môi trường xung quanh [27, 29].
Hiện có nhiều giải pháp kĩ thuật để kiểm soát nồng độ ammonia tổng số (TAN –
total ammonia nitrogen, gồm NH
3
và NH
4
+
), phương pháp phổ biến là cho nước nuôi
tôm chạy qua một lớp vật liệu xốp, hệ vi khuẩn nitrate hoá được cố định trên đó sẽ tiến
hành chuyển hoá ammonia trong nước thải thành nitrite rồi nitrate, các nghiên cứu liên
quan đã được áp dụng như phương pháp dòng chảy chìm, nitrate hoá hiệu suất cao qua
lớp đệm, hệ thống xử lý liên tục với gel alginate cố định vi khuẩn nitrate hoá… Các
nghiêu cứu này đã tiến hành ở qui mô pilot và đạt được những thành công nhất định.
Cụ thể, hệ thống xử lý nước thải dùng phương pháp dòng chảy chìm đã làm giảm đến
25% lượng ammonia ở trang trại nuôi tôm thương phẩm. Tuy vậy, nhược điểm lớn của

các phương pháp trên chính là chi phí đầu tư ban đầu lớn, tốn kém trong quá trình bảo
trì vận hành, hơn nữa, công nghệ sử dụng khá phức tạp nên khó ứng dụng đối với
những hộ nuôi tôm có quy vừa và nhỏ vốn là thành phần chủ lực trong sản xuất tôm
giống ở những nước Đông Nam Á.


Hình 1-1. Phương pháp dòng chảy qua
lớp đệm [35].

Hình 1-2. Phương pháp dòng chảy chìm [35].
Giải pháp sử dụng trực tiếp chế phẩm vi sinh ngay trong bể nuôi để xử lý ammo-
nia hiện đang được áp dụng nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp xử lý tập
trung. Hai hệ vi khuẩn được sử dụng trong chế phẩm vi sinh thuộc nhóm hoá tự
dưỡng, Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp., đây là những chủng có tốc độ sinh trưởng
chậm, thường có sẵn trong môi trường nước nhưng vì việc thay nước thường xuyên đã
làm rửa trôi hệ vi khuẩn có lợi này, kết quả là hoạt lực nitrate hoá tự nhiên trong bể
nuôi bị giảm đáng kể. Các chế phẩm thương mại hiện nay trên thị trường rất nhiều,
nhưng hiệu quả thật sự thì vẫn chưa rõ ràng bởi các nhà sản xuất thường nói quá hiệu
quả của chế phẩm. Các nguyên nhân dẫn đến sự kém hiệu quả khi sử dụng chế phẩm
vi sinh tự do (dạng lỏng, dạng bột) là chúng thích nghi kém với môi trường nước nuôi
tôm ở từng địa phương, sự cạnh tranh cơ chất với chủng vi sinh vật nội tại trong bể
nuôi và mật độ tế bào trong chế phẩm thường không cao.
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU


3

1.2 Mục tiêu cần đạt
Đề tài này được thực hiện nhằm tìm ra một loại chế phẩm xử lý ammonia trong
nước nuôi tôm giống nhằm giúp nâng cao năng suất thu hoạch. Chúng tôi kết hợp giữa

phương pháp xử lý ammonia bằng vi khuẩn nitrate hoá cố định trên vật liệu đệm ở các
bể xử lý chuyên biệt với phương pháp xử lý ammonia bằng chế phẩm dùng trực tiếp
trong bể nuôi tôm, để làm được việc đó mục tiêu của đề tài này như sau:
1) Phân lập hệ vi khuẩn nitrate hoá từ chế phẩm thương mại.
2) Lên men thu sinh khối hệ vi khuẩn nitrate hoá.
3) Cố định vi khuẩn lên các loại giá thể khác nhau và xác định hoạt tính chế phẩm
nhằm đưa ra loại giá thể phù hợp với điều kiện thực tế. Chúng tôi thí nghiệm
trên giá thể cellulose vi khuẩn (BC) đại diện cho nhóm chất mang có bản chất
hữu cơ; và giá thể đá san hô (CR) đại diện cho nhóm chất mang có bản chất
vô cơ.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Bao gồm 4 nội dung chính:
1) Hệ thống kiến thức về hệ vi khuẩn nitrate hoá từ cơ sở hoá sinh của quá trình
phân giải ammonia và nitrite trong tế bào đến đặc điểm hình thái, sinh hoá và
sinh thái của các giống vi khuẩn tiêu biểu. Kiến thức này làm nền tảng cho việc
phân lập giống và kiểm soát quá trình lên men đồng thời giúp giải thích các kết
quả thí nghiệm hoạt tính chế phẩm.
2) Nghiên cứu đặc điểm cố định tế bào vi khuẩn nitrate hoá lên giá thể BC, một
loại giá thể quan trọng được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực thực phẩm, và
nay mở rộng sang lĩnh vực xử lý nước thải. Xác định thời gian bẫy hấp phụ, tỉ
lệ giữa giá thể và dịch lỏng khi cố định và hoạt lực trên môi trường nước biển
thực tế.
3) Nghiên cứu đặc điểm cố định tế bào vi khuẩn nitrate hoá lên giá thể đá san hô,
một loại giá thể tương đối mới ít có ứng dụng ở dạng là chất mang vi sinh vật.
Xác định các thông số tương tự như đối với giá thể BC.
4) Bước đầu huấn luyện thích nghi hệ vi khuẩn nitrate hoá với điều kiện thực tế,
nhằm đề ra phương pháp huấn luyện phù hợp để tạo ra những chủng vi khuẩn
có hoạt lực ổn định trong những điều kiện môi trường khác nhau.

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


4

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Quy trình nuôi tôm giống
Đối tượng áp dụng của chế phẩm vi sinh của chúng tôi chính là các trại nuôi tôm
giống nói chung, ở đó, người ta nuôi tôm giống trong các bể xi măng 4m
3
, trong môi
trường tối và thường không thay nước trong suốt vụ nuôi (khoảng 30 ngày). Chính vì
vậy, lượng thức ăn thừa tích tụ dưới đáy bể là rất lớn, giải pháp thường sử dụng là xy-
phông đáy (dùng bơm hút cặn ra ngoài), nhưng không thể loại được khí NH
3
hoà tan
trong nước.
Qua việc tìm hiểu sơ bộ cách nuôi tôm giống, yêu cầu chất lượng nước để đảm
bảo tôm phát triển tốt, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm chế phẩm vi sinh
sao cho phù hợp với môi trường nuôi và có hoạt tính phân giải NH
3
cao.
2.1.1 Yêu cầu chung về môi trƣờng nuôi
Nước biển dùng cho trại giống phải trong, sạch, hạn chế phù sa. Chất lượng nước
ổn định, độ mặn dao động ít. Vùng ven biển có đáy cát hay đá với nước tốt và đầy đủ
quanh năm được xem là rất lý tưởng. Trại xây dựng ven bờ biển đáy cát hay đá này
cũng hạn chế chi phí bơm nước và xử lý nước. Ngược lại, những nơi đầm lầy cửa sông
với nhiều phù sa, độ mặn thấp và biến động lớn về chất lượng nước và chịu ảnh hưởng
của nước thải, chất độc từ trong nội địa thì không thích hợp cho trại giống. Cũng cần

tránh xây dựng trại tôm nơi đông đúc cư dân sinh sống hay gần các nhà máy, xăng
dầu, hóa chất vì nguồn nước rất dễ bị ô nhiễm [6].
Môi trường nước thích hợp cho trại ương tôm giống:
o Độ mặn: 20-32 ‰
o Nhiệt độ: 28-32
0
C
o pH: 7,5-8,3
o Oxy hòa tan: 5-10 mg/L
o NH
3
: < 0,1 mg/L
o N-NO
2-
: < 0,02 mg/L
o Kim loại nặng: < 0,01 mg/L
2.1.2 Chu kỳ phát triển của tôm giống
Vòng đời của tôm giống trải qua 4 giai đoạn chính bao gồm giai đoạn trứng; ấu
trùng (gồm 3 giai đoạn phụ: Nauplius, Zoae, và Mysis); hậu ấu trùng (tôm bột
- postlarvae) và tôm giống. Giai đoạn nuôi trong bể ương là từ ấu trùng trở đi, thường
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


5

trong 1 bể người ta nuôi đến 40 vạn ấu trùng và cuối vụ còn trên 20 vạn tôm bột, như
vậy cũng được xem là đợt nuôi thành công.

Hình 2-1. Vòng đời phát triển của tôm sú [6].
2.1.2.1 Giai đoạn ấu trùng

Ngoại trừ một số loài, hầu hết các loài tôm biển đều trải qua các giai đoạn ấu
trùng tương tự nhau gồm Nauplius, Zoae (3 giai đoạn) và Mysis (3 giai đoạn).
o Nauplius: Ấu trùng Nauplius mới nở có chiều dài khoảng 0,3mm, có 3 đôi phụ
bộ và một điểm mắt ở giữa trước. Ấu trùng có tập tính trôi nổi, hướng quang,
dinh dưỡng bằng noãn hoàn.
o Zoae: bao gồm 3 giai đoạn phụ: phân biệt Zoae 1 với Nauplius qua một số đặc
điểm như có carapace tròn, các phụ bộ và gai đuôi phát triển; Zoae 2, ấu trùng
xuất hiện 2 mắt có cuống, chủy có răng, bụng phát triển dài ra. Đôi râu thứ nhất
hướng ra phía trước; Zoae 3 có các gai lưng và gai bụng trên các đốt bụng. Râu
thứ nhất to hơn và có nhiều lông tơ. Các mầm chân ngực xuất hiện phía sau các
phụ bộ miệng. Đặc điểm rõ nhất là chân bụng xuất hiện trước đuôi; Ấu trùng
Zoae có tính ăn lọc, thụ động, thức ăn chính là tảo, có kích cỡ 3-30µm. Tuy
nhiên Zoae vẫn còn sử dụng noãn hoàn trong khi bắt đầu ăn ngoài. Zoae có
tính hướng quang mạnh.
o Mysis: có 3 giai đoạn phụ: Mysis 1 có cơ thể kéo dài, chân ngực phát triển,
telson xuất hiện, chưa có chân bụng; Mysis2 có mầm chân bụng nhưng chưa
phân đốt; Mysis3 có chân bụng phát triển dài gấp đôi so với giai đoạn Mysis2,
chân bụng có 2 đốt. Ấu trùng Mysis dần dần chuyển sang ăn động vật phiêu
sinh, bơi ngửa và giật về phía sau.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


6

2.1.2.2 Giai đoạn hậu ấu trùng
Sau giai đoạn Mysis 3, ấu trùng chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng (tôm bột -
postlarvae) và có hình dạng tương tự như tôm trưởng thành. Postlarvae đầu tiên có
chiều dài khoảng 4,5mm. Các chân bụng có nhiều lông tơ. Postlarvae giai đoạn đầu
một số còn tập tính bơi trong cột nước, phần lớn bắt đầu sống đáy. Từ Postlarvae 6,
tôm chủ yếu sống đáy.

2.1.2.3 Giai đoạn lột xác và tăng trƣởng
Tôm he cũng giống như các loài giáp xác khác, chúng lớn lên nhờ lột xác. Tiến
trình lột xác của tôm trải qua một số giai đoạn chính là tiền lột xác, lột xác, hậu lột
xác, với những diễn biến bao gồm sự kết dính giữa biểu mô và vỏ tôm bị lỏng lẻo ra 
cơ thể nhanh chóng rút ra khỏi vỏ cũ  cơ thể hấp thụ nước để nở rộng vỏ và lớn
nhanh  cơ thể cứng cáp lại nhờ chất khoáng và chất đạm. Do có hiện tượng lột xác
mà quá trình tăng trưởng của tôm không liên tục mà có tính gián đoạn.
Quá trình lột xác của tôm được điều khiển hài hoà nhờ hormone lột xác và
hormone ức chế lột xác. Chu kỳ lột xác là thời gian giữa hai lần lột xác liên tiếp nhau,
chu kỳ này mang tính đặc trưng riêng biệt cho loài và giai đoạn sinh trưởng của tôm.
Chu kỳ lột xác sẽ ngắn ở giai đoạn tôm con và kéo dài khi tôm càng lớn. Ngoài ra, quá
trình lột xác và tốc độ tăng trưởng của tôm còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi rất nhiều yếu
tố như loài, dinh dưỡng, môi trường.
2.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến tôm giống
Các yếu tố môi trường nước có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố, sinh sống, bắt
mồi, tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm. Trong đó, một số yếu tố quan trọng như sau:
o pH: nước có độ pH dưới 4 hay trên 10 có thể gây chết tôm. Khoảng thích hợp
cho tôm là 7-9.
o Độ mặn: khả năng chịu đựng và thích nghị độ mặn có khác nhau tùy loài tôm.
Thông thường các loài tôm nuôi có khả năng chịu đựng độ mặn thấp đến 5-10
‰ hay thấp hơn. Độ mặn cao 45-60 ‰ có thể gây chết tôm. Hầu hết các loài
tôm tăng trưởng tốt ở độ mặn 25-30 ‰.
o Nhiệt độ: nhiệt độ tốt nhất cho tăng trưởng của tôm dao động trong khoảng 25-
30
0
C. Một vài loài có khả năng tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 20
0
C, nhưng nhiệt
độ trên 35
0

C có thể gây chết tôm.
o Oxy hòa tan: hàm lượng oxy hòa tan thấp (0-1,5 mg/L) có thể gây chết tôm tùy
thời gian bị tác động và các điều kiện khác. Hàm lượng oxy hòa tan tốt nhất cho
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


7

tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm nên trong khoảng giữa 3,5 mg/L đến bão hòa.
Oxy hòa tan quá bão hòa cũng gây nguy hiểm cho tôm.
o CO
2
: hàm lượng CO
2
dưới 20 mg/L thông thường chưa ảnh hưởng đến tôm nếu
oxy đầy đủ.
o H
2
S: khí H
2
S rất độc đối với tôm. Khí này ở bất kỳ nồng độ nào nếu có cũng có
ảnh bất lợi đối với tôm. Tuy nhiên, do độ hoà tan trong nước thấp nên khí dễ
bay hơi ra khỏi bể nuôi.
o Ammonia (NH
3
và NH
4
+
): chỉ dạng khí NH
3

mới gây độc cho tôm. Hàm lượng
khí này nếu trên 1mg/L có thể gây chết tôm. Hàm lượng trên 0,1 mg/L cũng gây
ảnh hưởng bất lợi. Ở pH 9 và độ mặn 20 ‰, khoảng 25 % tổng lượng ammonia
ở dạng khí. Vì thế nếu hàm lượng ammonia tổng số (TAN) khoảng 0,4 mg/L
cũng sẽ gây bất lợi cho tôm.
o Nitrite: thông thường, hàm lượng nitrite trong ao nuôi không cao đến mức gây
chết tôm, tuy nhiên, nồng độ cao 4-5 mg/L có ảnh hưởng xấu đến sự phát triển
của tôm.

Hình 2-2. Chu trình ammonia trong bể nuôi tôm [25].
2.2 Hệ vi khuẩn nitrat hóa
2.2.1 Đặc điểm chung
Hệ vi khuẩn này luôn tồn tại ở trong đất và trong nước, đặc biệt những nguồn
nước giàu chất hữu cơ, khi đó chúng sẽ phân giải NH
3
là sản phẩm cuối của quá trình
ammon hoá thành nirite, nitrate thích hợp cho cây trồng sử dụng, hoặc là cơ chất cho
nhóm vi khuẩn phản nitrate khử về khí nitơ (N
2
) tự do. Đồng thời do khả năng linh
hoạt trong việc oxi hoá các hợp chất nitơ (N
2
O, NO, NO
2
-
, NO
3
-
) nên một thời gian dài
người ta xem hệ vi khuẩn này xuất phát chỉ từ một chủng. Nguồn gốc phát sinh nhóm

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


8

vi khuẩn nitrate hoá là từ nhóm vi khuẩn quang hợp do sở hữu chu trình Calvin, cố
định CO
2
tạo thành các hợp chất carbon dự trữ năng lượng [15].
Nhóm vi khuẩn oxi hoá ammonia gồm 2 loại riêng biệt: vi khuẩn cổ oxi hoá am-
monia (AOA) và vi khuẩn oxi hoá ammonia (AOB). Tương tự như vậy cho nhóm vi
khuẩn oxi hoá nitrite. Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tập trung xem xét đặc
điểm hình thái và sinh hoá của chủng vi khuẩn oxi hoá ammonia (AOB) và vi khuẩn
oxi hoá nitrite (NOB) mà 2 dòng tiêu biểu nhất chính là Nitrosomonas sp. và
Nitrobacter sp.
Đặc trưng chung của hệ vi khuẩn nitrate hoá là chúng sống được trong môi
trường khoáng vô cơ và oxi hoá chuyên biệt ammonia, nitrite hoặc nitrate, không sử
dụng glucose, peptone hay các chất hữu cơ khác để thu năng lượng. Vì vậy, các nhà
khoa học xếp chúng vào nhóm khoáng vô cơ tự dưỡng (lithotrophic) để phân biệt với
nhóm heterotrophic sống trên môi trường vô cơ lẫn hữu cơ bao gồm các loài nấm (như
Aspergillus), vi khuẩn dị dưỡng (Bacillus, Paracoccus, Pseudomonas, Thermus,
Azoarcus) cũng sở hữu khả năng oxi hoá ammonia hay nitrite để thu năng lượng,
nhưng hoạt tính rất thấp.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


9


Hình 2-3. Cây phát sinh loài của hệ vi khuẩn oxi hoá ammonia (màu xanh) và oxi hoá

nitrite (màu đỏ) dựa trên phân tích 16S rRNA [19].
2.2.2 Vi khuẩn oxi hoá ammonia
Winogradsky là người đặt nền tảng nghiên cứu về các loại vi khuẩn oxi hoá
ammonia vào năm 1892. Tuy vậy, việc phân lập và nghiên cứu sâu hơn về các loại vi
khuẩn này đã không được tiếp nối nên trong một thời gian dài, người ta chỉ biết đến
chủng Nitrosomonas europaea. Bắt đầu từ năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra
một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


10

và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hoá ammonia khác nhau. Từ đó đến nay,
kiến thức về loại vi khuẩn này liên tục được cập nhập, người ta đã dùng kỹ thuật PCR
để xác định đoạn gen amoA (mã hoá cho trung tâm hoạt động của enzyme chìa khoá
trong quá trình oxi hoá ammonia là ammonia monooxygenase-AOB) và phương pháp
phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridiza-
tion). Với các thành tựu này, việc kiểm soát các loại vi khuẩn oxi hoá ammonia trong
thực tế trở nên dễ dàng hơn rất nhiều [13, 20].
2.2.2.1 Phân lập, giữ giống và nuôi cấy
Để phân lập một loại vi khuẩn nào đó, ta nắm vững nguyên tắc “cơ chất nào thì
sẽ có vi sinh vật loại đó phân huỷ”, vì vậy cần lấy mẫu ở những nơi mà vi khuẩn oxi
hoá ammonia tập trung cao. Tiếp theo, sử dụng phương pháp MPN ứng với một loạt
các loại môi trường nuôi cấy khác nhau nhằm phản ánh tác động của yếu tố môi
trường lên quá trình nghiên cứu. Chẳng hạn, trong quá trình tăng sinh khối từ môi
trường acid, pH thấp và thêm vào urea như nguồn cơ chất sinh năng lượng duy nhất,
người ta có thể phân lập được những chủng trội của vi khuẩn oxi hoá ammonia, có thể
thích nghi trong điều kiện khắc nghiệt. Về tổng quát, hai yếu tố ảnh hưởng quan trọng
nhất là ammonia (NH
3

) và nồng độ muối, tiếp đến là nhiệt độ và pH môi trường.
Sau khi có được công thức môi trường thích hợp nhất cho vi khuẩn oxi hoá am-
monia phát triển, ta sẽ dùng một trong hai cách sau để phân lập là: phương pháp MPN
(số lượng tế bào chắc chắn có thể) dựa trên phân phối Poisson khi phân tích một loạt
mẫu pha loãng theo nhiều tỉ lệ khác nhau vào các ống nghiệm chứa môi trường nuôi
cấy thích hợp hoặc phương pháp trãi đĩa Petri từ mẫu ban đầu. Cần lưu ý là nhóm vi
khuẩn này phát triển cực kì chậm, nên đối với phương pháp MPN thì có thể xác định
mẫu có chứa tế bào vi khuẩn sau 2-3 tuần nuôi cấy (dựa trên sự thay đổi màu sắc do
chất chỉ thị pH gây ra), phương pháp trãi đĩa thì cần chờ đến 6-8 tuần mới thu được
khuẩn lạc.
Các môi trường chuẩn để nhân giống được liệt kê bên dưới, đối với môi trường
giữ giống, thì CaCO
3
(5 g/l) hoặc N-2-hydroxyethyl-piperarine-N’-2’ethanesulfonic
acid (HEPES, 4,77 g/l) được dùng như một chất đệm pH. Khi nuôi cấy, thì pH luôn
được chỉnh bằng NaHCO
3
10%. Giá trị pH tối ưu phụ thuộc vào nồng độ các muối
ammonium thêm vào. 10 mM muối ammonium thêm vào ở pH 8.0 được xem là tạo
điều kiện rất tốt cho quá trình phát triển của vi khuẩn. Nếu nuôi cấy ở thể tích lớn thì
cần phải khuấy hoặc sục oxy. Nhiệt độ 30
0
C là thích hợp với quá trình phát triển của vi
khuẩn. Thời gian cấy chuyền trong khoảng 3-4 tháng, có thể trữ vi khuẩn ở dạng dịch
lỏng chứ không nhất thiết ở dạng thạch nghiêng. Việc lưu trữ bằng phương pháp lạnh
sâu về cơ bản tỏ ra không thành công [20].
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


11

Bảng 1. Các môi trường khác nhau dùng nuôi cấy vi khuẩn oxi hoá ammonia. Môi
trường 1, 2 và 3 đề xuất tương ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và
Krinmel và Harms (1982) đối với vi khuẩn phân lập từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi
Watson (1965) đối với vi khuẩn phân lập từ biển và môi trường 5 đề xuất bởi Koops
và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân lập từ nước lợ. Tất cả các môi trường đều cần
5 g/l CaCO
3
hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm pH.
Thành phần
Môi trƣờng
1
2
3
4
5
Nước cất (ml)
1000
1000
1000

600
Nước biển (ml)



1000
400
NH
4

Cl (mg)


535
1320
500
(NH
4
)
2
SO
4
(mg)
500
130



MgSO
4
.7H
2
O (mg)
40
200
49,3
200

CaCl
2

.2H
2
O (mg)
40
20
147
20

KH
2
PO
4
(mg)
200

54,4

50
K
2
HPO
4
(mg)

87

114

KCl (mg)

74,4


NaCl (mg)


584


Chelated iron FeNaEDTA (mg)

1

1

FeSO
4
.7H
2
O (μg)


973,1


Fe-EDTA (mg)
0,5

Na
2
MoO
4
.2H
2
O (μg)

100

1

(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O (μg)


37,1

MnCl
2
.4H
2
O (μg)

200

2

MnSO
4
.4H
2
O (μg)


44,6


CoCl
2
.6H
2
O (μg)

2

2

CuSO
4
.5H
2
O (μg)

20
25
20

ZnSO
4
.7H
2
O (μg)

100
43,1
100

H
3
BO
3
(μg)


49,4

Phenol red 0,5% (ml)
0,1
1

1

Cresol red 0,5% (ml)


1

1
[20].
2.2.2.2 Đặc điểm về giống
Việc phân loại vi khuẩn này về cơ bản dựa vào hình dáng của tế bào, sau đó là sự
sắp xếp của màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrane). Với các tiêu chí này,
người ta đã phân loại vi khuẩn oxi hoá ammonia thành 5 giống chính là Nitrosomonas,
Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus và Nitrosovibrio. Trong đó, hiện có 16 loài
vi khuẩn đã được phân biệt dựa trên tỉ lệ G+C trong DNA, hoạt động của
carboxysome, hoạt tính urease, tốc độ chuyển hoá NH
3
, nồng độ tới hạn ammonia
trong môi trường, yêu cầu về độ mặn và nồng độ muối tới hạn.


12
Bảng 2. Đặc điểm hình thái-sinh hoá của vi khuẩn oxi hoá ammonia.

Vi thể
Đại thể

Sinh hoá
GIỐNG
Nitrosomonas sp.
Tế bào có dạng elip, không di động hoặc có 1 tiên mao ở cực, thường đứng riêng lẻ, theo cặp, chuỗi ngắn, tạo thành
những đám tế bào phân bố không đều thường không dính với nhau bởi 1 lớp màng.
Oxi hoá ammonia thành nitrite nhanh nhất trong các loài vi khuẩn thuộc cùng họ.
Nitrosomonas
europaea
+ Dạng que, 0,9-1 x 1,1-1,8
µm.
+ Đứng riêng lẻ, hiếm khi kết
thành chuỗi 3 hoặc 4 tế bào.
+ Gram âm.
+ Khuẩn lạc nhỏ, đặc, dễ
nhận thấy, có màu hơi nâu
trên silica gel.
+ Phát triển rất dễ dàng ở môi trường lỏng không có
chất hữu cơ. Môi trường sống phải chứa ammonium
sulfate, potassium phosphate và magnesium carbonate.
Tế bào tích luỹ thành những lớp sinh khối mỏng xung
quanh những hạt magnesium carbonate ở dưới đáy erlen
+ Dịch tế bào đôi khi bị đục do sự phát triển bởi sự di
động của đám tế bào đứng cụm hoặc riêng lẻ.
+ Sống hiếu khí. Sống tự dưỡng nghiêm ngặt, phân bố ở
trong đất, nước.
Nitrosomonas
monocella
+ Dạng que ovan, 0,6-0,9 µm,
khi tế bào còn nhỏ có dạng
hình cầu.

+ Thường đứng theo cặp, di
động nhờ tiên mao ở cực có
chiều dài từ 3 đến 5 lần so với
tế bào.
+ Gram dương.
+ Trên sicica gel hay đĩa
petri agar thì không có
khuẩn lạc đặc trưng.
Nhưng có màu hơi vàng
nâu, sinh khối phát triển
xung quanh các hạt
CaCO
3
trong môi trường.
+ Phát triển trong môi trường khoáng vô cơ có chứa
muối ammonium, phát triển đồng nhất trong dung dịch
cũng như trong cặn CaCO
3
dưới đáy erlen.
+ Thậm chí trong môi trường có tích luỹ nồng độ thấp
chất hữu cơ cũng làm chậm hoặc ức chế sự bắt đầu sinh
trưởng của vi khuẩn.
+ Dịch chiết từ thực vật gây độc cho vi khuẩn.
+ Khí CO
2
và O
2
cần thiết cho sự sinh trưởng.
+ pH tối ưu từ 8-9. Phát triển rất chậm ở pH 7, vẫn phát
triển ở pH cao hơn 9.

+ Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và oxi hoá
là 28
0
C.
+ Sống hiếu khí. Sống tự dưỡng nghiêm ngặt. Phân bố ở
trong đất trồng trọt.


13
GIỐNG
Nitrosococcus sp.
Tế bào có hình cầu lớn, không di động, không tạo thành đám khuẩn lạc nhầy (zoogloea).
Nitrosococcus
nitrosus
+ Hình cầu lớn, kích thước
1,5-1,7 µm với lớp màng
mỏng ở ngoài.
+ Khả năng di động chưa
được chứng minh.
+ Gram dương.
+ Trên silica gel thì có cả
khuẩn lạc tối và khuẩn lạc
sáng, bề mặt khuẩn lạc
trong giống như một giọt
dịch vàng nhạt hơi đục.
+ Phát triển làm đục môi trường lỏng.
+ Sống hiếu khí.
+ Nhiệt độ tối ưu trong khoảng 20-25
0
C.

+ Phân bố ở trong đất.
GIỐNG
Nitrosospira sp.
Tế bào có dạng xoắn ốc, oxi hoá ammonia thành nitrite rất chậm.
Nitrosospira
briensis
+ Tế bào cuộn xoắn rất chặt
tạo thành những ống dài đến
15-20 µm. Những vòng xoắn
nhỏ hơn được tạo từ các tế
bào có hình que ngắn hoặc
elip. Một số tế bào dạng cầu
nhỏ được quan sát thấy ở
những dịch nuôi cấy lâu ngày.
+ Khuẩn lạc trên silica gel
nhỏ, thỉnh thoảng những
tế bào kết lại thành dạng u
nhỏ nhưng những hạt này
phát triển kém hơn so với
những hạt khuẩn lạc ở
giống Nitrosocystis.
+ Sống hiếu khí.
+ pH thích hợp từ 7-7,2.
+ Phân bố ở trong đất.
Nitrososipira
antarctica
Tế bào và khuẩn lạc trông rất giống dòng Nitrosospira
briensis ngoại trừ tế bào về tổng thể thì cuộn với nhau tạo
thành những vòng xoắn chặt hơn.
GIỐNG

Nitrosocystis sp.
Tế bào hình elip hoặc dạng dài, kết lại khá chặt, liên kết thành từng đám bởi một lớp màng tạo thành các khối u nhỏ.
Những khối u này khi tan ra sẽ giải phóng tế bào tự do, đặc biệt khi chuyển sang môi trường mới. Các tế bào bên
trong các khối u này gắn với nhau bởi chất nhầy.
Khả năng oxi hoá ammonia thành nitrite thì thấp hơn Nitrosomonas sp. nhưng cao hơn Nitrosospira sp.
Nitrosocystis
javanensis
+ Có dạng elip nhỏ có đường
kính 0,5-0,6 µm, có tiên mao
ở cực có chiều dài gấp 20 lần
tế bào.
+ Trên silica gel thì khuẩn
lạc có dạng tròn đến elip
trở nên nhạt hoặc có màu
nâu nhạt.
+ Trong dịch lỏng, sinh khối tạo thành những đám tế
bào rất đặc (giống hạt bùn nhỏ).
+ Sống hiếu khí. Tự dưỡng nghiêm ngặt.
+ Phân bố trong đất


14
Nitrosocystis
coccoides
+ Tế bào hình elip có đường
kính 1,5 µm.
+ Tế bào liên kết rất chặt với
nhau tạo thành những đám
dịch nhầy, xung quanh có lớp
màng mỏng hình thành những

thể u nhỏ.
+ Tế bào ít khi đứng riêng lẻ
mà thường đứng thành cặp và
những nhóm nhỏ từ 4 tế bào
trở lên. Có khả năng di động.
+ Khuẩn lạc trên silica gel phát triển thì làm lớp áo CaCO
3
bên ngoài trở nên có màu
vàng nhạt và hoà tan, khuẩn lạc xuất hiện có phình ra và cứng chắc, tạo thành những
hạt nhỏ màu nâu có đường kính 0,5mm. Tế bào phát triển chặt với nhau tạo thành
những quần thể phồng ra không đều.
+ Sống hiếu khí. Xuất hiện trong đất rừng, phân bón.
GIỐNG
Nitrosogloea sp.
Tế bào dạng elip hoặc dạng que. Gắn với nhau bởi lớp nhầy tạo thành đám khuẩn lạc nhầy. Không có màng bao xung
quanh những đám khuẩn lạc này.
Nitrosogloea
merismoides
+ Tế bào elip từ 0,5-1,5µm. Hình ovan hay que ngắn tạo thành chuỗi, mỗi nhóm có màng bao riêng. Các nhóm này
rất khác nhau về mức độ phân nhánh của chuỗi, là tập hợp tế bào khá chặt và không theo quy luật.
+ Tế bào trên silica gel thì bao bọc bởi lớp nhầy màu vàng làm cho khuẩn lạc có dạng đục không rõ. Khuẩn lạc trên
bề mặt thạch rải rác tạo thành những hạt u nhỏ.
+ Sống hiếu khí. Phân bố ở bùn hoạt tính.
Nitrosogloca
schizobacteroides
+ Dạng que dài hoặc sợi nhỏ,
dài từ 3-4 µm.
+ Khuẩn lạc trên silica gel thì tạo thành nhóm tế bằng phẳng được liên kết bởi lớp
màng mỏng. Tập hợp này hình thành những miếng cơ giả, do sự đan xen bởi những
sợi nhỏ giống như miếng đệm của sợi nấm. Miếng đệm này có thể lấy ra như một

phần tử khỏi môi trường.
+ Sống hiếu khí.
Nitrosogloea
membranacea
+ Tế bào dạng elip thường
xuất hiện thành cặp hoặc đứng
riêng lẽ.
+ Khuẩn lạc trên silica gel tạo thành những hạt nhầy có màu vàng rơm.
+ Sống hiếu khí. Phân bố trong bùn hoạt tính.
[11].