Đặc điểm hình thái thoi phân bào của noãn không thụ tinh sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.52 MB, 184 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

NGUYỄN THANH HOA

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THOI PHÂN BÀOCỦA NỖN KHƠNG THỤ TINH SAU TIÊM

TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN(ICSI)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

NGUYỄN THANH HOA

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THOI PHÂN BÀOCỦA NỖN KHƠNG THỤ TINH SAU TIÊM

TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NỖN(ICSI)

Chun ngành : Mơ phơi thai học

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

bản thân, tôi đã nhận được được sự hỗ trợ, giúp đỡ tận tình của Nhà trường,các thầy cơ, đồng nghiệp và gia đình.

Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại họccủa trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong qtrình học tập.

Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS. Nguyễn Mạnh Hà,Chủ nhiệm Bộ môn Mô-Phôi, Đại học Y Hà Nội, người thầy đã luôn quantâm, theo sát chỉ dẫn truyền lại kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trongsuốt quá trình thực hiện quyển luận văn này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp, bạn bè và gia đình ln ủnghộ, động viên giúp đỡ tơi trong q trình hồn thành chương trình nghiên cứusinh và thực hiện luận án tiến sĩ.

Để hồn thành quyển luận văn cũng khơng thể không nhắc đến sự đồng ýtham gia nghiên cứu của các bệnh nhân. Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới họ!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận án

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Hà Nội, chuyên ngành Mô phôi thai học, xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Mạnh Hà

2. Cơng trình này khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được cơng bố tại Việt Nam.

Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngàythángnăm 2024

Tác giả luận án

Nguyễn Thanh Hoa

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

viết tắtTiếng AnhTiếng Việt

AMH Anti Mullerian hormone

APC/C Anaphase-promoting complex/cyclosome

AOA Artificial oocyte activation Hoạt hóa nỗn nhân tạoART Assisted reproductive technology Hỗ trợ sinh sản

AT Asthenoteratozoospermia Tinh trùng bất thường di độngvà hình thái

ATP Adenosine triphosphate

BMP15 Bone morphogenetic protein15CaMKII Ca²⁺/calmodulin-dependent protein

kinase II

CD9 Cluster of differentiation 9CDK1 Cyclin-dependent kinase 1

DNA Deoxyribonucleic acid

Emi2 Early mitotic inhibitor 2 Ức chế phân bào sớm

FISH Fluorescence in situ hybridization Kĩ thuật lai tại chỗ huỳnhquang

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

FSH Follicle stimulating hormon Hormon kích thích nangtrứng

GDF9 Growth and differentiation factor 9GPI Glycosyl phosphatidylinositolGSH Glutathione

GTP Guanosine-5’-triphosphate

GVBD Germinal vesicle break down Túi mầm vỡHCG Human chorionic gonadotropin

ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh trùng vào bàotương noãn

IP3 1,4,5-trisphosphat

IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm

IVM In vitro maturation Trưởng thành nỗn trong ốngnghiệm

NOA Non obstructive azoospermia Khơng có tinh trùng không dotắc nghẽn

MAPK Mitogen activated protein kinase

MPF Maturation-promoting factor

MTOCs Microtubule organizing centers Trung tâm tổ chức ống siêu vi

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

OA Oligoasthenozoospermia Tinh trùng bất thường mật độ,di động

OAT Oligoasthenoteratozoospermia Tinh trùng bất thường mật độ,di động và hình thái

PCC Premature chromosomecondensation

Cơ đặc nhiễm sắc thể sớmPIP2 Phosphatidylinositol 4,5-

bisphosphatPKC Protein kinase CPLCζ Phospholipase C zeta

PVP Polyvinylpyrrolidone

RNA Ribonucleic acid

ROS Reactive oxygen species Các gốc oxy hóa

ROSI Round spermatid injection Tiêm tiền tinh trùng trònROSNI Round spermatid nucleus injection Tiêm nhân tiền tinh trùng trònSAC Spindle assemble checkpoint Điểm kiểm soát tạo thoi phân

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ... 3

1.1.QUÁ TRÌNH THỤ TINH ... 3

1.1.1. Khái niệm và ý nghĩa của sự thụ tinh ... 3

1.1.2. Các giai đoạn của quá trình thụ tinh ... 3

1.1.3. Thụ tinh ống nghiệm ... 8

1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công trong IVF/ICSI ... 10

1.2.NỖN KHƠNG THỤ TINH SAU ICSI: NGUYÊN NHÂN VÀ YẾU TỐẢNH HƯỞNG ... 13

1.2.1. Khái niệm ... 13

1.2.2. Các ngun nhân nỗn khơng thụ tinh sau ICSI ... 13

1.2.3. Phân nhóm nguyên nhân nỗn khơng thụ tinh ... 31

1.3.ĐÁNH GIÁ THỤ TINH SAU ICSI ... 33

1.3.1. Sử dụng kính hiển vi quang học tại thời điểm kiểm tra thụ tinh ... 33

1.3.2. Phương pháp hóa mơ miễn dịch ... 34

1.3.3. Các nghiên cứu đánh giá nỗn khơng thụ tinh và ngun nhân nỗnkhơng thụ tinh ... 40

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 44

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ... 44

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng ... 44

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ... 44

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 45

2.2.1. Cỡ mẫu ... 45

2.2.2.Thiết kế nghiên cứu ... 46

2.2.3. Mơ hình nghiên cứu ... 46

2.2.4. Quy trình nghiên cứu ... 46

2.3.TIÊU CHUẨN NGHIÊN CỨU ... 51

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.4.2. Chỉ số nghiên cứu ... 55

2.5.PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ... 58

2.5.1. Phương pháp thu thập số liệu ... 58

2.5.2. Phương pháp phân tích xử lý kết quả ... 58

2.5.3. Các phương pháp khống chế sai số và yếu tố nhiễu ... 59

2.6.ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ... 60

2.7.THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ... 60

2.8.ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU ... 60

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 61

3.1.ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THOI PHÂN BÀO CỦA NỖN KHƠNGTHỤ TINH SAU ICSI ... 61

3.1.1. Đặc điểm của nhóm đối tượng nghiên cứu ... 61

3.1.2. Đặc điểm của thoi phân bào nỗn khơng thụ tinh ... 69

3.2.MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẶC ĐIỂM NỖN KHƠNG THỤTINH SAU ICSI ... 81

3.2.1. Tuổi mẹ ... 81

3.2.2. Chỉ số BMI ... 86

3.2.3. Số lượng noãn trưởng thành và nỗn khơng thụ tinh sau ICSI ... 90

3.2.4. Mối liên quan giữa đặc điểm tinh trùng và đặc điểm nỗn khơng thụtinh ... 94

3.2.5. Phân tích hồi quy đa biến các yếu tố ảnh hưởng đến đặc điểm nỗnkhơng thụ tinh ... 97

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

4.1.3. Đặc điểm của thoi phân bào nỗn khơng thụ tinh ... 110

4.2.MỐI LIÊN QUAN CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ VỚI NỖN KHƠNG THỤTINH ... 121

4.2.1. Tuổi mẹ và các đặc điểm nỗn khơng thụ tinh ... 121

4.2.2. BMI và đặc điểm nỗn khơng thụ tinh ... 124

4.2.3. Đặc điểm nỗn của chu kì kích thích buồng trứng và nỗn khơngthụ tinh ... 126

4.2.4. Đặc điểm của tinh trùng và nỗn khơng thụ tinh ... 127

4.2.5. Phân tích hồi quy đa biến các yếu tố ảnh hưởng đến đặc điểm nỗnkhơng thụ tinh ... 131

4.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ MỘT SỐ HẠN CHẾ ... 133

KẾT LUẬN ... 136

KHUYẾN NGHỊ ... 137 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ VỀ ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Bảng 3.2. Đặc điểm thời gian vô sinh ... 63

Bảng 3.3. Đặc điểm về chỉ số BMI của người mẹ ... 64

Bảng 3.4. Đặc điểm tinh dịch đồ ... 66

Bảng 3.5. Đặc điểm của chu kì chọc hút nỗn ... 67

Bảng 3.6. Đặc điểm sự thụ tinh của noãn sau ICSI ... 68

Bảng 3.7. Đặc điểm thoi phân bào và nhiễm sắc thể trong nỗn khơng thụ tinhsau ICSI ... 74

Bảng 3.8. Phân bố nỗn khơng thụ tinh theo hình thái thoi phân bào và nhiễmsắc thể ... 81

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tuổi mẹ và đặc điểm nỗn trong chu kì chọc hút 82

Bảng 3.10. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và tính lưỡng cực của thoi phân bào83Bảng 3.11. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và các nhóm hình thái thoi phân bàocùng nhiễm sắc thể và tuổi mẹ ... 84

Bảng 3.12. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và tình trạng giải nén nhân tinh trùng... 85

Bảng 3.13. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và nguyên nhân nỗn khơng thụ tinh

... 85

Bảng 3.14. Mối liên quan giữa BMI và đặc điểm của chu kì IVF/ICSI ... 86

Bảng 3.15. BMI và đặc điểm hình thái thoi phân bào nỗn khơng thụ tinh 88

Bảng 3.16. Mối liên quan giữa thừa cân và các nhóm hình thái thoi phân bào

ởnoãn không thụ tinh ... 89

Bảng 3.17. Mối liên quan giữa thừa cân và các ngun nhân gây nỗn khơngthụ tinh ... 89

Bảng 3.18. Mối liên quan giữa tỷ lệ noãn trưởng thành và tỷ lệ noãn không

thụtinh ... 91

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Bảng 3.20. Mối liên quan giữa số lượng nỗn trưởng thành và phân loại hình

thái thoi phân bào nỗn khơng thụ tinh ... 92

Bảng 3.21. Mối liên quan giữa số lượng noãn trưởng thành và ngun nhânnỗn khơng thụ tinh ... 93

Bảng 3.22. Hình thái tinh trùng và mức độ giải nén nhân tinh trùng ... 95

Bảng 3.23. Khả năng di động tinh trùng và mức độ giải nén nhân tinh trùng... 96

Bảng 3.24. Mối liên quan giữa hình thái tinh trùng và ngun nhân khơng thụtinh của noãn ... 96

Bảng 3.25. Phân tích hồi quy tuyến tính đa biến các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ

lệ nỗn khơng thụ tinh ... 97

Bảng 3.26. Phân tích hồi quy logistic đa biến của các yếu tố ảnh hưởng đến

tínhlưỡng cực của thoi phân bào trong não khơng thụ tinh ... 98

Bảng 3.27. Phân tích hồi quy logistic đa biến của các yếu tố ảnh hưởng đến bộmáy phân bào trong não không thụ tinh ... 99

Bảng 3.28. Phân tích hồi quy logistic đa biến của các yếu tố ảnh hưởng đếnngun nhân nỗn khơng thụ tinh ... 100

Bảng 4.1 Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của đặc điểm noãn thu nhận tới kếtquả thụ tinh và kết quả điều trị IVF ... 106

Bảng 4.2. Một số nghiên cứu ảnh hưởng chất lượng tinh trùng đến thụ tinh

trong ICSI ... 128

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Biểu đồ 3.2. Phân bố loại vô sinh ... 63 Biểu đồ 3.3. Phân bố tinh trùng theo nguồn thu nhận tinh trùng ... 65 Biểu đồ 3.4. Phân bố số chu kì theo tỷ lệ nỗn thụ tinh ... 69 Biểu đồ 3.5. Phân bố ngun nhân nỗn khơng thụ tinh của nỗn sau ICSI. 73 Biểu đồ 3.6. Đặc điểm nhân tinh trùng trong nỗn khơng thụ tinh ... 76Biểu đồ 3.7. BMI và sự hiện diện của thoi phân bào ở noãn không thụ tinh 87Biểu đồ 3.8. Mối tương quan giữa số lượng nỗn trưởng thành trong chu kì vàtỷ lệ nỗn khơng thụ tinh ... 90Biểu đồ 3.9. Chất lượng tinh trùng và tỷ lệ nỗn khơng thụ tinh ... 94

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Hình 1.2. Quá trình thay đổi bộ khung tế bào và hệ thống siêu vi khi thụ tinh

ởngười ... 7

Hình 1.3. Quá trình hỗ trợ sinh sản từ khi chọc hút noãn tới thụ tinh bằng phương

pháp IVF cổ điển hoặc ICSI tới chuyển phôi vào buồng tử cung ... 8

Hình 1.4. Các thao tác trong kĩ thuật ICSI. ... 9

Hình 1.5. Hình thái nỗn trưởng thành dưới kính hiển vi (x400). ... 14

Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của noãn ... 16

Hình 1.7. Nỗn trưởng thành bào tương ... 18

Hình 1.8. Mơ hình cơ chế tập hợp chất nhiễm sắc tại bề mặt phân cắt hạt nhântrước (bên trái) và sau khi (bên phải) hồn thành q trình di chuyển của tiềnnhân ... 19

Hình 1.9. Tinh trùng bất thường dạng đứt đầu-cổ (decapitated sperm) ... 23

Hình 1.10. Quá trình hoạt hóa nỗn thơng qua PLCζ ... 26

Hình 1.11. Vị trí biểu hiện PLCζ ở tinh trùng người ... 28

Hình 1.12. Vị trí cực cầu 1 ... 30

Hình 1.13. Nỗn với số lượng tiền nhân khác nhau ... 33

Hình 1.14. Các cơ chế gây bất thường tiền nhân có thể gặp. ... 34

Hình 1.15. Hình ảnh thoi phân bào và sắp xếp nhiễm sắc thể ... 36

Hình 1.16. Thụ tinh bất thường sau ICSI. ... 38

Hình 1.17. Các mơ hình tập hợp và hoạt động của ti thể trong quá trình trưởngthành của noãn ... 39

Hình 2.1. Mơ hình nghiên cứu ... 46

Hình 2.2. Các bước của kĩ thuật ICSI. ... 49

Hình 3.1. Tinh trùng khơng xâm nhập được vào bào tương noãn ... 70

Hình 3.2. Quá trình thụ tinh dừng tại thời điểm hoạt hóa noãn ... 71

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

... 75 Hình 3.5. Nhóm (i): Thoi phân bào lưỡng cực và nhiễm sắc thể thẳng hàng. 77Hình 3.6. Nhóm (ii): Thoi phân bào 2 cực và nhiễm sắc thể không thẳng hàng..

... 78 Hình 3.7. Nhóm (iii): Thoi phân bào xáo trộn, nhiễm sắc thể thẳng hàng 79 Hình 3.8. Nhóm (iv) Thoi phân bào xáo trộn, nhiễm sắc thể không thẳng hàng..

... 80

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Assisted reproductive technology –ART) đã có những bước cải tiến vượt bậc về phương tiện, kĩ thuật cũng nhưmôi trường nuôi cấy phôi. Đặc biệt, sự ra đời của kĩ thuật tiêm tinh trùng vàobào tương noãn (Intracytoplasmic sperm injection – ICSI) giúp tăng tỉ lệ thụtinh nói riêng và thành cơng trong thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization –IVF) nói chung. Mặc dù vậy nỗn không thụ tinh sau ICSI vẫn là một vấn đềđáng quan tâm. Tỷ lệ không thụ tinh trong ICSI hiện nay khoảng 20-30%.1

Đặc biệt có những trường hợp thất bại thụ tinh toàn bộ (Total failedfertilization- TFF) với tỷ lệ 5-10% các chu kỳ IVF và 1-3% các chu kỳ ICSI.2

Trong tự nhiên, q trình thụ tinh có thể hồn thành cần 2 yếu tố chínhlà nỗn và tinh trùng đảm bảo yêu cầu chất lượng cùng các sự kiện xảy ra sauđó. IVF cổ điển mơ phỏng quá trình thụ tinh gần giống với tự nhiên nhưngđược tiến hành ngoài cơ thể. Trong khi đó, ICSI là một trong những tiến bộcơng nghệ quan trọng, giúp hỗ trợ vận chuyển tinh trùng đi qua lớp tế bào hạt,màng trong suốt và màng bào tương của noãn. Tuy nhiên, ICSI không giảiquyết được các bước dẫn đến hợp nhất của gen trong quá trình thụ tinh. Dovậy, quá trình thụ tinh vẫn có thể khơng hồn thành. Phân tích những nỗn trênlâm sàng được chẩn đốn là khơng thụ tinh cho thấy có một số nỗn bị dừngq trình thụ tinh sau thời điểm ICSI.3 Dưới kính hiển vi quang học thôngthường, chúng ta chỉ xác định được nỗn khơng thụ tinh mà không chỉ ranguyên nhân gây ra hiện tượng này.

Nguyên nhân nỗn khơng thụ tinh đối với kỹ thuật IVF cổ điển chủ yếuliên quan đến bất thường tinh trùng khơng có khả năng xâm nhập vào nỗn.4

Trong khi đó những chu kỳ ICSI nguyên nhân không thụ tinh được cho là cóliên quan đến các khiếm khuyết của nỗn.5 Trên thực tế, những đặc tính củanỗn chịu trách nhiệm lớn trong việc điều chỉnh phần lớn các cơ chế phân tửvà tế bào cần

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

thiết cho quá trình thụ tinh. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển, phânchia của noãn như các bệnh lý liên quan đến vơ sinh, kiểm sốt q trình rụngnỗn và thối hóa nỗn liên tục bắt đầu ngay từ tuần lễ 20 của thai kì đều ảnhhưởng sâu sắc đến sự thụ tinh. Phần lớn các noãn được lấy ra có khả năng bịtổn hại từ trước và bất chấp những nỗ lực của quá trình hỗ trợ sinh sản vẫn cóthể khơng thụ tinh.6 Đáng chú ý là sự các sai sót trong việc hình thành thoiphân bào và bộ nhiễm sắc thể bất thường có thể dẫn đến nỗn khơng thể hoạthóa đúng cách làm quá trình thụ tinh bị dừng lại. Bằng cách đánh giá các thànhphần trong nỗn khơng thụ tinh như hệ thống thoi phân bào, sự sắp xếp nhiễmsắc thể của noãn hay các bào quan và nhân tinh trùng cũng như các cực cầu, tacó thể xác định được thời điểm dừng trong quá trình thụ tinh cũng như nguyênnhân không thụ tinh.

Việc hiểu biết nguyên nhân không thụ tinh là vô cùng cần thiết để cóbiện pháp cải thiện được thành công trong hỗ trợ sinh sản, đặc biệt với nhữngtrường hợp tỷ lệ không thụ tinh cao, thất bại thụ tinh toàn bộ và lặp đi lặp lại.Nhưng do đặc tính nhạy cảm của nỗn và những vấn đề liên quan đến đạo đứcy học nên những nghiên cứu liên quan đến nỗn khơng thụ tinh cịn khá hạnchế. Với mong muốn được đóng góp thêm những kiến thức về đặc điểm nỗnkhơng thụ tinh sau ICSI và một số yếu tố liên quan, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu: “Đặc điểm hình thái thoi phân bào của nỗn khơng thụ tinh

sau tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn (ICSI)” với các mục tiêu sau:

1. Mơ tả các đặc điểm hình thái thoi phân bào của nỗn không thụ tinhsau ICSI.

2. Khảo sát một số yếu tố liên quan đến việc nỗn khơng thụ tinh sau ICSI.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN1.1. QUÁ TRÌNH THỤ TINH

1.1.1. Khái niệm và ý nghĩa của sự thụ tinh

Thụ tinh là q trình kết hợp giữa nỗn và tinh trùng tạo ra hợp tử. Thụtinh có tính đặc hiệu cho lồi. Sự thụ tinh có ý nghĩa quan trọng đối với sựsống vì q trình này giúp khơi phục lại bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội đặc trưngcho loài từ 2 giao tử đơn bội. Sự kết hợp của nhiễm sắc thể giới tính của giaotử cái và giao tử đực giúp xác định giới tính di truyền của con. Khi bộ nhiễmsắc thể chứa cặp nhiễm sắc thể giới là XX sẽ xác định giới tính di truyền lànữ, bộ nhiễm sắc thể giới là XY sẽ xác định giới tính di truyền là nam.

Cá thể mới sẽ mang đặc tính di truyền của cả bố và mẹ do nhận đượcmột nửa số nhiễm sắc thể từ bố và một nửa từ mẹ. Đặc biệt, khi tinh trùngxâm nhập vào noãn sẽ cung cấp trung thể cho hợp tử. Cịn ti thể của tinh trùngsẽ tiêu biến, tồn bộ ti thể của noãn sẽ trở thành ti thể của hợp tử và phơi. Vàq trình thụ tinh kích thích nỗn hồn tất q trình giảm phân đồng thời khởiđộng q trình phân cắt phơi.

1.1.2. Các giai đoạn của q trình thụ tinh

1.1.2.1. Nỗn và tinh trùng trước khi thụ tinh

Noãn trước khi thụ tinh được bọc bởi màng trong suốt và lớp tế bào nangcủa gị nỗn. Nỗn đang dừng phân chia ở kỳ giữa giảm phân II. Kèm theo sựhiện diện của cực cầu 1 (first polar body – PB1) nhỏ, khơng có chức năng làsản phẩm của lần giảm phân I. Loa vịi bắt lấy nỗn được phóng ra từ buồngtrứng. Nỗn di chuyển trong vịi tử cung nhờ các yếu tố: luồng dịch di chuyểntừ buồng trứng vào buồng tử cung, sự lay chuyển của lơng chuyển biểu mơvịi tử cung và sự co bóp của cơ trơn vòi tử cung.

Tinh trùng ngay khi xuất tinh khỏi đường sinh dục của nam giới chưa cókhả năng thụ tinh. Tinh trùng cần trải qua bước cuối cùng để trưởng thành hóa

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

chức năng gọi là năng lực hóa tinh trùng. Đây là quá trình loại bỏ cácglycoprotein cũng như protein che phủ túi cực đầu của tinh trùng nhờ vào cácchất tiết trong đường sinh dục nữ. Tinh trùng sau khi xuất tinh di chuyểntrong đường sinh dục nữ nhờ vào sự tự chuyển động của đi cũng như sự cobóp tầng cơ đường sinh dục nữ.

1.1.2.2. Quá trình thụ tinh tự nhiên

Quá trình thụ tinh xảy ra ở vị trí bóng của vịi tử cung với 6 hiện tượngchính (Hình 1.1). Mỗi bước cần các điều kiện thúc đẩy noãn để có thể hồnthành.

Hình 1.1. Q trình thụ tinh tự nhiên. (1) Tinh trùng vượt qua lớp tế

bào nang; (2) Tinh trùng vượt qua màng trong suốt – (a) tinh trùng liên kếtvới ZP3, (b) phản ứng cực đầu và liên kết với ZP2, (c) xâm nhập qua màngtrong suốt; (3) Sự hồ màng bào tương của nỗn và tinh trùng; (4) Hoạt hóanỗn, nỗn bào 2 hồn thành quá trình giảm phân và hình thành tiền nhâncái; (5) Sự hình thành tiền nhân đực; (6) Sự hịa nhập của 2 tiền nhân, tạothành hợp tử.6

Bước đầu tiên, tinh trùng phải vượt qua lớp tế bào nang và chất nền. Chấtnền của các tế bào nang chủ yếu là glycosaminoglycan, hyaluronan tạo thànhmạng lưới.7 Noãn tiết ra các yếu tố như GDF9 và BMP15 kích thích các conđường truyền tín hiệu như SMAD2/3 khiến cho các tế bào nang giãn rộng, tạođiều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của tinh trùng qua hàng rào này.8

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Sau khi đi qua hàng tế bào nang, tinh trùng cần xuyên qua màng trongsuốt (Zona pellucida – ZP). Các noãn phát triển tổng hợp, tiết ra cácglycoprotein (ZP1-4) và các oligosaccharid liên kết để tạo thành ZP.9 Cácglycoprotein của ZP hoạt động như một rào cản đối với tinh trùng và đặc hiệucho lồi trong q trình thụ tinh thơng qua việc nhận biết và liên kết cácprotein trên đầu tinh trùng với các thụ thể tại vỏ glycoprotein. Protein ZP3 rấtquan trọng chịu trách nhiệm về sự gắn kết đặc trưng của tinh trùng với ZP.Một số protein trên bề mặt tinh trùng gắn với các oligosaccharide bằng liênkết O-đặc hiệu trên ZP3 được coi là thụ thể ZP3. Tại thời điểm tinh trùng liênkết với ZP dòng Ca² ⁺ ngoại bào đi vào nội bào, tinh trùng được cảm ứng đểtrải qua phản ứng cực đầu. Khi đó, các chất trong túi cực đầu tinh trùng đượcgiải phóng bằng hình thức xuất bào.Tinh trùng vượt qua màng trong suốt sẽ đi vào khoảng quanh noãn và tiếpxúc với màng bào tương noãn. Màng bào tương noãn được phủ bởi các vi nhungmao phân bố khơng đều, có vùng thưa hoặc thiếu hoàn toàn các vi nhung mao.10

Những vi nhung mao này cùng các protein màng của noãn như CD9 hay GPI cóvai trị quan trọng trong q trình hịa màng bào tương tinh trùng và noãn. Khimàng bào tương hợp nhất sẽ tạo lỗ cho tinh trùng đi vào noãn.

Yếu tố PLCζ (Sperm-specific phospholipase C zeta) ở đầu tinh trùng sẽkhởi động q hoạt hóa nỗn, giải phóng các ion canxi từ lưới nội bào nhẵn.Kết hợp với PKC, Ca²⁺ dẫn đến phản ứng vỏ ngăn chặn hiện tượng đa tinhtrùng thụ tinh. Đồng thời, Ca² ⁺ làm giảm hoạt động của CSF, giảm các hoạtđộng của MAP kinase và MPF thúc đẩy nỗn hồn thành nốt q trình giảmphân II và hình thành cực cầu 2 (Second polar body -PB2). Cùng với q trìnhhoạt hóa nỗn, PKC có tác động đến q trình tháo rời màng nhân tinh trùngvà giải nén nhiễm sắc thể. Các thành phần của nhân tinh trùng được giải néndần và các liên kết disulfide bị loại bỏ. Các histon từ bào tương noãn thaythế cho các

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

protamine tinh trùng thông qua sự hỗ trợ của các protein kinase vàphosphatase khác nhau. Và sau đó nhiễm sắc thể được cơ đặc.

Bước cuối cùng của q trình thụ tinh địi hỏi nỗn cung cấp các thànhphần hình thành màng nhân, ATP/GTP, Lamin B cũng như các hoạt động củacác protein kinase và phosphatase để tạo nên màng tiền nhân. Các vi sợi, viống trong bào tương noãn sẽ hỗ trợ trong quá trình hình thành và di chuyểncủa tiền nhân.6

1.1.2.3. Sự thay đổi của bộ khung tế bào và hệ thống thoi phân bào nỗntrong q trình thụ tinh

Dưới tác động của sự thay đổi các yếu tố trong bào tương noãn ̣(theo1.1.2.2), bộ khung tế bào cùng hệ thống ống siêu vi cũng thay đổi.

Noãn chưa thụ tinh chỉ hiện diện hệ thống ống siêu vi ở giai đoạn kỳgiữa giảm phân 2 (Hình 1.2-A). Sau khi tinh trùng xâm nhập vào bào tươngnoãn, các vi sợi được phát hiện ở đầu tinh trùng là biểu hiện của nỗn đượchoạt hóa hồn thành nốt kỳ giảm phân 2 và tạo ra cực cầu 2 (Hình 1.2-B).Nhân tinh trùng được giải nén, trung tử của tinh trùng nhân đôi tạo trung thểtrong khi đó, tiền nhân đực di chuyển từ vùng vỏ vào trong (Hình 1.2-C). Tiềnnhân cái di chuyển về phía tiền nhân đực với trung thể tinh trùng trở nên bấtđối xứng và phân lưỡng cực (Hình 1.2-D). Khi bắt đầu kỳ trước, các nhiễmsắc thể của bố và mẹ sẽ cô đặc riêng rẽ khi 2 hệ thống ống siêu vi được thiếtlập bắt đầu hình thành thoi phân bào (Hình 1.2-E). Các nhiễm sắc thể xen kẽdọc theo mặt phẳng xích đạo và 2 cấu trúc trung thể kết hợp với trục của tinhtrùng ở một cực (Hình 1.2-F). Cả tiền nhân và hệ thống thoi phân bào chínhvẫn nằm ở vị trí lệch tâm trong bào tương hợp tử. Khi bắt đầu kì sau, cực củathoi phân bào kéo dài và phản ứng với vùng vỏ liền kề, tạo thành rãnh phâncắt tại vị trí này (Hình 1.2- G). Sự phân tách dẫn đến hình thành phơi bào concó kích thước bằng nhau (Hình 1.2-H).

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Hình 1.2. Quá trình thay đổi bộ khung tế bào và hệ thống siêu vi khi

thụ tinh ở người (A-H) (Bình thường ngồi cùng bên trái và các biểu hiện

nỗn không thụ tinh bên phải).11 (A) Tinh trùng tiếp xúc với màng bào tương

noãn; (B) Nhân tinh trùng lọt vào bào tương noãn và noãn tiếp tục giảmphân;

(C) Hình thành tiền nhân đực và cái; (D) Trung thể nhân đôi tạo ra cực củathoi vô sắc; (E) Hai tiền nhân tiến lại gần nhau về trung tâm noãn; (F) Mấtmàng tiền nhân; (G-H) Hợp tử phân cắt.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

1.1.3. Thụ tinh ống nghiệm

Lĩnh vực Hỗ trợ sinh sản ra đời nhằm giải quyết các vấn đề dẫn đến việcthụ tinh và mang thai không thể diễn ra tự nhiên. Trong đó, IVF cổ điển(Conventional IVF) và ICSI là hai kỹ thuật phổ biến để thực hiện sự thụ tinhtrong phịng thí nghiệm.

1.1.3.1. IVF cổ điển

IVF cổ điển bắt đầu bằng việc thu nhận noãn. Một chu kỳ trứng rụngbình thường chỉ tạo ra 1 nỗn chín nhưng bằng cách sử dụng cácgonadotropin ngoại sinh, số lượng nỗn thu được có thể lên đến 10-20 nỗn.Sau đó, noãn được thu nhận bằng cách chọc hút nang trứng dưới sự hướngdẫn của siêu âm. Đồng thời, tinh trùng được thu nhận từ người chồng hoặc từngân hàng tinh trùng và xử lý. Tiếp theo, noãn được nhốt cùng với tinh trùngtrong điều kiện phù hợp gần giống với tự nhiên để gây ra quá trình thụ tinh.Quá trình thụ tinh trong IVF cổ điển gần với quá trình trong tự nhiên, đượcdiễn ra trong điều kiện phịng thí nghiệm. Sau đó, phơi sẽ được chuyển lại tửcung của mẹ để tiếp tục phát triển (Hình 1.3).

Hình 1.3. Quá trình hỗ trợ sinh sản từ khi chọc hút noãn tới thụ tinh bằng phương pháp IVF cổ điển hoặc ICSI tới chuyển phôi vào buồng tử cung.12

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

1.1.3.2. Kỹ thuật ICSI

Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) là kỹ thuật hỗ trợ sinh sản lầnđầu được giới thiệu vào năm 1992.13 Tỷ lệ thụ tinh sau ICSI khi sử dụng tinhtrùng xuất tinh tương đương với tỷ lệ thụ tinh của nam giới có chất lượng tinhtrùng bình thường khi sử dụng phương pháp IVF cổ điển.

Hình 1.4. Các thao tác trong kĩ thuật ICSI.14 (1) Sử dụng kim giữ cố

định noãn sao cho cực cầu 1 ở vị trí 12 giờ hoặc 6 giờ, kim ICSI có chứa tinhtrùng được bất động đưa vào bào tương noãn ở vị trí 3 giờ; (2) Sử dụng áplực hút của kim ICSI gây vỡ màng bào tương noãn; (3) Đưa tinh trùng và bàotương noãn trở lại noãn; (4) Rút kim ICSI ra khỏi noãn

Trong phương pháp ICSI, người ta sử dụng một kim giữ nỗn trong suốtq trình tiêm và một kim nhỏ có vai trị đưa tinh trùng vào bào tương noãn.2

Khi thực hiện kĩ thuật, tinh trùng sau khi xử lý thường được đưa vào môitrường làm chậm chuyển động để dễ quan sát và đánh giá. Một tinh trùng diđộng, hình thái bình thường sẽ được bất động và gây tổn thương màng bàotương. Sau đó, tinh trùng được hút vào kim với 1 lượng nhỏ mơi trường. Nỗnđược giữ trong môi trường nuôi bằng kim Holding với cực cầu ở vị trí 12 giờhoặc 6 giờ. Kim ICSI đang giữ tinh trùng sẽ đi xuyên qua màng trong suốt vàmàng bào tương nỗn, gây vỡ màng bằng hút 1 ít bào tương vào kim. Cuốicùng, đưa tinh trùng cùng bào tương vào tế bào nỗn (Hình 1.4).

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Kĩ thuật ICSI đã hỗ trợ cho những trường hợp q trình thụ tinh khơng xảyra được do các vấn đề liên quan đến chất lượng tinh trùng kém như: mật độ tinhtrùng không đủ gây thụ tinh, tinh trùng di động kém hoặc thậm chí bất độnghồn tồn. Đặc biệt, trong những trường hợp nam giới chỉ có thể thu nhận mộtvài tinh trùng từ các kĩ thuật chọc hút mào tinh hay sinh thiết tinh hồn.

Tuy nhiên, khơng phải lúc nào q trình thụ tinh cũng hồn thành. Domột số nguyên nhân mà dù tinh trùng được đưa trực tiếp vào bào tương nỗntrong q trình ICSI, nỗn vẫn bị dừng trong quá trình thụ tinh gây ra hiệntượng nỗn khơng thụ tinh.

1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công trong IVF/ICSI

Nhiều yếu tố đã được cho là có ảnh hưởng đến kết quả của IVF nóichung cũng như ICSI nói riêng.

1.1.4.1. Tuổi của phụ nữ

Tuổi của người phụ nữ được coi là một trong những yếu tố quan trọngnhất ảnh hưởng đến khả năng có thai trong các chu kì hỗ trợ sinh sản. Khi tuổităng lên, khả năng sinh sản suy giảm đặc biệt là sau tuổi 35. Trong thụ tinhống nghiệm, điều này thể hiện bao gồm số lượng noãn thu được và tỷ lệ thụtinh suy giảm theo tuổi mẹ.15 Các phương pháp đánh giá hình thái phơi ngườiđã chứng minh tuổi mẹ có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng phôi, tỷ lệ lệchbội ở phôi người tăng lên theo tuổi.16

Phụ nữ lớn tuổi có đáp ứng buồng trứng kém hơn trong chu kì kích thíchbuồng trứng có kiểm sốt, ít nỗn được lấy ra, tỷ lệ thụ tinh thấp, chất lượngphôi suy giảm, tỷ lệ làm tổ, tỷ lệ sinh thấp, tăng nguy cơ sảy thai và sinhnon.17

1.1.4.2. Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index – BMI)

Ngoài tuổi tác, yếu tố béo phì cũng rất quan trọng ảnh hưởng đến kết quảcủa hỗ trợ sinh sản. Tác động tiêu của béo phì đối với quá trình sinh sản gồmcác biến chứng ở mẹ, vô sinh và rối loạn kinh nguyệt. Khả năng sinh sản giảm

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

được cho là do nhiều vấn đề khác nhau ở phụ nữ béo phì như rối loạn chứcnăng nội tiết và chuyển hóa từ đó ảnh hưởng đến sự tăng sinh nang trứng, sựlàm tổ và sự phát triển của thai lâm sàng.18 Nghiên cứu của Kasum và cộng sự(2018) đã chứng minh rằng tỷ lệ mang thai và sinh sống ở những người thừacân và béo phì giảm so với những người có cân nặng bình thường khi thựchiện thụ tinh ống nghiệm.19 Nguyên nhân có thể do tăng nhu cầu gonadotropintrong q trình kích thích buồng trứng, số lượng noãn thu hồi được thấp hơn,nồng độ estradiol huyết thanh giảm và tỷ lệ thụ tinh thấp.20

Phụ nữ béo phì mang thai sau IVF cũng tăng nguy cơ sảy thai và gặp cácbiến chứng sản khoa nói chung. Béo phì làm tăng thời gian gây rụng noãn,giảm đỉnh estradiol và giảm số lượng nang trưởng thành. Ngồi ra, béo phì cóảnh hưởng xấu đến chất lượng nỗn và phơi.21˒22

1.1.4.3. Tuổi của nam giới và đặc điểm của tinh trùng

Xét nghiệm tinh dịch là phương pháp quan trọng và cơ bản nhất để đánhgiá nguyên nhân vô sinh và lựa chọn phương pháp điều trị. Đánh giá các đặcđiểm của tinh trùng như khả năng di động, tổng số lượng và các bất thường vềhình thái tinh trùng dường như rất quan trọng để dự đốn sự thụ tinh, làm tổcủa phơi và phát triển thai nhi thành công. Nhiều nghiên cứu khác nhau đãđánh giá về vai trò của các thông số tinh dịch khác nhau đối với quá trình thụtinh và mang thai trong thụ tinh ống nghiệm. Khả năng di động của tinh trùngvà tổng số lượng tinh trùng có liên quan đến cơ hội mang thai và thụ tinh caohơn.

Hình thái tinh trùng là một trong những thơng số quan trọng nhất. Bấtthường về hình thái là một yếu tố dự báo đáng tin cậy về khả năng sinh sảnthành công ở những bệnh nhân thực hiện IVF. Trong trường hợp hình tháibình thường dưới 4% cho kết quả điều trị kém hơn.

Một thông số khác được nghiên cứu là tuổi của nam giới. Tuổi già cóliên quan đáng kể đến việc giảm chất lượng tinh dịch, số lượng tinh trùng vàkhả

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

năng vận động và hình thái bình thường. Độ tuổi nam giới thực sự ảnh hưởngđến kết quả IVF/ICSI còn nhiều tranh cãi. Nghiên cứu của Fratterelli và cộngsự (2008) báo cáo tỷ lệ phôi nang và sinh sống sụt giảm đáng kể ở nam giớitrên 50 tuổi. Trong khi đó Cito và cộng sự (2019) thấy tỷ lệ nỗn thụ tinh củanhóm nam giới trên 45 tuổi giảm có ý nghĩa thống kê khi thực hiện kĩ thuậtICSI.23 Một số nghiên cứu khác lại khơng thấy có sự ảnh hưởng tuổi cha đếnkết quả ICSI.24

Nhiễm trùng bộ phận sinh dục nam là một trong những nguyên nhânhàng đầu gây vô sinh nam trên toàn thế giới. Sự xâm nhập của vi khuẩn vàohệ thống sinh sản thường được chứng minh liên quan đến giảm chức năngsinh tinh trùng và dẫn đến vô sinh. Chất lượng tinh dịch quan trọng đối vớikết quả IVF.

1.1.4.4. Đáp ứng buồng trứng của bệnh nhân trong chu kì kích thích buồngtrứng có kiểm sốt

Bệnh nhân được kích thích buồng trứng khi thực hiện kĩ thuật thụ tinhống nghiệm. Khi đó, bệnh nhân sử dụng gonadotropin ngoại sinh liều cao đểcho phép lấy nhiều noãn trong một chu kỳ. Đáp ứng buồng trứng kém thườngdo sự kết hợp giữa các yếu tố gồm số lượng nang trưởng thành, số lượng noãnthu được và nồng độ đỉnh estradiol, FSH (Follicle Stimulating Hormone), LH(Luteinizing hormone) và AMH (Anti Mullerian Hormone). Đáp ứng kém vớigonadotrophin kích thích hay gặp ở những phụ nữ lớn tuổi, nhưng cũng có thểgặp ở phụ nữ trẻ. Những người này có tỷ lệ có thụ tinh, chất lượng phơi cũngnhư khả năng mang thai thấp hơn so với những phụ nữ đáp ứng tốt ở cùng độtuổi.25

Một chu kì kích thích buồng trứng có tỷ lệ nỗn chưa trưởng thành cao làbiểu hiện bất lợi của bộ máy sinh học kém hiệu quả và ảnh hưởng đến kết quảcủa chu kì thụ tinh ống nghiệm đó.26 Nghiên cứu của Escrich và cộng sự chothấy có sự gia tăng số lượng phơi từ nỗn chưa trưởng thành, có đến 50% phơi

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

phát triển từ nỗn chưa trưởng thành có bộ NST lưỡng bội.27 Nhưng một sốnghiên cứu lại cho rằng sử dụng nỗn chưa trưởng thành khơng có hiệu quảtrong việc tăng tỷ lệ có thai và trẻ sinh sống.28,29 Sự trưởng thành nhân, bàotương và khả năng phát triển của những noãn non trong chu kỳ kích thíchbuồng trứng rất khác so với những nỗn chưa trưởng thành trong chu kỳ IVM(In vitro maturation – Trưởng thành nỗn trong ống nghiệm) thực sự. Do đó,ý nghĩa lâm sàng của việc sử dụng noãn chưa trưởng thành trong các chu kỳkích thích buồng trứng cần được nghiên cứu thêm.

1.2. NỖN KHƠNG THỤ TINH SAU ICSI: NGUN NHÂN VÀ YẾUTỐ ẢNH HƯỞNG

1.2.1. Khái niệm

Nỗn khơng thụ tinh sau ICSI là hiện tượng nỗn khơng hồn thành đượcq trình thụ tinh sau khi thực hiện kĩ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn,khơng tạo ra hợp tử và phôi. Hiện nay, tỉ lệ thụ tinh sau ICSI đạt khoảng 70-80%.6 Như vậy, vẫn có 20-30% nỗn khơng thụ tinh sau khi thực hiện kĩ thuậtnày. Đặc biệt có những trường hợp 100% nỗn trong 1 chu kỳ IVF không thụtinh được gọi là thất bại thụ tinh toàn bộ. Những trường hợp thất bại thụ tinhtoàn bộ này hiếm gặp hơn chiếm khoảng 1-3% các chu kỳ ICSI.5

1.2.2. Các ngun nhân nỗn khơng thụ tinh sau ICSI

ICSI đạt được tỷ lệ thụ tinh từ 70 đến 80% với tinh trùng xuất tinh. ICSIđã khắc phục được nhiều trường hợp khuyết tật của tinh trùng nhưng khôngloại bỏ được hoàn toàn sự thất bại thụ tinh. Các nguyên nhân có thể gây thấtbại thụ tinh là phức tạp, có thể liên quan đến các đặc điểm của chu kỳ kíchthích buồng trứng, số lượng, chất lượng nỗn, tinh trùng di động và/hoặc mứcđộ nghiêm trọng của các khiếm khuyết tinh trùng.30,31

1.2.2.1. Các yếu tố thuộc về nỗn

a. Hình thái noãn

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Các đặc điểm bình thường của một nỗn trưởng thành khỏe mạnh lànoãn dừng ở kì giữa lần giảm phân II (Metaphase II - MII) bao gồm các đặcđiểm: có sự hiện diện của 1 cực cầu (first polar body - PB1), hình dạng trịn,bào tương sáng màu với các hạt kích thước đồng đều, khoảng quanh noãn(Perivitelline space-PVS) rộng vừa phải, khơng có các mảnh vụn và màngtrong suốt khơng màu (Hình 1.5-I).

Hình 1.5. Hình thái nỗn trưởng thành dưới kính hiển vi (x400). (I)

Nỗn trưởng thành bình thường: Có sự hiện diện của cực cầu 1, nỗn trịn

đều, bào tương noãn sáng màu, khoảng quanh noãn rộng vừa phải, màngtrong suốt khơng màu.32 (II) Một số dạng hình thái noãn bất thường (mũi

tên):(A) Nhiều hạt lớn phân tán trong bào tương; (B) Đám hạt tập trung ở

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

lặp lại từ chu kỳ này sang chu kỳ khác. Các nhà nghiên cứu cho rằng sự xuấthiện lặp đi lặp lại của cụm bào quan bất thường có liên quan đến 1 yếu tố tiềmẩn ảnh hưởng xấu đến toàn bộ số noãn chọc hút được.35 Ten và cộng sự(2007) cũng chỉ ra đặc điểm bào tương sẫm màu cũng làm giảm 83% khảnăng thu được phôi tốt.36 Một số nghiên cứu cũng cho rằng những thay đổi bấtthường của bào tương của nỗn MII có thể là phản ánh sự trưởng thành củabào tương bị trì hỗn, khơng đồng bộ với sự trưởng thành của hạt nhân.37

Ở những noãn trưởng thành nhân MII có hình thái bào tương bìnhthường, những yếu tố ngoài tế bào như tăng độ rộng PVS, có sự hiện diện cáchạt ở PVS hay PB1 phân mảnh làm giảm khả năng phát triển của noãn. Trongcác nghiên cứu gần đây cho thấy có mối tương quan giữa hình thái PB1 vàtiềm năng của nỗn. Mặc dù PB1 không tham gia vào quá trình phát triển,nhưng những nỗn có PB1 ngun vẹn có tỷ lệ thụ tinh cao hơn và chất lượngnoãn tốt hơn so với những nỗn có PB1 lớn, hình dạng khơng đều, bề mặt thơráp hoặc phân mảnh. Nỗn có những bất thường PB1 cũng có tỷ lệ mang thaigiảm sau chuyển phơi.38˒39˒40

Trong khi đó, một số bất thường khác như màng trong suốt dày, bấtthường hình thái thậm chí là khơng có màng trong suốt có thể được giải quyếtbằng kỹ thuật ICSI sẽ cho kết quả thụ tinh và tạo phơi bình thường.41˒42˒43

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

b. Sự trưởng thành của noãn

Sự trưởng thành của noãn là một quá trình phức tạp bao gồm cả sựtrưởng thành về nhân và bào tương.

Noãn sau khi được tách tế bào hạt, có thể đánh giá được hình thái và sựtrưởng thành của nhân ở các giai đoạn GV (germinal vesicle), GVBD(germinal vesicle break down), MI (metaphase I) và MII (Hình 1.6). Có 20%số nỗn thu được từ các chu kì kích thích buồng trứng là chưa trưởng thành:MI hoặc GV. Trong những trường hợp bệnh nhân đáp ứng kém, nang trứngphát triển không đồng bộ dẫn đến có sự diện của những nỗn chưa trưởng

thành. Những nỗn này có thể tiếp tục phát triển trong q trình ni cấy in

vitro thành MII và được sử dụng làm nguồn ICSI.

Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của nỗn.44 Giai đoạn GV: có sự

hiện diện của túi mầm nhân (Germinal vescicle) trong bào tương noãn, nỗnđang ở giai đoạn kì đầu giảm phân I; Giai đoạn MI: khơng có sự hiện diệncủa túi mầm nhân và cực cầu I; Giai đoạn MII: có sự hiện diện của cực cầu Iở khoảng quanh noãn, noãn dừng ở kì giữa giảm phân II.

Cùng với sự trưởng thành của nhân, sự trưởng thành của bào tương có sựảnh hưởng quan trọng tới quá trình thụ tinh. Bào tương của noãn chứa các bàoquan và vật chất tế bào cần thiết hỗ trợ quá trình trao đổi chất của phơi sau khithụ tinh. Ở nỗn người, bào tương chứa các ti thể, lưới nội bào nhẵn (Smoothendoplasmic reticulum-SER), bộ Golgi, hạt vỏ, khung tế bào nhưng khơng cókhơng bào, thiếu lipid khơng như ở các lồi động vật khác (Hình 1.7).

Sự trưởng thành của bào tương liên quan đến một loạt các sự kiện phứctạp bao gồm: tổng hợp protein, phiên mã RNA trong bào tương. Các hoạtđộng

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

này tiêu thụ năng lượng. Chức năng chính của ti thể là tổng hợp ATP(Adenosine triphosphate). Vì vậy, sự di chuyển của ti thể đến khu vực có nănglượng tiêu thụ cao là rất quan trọng trong q trình trưởng thành của nỗn.45 Ởngười, nỗn giai đoạn GV, ti thể chủ yếu hình cầu hoặc hình bầu dục với chấtnền đặc và một vài mào dạng vòm hay ngang, và thường không thấy ở vùngngoại vi của bào tương.46 Ở noãn MI, MII, ti thể nhiều hơn, phân tán trongtoàn bào tương. Ti thể noãn người liên kết với với hệ thống SER ở cuối giaiđoạn trưởng thành. Phức hợp ti thể-SER chứa các chất và các thành phầnmàng tham gia vào quá trình thụ tinh và hình thành phơi sớm.47 Nhu cầu nănglượng cao của nỗn được đáp ứng bằng sự gia tăng diện tích của mào ti thể,sự biệt hóa mào ti thể có thể cung cấp năng lượng hiệu quả cho sự phát triểncủa phơi. Vào thời điểm trứng rụng, mỗi nỗn chứa khoảng 10 ⁵ ti thể, vàDNA ti thể (mitochondria DNA-mtDNA) không được nhân lên cho đến giaiđoạn phôi vị. Khi nỗn, phơi khơng đủ ti thể do ti thể kém chức năng hoặc lỗihay gặp ở noãn của người phụ nữ lớn tuổi sẽ không cung cấp đủ năng lượngcho sự thụ tinh và phát triển của phôi. Do đó, có thể gây ra hiện tượng dừngphát triển ở bất cứ giai đoạn nào. Hiện tượng mất đoạn của mtDNA cũng nhưthối hóa mtDNA tăng lên đáng kể ở những trường hợp nỗn thất bại thụ tinhhay phơi dừng phát triển.48 Rõ ràng, ti thể được biệt hóa hồn tồn, di chuyểnthành cơng, số lượng ti thể tối ưu và đảm bảo chất lượng mtDNA là nhữngyêu cầu tối thiểu cho sự thụ tinh và phát triển của phơi.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Hình 1.7. Nỗn trưởng thành bào tương. (A) Dưới kính hiển vi quang

học. (B,C) Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua. Các phức hợp giống vòng cổ(Necklace-like) đặc trưng bởi ti thể và lưới nội bào nhẵn, cũng như tập hợpcác lưới nội bào hình ống kích thước lớn, thoi phân bào ở kì giữa giảm phân2 (mũi tên) được định hướng vng góc với bề mặt (B). Thước đo 50μm (A)m (A)và 10μm (A)m (B).49

Các vi ống tham gia trực tiếp vào quá trình di chuyển của nhiễm sắc thể(NST) và các bào quan. Các nghiên cứu về vi ống trong noãn cho thấy thoiphân bào và các vi ống ở kì trung gian bất thường có thể là ngun nhân dẫnđến khơng thụ tinh ở nỗn.50, 51, 52 Trong khi đó, các vi sợi liên quan đến quátrình di cư của NST, neo vùng ngoại vi thoi phân bào, thiết lập tính phân cựcvà tống xuất PB1 khi noãn trưởng thành.53 Đồng thời, các vi sợi cùng dyneincó vai trị đặc biệt quan trọng trong việc di chuyển các tiền nhân mới hìnhthành tiến lại gần nhau tại vị trí trung tâm của hợp tử tạo điệu kiện cho chúngnhanh chóng được bắt giữ và kết hợp trên thoi phân bào ở lần phân chia đầutiên (Hình 1.8).54

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Hình 1.8. Mơ hình cơ chế tập hợp chất nhiễm sắc tại bề mặt phân cắthạt nhân trước (bên trái) và sau khi (bên phải) hoàn thành quá trình di

chuyển của tiền nhân. Màu xám – tiền nhân. Màu đỏ – chất nhiễm sắc,

nhiễm sắc thể. Màu vàng – NPC. Màu lam – dynein. Màu xanh lá – Vi sợi,trung thể. Độ phân cực của vi sợi được biểu thị bằng (+) và (-). Các mũi tênđịnh hướng dynein. Các tiền nhân cái và được lần lượt được đánh dấu bằng♀ và ♂.54

Cùng với sự thay đổi của bào quan, sự toàn vẹn của thoi phân bào là cầnthiết cho chuỗi các sự kiện dẫn đến việc hồn thành chính xác giảm phân vàthụ tinh. Các vi ống của thoi phân bào rất nhạy cảm với các thay đổi hóa họcvà vật lý trong q trình xử lý tế bào nỗn. Khi mơi trường ni cấy nỗn bịhạ thấp đến nhiệt độ phịng sẽ làm ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc vi ống củathoi phân bào. Từ đó dẫn đến hậu quả xấu về cách tổ chức sắp xếp nhiễm sắcthể.55 Ở nỗn tươi, thoi phân bào có hướng song song với bề mặt màng bàotương và các cực của thoi phân bào kết hợp với các trung tâm tổ chức vi ống(Microtubule-organizing centres-MTOCs) tạo ra thoi phân bào nhỏ gọn. Điềunày được thực hiện thông qua sự sắp xếp các vi ống và vi sợi.56

Ngoài ra, sự xuất hiện các cụm SER (Đĩa SER) – một cấu trúc giống nhưkhông bào trong mờ trong bào tương noãn MII khi quan sát bằng kính hiển vitương phản cũng liên quan đến nguy cơ bất thường thụ tinh 32 và cần thậntrọng khi chuyển phôi do hiệu quả chu kỳ thấp hơn.57 Các bất thường khác củanoãn như sự xuất hiện của các hạt trung tâm (Central located cytoplasmicgranular –

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

CLCG) cũng làm giảm tỷ lệ thụ tinh và có xu hướng làm giảm tỷ lệ phôi tốtngày hai.58

Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, những nỗn khơng thụ tinh trongICSI có mối liên quan chặt chẽ đến những biểu hiện gen chết theo chươngtrình trong bộ nhiễm sắc thể. Những nỗn này được định sẵn để loại bỏ sinhlý ở buồng trứng trong q trình phát triển nhưng khi bệnh nhân có sử dụngcác phác đồ kích thích buồng trứng, những nỗn này lại được thu nhận trongq trình chọc hút nỗn và ICSI. Đồng thời những đứt gãy DNA trong nỗncó liên quan đến một khiếm khuyết về trao đổi chất chung gây ra thất bại thụtinh sau ICSI.59

1.2.2.2. Các yếu tố của tinh trùng

a. Khả năng di động tiến tới của tinh trùng

Tốc độ di chuyển của tinh trùng thông thường không ảnh hưởng đến tỉ lệthụ tinh khi thực hiện kỹ thuật ICSI. Tuy nhiên, những trường hợp tinh trùngbất động tỷ lệ thất bại thụ tinh cao hơn so với sử dụng tinh trùng di động.60

b. Nguồn gốc tinh trùng và mức độ trưởng thành tinh trùng

Khi kỹ thuật ICSI áp dụng trong hỗ trợ sinh sản mở ra một cơ hội mớicho những trường hợp vô sinh do nam khơng có tinh trùng trong tinh dịch(azoospermia). Với trường hợp khơng có tinh trùng do tắc nghẽn, quá trìnhsản xuất tinh trùng có thể bình thường nhưng tinh trùng không xuất tinh đượcdo bị chặn đường ra. Trong khi đó, khơng có tinh trùng khơng do tắc nghẽn làkết quả của quá trình sinh tinh suy yếu nghiêm trọng hoặc khơng có. Hiệnnay, những kỹ thuật thu nhận tinh trùng từ mào tinh, tinh hoàn được pháttriển. Tinh trùng thu nhận được từ kĩ thuật này có thể được sử dụng cho kỹthuật ICSI. Những trường hợp không xác định được những dạng tinh trùngtrưởng thành, một số biện pháp khác đang được thử nghiệm như tiêm nhântiền tinh trùng tròn (round spermatid nucleus injection – ROSNI) hay tiêmtiền tinh trùng tròn (round spermatid injection-ROSI). Đây là phương pháp sửdụng những tế bào

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

tiền thân của tinh trùng thu được từ các mẫu xuất tinh hay từ tinh hoàn tiêmtrực tiếp vào bào tương noãn.

Trong trường hợp tinh trùng trích xuất di động và có hình thái bìnhthường, tỷ lệ thụ tinh và làm tổ tương tự những trường hợp sử dụng mẫu tinhdịch bình thường. Nhưng các nghiên cứu cho thấy, sự thay đổi trạng tháinhiễm sắc thể của tinh trùng có liên quan đến sự suy yếu hoặc mất khả năngsinh tinh.61 Với những trường hợp này tinh trùng và tiền tinh trùng có tỷ lệ đứtgãy DNA tăng cao. Dẫn đến nhiều trường hợp tỷ lệ thụ tinh, có thai khi sửdụng tinh trùng trích xuất ICSI giảm đi.62

c. Khiếm khuyết cấu trúc tinh trùng

Khi thực hiện kĩ thuật ICSI, nhà phôi học sẽ lựa chọn những tinh trùng diđộng có hình thái tốt nhất. Tuy nhiên, chỉ dựa vào hình thái vi thể để xác địnhkhả năng thụ tinh thực sự của tinh trùng là khá hạn chế. Các nghiên cứu cũngchỉ ra rằng có mối liên quan giữa tình trạng hình thái siêu cấu trúc của các bàoquan ở phần đầu tinh trùng và kết quả thụ tinh tự nhiên cũng như thụ tinh ốngnghiệm.63˒64

Có những khiếm khuyết duy nhất liên quan đến tồn bộ các tinh trùng làtrường hợp vơ sinh nam không thể điều trị. Nguyên nhân vô sinh này do ditruyền và thường dưới dạng di truyền lặn tự phát. Tinh trùng đầu tròn là mộttrong những trường hợp như vậy. Tùy vào mức độ nghiêm trọng của khiếmkhuyết, tỷ lệ thụ tinh sau ICSI với tinh trùng đầu tròn suy giảm. Nguyên nhânthất bại có thể do tinh trùng khơng có khả năng hoạt hóa nỗn hoặc nhân tinhtrùng ngừng giải nén hoặc nhiễm sắc thể cô đặc sớm (Premature chromosomecondensation-PCC).65˒66

Tinh trùng có khơng bào được xếp vào nhóm có hình thái bất thường. Sựhiện diện của khơng bào ở nhân tinh trùng có tương quan nghịch với tỷ lệ thụtinh, làm tổ và có thai.67 Khơng bào đầu tinh trùng được cho là tạo ra ở cácgiai đoạn trưởng thành sớm của tinh trùng. Trong khi đó, những không bàotrong

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

nhân được cho là có liên quan đến việc tạo túi cực đầu. Những không bàotrong nhân được coi là lớn khi có đường kính tối đa lớn hơn 50% chiều rộngđầu tinh trùng. Tinh trùng có khơng bào lớn trong nhân có ít khả năng phảnứng cực đầu và duy trì khả năng di chuyển sau 24 giờ ở 37°C.68 Tỷ lệ giữakích thước khơng bào và vùng đầu có tương quan nghịch với hình thái tinhtrùng kém.69 Đồng thời, không bào trong nhân gồm các thành phần màng cịnsót lại có thể là nguồn tạo ra các gốc oxy hóa (Reactive oxygen species-ROS).ROS khiến tinh trùng tiếp xúc với stress oxy hóa quá mức sẽ gây tổn thươngDNA tinh trùng và làm giảm khả năng thụ tinh.70,71 Không những thế, một sốnghiên cứu báo cáo rằng các không bào lớn liên quan đến sự thất bại cô đặcchất nhiễm sắc đầu tinh trùng làm ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh.72

Ở người, trung tử của tinh trùng là yếu tố thiết yếu cho quá trình chuyểndạng từ phân chia khơng trung thể của nỗn sang dạng phân chia có trung thểcủa hợp tử. Trung tử của tinh trùng người gồm có trung tử gần và trung tử xanằm ở đoạn trung gian của đuôi tinh trùng. Một ý kiến gợi ý rằng các trung tửbất thường sẽ dẫn đến vận động đuôi tinh trùng bất thường, những khiếmkhuyết trung thể tinh trùng có thể là nguyên nhân gây thất bại thụ tinh.

Bất thường hình thái đầu-cổ tinh trùng có thể là nguyên nhân gây vôsinh. Cổ tinh trùng chứa trung tử là phần cơ học yếu nhất của tinh trùng. Áplực bên ngồi có thể khiến cổ tinh trùng bị vỡ thành 2 mảnh: mảnh đầu vàmảnh đuôi.73 Một dạng đứt gãy khác hiếm gặp là sự tách rời khu vực trung thểtử gần và xa. Hội chứng tinh trùng dễ bị đứt đầu (Easily decapitated spermsyndrome) là dạng của bất thường hình thái đầu-cổ (Hình 1.9). Những tinhtrùng này thường khơng có đĩa đáy và/hoặc chỉ cịn di tích với các vết đứt gãygiữa đầu và đuôi.74 Việc tiêm những tinh trùng này vẫn cho phép hoạt hóanỗn, hình thành tiền nhân nhưng khơng có sự di chuyển và hợp nhất các tiềnnhân để tạo ra hợp tử. Ngoài ra, loạn sản vỏ bọc đi tinh trùng có các biếndạng hình thái đoạn trung gian,

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

cổ và đuôi cũng như rối loạn chức năng trung tử cũng là một nguyên nhân gâythất bại thụ tinh sau ICSI do không tạo ra được cấu trúc sao và tổ chức viống.75 Như vậy, các dạng hình thái bất thường của tinh trùng thường tiềm ẩncác khiếm khuyết sâu xa hơn về mặt vi cấu trúc và chức năng có thể gây ra sựthấtbại thụ tinh.

Hình 1.9. Tinh trùng bất thường dạng đứt đầu-cổ (decapitated sperm).

(A) Kính hiển vi điện tử quét (x8000); (B-D) Kính hiển vi điện tử truyền qua(x12500). (A-Acrosome- Túi cực đầu; N-Nuclear - Nhân; AX- Axon – Trụcchính; CR- Cytoplasmic residue – Giọt bào tương; M- Motochoria – Ti thể).76

1.2.3.3. Các tương tác khi tinh trùng gặp noãn

Sau khi tinh trùng hợp nhất với màng bào tương noãn, sự hình thành tiềnnhân sẽ xảy ra. Thiếu sự hiện diện tiền nhân là một dấu hiệu rõ ràng của khôngthụ tinh trong ICSI. Cơ chế nỗn người hoạt hóa trong ICSI khác với trong tựnhiên. Vì sau khi ICSI tinh trùng đã nằm trong bào tương noãn nên sự thất bạicủa quá trình thụ tinh liên quan nhiều đến yếu tố tinh trùng hoặc bộ máy hoạt

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

hóa nỗn. Sự thụ tinh khơng thành cơng sau ICSI có thể do hiện tượng số daođộng Ca²⁺ khơng đủ - yếu tố này liên quan đến cả sự thụ tinh tồn phần hoặcmột phần của nỗn.

Hoạt hóa nỗn là một quá trình thiết yếu được gây ra bởi sự xâm nhập củatinh trùng, chuyển đổi nỗn đang ở kì giữa giảm phân 2 thành nỗn đã thụ tinh.77

Sau đó, tinh trùng không chỉ đưa vật liệu di truyền mà còn mang yếu tố đượccho là phospholipase C zeta (PLCζ) sẽ kích hoạt sự khởi đầu của q trình hoạthóa nỗn.78 Q trình này gồm các sự kiện khác nhau bao gồm sự xuất bào củacác hạt vỏ (cortical granules – CGs), phục hồi chu kì giảm phân, hình thành tiềnnhân, dịch mã mRNA của mẹ và từ giảm phân sang nguyên phân.79

Người ta đã chỉ ra rằng yếu tố tinh trùng PLCζ sẽ thủy phânphosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) tạo ra 2 phân tử mới là inositol1,4,5-trisphosphat (IP3) và diacylglycerol (DAG). IP3 sẽ liên kết với thụ thểIP3 (IP3R), nằm trên lưới nội bào nhẵn trong nỗn. Sau đó, IP3R sẽ trải quathay đổi cấu trúc, tăng độ nhạy của IP3R và dẫn đến giải phóng Ca²⁺ từ cáclưới nội bào.78 Ở những nơi nồng độ Ca² ⁺ nội bào thấp, sự phóng thích Ca²⁺do IP3 được kích thích (feedback dương), ở những nơi nồng độ Ca² ⁺ nội bàocao, cơ chế này ức chế và các kênh IP3R sẽ đóng lại. Cơ chế điều chỉnh képnày của IP3R giúp nó có thể hỗ trợ dao động Ca² ⁺ kéo dài mà khơng gây qtrình chết theo chương trình do Ca² ⁺ gây ra.80 Dao động Ca² ⁺ xuất hiện sau khitinh trùng xâm nhập và sẽ khởi phát các sự kiện liên tiếp khác nhau.

a. Vai trò của Ca² ⁺ nội bào

Tần số dao động Ca² ⁺ nội bào đặc trưng cho loài. Ở người, cứ sau 30-60phút lại có một dao động Ca².81 Các nghiên cứu có sự đồng thuận chung rằngCa²⁺đóng vai trị quan trọng trong q trình hoạt hóa nỗn. Ở động vật có vúkhi thụ tinh, mơ hình thay đổi Ca²⁺gồm các dấu hiệu cụ thể của quá trìnhchuyển

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

tiếp Ca² ⁺ hoặc dao động Ca²⁺lặp đi lặp lại kéo dài vài giờ. Các sự kiện kíchthích hoạt hóa nỗn khác nhau địi hỏi số lượng dao động Ca² ⁺ khác nhau đểbắt đầu và hoàn thành. Một xung Ca²⁺đơn lẻ là đủ để bắt đầu quá trình xuấtbào của hạt vỏ, trong khi quay trở lại giảm phân và hình thành tiền nhân cần ítnhất 4 đến 8 xung Ca²⁺tương ứng.82 Bên cạnh đó, việc hồn thành các sự kiệnhoạt hóa nỗn này đòi hỏi số lượng dao động Ca²⁺ chuyển tiếp nhiều hơn sovới giai đoạn khởi đầu.82 Tuy nhiên, các bằng chứng khác chứng minh rằngnếu tổng tín hiệu Ca²⁺đạt đến ngưỡng nhất định, bất kể số lượng Ca²⁺chuyểntiếp là bao nhiêu thì điều này cũng đủ để gây ra sự hoạt hóa nỗn và sự pháttriển trước và sau cấy chuyển phôi.83 Tuy nhiên, các nghiên cứu khác chỉ rarằng, những thay đổi nhỏ trong bản chất dao động của tín hiệu Ca² ⁺ có thể tácđộng tiêu cực đến cả q trình hoạt hóa nỗn và biểu hiện gen và ảnh hưởnglâu dài hơn, chẳng hạn như sự giảm phát triển của phôi, ngay cả giai đoạn saunuôi cấy. Sự kết thúc sớm của dao động Ca² ⁺ sau khi thụ tinh dẫn đến tỷ lệlàm tổ thấp hơn. Ngược lại sự kích thích quá mức tín hiệu Ca² ⁺ khơng ảnhhưởng đến q trình làm tổ nhưng làm giảm sự phát triển trên các mơ hìnhđộng vật.83, 84

</div>