Đặc điểm hình thái thoi phân bào của noãn không thụ tinh sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.47 MB, 185 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀOTẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THANH HOA

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THOI PHÂN BÀOCỦA NỖN KHƠNG THỤ TINH SAU TIÊMTINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN(ICSI)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀOTẠO BỘ YTẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THANH HOA

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THOI PHÂN BÀOCỦA NỖN KHƠNG THỤ TINH SAU TIÊMTINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NỖN(ICSI)

Chunngành : Mơ phơi thaihọcMãsố 9720101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. NGUYỄN MẠNH HÀ

HÀ NỘI - 2024

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CẢM ƠN

Trongqtrìnhhọctậpvàthựchiệnluậnánnày,ngồisựnỗlựccủabản thân, tơi đãnhận được được sự hỗ trợ, giúp đỡ tận tình của Nhà trường, các thầy cơ, đồngnghiệp và giađình.

Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học củatrường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong qtrình học tập.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS. Nguyễn Mạnh Hà,ChủnhiệmBộmônMô-Phôi,ĐạihọcYHàNội,ngườithầyđãluônquantâm, theo sát chỉdẫn truyền lại kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiệnquyển luận vănnày.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp, bạn bè và gia đình ln ủnghộ, động viên giúp đỡ tơi trong q trình hồn thành chương trình nghiên cứusinh và thực hiện luận án tiến sĩ.

Để hoàn thành quyển luận văn cũng không thể không nhắc đến sự đồng ýtham gia nghiên cứu của các bệnh nhân. Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới họ!

Tơi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận án

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Thanh Hoa, nghiên cứu sinh khóa 38, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Mô phôi thai học, xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn MạnhHà

2. Cơngtrìnhnàykhơngtrùnglặpvớibấtkỳnghiêncứunàokhácđãđược cơng bố tại ViệtNam.

Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội,ngàythángnăm2024

Tác giả luận án

Nguyễn Thanh Hoa

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AMH Anti Mullerian hormone

APC/C Anaphase-promoting complex/cyclosome

AOA Artificial oocyte activation Hoạt hóa noãn nhân tạoART Assisted reproductive technology Hỗ trợ sinh sản

AT Asthenoteratozoospermia Tinh trùng bất thường di độngvà hình thái

ATP Adenosine triphosphate

BMP15 Bone morphogenetic protein15CaMKII Ca²⁺/calmodulin-dependent protein

kinase II

CD9 Cluster of differentiation 9CDK1 Cyclin-dependent kinase 1

DNA Deoxyribonucleic acid

Emi2 Early mitotic inhibitor 2 Ức chế phân bào sớm

FISH Fluorescence in situ hybridization Kĩ thuật lai tại chỗ huỳnhquang

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

FSH Follicle stimulating hormon Hormon kích thích nangtrứng

GDF9 Growth and differentiation factor 9GPI Glycosyl phosphatidylinositolGSH Glutathione

GTP Guanosine-5’-triphosphate

GVBD Germinal vesicle break down Túi mầm vỡHCG Human chorionic gonadotropin

ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh trùng vào bàotương noãn

IP3 1,4,5-trisphosphat

IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm

IVM In vitro maturation Trưởng thành noãn trong ốngnghiệm

NOA Non obstructive azoospermia Khơng có tinh trùng khơng dotắc nghẽn

MAPK Mitogen activated protein kinase

MPF Maturation-promoting factor

MTOCs Microtubule organizing centers Trung tâm tổ chức ống siêu vi

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

OA Oligoasthenozoospermia Tinh trùng bất thường mật độ,di động

OAT Oligoasthenoteratozoospermia Tinh trùng bất thường mật độ,di động và hình thái

PCC Premature chromosomecondensation

Cô đặc nhiễm sắc thể sớmPIP2 Phosphatidylinositol 4,5-

bisphosphatPKC Protein kinase CPLCζ Phospholipase C zeta

PVP Polyvinylpyrrolidone

RNA Ribonucleic acid

ROS Reactive oxygen species Các gốc oxy hóa

ROSI Round spermatid injection Tiêm tiền tinh trùng trònROSNI Round spermatid nucleus injection Tiêm nhân tiền tinh trùng trịnSAC Spindle assemble checkpoint Điểm kiểm sốt tạo thoi phân

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1:TỔNGQUAN...3

1.1. QUÁ TRÌNHTHỤTINH...3

1.1.1. Khái niệm và ý nghĩa của sựthụtinh...3

1.1.2. Các giai đoạn của quá trìnhthụtinh...3

1.1.3. Thụ tinhống nghiệm...8

1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến thành cơngtrong IVF/ICSI...10

1.2. NỖN KHƠNG THỤ TINHSAUICSI: NGUN NHÂN VÀ YẾU TỐẢNHHƯỞNG...13

1.2.1. Khái niệm...13

1.2.2. Các ngun nhân nỗn khơng thụ tinhsau ICSI...13

1.2.3. Phân nhóm ngun nhân nỗn khơngthụtinh...31

1.3. ĐÁNH GIÁ THỤ TINHSAU ICSI...33

1.3.1. Sử dụng kính hiển vi quang học tại thời điểm kiểm trathụtinh...33

1.3.2. Phương pháp hóa mơmiễndịch...34

1.3.3. Các nghiên cứu đánh giá nỗn khơng thụ tinh và ngun nhân nỗnkhơngthụtinh...40

CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU...44

2.1. ĐỐI TƯỢNGNGHIÊN CỨU...44

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọnđối tượng...44

2.1.2. Tiêu chuẩnloạitrừ...44

2.2. PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU...45

2.2.1. Cỡmẫu...45

2.2.2.Thiết kếnghiêncứu...46

2.2.3. Mơ hìnhnghiên cứu...46

2.2.4. Quy trìnhnghiên cứu...46

2.3. TIÊU CHUẨNNGHIÊN CỨU...51

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.4. CÁC BIẾN SỐ VÀ CHỈ SỐNGHIÊNCỨU...55

2.4.1. Biến sốnghiêncứu...55

2.4.2. Chỉ sốnghiên cứu...55

2.5. PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝSỐLIỆU...58

2.5.1. Phương pháp thu thậpsốliệu...58

2.5.2. Phương pháp phân tíchxửlýkếtquả...58

2.5.3. Các phương pháp khống chế sai số và yếutốnhiễu...59

2.6. ĐỊA ĐIỂMNGHIÊNCỨU...60

2.7. THỜI GIANNGHIÊN CỨU...60

2.8. ĐẠO ĐỨC TRONGNGHIÊNCỨU...60

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢNGHIÊN CỨU...61

3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THOI PHÂN BÀO CỦA NỖN KHƠNGTHỤ TINHSAUICSI...61

3.1.1. Đặc điểm của nhóm đối tượngnghiêncứu...61

3.1.2. Đặc điểm của thoi phân bào nỗn khơngthụtinh...69

3.2. MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẶC ĐIỂM NỖN KHƠNG THỤTINHSAUICSI...81

3.2.1. Tuổi mẹ...81

3.2.2. Chỉsố BMI...86

3.2.3. Số lượng nỗn trưởng thành và nỗn khơng thụ tinhsauICSI...90

3.2.4. Mối liên quan giữa đặc điểm tinh trùng và đặc điểm nỗn khơng thụtinh...94

3.2.5. Phân tích hồi quy đa biến các yếu tố ảnh hưởng đến đặc điểm nỗnkhơngthụtinh...97

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

4.1.2. Đặc điểm của chu kì thu nhận nỗn khơng thụ tinh sau ICSI

4.1.3. Đặc điểm của thoi phân bào nỗn khơngthụtinh...110

4.2. MỐI LIÊN QUAN CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ VỚI NỖN KHƠNG THỤTINH...121

4.2.1. Tuổi mẹ và các đặc điểm nỗn khơngthụtinh...121

4.2.2. BMI và đặc điểm nỗn khơngthụtinh...124

4.2.3. Đặc điểm nỗn của chu kì kích thích buồng trứng và nỗn khơngthụ tinh...126

4.2.4. Đặc điểm của tinh trùng và nỗn khơngthụtinh...127

4.2.5. Phân tích hồi quy đa biến các yếu tố ảnh hưởng đến đặc điểm nỗnkhơngthụtinh...131

4.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ MỘT SỐHẠNCHẾ...133

KHUYẾNNGHỊ...137DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ VỀ ĐỀ TÀI LUẬN

ÁNTÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các đặc điểm tuổi của nhómnghiêncứu...61

Bảng 3.2. Đặc điểm thời gianvơ sinh...63

Bảng 3.3. Đặc điểm về chỉ số BMI củangười mẹ...64

Bảng 3.4. Đặc điểm tinhdịchđồ...66

Bảng 3.5. Đặc điểm của chu kì chọchút noãn...67

Bảng 3.6. Đặc điểm sự thụ tinh của noãnsau ICSI...68

Bảng 3.7. Đặc điểm thoi phân bào và nhiễm sắc thể trong nỗn khơng thụtinhsau ICSI...74

Bảng 3.8. Phân bố nỗn khơng thụ tinh theo hình thái thoi phân bào và nhiễmsắcthể...81

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tuổi mẹ và đặc điểm noãn trong chu kì chọc hút8 2Bảng 3.10. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và tính lưỡng cực của thoi phânbào83Bảng 3.11. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và các nhóm hình thái thoi phânbàocùng nhiễm sắc thể vàtuổimẹ...84

Bảng 3.14. Mối liên quan giữa BMI và đặc điểm của chukì IVF/ICSI...86

Bảng 3.15. BMI và đặc điểm hình thái thoi phân bào nỗn khơngthụtinh...88

Bảng 3.16. Mối liên quan giữa thừa cân và các nhóm hình thái thoi phân bàoởnỗn khơngthụtinh...89

Bảng 3.17. Mối liên quan giữa thừa cân và các ngun nhân gây nỗn khơngthụtinh...89

Bảng3.18.Mốiliênquangiữatỷlệnỗntrưởngthànhvàtỷlệnỗnkhơngthụtinh...91

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Bảng 3.19. Mối liên quan giữa số lượng nỗn trưởng thành và hình thái thoiphânbào nỗn khơngthụtinh...92Bảng 3.20. Mối liên quan giữa số lượng noãn trưởng thành và phân loại hìnhtháithoi phân bào nỗn khơngthụtinh...92Bảng 3.21. Mối liên quan giữa số lượng noãn trưởng thành và nguyên nhânnỗn khơngthụ tinh...93

Bảng 3.22. Hình thái tinh trùng và mức độ giải nén nhântinh trùng...95Bảng3.23.Khảnăngdiđộngtinhtrùngvàmứcđộgiảinénnhântinhtrùng

...96Bảng 3.24. Mối liên quan giữa hình thái tinh trùng và ngun nhân khơng

thụtinhcủanỗn...96Bảng3.25.Phântíchhồiquytuyếntínhđabiếncácyếutốảnhhưởngđếntỷlệnỗn khơngthụtinh...97Bảng3.26.Phântíchhồiquylogisticđabiếncủacácyếutốảnhhưởngđếntínhlưỡng cực của thoi phân bào trong não khôngthụtinh...98Bảng 3.27. Phân tích hồi quy logistic đa biến của các yếu tố ảnh hưởng đến bộmáy phân bào trong não khôngthụ tinh...99Bảng 3.28. Phân tích hồi quy logistic đa biến của các yếu tố ảnh hưởng

đếnngun nhân nỗn khơngthụtinh...100Bảng 4.1 Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của đặc điểm noãn thu nhận tới kếtquả thụ tinh và kết quả điềutrịIVF...106Bảng4.2.MộtsốnghiêncứuảnhhưởngchấtlượngtinhtrùngđếnthụtinhtrongICSI...128

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Phân bố bệnh nhân theo tuổingườivợ...62

Biểu đồ 3.2. Phân bố loạivôsinh...63

Biểu đồ 3.3. Phân bố tinh trùng theo nguồn thu nhậntinhtrùng...65

Biểu đồ 3.4. Phân bố số chu kì theo tỷ lệ noãnthụtinh...69

Biểu đồ 3.5. Phân bố nguyên nhân nỗn khơng thụ tinh của noãnsauICSI.73Biểu đồ 3.6. Đặc điểm nhân tinh trùng trong nỗn khơngthụtinh...76

Biểu đồ 3.7. BMI và sự hiện diện của thoi phân bào ở noãn không thụ tinh87Biểu đồ 3.8. Mối tương quan giữa số lượng nỗn trưởng thành trong chu kìvàtỷ lệ nỗn khơngthụtinh...90

Biểu đồ 3.9. Chất lượng tinh trùng và tỷ lệ noãn khơngthụtinh...94

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Hình 1.4. Các thao tác trong kĩthuật ICSI...9

Hình 1.5. Hình thái nỗn trưởng thành dưới kính hiểnvi(x400)...14

Hình 1.6. Các giai đoạn phát triểncủanỗn...16

Hình 1.7. Nỗn trưởng thànhbàotương...18

Hình 1.8. Mơ hình cơ chế tập hợp chất nhiễm sắc tại bề mặt phân cắt hạtnhântrước (bên trái) và sau khi (bên phải) hồn thành q trình di chuyển củatiềnnhân...19

Hình1.9.Tinhtrùngbấtthường dạngđứtđầu-cổ(decapitatedsperm)...23

Hình 1.10. Q trình hoạt hóa nỗn thơngquaPLCζ...26

Hình 1.11. Vị trí biểu hiện PLCζ ở tinhtrùngngười...28

Hình 1.12. Vị trí cựccầu1...30

Hình 1.13. Nỗn với số lượng tiền nhânkhácnhau...33

Hình 1.14. Các cơ chế gây bất thường tiền nhân cóthểgặp...34

Hình 1.15. Hình ảnh thoi phân bào và sắp xếp nhiễmsắcthể...36

Hình 1.16. Thụ tinh bất thườngsau ICSI...38

Hình 1.17. Các mơ hình tập hợp và hoạt động của ti thể trong quá trình trưởngthànhcủanỗn...39

Hình 2.1. Mơ hìnhnghiên cứu...46

Hình 2.2. Các bước của kĩthuật ICSI...49

Hình 3.1. Tinh trùng khơng xâm nhập được vào bàotương nỗn...70

Hình 3.2. Q trình thụ tinh dừng tại thời điểm hoạthóanỗn...71

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Hình 3.3. Q trình thụ tinh dừng tại thời điểm tạo ra cáctiền nhân...72Hình3.4.Mộtsốdạnghìnhtháicủathoiphânbàotrongnỗnkhơngthụtinh

...75Hình 3.5. Nhóm (i): Thoi phân bào lưỡng cực và nhiễm sắc thể thẳng hàng. 77Hình3.6.Nhóm(ii):Thoiphânbào2cựcvànhiễmsắcthểkhơngthẳnghàng..

...78Hình 3.7. Nhóm (iii): Thoi phân bào xáo trộn, nhiễm sắc thểthẳnghàng...79Hình3.8.Nhóm(iv)Thoiphânbàoxáotrộn,nhiễmsắcthểkhơngthẳnghàng..

...80

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Assisted reproductive technology –ART) đã có những bước cải tiến vượt bậc về phương tiện, kĩ thuật cũng như môitrường nuôi cấy phôi. Đặc biệt, sự ra đời của kĩ thuật tiêm tinh trùng vào bàotương noãn (Intracytoplasmic sperm injection – ICSI) giúp tăng tỉ lệ thụ tinh nóiriêng và thành cơng trongthụtinh ống nghiệm (In vitro fertilization – IVF) nóichung. Mặc dù vậy noãn không thụ tinh sau ICSI vẫn là một vấn đềđángquantâm.TỷlệkhôngthụtinhtrongICSIhiệnnaykhoảng20-30%.1Đặc biệt có nhữngtrường hợp thất bại thụ tinh tồn bộ (Total failed fertilization- TFF) với tỷ lệ 5-10% cácchu kỳ IVF và 1-3% các chu kỳICSI.2

Trongtựnhiên,qtrìnhthụtinhcóthểhồnthànhcần2yếutốchínhlànỗnvàtinhtrùng đảmbảo yêucầu chất lượng cùngcác sựkiệnxảyrasauđó.IVFcổđiểnmơphỏngqtrìnhthụtinhgầngiốngvớitựnhiênnhưngđượctiếnhành ngồicơ thể.Trongkhi đó,ICSIlà mộttrongnhữngtiếnbộcơngnghệquan trọng,giúphỗtrợvậnchuyển tinh trùngđiqualớp tế bàohạt,màngtrongsuốt vàmàng bàotươngcủanỗn.Tuynhiên, ICSI khơnggiảiquyết đượccácbướcdẫn đến hợpnhấtcủagentrongqtrìnhthụtinh.Dovậy,qtrìnhthụ

đốnlàkhơngthụtinhchothấycómộtsốnỗnbịdừngqtrìnhthụ tinhsauthờiđiểmICSI.3Dướikính hiển viquanghọcthông thường,chúng tachỉxác địnhđược nỗnkhơngthụtinhmàkhơng chỉrangun nhân gâyra hiệntượngnày.

NgunnhânnỗnkhơngthụtinhđốivớikỹthuậtIVFcổđiểnchủyếuliên quanđến

nhậpvàonỗn.4TrongkhiđónhữngchukỳICSIngunnhânkhơngthụtinhđượccholàcóliênquanđến các khiếmkhuyếtcủa noãn.5Trênthực tế, những đặc tính củanỗnchịu tráchnhiệmlớntrongviệcđiềuchỉnhphầnlớncáccơchếphântửvàtếbàocần

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

thiếtchoqtrìnhthụtinh.Nhữngyếutốảnhhưởngđếnsựpháttriển,phânchiacủanỗnnhưcác bệnh lýliên quanđến vơ sinh,kiểm sốtqtrình rụng nỗnvàthốihóanỗnliêntụcbắt đầu ngaytừtuầnlễ 20 củathaikì đềuảnhhưởngsâu sắc đến sựthụtinh.Phần lớncácnoãn đượclấy racókhảnăng bịtổnhại từtrướcvà bấtchấp

thểkhơngthụtinh.6Đángchúýlàsựcácsaisóttrongviệchìnhthànhthoiphânbàovàbộnhiễmsắcthểbấtthườngcóthểdẫnđếnnỗnkhơngthểhoạthóađúngcáchlàmqtrìnhthụtinh bịdừnglại.Bằngcách đánhgiá cácthànhphầntrong nỗnkhơngthụtinh như hệ thốngthoiphân bào,sự sắp xếp nhiễm sắc thể của noãn hay các bàoquanvànhântinhtrùngcũngnhư các cực cầu, ta có thể xácđịnhđượcthời điểmdừng trongqtrìnhthụtinhcũngnhưngun nhân khơngthụ tinh.

phápcảithiệnđượcthànhcơngtronghỗtrợsinhsản,đặcbiệtvớinhữngtrường hợp tỷ lệ khơngthụ tinh cao, thất bại thụ tinh toàn bộ và lặp đi lặp lại. Nhưng do đặc tính nhạy cảm củanỗn và những vấn đề liên quan đến đạo đức y họcnênnhữngnghiêncứuliênquanđếnnỗnkhơngthụtinhcịnkháhạnchế.Với

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Q TRÌNH THỤTINH

1.1.1. Khái niệm và ý nghĩa của sự thụtinh

Thụ tinh là q trình kết hợp giữa nỗn và tinh trùng tạo ra hợp tử. Thụtinhcótínhđặchiệucholồi.Sựthụtinhcóýnghĩaquantrọngđốivớisựsống vì q trình nàygiúp khôi phục lại bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội đặc trưng cholồitừ2giaotửđơnbội.Sựkếthợpcủanhiễmsắcthểgiớitínhcủagiaotửcái và giao tử đựcgiúp xác định giới tính di truyền của con. Khi bộ nhiễm sắc thể chứa cặp nhiễm sắcthể giới là XX sẽ xác định giới tính di truyền là nữ, bộ nhiễm sắc thể giới là XY sẽxác định giới tính di truyền lànam.

Cá thể mới sẽ mang đặc tính di truyền của cả bố và mẹ do nhận đượcmộtnửasốnhiễmsắcthểtừbốvàmộtnửatừmẹ.Đặcbiệt,khitinhtrùngxâmnhập vào noãn sẽ cungcấp trung thể cho hợp tử. Còn ti thể của tinh trùng sẽ tiêubiến,tồnbộtithểcủanỗnsẽtrởthànhtithểcủahợptửvàphơi.Vàqtrình thụ tinh kíchthích nỗn hồn tất q trình giảm phân đồng thời khởi động q trình phân cắtphơi.

1.1.2. Cácgiai đoạn của q trình thụtinh

1.1.2.1. Nỗn và tinh trùng trước khi thụtinh

Nỗn trước khi thụ tinh được bọc bởi màng trong suốt và lớp tế bào nangcủa gị nỗn. Nỗn đang dừng phân chia ở kỳ giữa giảm phân II. Kèm theo sựhiện diện của cực cầu 1 (first polar body – PB1) nhỏ, khơng có chức năng là sảnphẩm của lần giảm phân I. Loa vịi bắt lấy nỗn được phóng ra từ buồng trứng.Noãn di chuyển trong vòi tử cung nhờ các yếu tố: luồng dịch di chuyểntừbuồngtrứngvàobuồngtửcung,sựlaychuyểncủalơngchuyểnbiểumơvịi tử cung và sựco bóp của cơ trơn vòi tửcung.

Tinh trùng ngay khi xuất tinh khỏi đường sinh dục của nam giới chưa cókhả năng thụ tinh. Tinh trùng cần trải qua bước cuối cùng để trưởng thành hóa

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

chức năng gọi là năng lực hóa tinh trùng. Đây là quá trình loại bỏ cácglycoprotein cũng như protein che phủ túi cực đầu của tinh trùng nhờ vào cácchất tiết trong đường sinh dục nữ. Tinh trùng sau khi xuất tinh di chuyểntrong đườngsinh dục nữ nhờ vào sự tự chuyển động của đi cũng như sự co bóp tầng cơ đường sinh dụcnữ.

1.1.2.2. Quá trình thụ tinh tựnhiên

Hình 1.1. Quá trình thụ tinh tự nhiên.(1) Tinh trùng vượt qua lớp

tếbàonang;(2)Tinhtrùngvượtquamàngtrongsuốt–(a)tinhtrùngliênkếtvới ZP3, (b)phản ứng cực đầu và liên kết với ZP2, (c) xâm nhập qua màng trong suốt; (3) Sựhồ màng bào tương của nỗn và tinh trùng; (4) Hoạt hóa nỗn, nỗn bào 2 hồnthành q trình giảm phân và hình thành tiền nhân cái; (5) Sự hình thành tiềnnhân đực; (6) Sự hịa nhập của 2 tiền nhân, tạo thành hợp tử.6

Bước đầutiên,tinhtrùng phải vượtqualớptếbàonangvàchấtnền. Chấtnền

hyaluronantạothànhmạnglưới.7Noãntiết ra các yếutốnhư GDF9vàBMP15 kíchthích cácconđường truyềntín hiệu nhưSMAD2/3khiến chocáctếbàonang giãnrộng,tạođiều kiện thuậnlợi chosựxâmnhậpcủa tinhtrùngquahàng rào này.8

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Saukhiđiquahàngtếbàonang,tinhtrùngcầnxuyênquamàngtrongsuốt(Zonapellucida–ZP).Cácnoãnpháttriểntổnghợp,tiếtracácglycoprotein(ZP1-4) và cácoligosaccharid liên kết để tạo thànhZP.9Cácg l y c o p r o t e i n củaZPhoạtđộngnhưmộtràocảnđốivớitinhtrùngvàđặchiệucholồitrongqtrìnhthụtinhthơngquaviệcnhậnbiếtvàliênkếtcácproteintrênđầutinhtrùngvớicácthụthểtạivỏglycoprotein.ProteinZP3rấtquantrọngchịutráchnhiệmvề sự gắn kết đặctrưng của tinh trùng với ZP. Một số protein trên bềm ặ t tinhtrùng gắn với cácoligosaccharide bằng liên kết O-đặc hiệu trên ZP3đượccoilà thụ thể ZP3. Tạithời điểm tinh trùng liên kết với ZP dịngCa²⁺ngoạibàođivàonộibào,tinhtrùngđượccảmứngđểtrảiquaphảnứngcựcđầu.Khiđó,các chất trong túi cực đầu tinh trùng được giải phóng bằng hình thứcxuấtbào.Tinhtrùng vượtquamàng trongsuốtsẽ đivàokhoảng quanh noãnvàtiếp xúcvớimàng bào tương noãn. Màng bào tương noãn đượcphủbởi cácvinhung maophânbốkhơng đều,có vùngthưahoặcthiếu hoàn toàn cácvinhungmao.10Nhữngvinhung mao này cùng các protein màngcủanỗnnhư CD9 hayGPIcóvai

trịquantrọngtrongqtrìnhhịamàngbàotươngtinhtrùngvànỗn.Khimàngbàotươnghợpnhấtsẽtạolỗcho tinhtrùngđivào noãn.

Yếu tố PLCζ (Sperm-specific phospholipase C zeta) ở đầu tinh trùng sẽkhởi động q hoạt hóa nỗn, giải phóng các ion canxitừlưới nội bào nhẵn.KếthợpvớiPKC,Ca²⁺dẫnđếnphảnứngvỏngănchặnhiệntượngđatinhtrùng

thụtinh.Đồngthời,Ca²⁺làmgiảmhoạtđộngcủaCSF,giảmcáchoạtđộngcủa MAP kinase vàMPF thúc đẩy nỗn hồn thành nốt q trình giảm phân II và hình thành cực cầu 2(Second polar body -PB2). Cùng với quá trình hoạt hóanỗn,PKCcótácđộngđếnqtrìnhtháorờimàngnhântinhtrùngvàgiảinén nhiễm sắc thể.Các thành phần của nhân tinh trùng được giải nén dần và cácliênkếtdisulfidebịloạibỏ.Cáchistont ừbàotươngnỗnthayt hế chocác

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

protaminetinhtrùngthơngquasựhỗtrợcủacácproteinkinasevàphosphatase khác nhau. Vàsau đó nhiễm sắc thể được cơđặc.

Bước cuối cùng của q trình thụ tinh địi hỏi nỗn cung cấp các thànhphần hình thành màng nhân, ATP/GTP, Lamin B cũng như cáchoạtđộng củacácproteinkinasevàphosphataseđểtạonênmàngtiềnnhân.Cácvisợi,viốngtrongbàotươngnỗnsẽhỗtrợtrongqtrìnhhìnhthànhvàdichuyểncủatiền nhân.6

1.1.2.3. Sựthayđổicủabộkhungtếbàovàhệthốngthoiphânbàonỗntrongq trìnhthụtinh

Dưới tác động của sự thay đổi các yếu tố trong bào tương noãn ̣(theo1.1.2.2), bộ khung tế bào cùng hệ thống ống siêu vi cũng thay đổi.

Noãn chưa thụ tinh chỉ hiện diện hệ thống ống siêu vi ở giai đoạn kỳgiữa giảmphân 2 (Hình 1.2-A). Sau khi tinh trùng xâm nhập vào bào tương noãn, các vi sợi được phát hiện ở đầu tinh trùng là biểu hiện của noãnđược hoạt hóa hồn thành nốt kỳ giảm phân 2 và tạo ra cực cầu 2 (Hình 1.2-B). Nhân tinhtrùngđượcgiảinén,trungtửcủatinhtrùngnhânđơitạotrungthểtrongkhiđó, tiền nhân đực dichuyển từ vùng vỏ vào trong (Hình 1.2-C). Tiền nhân cái di chuyển về phía tiền nhânđực với trung thể tinh trùng trở nên bất đối xứng và phân lưỡng cực (Hình 1.2-D). Khibắt đầu kỳ trước, các nhiễm sắc thể của bố và mẹ sẽ cô đặc riêng rẽ khi 2 hệ thống ốngsiêu vi được thiết lập bắt đầu hình thànhthoiphânbào(Hình1.2-E).Cácnhiễmsắcthểxenkẽdọctheomặtphẳng

xíchđạovà2cấutrúctrungthểkếthợpvớitrụccủatinhtrùngởmộtcực(Hình 1.2-F). Cả tiềnnhân và hệ thống thoi phân bào chính vẫn nằm ở vị trí lệch tâm trong bào tương hợp tử.Khi bắt đầu kì sau, cực của thoi phân bào kéo dài và phản ứng với vùng vỏ liền kề, tạothành rãnh phân cắt tại vị trí này (Hình 1.2- G). Sự phân tách dẫn đến hình thành phơibào con có kích thước bằng nhau (Hình 1.2-H).

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Hình 1.2. Quá trình thay đổi bộ khung tế bào và hệ thống siêu vi khi

thụ tinh ở người (A-H)(Bình thường ngồi cùng bên trái và các biểu

hiệnnỗn khơng thụ tinh bên phải).11(A) Tinh trùng tiếp xúc với màngbàotươngnỗn;(B)Nhântinhtrùnglọtvàobàotươngnỗnvànỗntiếptụcgiảmphân;

(C) Hình thành tiền nhân đực và cái; (D) Trung thể nhân đôi tạo ra cựccủathoi vô sắc; (E) Hai tiền nhân tiến lại gần nhau về trung tâm noãn; (F)Mất màng tiền nhân; (G-H) Hợp tử phân cắt.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

1.1.3. Thụ tinh ốngnghiệm

Lĩnh vực Hỗ trợ sinh sản ra đời nhằm giải quyết các vấn đề dẫn đến việcthụ tinh và mang thai không thể diễn ra tự nhiên. Trong đó, IVF cổ điển(Conventional IVF) và ICSI là hai kỹ thuật phổ biến để thực hiện sự thụ tinhtrong phịng thí nghiệm.

1.1.3.1. IVF cổđiển

tinhtrùngđượcthunhậntừngườichồnghoặctừngânhàngtinhtrùngvàxửlý. Tiếp theo, noãnđược nhốt cùng với tinh trùng trong điều kiện phù hợp gầngiốngvớitựnhiênđểgâyraquátrìnhthụtinh.QuátrìnhthụtinhtrongIVFcổ điển gần vớiquá trình trong tự nhiên, được diễn ra trong điều kiện phịng thí nghiệm. Sau đó,phơi sẽ được chuyển lại tử cung của mẹ để tiếp tục phát triển (Hình 1.3).

Hình1.3.Quá trìnhhỗtrợ sinhsản từkhichọc hútnỗntới thụtinhbằngphươngphápIVF cổđiểnhoặc ICSI tớichuyển phơivàobuồngtửcung.12

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

1.1.3.2. Kỹ thuậtICSI

Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) là kỹ thuật hỗ trợ sinh sản lầnđầu được giới thiệu vào năm 1992.13Tỷ lệ thụ tinh sau ICSI khi sử dụng tinhtrùng xuất tinh tương đương với tỷ lệ thụ tinh của nam giới có chất lượng tinhtrùng bình thường khi sử dụng phương pháp IVF cổ điển.

Hình 1.4. Các thao tác trong kĩ thuật ICSI.14(1) Sử dụng kim giữcốđịnh nỗn sao cho cực cầu 1 ở vị trí 12 giờ hoặc 6 giờ, kim ICSI có chứa

tinhtrùngđượcbấtđộngđưavàobàotươngnỗnởvịtrí3giờ;(2)SửdụngáplựchútcủakimICSIgâyvỡmàngbàotươngnỗn;(3)Đưatinhtrùngvàbàotương noãn trở lạinoãn; (4) Rút kim ICSI ra khỏinoãn

Trong phương pháp ICSI, người ta sử dụng một kim giữ nỗn trong suốtq trình tiêm và một kim nhỏ có vai trò đưa tinh trùng vào bào tươngnỗn.2Khithựchiệnkĩthuật,tinhtrùngsaukhixửlýthườngđượcđưavàomơitrường

tinhtrùngđượchútvàokimvới1lượngnhỏmơitrường.Nỗnđượcgiữtrong mơi trườngni bằng kim Holding với cực cầu ở vị trí 12 giờ hoặc 6 giờ. Kim ICSI đang giữtinh trùng sẽ đi xuyên qua màng trong suốt và màng bào tươngnỗn,gâyvỡmàngbằnghút1ítbàotươngvàokim.Cuốicùng,đưatinhtrùng cùng bàotương vào tế bào nỗn (Hình1.4).

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Kĩthuật ICSIđã hỗtrợ chonhững trườnghợp qtrìnhthụtinh khơngxảy

lượngtinhtrùngkémnhư:mậtđộtinhtrùngkhơngđủgâythụtinh,tinhtrùngdiđộngkémhoặcthậmchíbấtđộnghồn tồn.Đặcbiệt, trong những trườnghợp namgiớichỉ có thểthunhậnmột vàitinh trùngtừcáckĩthuậtchọchútmàotinhhaysinhthiếttinhhồn.

Tuynhiên,khơngphảilúcnàoqtrìnhthụtinhcũnghồnthành.Domột số ngunnhân mà dù tinh trùng được đưa trực tiếp vào bào tương nỗn trong q trình ICSI, nỗnvẫn bị dừng trong q trình thụ tinh gây ra hiện tượng nỗn khơng thụtinh.

1.1.4. Cácyếu tố ảnh hưởng đến thành cơng trongIVF/ICSI

NhiềuyếutốđãđượccholàcóảnhhưởngđếnkếtquảcủaIVFnóichung cũng nhưICSI nóiriêng.

1.1.4.1. Tuổi của phụnữ

Tuổi của người phụ nữ được coi là một trong những yếu tố quan trọng nhấtảnh hưởng đến khả năng có thai trong các chu kì hỗ trợ sinh sản. Khi tuổitănglên,khảnăngsinhsảnsuygiảmđặcbiệtlàsautuổi35.Trongthụtinhốngnghiệm, điềunày thể hiện bao gồm số lượng noãn thu được và tỷ lệ thụ tinh suy giảm theotuổi mẹ.15Các phương pháp đánh giá hình thái phơi người đã chứng minh tuổimẹ có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng phôi, tỷ lệ lệch bội ở phôi người tănglên theotuổi.16

Phụ nữ lớn tuổi có đáp ứng buồng trứng kém hơn trong chu kì kích thíchbuồng trứng có kiểm sốt, ít noãn được lấy ra, tỷ lệ thụ tinh thấp, chất lượngphôisuygiảm,tỷlệlàmtổ,tỷlệsinhthấp,tăngnguycơsảythaivàsinhnon.17

1.1.4.2. Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index –BMI)

Ngồi tuổi tác, yếu tố béo phì cũng rất quan trọng ảnh hưởng đến kết quảcủa hỗ trợ sinh sản. Tác động tiêu của béo phì đối với quá trình sinh sản gồm cácbiến chứng ở mẹ, vô sinh và rối loạn kinh nguyệt. Khả năng sinh sản giảm

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

được cho là do nhiều vấn đề khác nhau ở phụ nữ béo phì như rối loạn chức năngnội tiết và chuyển hóa từ đó ảnh hưởng đến sự tăng sinh nang trứng, sự làm tổ vàsự phát triển của thai lâm sàng.18Nghiên cứu của Kasum và cộng sự (2018) đãchứng minh rằng tỷ lệ mang thai và sinh sống ở những người thừacânvàbéophìgiảmsovớinhữngngườicócânnặngbìnhthườngkhithựchiện

thụtinhốngnghiệm.19Ngunnhâncóthểdotăngnhucầugonadotropintrong q trình kíchthích buồng trứng, số lượng nỗn thu hồi được thấp hơn, nồng độ estradiol huyết thanhgiảm và tỷ lệ thụ tinhthấp.20

Phụ nữ béo phì mang thai sau IVF cũng tăng nguy cơsảythai và gặp cácbiếnchứngsảnkhoanóichung.Béophìlàmtăngthờigiangâyrụngnỗn,giảm đỉnh estradiol vàgiảm số lượng nang trưởng thành. Ngồi ra, béo phì có ảnh hưởng xấu đến chất lượng nỗnvàphơi.21˒22

1.1.4.3. Tuổi của nam giới và đặc điểm của tinhtrùng

Xét nghiệm tinh dịch là phương pháp quan trọng và cơ bản nhất để đánh giánguyên nhân vô sinh và lựa chọn phương pháp điều trị. Đánh giá các đặc điểmcủa tinh trùng như khả năng di động, tổng số lượng và các bất thường về hìnhthái tinh trùng dường như rất quan trọng để dự đoán sự thụ tinh, làm tổcủaphơivàpháttriểnthainhithànhcơng.Nhiềunghiêncứukhácnhauđãđánh

giávềvaitrịcủacácthơngsốtinhdịchkhácnhauđốivớiqtrìnhthụtinhvà mang thai trongthụ tinh ống nghiệm. Khả năng di động của tinh trùng và tổng số lượng tinh trùng cóliên quan đến cơ hội mang thai và thụ tinh caohơn.

Hình thái tinh trùng là một trong những thơng số quan trọng nhất. Bấtthường về hình thái là một yếu tố dự báo đáng tin cậy về khả năng sinh sảnthànhcơngởnhữngbệnhnhânthựchiệnIVF.Trongtrườnghợphìnhtháibình thường dưới4% cho kết quả điều trị kémhơn.

Mộtthơngsốkhácđượcnghiêncứulàtuổicủanamgiới.Tuổigiàcóliênquanđángkểđếnviệcgiảmchấtlượngtinhdịch,sốlượngtinhtrùngvàkhả

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

năng vận động và hình thái bình thường. Độ tuổi nam giới thực sự ảnh hưởngđến kết quả IVF/ICSI còn nhiều tranh cãi. Nghiên cứu của Fratterelli và cộng sự(2008) báo cáo tỷ lệ phôi nang và sinh sống sụt giảm đáng kể ở nam giới trên 50tuổi. Trong khi đó Cito và cộng sự (2019) thấy tỷ lệ nỗn thụ tinh của nhóm namgiới trên 45 tuổi giảm có ý nghĩa thống kê khi thực hiện kĩ thuật ICSI.23Một sốnghiên cứu khác lại khơng thấy có sự ảnh hưởng tuổi cha đến kết quả ICSI.24

sinhsảnthườngđượcchứngminhliênquanđếngiảmchứcnăngsinhtinhtrùng và dẫn đến vôsinh. Chất lượng tinh dịch quan trọng đối với kết quảIVF.

1.1.4.4. Đáp ứng buồng trứng của bệnh nhân trong chu kì kích thíchbuồngtrứng có kiểmsốt

Bệnh nhân được kích thích buồng trứng khi thực hiện kĩ thuật thụ tinh ốngnghiệm. Khi đó, bệnh nhân sử dụng gonadotropin ngoại sinh liều cao để chophép lấy nhiều noãn trong một chu kỳ. Đáp ứng buồng trứng kém thường do sựkết hợp giữa các yếu tố gồm số lượng nang trưởng thành, số lượng noãn thuđược và nồng độ đỉnh estradiol, FSH (Follicle Stimulating Hormone), LH(Luteinizing hormone) và AMH (Anti Mullerian Hormone). Đáp ứng kém vớigonadotrophin kích thích hay gặp ở những phụ nữ lớn tuổi, nhưng cũng có thểgặp ở phụ nữ trẻ. Những người này có tỷ lệ có thụ tinh, chất lượng phôi cũngnhư khả năng mang thai thấp hơn so với những phụ nữ đáp ứng tốt ở cùng độtuổi.25

Một chu kì kích thích buồng trứng có tỷ lệ nỗn chưa trưởng thành cao làbiểu hiện bất lợi của bộ máy sinh học kém hiệu quả và ảnh hưởng đến kết quảcủa chu kì thụ tinh ống nghiệm đó.26Nghiên cứu của Escrich và cộng sự cho thấycó sự gia tăng số lượng phơi từ nỗn chưa trưởng thành, có đến 50% phơi

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

phát triển từ nỗn chưa trưởng thành có bộ NST lưỡng bội.27Nhưng một sốnghiên cứu lại cho rằng sử dụng nỗn chưa trưởng thành khơng có hiệu quảtrong việc tăng tỷ lệ có thai và trẻ sinh sống.28,29Sự trưởng thành nhân, bàotươngvàkhảnăngpháttriểncủanhữngnỗnnontrongchukỳkíchthíchbuồng

trứngrấtkhácsovớinhữngnỗnchưatrưởngthànhtrongchukỳIVM(Invitro maturation –Trưởng thành noãn trong ống nghiệm) thực sự. Do đó, ý nghĩa lâm sàng của việc sửdụng nỗn chưa trưởng thành trong các chu kỳ kíchthích buồng trứng cần được nghiên cứuthêm.

1.2. NỖN KHƠNG THỤ TINH SAU ICSI: NGUN NHÂN VÀ YẾUTỐ ẢNHHƯỞNG

1.2.1. Kháiniệm

Nỗn khơngthụtinhsauICSIlàhiệntượng nỗn khơng hồnthànhđượcqtrìnhthụ tinhsau khi thựchiệnkĩthuật tiêmtinhtrùng vào bào tươngnỗn,khơngtạorahợptửvàphơi.Hiệnnay,tỉlệthụtinhsauICSIđạtkhoảng70-

1.2.2. Cácngun nhân nỗn khơng thụ tinh sauICSI

ICSI đạt được tỷ lệ thụ tinh từ 70 đến 80% với tinh trùng xuất tinh. ICSI đãkhắc phục được nhiều trường hợp khuyết tật của tinh trùng nhưng không loại bỏđược hoàn toàn sự thất bại thụ tinh. Các nguyên nhân có thể gây thấtbạithụtinhlàphứctạp,cóthểliênquanđếncácđặcđiểmcủachukỳkíchthích buồng trứng, sốlượng, chất lượng noãn, tinh trùng di động và/hoặc mức độ nghiêm trọng của các khiếmkhuyết tinhtrùng.30,31

1.2.2.1. Các yếu tố thuộc vềnoãn

a. Hình thái nỗn

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Cácđặcđiểmbìnhthườngcủamộtnỗntrưởngthànhkhỏemạnhlànỗn dừng ở kìgiữa lần giảm phân II (Metaphase II - MII) bao gồm các đặc điểm:cósựhiệndiệncủa1cựccầu(firstpolarbody-PB1),hìnhdạngtrịn,bàotương sáng màu với cáchạt kích thước đồng đều, khoảng quanh noãn (Perivitelline space-PVS) rộng vừa phải,khơng có các mảnh vụn và màng trong suốt khơng màu (Hình 1.5-I).

Hình 1.5. Hình thái nỗn trưởng thành dưới kính hiển vi (x400).

(I)Nỗn trưởng thành bình thường:Có sự hiện diện của cực cầu 1, nỗn

trịnđều,bàotươngnỗnsángmàu,khoảngquanhnỗnrộngvừaphải,màngtrong suốtkhơng màu.32(II) Một số dạng hình thái nỗn bất thường (mũi tên):

(A)Nhiềuhạtlớnphântántrongbàotương;(B)Đámhạttậptrungởtrungtâm;(C) Đám lưới nội bào nhẵn; (D) Không bào; (E) Hình dạng màng trongsuốtbất thường; (F) Khoảng quanh nỗn rộng, nhiều hạt.33

Nỗn có nhiều dạng hình thái bất thường khác nhau (Hình 1.5). Nỗn cóhình thái bất thường được xem là nguyên nhân chính dẫn đến sự suy giảm thụtinh.Ebnervàcộngsựchỉrarằngcáckiềuhìnhbấtthườngxuấthiệnsớmtrong

khinếunhữngbấtthườngnàyxảyratrongqtrìnhnỗntrưởngthànhsẽtăng tỷ lệ nỗnkhơng phát triển.34Tỷ lệ có thai và làm tổ thấp hơn khi phơi chuyểncónguồngốctừchukỳcóhơn50%nỗndịdạngvàsựbấtthườnggiốngnhau

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

lặp lại từ chu kỳ này sang chu kỳ khác. Các nhà nghiên cứu cho rằng sự xuấthiện lặp đi lặp lại của cụm bào quan bất thường có liên quan đến 1 yếu tố tiềmẩnảnhhưởngxấuđếntồnbộsốnỗnchọchútđược.35Tenvàcộngsự(2007) cũng chỉ rađặc điểm bào tương sẫm màu cũng làm giảm 83% khả năng thu được phôi tốt.36Mộtsố nghiên cứu cũng cho rằng những thay đổi bất thường của bào tương của nỗnMII có thể là phản ánh sự trưởng thành của bào tương bị trì hỗn, khơng đồng bộvới sự trưởng thành của hạtnhân.37

nhữngyếutốngồitếbàonhưtăngđộrộngPVS,cósựhiệndiệncáchạtởPVS hay PB1 phânmảnh làm giảm khả năng phát triển của noãn. Trong các nghiên cứu gần đây cho thấycó mối tương quan giữa hình thái PB1 và tiềm năng củanỗn.MặcdùPB1khơngthamgiavàoqtrìnhpháttriển,nhưngnhữngnỗn có PB1nguyên vẹn có tỷ lệ thụ tinh cao hơn và chất lượng noãn tốt hơn sovớinhữngnỗncóPB1lớn,hìnhdạngkhơngđều,bềmặtthơráphoặcphânmảnh. Nỗn có nhữngbất thường PB1 cũng có tỷ lệ mang thai giảm sau chuyển phơi.38˒39˒40

hìnhtháithậmchílàkhơngcómàngtrongsuốtcóthểđượcgiảiquyếtbằngkỹ thuật ICSI sẽcho kết quả thụ tinh và tạo phơi bìnhthường.41˒42˒43

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

b. Sự trưởng thành củanỗn

Sựtrưởngthànhcủanỗnlàmộtqtrìnhphứctạpbaogồmcảsựtrưởng thành về nhânvà bàotương.

Nỗn sau khi được tách tế bào hạt, có thể đánh giá được hình thái và sựtrưởngthànhcủanhânởcácgiaiđoạnGV(germinalvesicle),GVBD(germinal

vesiclebreakdown),MI(metaphaseI)vàMII (Hình1.6).Có20%sốnỗnthu được từ cácchu kì kích thích buồng trứng là chưa trưởng thành: MI hoặc GV. Trong nhữngtrường hợp bệnh nhân đáp ứng kém, nang trứng phát triểnkhông đồng bộ dẫn đến có sự diện của

nàycóthểtiếptụcpháttriểntrongqtrìnhnicấyinvitrothànhMIIvàđược sử dụng làm

Hình1.6.Cácgiaiđoạnpháttriểncủanỗn.44GiaiđoạnGV:cósựhiệndiện của túi

mầm nhân (Germinal vescicle) trong bào tương noãn, noãn đang ở giai đoạnkì đầu giảm phân I; Giai đoạn MI: khơng có sự hiện diện của túimầmnhânvàcựccầuI;GiaiđoạnMII:cósựhiệndiệncủacựccầuIởkhoảng quanh nỗn,nỗn dừng ở kì giữa giảm phânII.

Cùng với sự trưởng thành của nhân, sự trưởng thành của bào tương có sựảnh hưởng quan trọng tới quá trình thụ tinh. Bào tương của noãn chứa các bàoquan và vật chất tế bào cần thiết hỗ trợ q trình trao đổi chất của phơi sau khithụ tinh. Ở noãn người, bào tương chứa các ti thể, lưới nội bào nhẵn (Smoothendoplasmic reticulum-SER), bộ Golgi, hạt vỏ, khung tế bào nhưng khơng cókhơng bào, thiếu lipid khơng như ở các lồi động vật khác (Hình 1.7).

Sự trưởng thành của bào tương liên quan đến một loạt các sự kiện phứctạpbaogồm:tổnghợpprotein,phiênmãRNAtrongbàotương.Cáchoạtđộng

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

này tiêu thụ năng lượng. Chức năng chính của ti thể là tổng hợp ATP(Adenosine triphosphate). Vì vậy, sự di chuyển của ti thể đến khu vực có nănglượng tiêu thụ cao là rất quan trọng trong q trình trưởng thành của nỗn.45Ởngười, nỗn giai đoạn GV, ti thể chủ yếu hình cầu hoặc hình bầu dục với chấtnền đặc và một vài mào dạng vịm hay ngang, và thường khơng thấy ở vùngngoạivicủabàotương.46ỞnỗnMI,MII,tithểnhiềuhơn,phântántrongtồn bào tương. Tithể noãn người liên kết với với hệ thống SER ở cuối giai đoạntrưởngthành.Phứchợptithể-SERchứacácchấtvàcácthànhphầnmàngtham gia vào quátrình thụ tinh và hình thành phơi sớm.47Nhu cầu năng lượng cao của nỗn được đápứng bằng sự gia tăng diện tích của mào ti thể, sự biệt hóamàotithểcóthểcungcấpnănglượnghiệuquảchosựpháttriểncủaphơi.Vào thời điểm trứngrụng, mỗi nỗn chứa khoảng 10⁵ti thể, và DNA ti thể (mitochondria DNA-mtDNA) không được nhân lên cho đến giai đoạn phơi vị.Khinỗn,phơikhơngđủtithểdotithểkémchứcnănghoặclỗihaygặpởnỗn

củangườiphụnữlớntuổisẽkhơngcungcấpđủnănglượngchosựthụtinhvà phát triển củaphơi. Do đó, có thể gây ra hiện tượng dừng phát triển ở bất cứ giai đoạn nào. Hiệntượng mất đoạn của mtDNA cũng như thoái hóa mtDNAtănglênđángkểởnhữngtrườnghợpnỗnthấtbạithụtinhhayphơidừngphát

triển.48Rõràng,tithểđượcbiệthóahồntồn,dichuyểnthànhcơng,sốlượng ti thể tối ưuvà đảm bảo chất lượng mtDNA là những yêu cầu tối thiểu cho sự thụ tinh và pháttriển củaphơi.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Hình 1.7. Noãn trưởng thành bào tương.(A) Dưới kính hiển vi

quanghọc. (B,C) Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua. Các phức hợp giốngvịng cổ (Necklace-like)đặctrưngbởitithểvàlướinộibàonhẵn,cũngnhưtậphợpcáclướinộibàohìnhốngkíchthướclớn,thoiphânbàoởkìgiữagiảmphân2(mũi tên) được địnhhướng vng góc với bề mặt (B). Thước đo 50μm (A) và 10μm (B).m (A) và 10μm (A) và 10μm (B).m (B).49

Các vi ống tham gia trực tiếp vào quá trình di chuyển của nhiễm sắc thể(NST) và các bào quan. Các nghiên cứu về vi ống trong noãn cho thấy thoi phânbào và các vi ống ở kì trung gian bất thường có thể là nguyên nhân dẫn đếnkhơng thụ tinh ở nỗn.50,51,52Trong khi đó, các vi sợi liên quan đến quá trình dicư của NST, neo vùng ngoại vi thoi phân bào, thiết lập tính phân cực và tốngxuất PB1 khi noãn trưởng thành.53Đồng thời, các vi sợi cùng dyneincóvaitrịđặcbiệtquantrọngtrongviệcdichuyểncáctiềnnhânmớihìnhthành tiến lại gần nhautại vị trí trung tâm của hợp tử tạo điệu kiện cho chúng nhanhchóngđượcbắtgiữvàkếthợptrênthoiphânbàoởlầnphânchiađầutiên(Hình 1.8).54

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Hình 1.8. Mơ hình cơ chế tập hợp chất nhiễm sắc tại bề mặt phân cắthạt nhân trước (bên trái) và sau khi (bên phải) hoàn thành quá trình di

chuyểncủatiềnnhân.Màuxám–tiềnnhân.Màuđỏ–chấtnhiễmsắc,nhiễmsắc thể.

Màu vàng – NPC. Màu lam – dynein. Màu xanh lá – Vi sợi, trung thể. Độphân cực của vi sợi được biểu thị bằng (+) và (-). Các mũi tên định hướngdynein. Các tiền nhân cái và được lần lượt được đánh dấu bằng ♀ và♂.54

Cùng với sự thay đổi của bào quan, sự toàn vẹn của thoi phân bào là cầnthiếtchochuỗicácsựkiệndẫnđếnviệchồnthànhchínhxácgiảmphânvàthụ

tinh.Cácviốngcủathoiphânbàorấtnhạycảmvớicácthayđổihóahọcvàvật lý trong quátrìnhxửlý tế bào noãn. Khi môi trường nuôi cấy noãn bị hạ thấpđếnnhiệtđộphịngsẽlàmảnhhưởngđángkểđếncấutrúcviốngcủathoiphân bào. Từ đó dẫnđến hậu quả xấu về cách tổ chức sắp xếp nhiễm sắc thể.55Ở noãn tươi, thoi phân bàocó hướng song song với bề mặt màng bào tương và các cực của thoi phân bàokết hợp với các trung tâm tổ chức vi ống (Microtubule-organizing centres-MTOCs) tạo ra thoi phân bào nhỏ gọn. Điều này được thực hiện thông qua sựsắp xếp các vi ống và visợi.56

Ngoài ra, sự xuất hiện các cụm SER (Đĩa SER) – một cấu trúc giống nhưkhông bào trong mờ trong bào tương noãn MII khi quan sát bằng kính hiển vitươngphảncũngliênquanđếnnguycơbấtthườngthụtinh32vàcầnthậntrọng khi chuyển phơido hiệu quả chu kỳ thấp hơn.57Các bất thường khác của noãnnhưsựxuấthiệncủacáchạttrungtâm(Centrallocatedcytoplasmicgranular–

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

CLCG) cũng làm giảm tỷ lệ thụ tinh và có xu hướng làm giảm tỷ lệ phơi tốtngày hai.58

cómốiliênquanchặtchẽđếnnhữngbiểuhiệngenchếttheochươngtrìnhtrong bộ nhiễm sắc thể.Những nỗn này được định sẵn để loại bỏ sinh lý ở buồng trứng trong quá trình phát triểnnhưng khi bệnh nhân có sử dụng các phác đồkíchthíchbuồngtrứng,nhữngnỗnnàylạiđượcthunhậntrongqtrìnhchọc hút noãn vàICSI. Đồng thời những đứt gãy DNA trong nỗn có liên quan đến một khiếm khuyếtvề trao đổi chất chung gây ra thất bại thụ tinh sauICSI.59

1.2.2.2. Các yếu tố của tinhtrùng

a. Khả năng di động tiến tới của tinhtrùng

Tốc độ di chuyển của tinh trùng thông thường không ảnh hưởng đến tỉ lệthụ tinh khi thực hiện kỹ thuật ICSI. Tuy nhiên, những trường hợp tinh trùng bấtđộng tỷ lệ thất bại thụ tinh cao hơn so với sử dụng tinh trùng di động.60

b. Nguồn gốc tinh trùng và mức độ trưởng thành tinhtrùng

KhikỹthuậtICSIápdụngtronghỗtrợsinhsảnmởramộtcơhộimớicho những trườnghợp vô sinh do nam khơng có tinh trùng trong tinh dịch(azoospermia).Vớitrườnghợpkhơngcótinhtrùngdotắcnghẽn,qtrìnhsản

xuấttinhtrùngcóthểbìnhthườngnhưngtinhtrùngkhơngxuấttinhđượcdobị chặn đường ra.Trong khi đó, khơng có tinh trùng khơng dotắcnghẽn là kết quả của q trình sinhtinh suy yếu nghiêm trọng hoặc không có. Hiện nay,nhữngkỹthuậtthunhậntinhtrùngtừmàotinh,tinhhồnđượcpháttriển.Tinh trùng thu nhậnđược từ kĩ thuật này có thể được sử dụng cho kỹ thuật ICSI. Những trường hợp khôngxác định được những dạng tinh trùng trưởng thành, một số biện pháp khác đang đượcthử nghiệm như tiêm nhân tiền tinh trùng tròn(roundspermatidnucleusinjection–ROSNI)haytiêmtiềntinhtrùngtròn (round spermatid injection-ROSI). Đây là phươngphápsửdụng những tếb à o

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

tiền thân của tinh trùng thu được từ các mẫu xuất tinh hay từ tinh hoàn tiêm trựctiếp vào bào tương nỗn.

Trongtrườnghợptinhtrùngtríchxuấtdiđộngvàcóhìnhtháibìnhthường, tỷ lệ thụ tinh và làmtổ tương tự những trường hợp sử dụng mẫu tinh dịchbình thường. Nhưng các nghiên cứu cho thấy, sự thayđổi trạng thái nhiễm sắc thể của tinh trùng có liên quan đến sự suy yếu hoặc mất khả năng sinh tinh.61Với nhữngtrường hợp này tinh trùng và tiền tinh trùng có tỷ lệ đứt gãy DNA tăng cao. Dẫnđến nhiều trường hợp tỷ lệ thụ tinh, có thai khi sử dụng tinh trùng trích xuất ICSIgiảmđi.62

c. Khiếm khuyết cấu trúc tinhtrùng

Khi thực hiện kĩ thuật ICSI, nhà phôi học sẽ lựa chọn những tinh trùng diđộng có hình thái tốt nhất. Tuy nhiên, chỉ dựa vào hình thái vi thể để xác địnhkhả năng thụ tinh thực sự của tinh trùng là khá hạn chế. Các nghiên cứu cũng chỉra rằng có mối liên quan giữa tình trạng hình thái siêu cấu trúc của các bào quanở phần đầu tinh trùng và kết quả thụ tinh tự nhiên cũng như thụ tinh ốngnghiệm.63˒64

Có những khiếm khuyết duy nhất liên quan đến tồn bộ các tinh trùng làtrường hợp vơ sinh nam không thể điều trị. Nguyên nhân vô sinh này do ditruyền và thường dưới dạng di truyền lặn tự phát. Tinh trùng đầu tròn là mộttrong những trường hợp như vậy. Tùy vào mức độ nghiêm trọng của khiếmkhuyết, tỷ lệ thụ tinh sau ICSI với tinh trùng đầu trịn suy giảm. Ngun nhânthất bại có thể do tinh trùng khơng có khả năng hoạt hóa nỗn hoặc nhân tinhtrùng ngừng giải nén hoặc nhiễm sắc thể cô đặc sớm (Premature chromosomecondensation-PCC).65˒66

Tinh trùng có khơng bào được xếp vào nhóm có hình thái bất thường. Sựhiện diện của khơng bào ở nhân tinh trùng có tương quan nghịch với tỷ lệ thụtinh,làmtổvàcóthai.67Khơngbàođầutinhtrùngđượccholàtạoraởcácgiai

đoạntrưởngthànhsớmcủatinhtrùng.Trongkhiđó,nhữngkhơngbàotrong

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

vàduytrìkhảnăngdichuyểnsau24giờở37°C.68Tỷlệgiữakíchthướckhơng bào và vùng đầucó tương quan nghịch với hình thái tinh trùng kém.69Đồngthời,khơngbàotrongnhângồmcácthànhphầnmàngcịnsótlạicóthểlànguồn tạo ra các gốc oxyhóa (Reactive oxygen species-ROS). ROS khiến tinh trùng tiếp xúc với stress oxy hóa q mức sẽ

giảmkhảnăngthụtinh.70,71Khơngnhữngthế,mộtsốnghiêncứubáocáorằng các khôngbào lớn liên quan đến sự thất bại cô đặc chất nhiễm sắc đầu tinh trùng làm ảnhhưởng đến quá trình thụtinh.72

Ở người, trung tử của tinh trùng là yếu tố thiết yếu cho quá trình chuyểndạng từ phân chia khơng trung thể của nỗn sang dạng phân chia có trung thểcủa hợp tử. Trung tử của tinh trùng người gồm có trung tử gần và trung tử xanằm ở đoạn trung gian của đuôi tinh trùng. Một ý kiến gợi ý rằng các trung tửbấtthườngsẽdẫnđếnvậnđộngđitinhtrùngbấtthường,nhữngkhiếmkhuyết trung thể tinh trùngcó thể là ngun nhân gây thất bại thụtinh.

Bấtthườnghìnhtháiđầu-cổtinhtrùngcóthểlàngunnhângâyvơsinh. Cổ tinh trùngchứa trung tử là phần cơ học yếu nhất của tinh trùng. Áp lựcbênngồicóthểkhiếncổtinhtrùngbịvỡthành2mảnh:mảnhđầuvàmảnhđi.73Một dạng đứtgãy khác hiếm gặp là sự tách rời khu vực trung thể tử gần và xa.Hộichứngtinhtrùngdễbịđứtđầu(Easilydecapitatedspermsyndrome)làdạng

củabấtthườnghìnhtháiđầu-cổ(Hình1.9).Nhữngtinhtrùngnàythườngkhơng có đĩa đáy và/hoặcchỉ cịn di tích với các vết đứt gãy giữa đầu và đuôi.74Việc tiêm những tinh trùng này vẫncho phép hoạt hóa nỗn, hình thành tiền nhânnhưngkhơngcósựdichuyểnvàhợpnhấtcáctiềnnhânđểtạorahợptử.Ngồi ra, loạn sản vỏbọc đi tinh trùng có các biến dạng hình thái đoạn trunggian,

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

cổ và đuôi cũng như rối loạn chức năng trung tử cũng là mộtngunnhângâythấtbạithụtinhsauICSIdokhơngtạorađượccấutrúcsaovàtổchứcviống.

75Nhưvậy,cácdạnghìnhtháibấtthườngcủatinhtrùngthườngtiềmẩncáckhiếm khuyếtsâu xa hơn về mặt vi cấu trúc và chức năng có thể gây ra sựthấtbại thụ tinh.

(A) Kính hiển vi điện tử quét (x8000); (B-D) Kính hiển vi điện tử truyềnqua(x12500). (A-Acrosome- Túi cực đầu; N-Nuclear - Nhân; AX- Axon –Trục chính; CR- Cytoplasmic residue – Giọt bào tương; M- Motochoria –Tithể).76

1.2.3.3. Các tương tác khi tinh trùng gặpnoãn

Sau khitinh trùnghợp nhất vớimàngbàotương noãn,sự hìnhthànhtiềnnhânsẽxảy ra. Thiếu sự hiện diệntiền nhânlà một dấu hiệu rõ ràng củakhơngthụtinh

vớitrongtựnhiên.VìsaukhiICSItinhtrùngđã nằmtrongbàotương nỗn nênsựthấtbạicủaquátrìnhthụ tinh liênquan nhiều đếnyếu tốtinh trùnghoặc bộmáyhoạt

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

hóanỗn.Sự thụ tinhkhơng thành công sau ICSIcó thể dohiện tượngsố daođộngCa² khơng⁺ đủ-yếutốnàyliênquanđếncảsựthụtinhtồnphầnhoặcmột

Hoạthóanỗnlàmột qtrình thiếtyếuđượcgây ra bởisựxâm nhập củatinhtrùng,chuyểnđổinỗn đangở kìgiữa giảm phân2thànhnỗnđãthụtinh.77Sauđó,tinhtrùngkhơngchỉđưavậtliệuditruyềnmàcịnmangyếutốđượccholàphospholipaseCzeta(PLCζ)sẽkíchhoạtsựkhởiđầu của qtrìnhhoạthóanỗn.78Qtrìnhnàygồmcácsựkiệnkhácnhaubaogồmsựxuấtbàocủacáchạtvỏ(corticalgranules–CGs),phục hồi chukìgiảmphân,hìnhthànhtiềnnhân,dịchmãmRNAcủamẹvàtừgiảmphânsangngunphân.79

Người ta đã chỉ ra rằng yếu tố tinh trùng PLCζ sẽ thủy phânphosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) tạo ra 2 phân tử mới là inositol1,4,5-trisphosphat (IP3) và diacylglycerol (DAG). IP3sẽliên kết với thụ thể IP3(IP3R), nằm trên lưới nội bào nhẵn trong nỗn. Sau đó, IP3Rsẽtrải quathayđổicấutrúc,tăngđộnhạycủaIP3RvàdẫnđếngiảiphóngCa²⁺từcáclưới nội bào.78Ởnhững nơi nồng độ Ca²⁺nội bào thấp, sự phóng thích Ca²⁺do IP3 được kích thích(feedback dương), ở những nơi nồng độ Ca²⁺nội bào cao, cơ chế này ức chế vàcác kênh IP3R sẽ đóng lại. Cơ chế điều chỉnh kép này của IP3R giúp nó có thểhỗ trợ dao động Ca²⁺kéo dài mà khơng gây q trìnhchết theo chương trình do Ca²⁺gâyra.80Dao động Ca²⁺xuất hiện saukhi tinh trùng xâm nhập và sẽ khởi phát các sự kiện liên tiếp khácnhau.

a. Vai trò của Ca²⁺nộibào

Tần số dao động Ca²⁺nội bào đặc trưng cho lồi. Ở người, cứ sau 30-60phút lại có một dao động Ca².81Các nghiên cứu có sự đồng thuận chung rằngCa²⁺đóng vai trị quan trọng trong q trình hoạt hóa nỗn. Ở động vật có vúkhithụtinh,mơhìnhthayđổiCa²⁺gồmcácdấuhiệucụthểcủaqtrìnhchuyển

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

tiếp Ca²⁺hoặc dao động Ca²⁺lặp đi lặp lại kéo dài vài giờ. Các sự kiện kích thíchhoạt hóa noãn khác nhau đòi hỏi số lượng dao động Ca²⁺khác nhau đểbắtđầuvàhồnthành.MộtxungCa²⁺đơnlẻlàđủđểbắtđầuqtrìnhxuấtbào

củahạtvỏ,trongkhiquaytrởlạigiảmphânvàhìnhthànhtiềnnhâncầnítnhất 4 đến 8 xungCa²⁺tương ứng.82Bên cạnh đó, việc hoàn thành các sự kiện hoạthóanỗnnàyđịihỏisốlượngdaođộngCa²⁺chuyểntiếpnhiềuhơnsovớigiai đoạn khởiđầu.82Tuy nhiên, các bằng chứng khác chứng minh rằng nếu tổng tín hiệu Ca²⁺đạtđến ngưỡng nhất định, bất kể số lượng Ca²⁺chuyển tiếp là baonhiêuthìđiềunàycũngđủđểgâyrasựhoạthóanỗnvàsựpháttriểntrướcvà

saucấychuyểnphơi.83Tuynhiên,cácnghiêncứukhácchỉrarằng,nhữngthay đổi nhỏ trongbản chất dao động của tín hiệu Ca²⁺có thể tác động tiêu cực đến cả q trình hoạthóa nỗn và biểu hiện gen và ảnh hưởng lâu dài hơn, chẳng hạn như sự giảmphát triển của phôi, ngay cả giai đoạn sau nuôi cấy. Sự kết thúc sớm của daođộng Ca²⁺sau khi thụ tinh dẫn đến tỷ lệ làm tổ thấp hơn. Ngược lại sự kích thíchquá mức tín hiệu Ca²⁺khơng ảnh hưởng đến q trình làm tổ nhưng làm giảm sựphát triển trên các mơ hình động vật.83,84

</div>