điều chế tiểu phân nano chitosan chứa phức hợp silymarin phospholipid

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.77 MB, 89 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

<b>ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

<b>ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH</b>

<b>NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:PGS.TS. PHẠM ĐÌNH DUY</b>

<b>THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết quả nêutrong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nàokhác.

TpHCM, ngày… tháng… năm 2023

<b>Trương Công Khánh</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>ĐIỀU CHẾ TIỂU PHÂN NANO CHITOSAN CHỨA PHỨC HỢPSILYMARIN-PHOSPHOLIPID</b>

<b>Trương Cơng Khánh</b>

<b>Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Đình DuyTĨM TẮT</b>

<b>Mở đầu: Các bệnh về gan đang ngày càng phổ biến. Silymarin (dịch chiết từ cây kế</b>

<i>sữa - Silybum marianum) là một trong những lựa chọn hàng đầu trong điều trị viêm</i>

gan và xơ gan. Việc sử dụng dạng phức hợp giữa silymarin và phospholipid đã giúpcải thiện đáng kể sinh khả dụng đường uống của hợp chất này. Tuy nhiên, phức hợpvẫn còn kém tan trong nước. Phức hợp khi điều chế dưới dạng nano có sự cải thiệnđáng kể độ tan và sinh khả dụng so với phức hợp thô ban đầu.

<b>Mục tiêu: Xây dựng công thức đi ều chế tiểu phân nano chitosan chứa phức hợp</b>

silymarin-phospholipid bằng phương pháp tự kết tạo và khảo sát một số đặc tính củahệ tiểu phân. Khảo sát một số đặc tính của hệ phân tán sau khi thu hồi các tiểu phânbằng phương pháp phun sấy.

<b>Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành và đặc</b>

tính của tiểu phân, bao gồm tỉ lệ phosphatidylcholin:chitosan (kl:kl), nồng đ ộpoloxamer 407, tốc độ khuấy trộn, nhiệt độ đun hồi lưu và thời gian đun hồi lưu. Dựatrên việc đánh giá kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán, thế zeta, hiệu suất bắt giữvà khả năng tải, chọn ra cơng thức có các đặc tính mong muốn và sử dụng cơng thứcnày để tiến hành quét nhiệt vi sai, đo nhiễu xạ tia X và phun sấy thu hồi tiểu phân cóbổ sung giá mang là mannitol. Mẫu bột phun sấy với các tỉ lệ giá mang khác nhauđược tiến hành chụp kính hiển vi điện tử quét, thời gian tái phân tán và kích thướctiểu phân sau tái phân tán.

<b>Kết quả nghiên cứu: Hệ tiểu phân được chọn có kích thước hạt trung bình 141,7 ±</b>

3,6 nm, chỉ số đa phân tán 0,189 ± 0,020, giá trị thế zeta +17,16 ± 1,56 mV, hiệu suấtbắt giữ đạt 86,33 ± 3,02 %, và khả năng tải đạt 29,78 ± 1,04 %. Các mẫu bột phunsấy có thời gian tái phân tán trung bình từ 67 đến 760 giây và kích thước tiểu phân

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

trung bình sau tái phân tán từ 196 đến 334 nm với PDI trung bình trong khoảng 1 tùy vào tỉ lệ giá mang.

<b>0,668-Kết luận: Đề tài đã xây dựng được công thức để điều chế tiểu phân nano chitosan</b>

chứa phức hợp silymarin-phospholipid bằng phương pháp tự kết tạo, đánh giá cácyếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và một số đặc tính của hệ tiểu phân. Tuy nhiêncông thức được chọn với giá mang mannitol chưa phù hợp để tiến hành phun sấy.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>PREPARATION OF CHITOSAN NANOPARTICLES CONTAININGSILYMARIN-PHOSPHOLIPID COMPLEX</b>

<b>Truong Cong Khanh</b>

<b>Supervisor: Associate Professor, PhD. Pham Dinh DuyABSTRACT</b>

<b>Introduction: Liver diseases are increasingly prevalent, and Silymarin, extracted</b>

<i>from milk thistle (Silybum marianum), stands as one of the leading choices in treating</i>

hepatitis and cirrhosis. The combination of silymarin with phospholipids hassignificantly improved the oral bioavailability of this compound. However, thecomplex remains poorly soluble in water. The formulation of the complex in nanoform has shown a notable enhancement in solubility and bioavailability compared tothe original crude complex

<b>Objective: The aim of this study is to develop a formula to prepare chitosan</b>

nanoparticles containing silymarin-phospholipid complex via self-assembly methodand examine some properties of the nanosuspension. Investigate some characteristicsof the dispersion system after spray dried.

<b>Research methods: Surveying the factors influencing the formation and</b>

characteristics of nanoparticles, including the phosphatidylcholine:chitosan (w/w)ratio, poloxamer 407 concentration, stirring speed, reflux temperature, and refluxtime. Based on the assessment of nanoparticle size, polydispersity index, zetapotential, encapsulation efficiency, and loading capacity, a formulation with desiredproperties is selected. This formulation is then used for differential scanningcalorimetry, X-ray diffraction analysis, and spray drying with mannitol as asupplementary cryoprotectant. Electron microscopy is employed to examine spray-dried powder samples with varying cryoprotectant ratios, evaluating redispersiontime and nanoparticle size post-redispersion.

<b>Results: The selected formulation exhibited an average particle size of 141.7 ± 3.6</b>

nm, polydispersity index of 0.189 ± 0.020, zeta potential of +17.16 ± 1.56 mV,entrapment efficiency of 86.33 ± 3.02 %, and drug loading of 29.78 ± 1.04 %. The

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

spray-dried powder samples showed an average redispersion time ranging from 67 to760 seconds and an average nanoparticle size after redispersion ranging from 196 to334 nm, with a mean polydispersity index ranging from 0.668 to 1, depending on thecryoprotectant ratio.

<b>Conclusion: The study has successfully developed a formulation for preparation of</b>

chitosan nanoparticles containing silymarin-phospholipid complex through the assembly method. The study involved evaluating the factors influencing theformation and various characteristics of the nanoparticle system. However, it wasfound that the selected formulation with mannitol as the cryoprotectant was notsuitable for the spray drying process.

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>FE-SEM </b> Field-Emission ScanningElectron Microscopy

Kính hiển vi điện tử quét phátxạ trường

<b>FTIR </b> Fourier-Transform Infraredspectroscopy

Phổ hồng ngoại biến đ ổiFourier

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>Hình 1.1. Cấu trúc 3D của 20(S)-protopanaxadiol và phospholipid sau khi docking4</b>

<b>Hình 1.2. Cấu trúc của chitosan ... 10</b>

<b>Hình 1.3 Các cơ chế vận chuyển qua tế bào biểu mô của tiểu phân nano chitosan 11Hình 1.4 Tự kết tạo giữa chính chitosan và các dẫn xuất ... 12</b>

<b>Hình 1.5. Sự tương tác giữa CHI và PC trong hệ tiểu phân nano tự kết tạo ... 13</b>

<b>Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của các hợp chất trong silymarin ... 14</b>

<b>Hình 2.7. Sơ đồ quy trình điều chế tiểu phân nano chứa silymarin ... 24</b>

<b>Hình 3.9. Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ silymarin và độ hấp thu 30Hình 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy ... 34</b>

<b>Hình 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun hồi lưu ... 35</b>

<b>Hình 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đun hồi lưu ... 36</b>

<b>Hình 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ poloxamer... 37</b>

<b>Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phosphatidylcholin và chitosan .. 38</b>

<b>Hình 3.15. Hỗn dịch nano silymarin theo các thơng số được chọn ... 41</b>

<b>Hình 3.16. Đồ thị phân bố kích thước tiểu phân của cơng thức đã chọn ... 42</b>

<b>Hình 3.18. Kết quả quét nhiệt vi sai... 44</b>

<b>Hình 3.19. Kết quả đo nhiễu xạ tia X... 46</b>

<b>Hình 3.20. Thành phẩm bột phun sấy ... 47</b>

<b>Hình 3.23. Dải phân bố kích thước hạt của các mẫu hỗn dịch sau tái phân tán ... 50</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>Bảng 1.1. Các nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp SIL-PC .. 15</b>

<b>Bảng 2.2. Các nguyên liệu được sử dụng ... 18</b>

<b>Bảng 2.3. Danh mục máy móc và trang thiết bị ... 19</b>

<b>Bảng 3.7. Kết quả đo khoảng tuyến tính ... 30</b>

<b>Bảng 3.11. Thành phần cho 100 mL hỗn dịch nano ... 40</b>

<b>Bảng 3.12. Các thơng số của quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ... 40</b>

<b>Bảng 3.13. Kết quả đo thông số hóa lý của mẫu nano silymarin được chọn (n = 3)42Bảng 3.14. Kết quả khảo sát một số đặc tính khi tái phân tán mẫu bột phun sấy ... 49</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

Gan đóng vai trị quan trọng trong q trình chuyển hóa, dự trữ glycogen, tổnghợp protein huyết tương và thải độc. Tuy nhiên, việc sử dụng rượu bia, thuốc lá, càphê, dầu mỡ… quá mức có thể gây suy giảm chức năng gan. Ngoài ra, các chủngvirus viêm gan (chủ yếu là virus viêm gan B và C) cũng gây tổn thương gan nghiêmtrọng. Theo một thống kê năm 2013, hàng năm có khoảng 1,45 triệu người chết do

Một số thuốc hóa dược đã được phát triển để điều trị viêm gan, tuy nhiên cũng đi kèmnhiều tác dụng phụ gây khó chịu cho nhiều dùng, một số phản ứng có hại nghiêm

Trong điều trị bệnh viên gan mạn tính và xơ gan, dịch chiết từ quả và hạt của

<i>cây kế sữa (hay còn gọi là cây cúc gai, cây kế thánh) tên khoa học là Silybum</i>

<i>marianum chứa silymarin</i><small>3</small> đang rất được chú ý nhờ những tác dụng dược lý đã đượcghi nhận bao gồm chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, ổn định màng tế bào, khả năng

khả dụng đường uống chỉ khoảng 20-50% đã giới hạn rất nhiều những ứng dụng của

Để cải thiện sinh khả dụng đường uống của silymarin, nhiều công nghệ đã đượcáp dụng. Trong số đó, kỹ thuật tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid (phức hợpphyto-phospholipid) đã giúp cải thiện đáng kể sinh khả dụng của nhiều chế phẩm

với phospholipid có tính thân dầu mạnh, làm giảm khả năng rã và phân tán trong

đó tối ưu sinh khả dụng đường uống của phức chất này.

Nhằm gia tăng khả năng rã và phân tán của phức hợp, kỹ thuật bào chế hệ tiểuphân nano đã được áp dụng. Nhiều phương pháp tạo tiểu phân nano chứa dạng phứccủa silymarin và phospholipid đã được nghiên cứu và cho kết quả khả quan, trong đó

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

các tiểu phân nano đã giúp tăng sinh khả dụng đường uống lên khoảng 1,6 lần so với

Để khai thác tiềm năng của hệ phân tán nano đ ối với phức hợp

<b>phyto-phospholipid cho các dạng bào chế đường uống, đề tài “Điều chế tiểu phân nano</b>

<b>chitosan chứa phức hợp silymarin-phospholipid” nhằm tạo ra một hệ nano chứa</b>

phức hợp silymarin-phospholipid sử dụng phương pháp tự kết tạo với chitosan. Đâylà một phương pháp đơn giản và hiệu quả để tạo ra một hỗn dịch có kích thước nano.

Các mục tiêu cụ thể gồm có:

- Xây dựng công thức đ iều chế tiểu phân nano chitosan chứa phospholipid bằng phương pháp tự kết tạo và khảo sát một số đặc tính lý hóacủa hệ tiểu phân.

silymarin-- Khảo sát một số đặc tính của hệ nano sau khi thu hồi các tiểu phân nanobằng phương pháp phun sấy.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1. Phức hợp giữa phospholipid-dược chất.</b>

Hiện nay, các dược chất từ thiên nhiên đang ngày càng được chú ý, chẳng hạnnhư curcumin chiết xuất từ nghệ đã được báo cáo về tác dụng chống oxy hóa và chống

hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên với cấu trúc alkaloid, glycosid, flavonoid,terpenoid,... là những chất có hoạt tính sinh học cao, an toàn cho người sử dụng, thânthiện với mơi trường, và có giá thành hợp lý nên dễ dàng tiếp cận với người bệnh.Tuy nhiên, hầu hết các hoạt chất này có có độ tan kém, khả năng thấm và khuếch tánthấp dẫn đến sinh khả dụng thấp, từ đó làm giảm khả năng phân bố thuốc tại nơi tácđộng. Sự kém tan trong dầu hoặc trong nước cũng như cấu trúc phân tử lớn, đa vòngcủa các hoạt chất được cho là đã làm cản trở việc vượt qua lớp biểu mô dạ dày-ruột,

Những nhược điểm vừa nêu đã giới hạn việc ứng dụng các hoạt chất này trong trị liệu.Các khảo sát về sinh khả dụng cho thấy, những hoạt chất có nguồn gốc từ dược liệu

<i>mang hiệu quả mạnh mẽ trong in vitro, tuy nhiên tác dụng dược lý trên in vivo lại rất</i>

Rất nhiều giải pháp đã được đề xuất để giải quyết vấn đề này, bao gồm dạng

Phức hợp phyto-phospholipid (phytosom), được phát triển bơi Indena, là mộtchiến lược đầy hứa hẹn để tăng sinh khả dụng của các dược chất bằng cách tạo phứcgiữa phospholipid và hoạt chất ở một tỉ lệ xác định (thường thay đổi từ 0,5-2,0, trongđó tỉ lệ 1:1 được xem là có hiệu quả nhất). Phospholipid trong phức hợp có tác dụngnhư một “chất dẫn đường”, giúp cho hoạt chất vượt qua màng tế bào dạ dày-ruột để

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Phức hợp được tạo thành bởi liên kết hydro giữa đầu phân cực của phospholipidvà các nhóm -OH của hoạt chất. Một nghiên cứu về phức hợp phospholipid - 20(S)-protopananxadiol sử dụng mơ hình docking cho thấy liên kết hydro tạo thành giữa

phospholipid có thể di chuyển và bao lấy phần phân cực của phức hợp tạo bề mặtthân dầu.

<b>Hình 1.1. Cấu trúc 3D của 20(S)-protopanaxadiol và phospholipid sau khi docking</b>

<i>Nguồn: Pu Y et al. (2016)<small>26</small></i>

Phospholipid thường đư ợc sử dụng trong bào chế phyto-phospholipid làphosphatidylcholin (PC), có cấu trúc lưỡng tính bao gồm đầu cholin thân nước vàđuôi là 2 gốc acyl béo thân dầu. Hơn nữa, PC cịn là thành phần của màng tế bào, nhờ

Ngồi việc sở hữu các ưu điểm của công nghệ nano, dạng bào chế phytosom

- Tăng sinh khả dụng và tính thấm qua da;

- Giảm liều dùng do sự hấp thu tối đa của các thành phần có hoạt tính;- Tạo điều kiện liên kết với gan nhờ khả năng tan trong muối mật;

- Hiệu quả bắt giữ cao do cấu trúc polyphenol của dược chất có khả năng tựliên kết với phosphatidylcholin, thuận lợi cho việc bào chế;

- Kéo dài thời gian lưu thuốc trong cơ thể;

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

- Phosphatidylcholin ngoài vai trị là chất mang cịn có tác dụng bảo vệ gando đó nó mang lại tác dụng hiệp đồng khi sử dụng các chất bảo vệ ganTuy nhiên, phức phyto-phospholipid có tính thân dầu mạnh, dẫn đên khả năng

cải thiện khả năng rã/phân tán, từ đó tối ưu sinh khả dụng đường uống của các phứcchất này.

<b>1.2. Hệ phân tán trong phát triển các dược phẩm có nguồn gốc từ thiên</b>

Các hệ phân tán với các giá mang chứa dược chất đã được phát triển nhằm mụctiêu đạt được sự kiểm sốt hồn hảo sinh khả dụng của thuốc tại vị trí mong muốn.

- Có khả năng tải cao, tức là đưa đủ lượng hoạt chất đạt nồng độ trị liệu trongsuốt thời gian trị liệu, điều này liên quan tới khả năng tải và khả năng bảovệ hoạt chất, tránh bị phân hủy trong môi trường dịch thể;

- Hoạt chất phải tới được nơi tác động, đòi hỏi các tiểu phân phải đạt kíchthước đủ nhỏ để vận chuyển qua màng sinh học; hoặc thẩm thấu qua màngtế bào;

- Cải thiện độ tan hoạt chất do dễ dàng thay đổi kích thước hạt, tăng đáng kểdiện tích tiếp xúc với mơi trường dịch thể;

- Phân hủy sinh học hoặc thải trừ hoàn toàn khỏi cơ thể khi dừng điều trị,tránh nguy cơ tích tụ gây độc, không gây ra các phản ứng miễn dịch, dị ứng;- Làm giảm liều sử dụng, tăng khả năng tuân thủ trị liệu của bệnh nhân.Trong nghiên cứu phát triển, kĩ thuật bào chế đóng vai trị cốt lõi trong việc tìmra các phương pháp bào chế mới để tạo ra những chế phẩm phù hợp với yêu cầu điềutrị, quy mơ sản xuất, chi phí sản phẩm, cũng như đối tượng sử dụng. Ngày này, để tốiưu hóa hiệu quả và chi phí điều trị, nhiều hệ phân tán đã được nghiên cứu và ứngdụng.

<i>Vi nhũ tương</i>

Nhũ tương là một hệ phân tán gồm hai pha lỏng không đồng tan (pha phân tánvà môi trường phân tán), hệ được ổn định nhờ vào chất hoạt động bề mặt. Nhũ tương

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

được phân loại dựa vào kiểu nhũ tương và kích thước giọt. Dựa vào kiểu nhũ tươngcó thể phân loại thành nhũ tương dầu/nước, nhũ tương nước/dầu, nhũ tương kép,...Dựa vào kích thước giọt có thể phân thành nhũ tương kích thước lớn (0,1 – 100 km)và nhũ tương kích thước nhỏ (vi nhũ micro, vi nhũ nano). Vi nhũ tương có kích thướcgiọt khoảng 20 – 200 nm, là hệ đồng nhất, ổn định về mặt nhiệt động học giữa hai

hình dạng tiểu phân ở pha phân tán. Nhờ đặc tính này, vi nhũ tương đã cải thiện đượcnhững hạn chế của nhũ tương thô như giúp hệ ổn định hơn, tăng cường hấp thu vàthẩm thấu của hoạt chất dược liệu, đồng thời được ứng dụng trong điều chế hệ thống

Nhiều dạng bào chế có kích thước nano đã được phát triển và đã được ứng dụngtrong trị liệu, bao gồm các tiểu phân nano polymer (polymeric nanoparticles), tiểuphân nano lipid rắn (nano thế hệ I – solid lipid nanoparticles), chất mang lipid có cấutrúc nano (nano thế hệ II – nanostructured lipid carriers), lipid thông minh (nano thếhệ III – SmartLipid), hệ tinh thể lỏng (Liquid crystalline systems). Trong đ ó, tiểuphân nano polymer được bào chế từ các polyme tương hợp sinh học và phân hủy sinhhọc, bao gồm vi cầu và vi nang. Còn tiểu phân nano lipid được điều chế từ các phântử lipid. Cấu tạo gồm một lõi chứa lipid ở trạng thái rắn, lỏng hoặc rắn-lỏng được baoquanh bởi một lớp màng đơn lipid. Do những ưu thế về cấu tạo nên tiểu phân nanovới cấu trúc lipid có vai trị như một phương tiện vận chuyển chuyên biệt, đảm bảochuyển giao hoạt chất đến đích tác dụng theo một đường dẫn thuốc phù hợp vào cơthể người. Chính vì vậy mà ngày càng có nhiều cơng trình nghiên cứu về tiểu phân

<i>nano chứa hoạt chất hướng đến đích tác động đạt thử nghiệm in vivo. Với lợi thế về</i>

mặt kích thước nên tiểu phân nano có triển vọng lớn trong việc tăng tính thấm và đưahoạt chất đến đúng nơi tác động, cũng như tăng cường dược động học và dược lực

- Tăng độ tan trong dầu/ trong nước của hoạt chất;

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

- Tăng khả năng thấm qua các màng sinh học;

- Cải thiện độ ổn định của dược chất, làm giảm sự phân hủy do nhiệt độ, ánhsáng, oxy, pH và các thành phần khác trong công thức bào chế;

- Tiềm năng phát triển các hệ thống phân phối thuốc tới các mô và cơ quanmục tiêu, các hệ thống phân phối thuốc có kiểm sốt.

Tuy nhiên, những dạng bào chế này cũng có một số nhược điểm như chi phí sảnxuất cao, khó nâng cấp cỡ lơ, kích thước hạt nhỏ khi hít vào dễ gây ra các bệnh phổi

Liposom được xem là tiểu phân đa năng, cấu tạo bởi các phân tử phospholipidcó tính lưỡng tính bao gồm đầu thân nước và đuôi kị nước. Nhờ cấu trúc này, cácphân tử phospholipid được sắp xếp có định hướng sẽ tạo thành một hoặc nhiều lớpphospholipid kép bao xung quanh các phân tử hoạt chất, giúp hoạt chất tan dễ dàngtrong môi trường mong muốn nên thích hợp cho cả hoạt chất thân nước và kị nước,cải thiện độ tan để tăng sinh khả dụng. Ngoài ra, liposom dễ dàng thấm qua màngsinh học nên được ứng dụng để bào chế những chế phẩm có kích thước tương đối lớnnhư gen, protein, peptid và là thành phần quan trọng trong bảo chế thuốc phóng thích

Ethosom là dạng túi mềm, có kích thước từ hàng chục nanomet đến micromet,được cấu tạo từ phospholipid, ethanol nồng độ cao (20 – 45%) và nước. Ethanol giúptăng cường tính thấm qua da do tác dụng phá vỡ cấu trúc lớp lipid kép của da, nhờvậy ethosome dễ dàng vượt qua hàng rào da và đi vào hệ tuần hồn. Nhờ tính chất

Transfersom được cấu tạo từ màng phospholipid bao quanh lõi nước, nhờ đómà transfersom có khả năng đàn hồi tốt và chịu được biến dạng cao, nên thấm qua dadễ dàng. Cơ chế thấm qua da của transfersom là do hydrat hóa lớp sừng và tăng cườngkhả năng thẩm thấu của hoạt chất. Vì vậy, transfersom được dùng để điều chế các sản

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

phẩm dùng ngoài da như kem, gel hay miếng dán thẩm qua da có hoạt chất từ dượcliệu. So với ethosom, thì transfersom là lựa chọn tốt nếu dược chất chỉ thẩm đến cáctầng ngoài của da. Nên tùy vào mục đích tác động tồn thân hay tại chỗ mà lựa chọn

<b>1.3. Công nghệ nano trong nghiên cứu phát triển thuốc thảo dược.</b>

Việc tạo các tiểu phân chứa dược chất có kích thước nano đã được ứng dụng để

phân tán nano là một lĩnh vực khoa học mới nổi và đã được nghiên cứu chuyên sâucho các ứng dụng tiềm năng trong ngành cơng nghiệp dược phẩm. Kích thước hạt củananosuspensions (với kích thước từ một đến vài trăm nanomet) nhỏ hơn nhiều so vớicác hạt thông thường (0,5 đến 10 µm), điều này có thể cải thiện đáng kể tốc độ tancủa chúng, thể hiện tiềm năng ứng dụng trong điều trị. Hơn nữa, so với các công nghệkhác, nanosuspension mang nhiều ưu điểm bao gồm dễ dàng trong việc chuẩn bị, ổn

Song song với việc phát triển các công thức nano cho những mục tiêu cụ thể,phương pháp bào chế cũng được quan tâm nhiều nhằm đưa những cơng thức nano ởquy mơ phịng thí nghiệm sang quy mô công nghiệp và mở rộng khả năng ứng dụngthực tế của cơng nghệ nano. Có nhiều phương pháp để sản xuất các tiểu phân nano,trong đó các phương pháp được chia thành 2 nhóm tiếp cận là từ trên xuống và từdưới lên.

Phương pháp từ trên xuống là phương pháp truyền thống với nguyên lý dùnglực cơ học như kĩ thuật xay nghiền để biến vật liệu hạt thô thành cỡ hạt kích thướcnano. Phương pháp này là sự mở rộng của những kỹ thuật đã được sử dụng để sảnxuất các hạt có kích thước micro. Đây là phương pháp đơn giản, chi phí sản xuất thấp,đạt hiệu quả cao và có thể áp dụng cho nhiều loại vật liệu với kích thước khác nhauđể tạo ra cấu trúc mong muốn với các đặc tính thích hợp. Một số vấn đề thường gặpkhi áp dụng phương pháp này bao gồm việc khó kiểm sốt cấu trúc hạt và tốn nhiềuthời gian. Để nâng cao hiệu năng của phương pháp này, có thể áp dụng kĩ thuật nghiền

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

ướt hay nghiền bị kết hợp đồng nhất áp suất cao vào trong quá trình sản xuất các hạt

Phương pháp từ dưới lên là phương pháp được hầu hết các nhà nghiên cứu sửdụng trong quá trình tổng hợp các hạt nano, vì các hạt nano được tạo thành nhờ vàosự tương tác lý hóa giữa các nguyên tử, phân tử hay ion nên tạo ra hạt nano có tínhlinh động và độ ổn định cao. Ngồi ra, phương pháp tạo ra ít chất thải hơn và do đó,

Trong các phương pháp từ dưới lên, thì kĩ thuật tự kết tạo (nano self-assembly)là một phương pháp đang được quan tâm, với nhiều ưu điểm như chí phí hợp lý, điềukiện thực hiện đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, hiệu suất bắt giữ cao, đồng thờităng tính thấm qua màng sinh học và kéo dài thời gian lưu của hoạt chất trong dịchthể. Bên cạnh đó phương pháp tự kết tạo có thể thực hiện trên cấu trúc khó hoặc cấu

Có 2 kiểu tự kết tạo. Một là tự kết tạo không định hướng (self-assembly) với cơchế là sự tổ chức các hạt nano ngẫu nhiên thành những cấu trúc có trật tự thơng quatương tác trực tiếp giữa các hạt nano hoặc tương tác gián tiếp được điều chỉnh bởimôi trường phân tán. Các hạt nano tạo ra kiểu này cho thấy sự ổn định về mặt nhiệtđộng học và đặc trưng bởi năng lượng tự do tối thiểu. Một cơ chế khác là tự kết tạocó định hướng (directed self-assembly). Nhờ vận dụng các liên kết phân tử như lựcVan der Waals, tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, liên kết đồng hóa trị yếu hoặc cáctrường năng lượng bên ngoài (trường mao dẫn, trường điện từ), từ đó tạo ra các hạt

<b>1.4. Điều chế hệ tiểu phân nano tự kết tạo với chitosan và phosphatidylcholin1.4.1. Chitosan</b>

Chitosan là một polymer tự nhiên bắt nguồn từ sự deacetyl hóa một phần chitin,có khả năng phân hủy sinh học, tương thích sinh học, khơng gây kích ứng miễn dịch,

bám dính lên lớp màng nhầy và có khả năng vượt qua những kết nối chặt chẽ của lớp

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Cấu trúc của chitosan, được minh họa trong Hình 1.2, bao gồm glucosamin vàN-acetyl-glucosamin liên kết với nhau tại vị trí 1, 4 của vòng 2-deoxy-D-

Các nhóm amino giúp chitosan trở thành một polymer đi ện ly tự nhiên(polyelectrolyte) có khả năng hịa tan trong dung dịch acid. Các liên kết hydro nộiphân tử và liên phân tử của nhóm -OH và -NH2 làm chitosan có cấu trúc tinh thể. Sựhiện diện của các nhóm N-acetyl làm cho chitosan có tính thân dầu nhẹ. Khối lượngphân tử và mức độ deacetyl hóa là hai nhân tố chính ảnh hưởng đến mật độ điện tích,tính thân dầu hay thân nước của chitosan. Nhờ sự chuyển dạng của nhóm amin (-NH2)

chitosan dễ dàng liên kết với các cấu trúc mang điện tích âm nhờ tương tác tĩnh điện.

<b>Hình 1.2. Cấu trúc của chitosan</b>

<i>Nguồn: Wang Q. et al. (2014)<small>41</small></i>

Các hạt nano chitosan có khả năng hấp thu vào cơ thể thơng qua vận chuyển

gian bào (paracellular transport) (Hình 1.3) bằng cách mở tạm thời các kết nối giữa

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>Hình 1.3 Các cơ chế vận chuyển qua tế bào biểu mô của tiểu phân nano chitosan</b>

<i>Nguồn: Mohammed MA et al. (2017)<small>45</small></i>

Hiện nay, phương pháp tự kết tạo với nguyên liệu là chitosan đã đạt được nhiều

- Tự kết tạo giữa chính chitosan và các dẫn xuất: quá trình này xảy ra do tươngtác của phần thân dầu hoặc do sự hình thành liên kết hydro. Sự tương tácthân dầu hình thành bằng cách sắp xếp hoặc loại bỏ các phân tử nước, kéocác đầu thân dầu lại gần nhau hơn tạo cấu trúc micelle.

- Tự kết tạo giữa chitosan với một phân tử khác: quá trình này xảy ra chủ yếudo lực tĩnh điện, sự hình thành liên kết hydro. Lực tĩnh điện lớn hơn nhiềuso với lực liên kết hydro (lực tĩnh điện: 500 – 1000 kJ/mol; lực liên kết hydro:10 – 40 kJ/mol), do đó phức hợp tạo ra rất dễ hình thành và có độ bền cao.

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

<b>Hình 1.4 Tự kết tạo giữa chính chitosan và các dẫn xuất</b>

<i>Nguồn: Yang Y et al. (2014)<small>41</small>.</i>

Trong cả 2 trường hợp, lực tương tác Van der Waals cũng là một yếu tố trongcơ chế tự kết tạo. Việc tạo thành hạt nano bằng chitosan tự kết tạo có thể là sự kếthợp đồng thời của cả tương tác tĩnh điện, tương tác kị nước, liên kết hydro và lực vander Waals.

Việc bào chế tiểu phân nano chitosan bằng phương pháp tự kết tạo có thể đượcthực hiện trong dung dịch. Với trường hợp tự kết tạo chitosan với chính nó, có thểcần lực khuấy nhẹ hoặc siêu âm tùy vào trọng lượng phân tử và lực liên kết hydro cótrong tinh thể chitosan. Với trường hợp tự kết tạo với phân tử mang điện tích âm khác,việc hình thành hạt nano sẽ diễn ra nhanh chóng nhờ tương tác tĩnh điện. Tỉ lệ phốitrộn, trình tự, thời gian phối trộn, nồng độ các thành phần, lực trộn sẽ ảnh hưởng đến

<b>1.4.2. Phosphatidylcholin</b>

Phosphatidylcholin (PC) là thành phần chính của phospholipid trong màng tếbào và giúp tạo ra tính lưu động cho màng tế bào. Là một chất đa chức năng do cấutrúc lưỡng tính bao gồm đầu choline thân nước và đi phosphatidyl thân dầu, thíchhợp làm chất nhũ hóa, chất trợ tan trong bào chế các dạng thuốc chứa hoạt chất kémtan, và là thành phần chính cấu tạo nên các dạng bào chế hướng mục tiêu như liposom,ethosom,…PC được đánh giá là an tồn và có tính kinh tế do nguồn nguyên liệu PC

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

Bên cạnh đó, dựa trên đặc tính về cấu trúc, PC có nhóm phosphat mang điệntích âm. Do đó có thể dễ dàng liên kết với các tác nhân mang điện tích dương nhưchitosan theo cơ chế tự kết tạo đ ể tạo thành màng bao bảo vệ phức hợp phyto-

và phospholipid để tạo thành tiểu phân nano tự kết tạo

<b>Hình 1.5. Sự tương tác giữa CHI và PC trong hệ tiểu phân nano tự kết tạo</b>

<i>Nguồn: Ma Q et al. (2020)<small>48</small></i>

<b>1.5. Tổng quan về silymarin</b>

Silymarin (SIL) là một nhóm các hợp chất polyphenolic được phân lập từ quảvà hạt của cây kế sữa (còn gọi là cây cúc gai, cây kế thánh, tên tiếng Anh là milk

<i>thistle), có tên khoa học là Silybum marianum (họ Asteraceae). Silymarin là một hỗn</i>

hợp của các flavonolignan, bao gồm silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin B,

khối lượng. Công thức phân tử của các đơn chất thành phần của silymarin được thểhiện trong Hình 1.6.

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

- Silybin nguyên chất thì kém bền trong dung dịch, silybin trong hỗn hợp vớisilymarin thì bền trong pH 1.0-7.8.

<b>Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của các hợp chất trong silymarin</b>

<i>Nguồn: Zhao X et al. (2016)</i><small>3</small>

<b>1.5.2. Tác dụng dược lý của silymarin</b>

Silymarin đã được báo cáo về khả năng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, điều

bảo vệ tế bào gan được chú ý nhất.

Khả năng bảo vệ gan được cho là nhờ tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ màng tế

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

vệ gan của silymarin bao gồm ức chế chu trình cyclooxygenase, leukotriene và sự

<b>1.5.3. Phức hợp Silybin-Phospholipid (Silybin Phytosome, Silipid, Siliphos®)</b>

Việc nghiên cứu phức hợp Silybin-phospholipid đã được diễn ra từ những năm

0,3-2 mol (1 mol được đề xuất cho kết qua tốt nhất) phospholipid với 1 mol silybin,silydianin, silychristin, hoặc hỗn hợp của 3 chất trong dung môi hữu cơ aprotic nhưdioxan hoặc aceton. Phức hợp thu đư ợc có thể tách ra bằng cách kết tinh với cáchydrocarbon no (n-hexan), phun sấy, đông khô.

phospholipid (tỉ lệ 1:1) vào ethanol khan. Dung dịch sau đó được hút chân khơng đểloại ethanol. Phần chất rắn cịn lại được sấy khơ và nghiền. Phức hợp được tạo ra cóđộ tan trong dầu tăng gần 90 lần so với silybin nguyên chất (0,72 ± 0,04 mg/mL lên62,67 ± 1,86 mg/mL) , độ tan trong nước của phức hợp cũng có tăng nhưng khơngđáng kể (từ 40,83 ± 1,18 µg/mL lên 78,25 ± 2,68 µg/mL).

Các nghiên cứu về sinh khả dụng của phức hợp silybin-phospholipid cũng đãđược thực hiện. Nghiên cứu của Yanyu cho thấy phức hợp có sinh khả dụng đườnguống trên chuột cao gấp 5 lần so với Silybin-N-methylglucamin (một dẫn xuất được

trên người tình nguyện khỏe mạnh cũng cho thấy mức độ hấp thu cao gấp 4,6 lần củaphức hợp silybin-phospholipid so với silymarin dạng hỗn hợp. Một nghiên cứu khácso sánh việc hấp thu của viên nang mềm chứa phức hợp silybin-phospholipid và viênnén truyền thống chứa silymarin cho thấy sinh khả dụng cao gấp 9,6 lần của dạng

<b>1.6. Các nghiên cứu về tiểu phân nano chứa phức hợp silymarin-phospholipid</b>

Các nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp SIL-PC được tổnghợp ở bảng 1.1.

<b>Bảng 1.1. Các nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp SIL-PC</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<b>công bố)<sup>Phương pháp bào chế </sup><sup>Kết quả đạt được</sup></b>

Rui-lingDuan và cộng

Phương pháp đồng kết tủa: phức hợpđược hòa tan vào trong ethanol cùngvới muối mật và polyen phosphatidyl-cholin, dung mơi sau đó được làm bayhơi và các chất tan sẽ tạo màng mỏng.Màng mỏng sau đó sẽ được phân tánvào nước để tạo micelle

Hệ micelle thu được có:- Kích thước: 30,7 ± 4,8

- Thế zeta: –39,0 ± 5,0mV

- DL: 14,43 ± 0,44 %Ruggero

Hỗn dịch liposomes:

phyto-- Kích thước 165 ± 6 nm- PDI: 0,25 ± 0,08

- Thế zeta: -25,1 ± 1,2mV

Hệ nang phytosomes có:- Kích thước: 133,534 ±

Hệ nano có:

- Kích thước: khoảng200 nm

- Thế zeta: -10mV- EE khoảng: 96,2%- DL khoảng: 5,6%

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

poloxamer 188, hỗn dịch sau đó đượcđồng nhất hóa áp suất cao.

Hỗn dịch nano có:- Kích thước: 223,50 ±

4,80 nm

- Thế zeta: -23,14 ±2,73 mV

- PDI: 0,217 ± 0,011Ravi

GundadkaShriram và

Phương pháp bay hơi dung môi: SILvà PC được hòa tan trong ethanol (tỉ lệkl:kl là 1:1,93), dung dịch được đunhồi lưu, cô quay để tạo màng phimmỏng, cuối cùng nước được thêm vàođể phân tán màng phim

Hỗn dịch nano có:- Kích thước: 218,4 ±

2,54 nm

- Thế zeta: −30,8 mV- PDI: 0,256 ± 0,02Arezoo

GohariMahmouda-bad và cộng

Phương pháp lớp mỏng: SIL và PCđược hòa tan vào acetone với tỉ lệ mol1:2,5. Dung dịch dược cô quay để lọaidung mơi. Sau đó thêm nước để phântán màng phim. Hỗn dịch cuối cùngđược siêu âm đầu dị

Hỗn dịch nano có:- Kích thước: 105,16 ±

7,303 nm

- Thế zeta: −10,681±1,6mV

- PDI: 0,374 ± 0,07- EE: khoảng 96 %- DL: khoảng 24 %

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Đối tượng nghiên cứu</b>

Các nguyên liệu được sử dụng cho đề tài được thể hiện trong Bảng 2.2.

<b>Bảng 2.2. Các nguyên liệu được sử dụng</b>

<b>STT Tên nguyên liệu Mục đích sử dụng<sup>Tiêu chuẩn chất</sup>lượng</b>

(Lipoid S100)

Phospholipid trongcấu trúc hạt nano

Hàm lượng 99%

hạt nano

<b>2.2. Máy móc và trang thiết bị</b>

Danh sách máy móc và trang thiết bị được sử dụng cho đề tài được liệt kê trongBảng 2.3.

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<b>Bảng 2.3. Danh mục máy móc và trang thiết bị</b>

Máy xác định kích thước hạtvà thế zeta

Malvern Zetasizer NanoZS90

Kính hiển vi điện tử quét SEM

<b>2.3. Phương pháp nghiên cứu</b>

<b>2.3.1. Thẩm định quy trình định lượng silymarin toàn phần trong hỗn dịch nanobằng quang phổ UV-Vis</b>

Quy trình dự kiến được dựa trên nghiên cứu thẩm định phương pháp định lượng

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

- Mẫu thử: được điều chế theo quy trình điều chế nano silymarin bằng phươngpháp tự kết tạo. Sau đó mẫu thử được pha loãng bằng methanol để thu đượcdung dịch có nồng độ 16 µg/mL.

- Mẫu chuẩn: cân chính xác 42,1 mg silybin chuẩn (hàm lượng 95%) và chovào bình định mức 25 mL, thêm methanol đến vạch, lắc đều đến khi hịa tanhồn tồn, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1,6 mg/mL. Hút 1 mLdung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 mL, thêm methanol đếnvạch để thu được dụng dịch silybin chuẩn có nồng độ 16 µg/mL.

- Mẫu thử thêm chuẩn: mẫu thử thêm chuẩn được điều chế bằng cách lấy mộtlượng mẫu thử tương đương với 1,6 mg silymarin và một lượng mẫu chuẩntương đương với 1,6 mg silybin cho vào bình đ ịnh mức 100 mL, thêmmethanol đến vạch để thu được dụng dịch có nồng độ silymarin tổng là 32µg/mL.

Quét phổ UV-Vis của mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu placebo và mẫu thử thêm chuẩntrong khoảng bước sóng từ 200 đến 400 nm. Đo độ hấp thu lần lượt các mẫu thử, mẫuplacebo và mẫu thử thêm chuẩn tại bước sóng cực đại tìm được.

2.3.1.2. Khoảng tuyến tính:

Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1,6 mg/mL, hút chính xác lần 0,625 mL,0,75 mL, 0,875 mL, 1 mL, 1,125 mL, 1,25 mL vào bình định mức 100 mL, thêmmethanol vừa đủ, lắc đều. Thu được dung dịch tương ứng với các nồng độ sau 10; 12;14; 16; 18; và 20 µg/mL. Tiến hành đo độ hấp thu của mỗi dung dịch tại bước sóng287 nm. Chuẩn bị song song một mẫu trắng. Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụlà trục tung và nồng độ dung dịch là trục hồnh. Đánh giá tính thích hợp của phươngtrình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số bằng công cụ Regression (MS-Excel).

2.3.1.3. Độ lặp lại:

Tiến hành lặp lại 6 lần quy trình định lượng mẫu thử, trong cùng điều kiện vềphịng thí nghiệm, ngày thực hiện và người thực hiện. Tính hàm lượng silymarin cótrong mẫu thử.

u cầu: giá trị RSD kết quả định lượng silymarin có trong các mẫu ≤ 2,0%.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

Yêu cầu: độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0 % - 102,0 %và giá trị RSD ≤ 2,0%.

<b>2.3.2. Xây dựng công thức tiểu phân nano chitosan chứa phức hợp phosphatidylcholin điều chế bằng phương pháp tự kết tạo:</b>

silimarin-2.3.2.1. Xác định các thành phần trong công thức và xây dựng quy trình bào chế tiểuphân nano chứa silymarin

Các thành phần trong công thức được thể hiện trong Bảng 2.4.

<b>Pha cồn </b> Silymarin Hoạt chất

<b>Pha nước </b> Chitosan Thành phần của tiểu phân nano

<b>Tổng </b> Vừa đủ 100 mL

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

Các thành phần trong công thức được dựa trên nghiên cứu của F. Sonvico và

định cấu trúc của hệ và làm giảm sự kết tụ của các tiểu phân. Tỉ lệ poloxamer 407được khảo sát ở nồng độ 0,25 - 0,5%. Ngoài ra, acid acetic băng được thêm vào côngthức nhằm điều chỉnh pH, giúp hòa tan chitosan.

Tiến hành khảo sát tỉ lệ (k1 : kl) phosphatidylcholin và chitosan tương ứng lầnlượt là 5:1, 10:1 và 20:1. Các khoảng tỉ lệ này dựa trên nghiên cứu của F. Sonvicocho thấy hệ tiểu phân nano tự kết tạo có kích thước nhỏ phân tán đồng nhất, thế zetadương và đạt độ ổn định cao. Cũng dựa trên nghiên cứu này, nồng độ PC trong phacồn cũng được cố định là 25 mg/mL. Tỉ lệ mol giữa SIL và PC được cố định là 1:1.Với khối lượng mol của SIL và PC tương ứng là 482 và 770 g/mol, do đó nồng độSIL trong pha cồn là 16 mg/mL.

Các thông số kĩ thuật trong quy trình điều chế cũng đóng vai trị quan trọng vàảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cũng như đặc tính của hệ nano. Trong đó, tốc độkhuấy được khảo sát ở mức 400, 700 và 1000 vòng/phút, thời gian đun hồi lưu ở mức30; 60; 120 phút và nhiệt độ đun hồi lưu ở mức 60; 80 °C. Bên cạnh đó, tốc độ bơmpha cồn được cố định là 1 mL/phút và việc phối hợp pha cồn và pha nước được thựchiện ở nhiệt độ phịng. Các cơng thức khảo sát được trình bày như trong bảng.

Các yếu số khảo sát và mức khảo sát được thể hiện trong Bảng 2.5.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<b>Bảng 2.5. Các công thức được khảo sátCơng</b>

<b>Tỉ lệpoloxamer</b>

<b>Tốc độkhuấy(vịng/phút)</b>

<b>Thời gian đunhồi lưu (phút)</b>

<b>Nhiệt độ đunhồi lưu (°C)</b>

- Pha chế dung dịch chitosan nồng độ gốc: Cân CHI cho vào cốc có mỏ, thêmmột lượng nước cất 2 lần, rồi cho từ từ acid acetic băng, vừa thêm vừa khuấybằng đũa thủy tinh. Sau đó, thêm một lượng nước vào hỗn hợp khuấy đếnkhi CHI tan hoàn toàn. Hỗn hợp được cho vào bình định mức, bổ sung nướccất 2 lần đến vạch, lắc đều thu được dung dịch CHI có nồng độ gốc (2).- Pha nước: Hút một lượng dung dịch (2) tương ứng với tỉ lệ PC:CHI cho vào

cốc có mỏ, thêm poloxamer 407 và nước cất 2 lần vào cốc có mỏ. Khuấybằng máy khuấy từ cho đến khi poloxamer 407 tan hoàn toàn (3).

- Tạo nano: tiến hành bơm từ từ pha cồn (1) vào pha nước (3) bằng bơm kimtiêm, vừa thêm vừa khuấy đều cho tới khi bơm hết pha cồn (1). Sau khi bơm

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

đủ lượng pha cồn cần thiết, tiếp tục khuấy trong 10 phút. Cuối cùng, bổ sungnước cất 2 lần vừa đủ 100 mL.

<b>Hình 2.7. Sơ đồ quy trình điều chế tiểu phân nano chứa silymarin</b>

Hệ tiểu phân nano sau đó sẽ được tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về kích thướctiểu phân, chỉ số đa phân tán (PDI), hiệu suất bắt giữ, khả năng tải và thế zeta, từ đóchọn ra cơng thức phù hợp cho các thử nghiệm kế tiếp. Chỉ tiêu sàng lọc được thểhiện trong Bảng 2.6.

Hòa tan PC và silymarinvào ethanol khan

Hòa tan poloxamertrong nước

Hòa tan chitosantrong nướcTrộn đều

Dung dịch chứapoloxamer và chitosanTự kết tạo

Hỗn dịch chứa tiểu phânnano silymarin trong nước

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Trong đó, chỉ tiêu về kích thước tiểu phân được xem là chỉ tiêu quan trọng nhấttrong nghiên cứu này do việc tối ưu hóa kích thước tiểu phân giúp làm tăng sinh khảdụng của phức hợp SIL-PC. Ngoài ra, thế zeta cao hơn +30 mV được xem là giúp hệổn định theo cơ chế ổn định tĩnh điện (electrostatic stabilization). Tuy nhiên, việc sửdụng poloxamer 407 trong công thức được xem là giúp hệ nano ổn định theo cơ chếổn định khơng gian (steric stabilization). Do đó, chỉ tiêu về thế zeta có thể thấp hơngiá trị +30 mV.

2.3.2.2. Kiểm chứng công thức đã chọn

Tiến hành điều chế 3 mẫu nano silymarin theo công thức đã lựa chọn. Đánh giácác chỉ tiêu về cảm quan, kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán, thế zeta, hiệu suấtbắt giữ, hiệu suất tải, phổ quét nhiệt vi sai và phổ nhiễu xạ tia X.

2.3.2.3. Thu hồi nano silymarin bằng phương pháp phun sấy

Tiến hành thu hồi bằng phương pháp phun sấy với giá mang là manitol với tỉ lệso với lượng chất rắn trong hỗn dịch nano lần lượt là 0,5:1, 1:1, 2:1 và 4:1. Quy trình

khoảng 70 °C, tốc độ bơm nhu động 5 mL/phút. Mẫu bột nano thu được bằng phươngpháp phun sấy sẽ được đánh giá về cảm quan, chụp kính hiển vi điện tử quét phát xạtrường (FE-SEM), thời gian tái phân tán, kích thước tiểu phân và PDI sau tái phântán.

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

<b>2.3.3. Đánh giá đ ặc tính của hệ tiểu phân nano CHI-SLM-PC điều chế bằngphương pháp tự kết tạo</b>

2.3.3.1. Kích thước tiểu phân và PDI

Mẫu hỗn dịch nano được pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần trước khi đo. Kíchthước tiểu phân và PDI của hệ tiểu phân nano silymarin được đo bằng máy ZetasizerNano ZS90. Khoảng 1,5 mL hỗn dịch nano đã pha loãng được cho vào cốc đo. Mỗimẫu được đo 3 lần trong cùng điều kiện nhiệt độ 25 °C. Kết quả đo kích thước tiểuphân và PDI được trình bày bằng kích thước tiểu phân trung bình ± độ lệch chuẩn, vàPDI trung bình ± độ lệch chuẩn.

2.3.3.2. Thế zeta

Mẫu hệ tiểu phân nano được pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần trước khi đo.Khoảng 1,5 mL hệ tiểu phân nano đã pha loãng được cho vào cốc đo. Thế zeta củahệ tiểu phân nano silymarin được đo bằng máy Zetasizer Nano ZS90 số lần đo là 3cho mỗi mẫu. Các mẫu đều được đo trong cùng điều kiện nhiệt độ 25 °C. Kết quả đothế zeta được trình bày bằng thế zeta trung bình ± độ lệch chuẩn.

2.3.3.3. Hiệu suất bắt giữ

Silymarin trong hệ tiểu phân nano bao gồm dạng tinh thể (dạng thô), dạng tự dovà silymarin trong tiểu phân nano. Đ ể tính hiệu suất bắt giữ (EE) cần đ ịnh lượngsilymarin trong tiểu phân nano. Tiến hành các bước:

- Định lượng silymarin toàn phần trong hệ tiểu phân nano (C).

- Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để tách riêng phần silymarinở dạng tinh thể (nếu có). Định lượng phần dịch sau ly tâm tính được tổngnồng độ silymarin ở dạng tự do và trong tiểu phân nano (C1).

- Hút phần dịch sau ly tâm vào ống ly tâm lọc 10 kDa. Ly tâm với tốc độ 4000vòng/phút trong 40 phút. Đ ịnh lượng nồng độ silymarin dạng tự do trongphần dịch sau ly tâm (C2).

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

Nồng độ silymarin trong tiểu phân nano (C3) được tính theo cơng thức:

phân nano được tính theo cơng thức:

Phương pháp: khoảng 50 mL hệ tiểu phân nano được đặt trong tủ sấy trong 48giờ tại nhiệt độ 50 °C để thu cắn rắn. Tiến hành phân tích nhiệt của 7 mẫu: SIL, PC,CHI, poloxamer 407, hỗn hợp trộn vật lý SIL-PC-CHI, phức hợp SIL-PC và mẫu rắncủa hệ tiểu phân nano bằng máy DSC với chương trình nhiệt 40 – 300 °C, cân bằngnhiệt ở 30 °C, tốc độ nhiệt thay đổi 10 °C/phút. Ghi nhận phổ quét nhiệt vi sai chotừng mẫu.

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

2.3.4.1. Hình thể học

Hình thể học của mẫu nano silymarin với các tỉ lệ giá mang khác nhau và mẫusilymarin nguyên liệu được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường(FE-SEM). Khoảng 0,3 g mẫu phân tích được cho lên màng carbon và phủ titanium.Sau đó cho vào máy FE-SEM, mẫu được phân tích ở tiêu cự f = 5,5 mm, có điện ápgia tốc 5 kV, với độ phóng đại 2000 – 100.000 lần.

2.3.4.2. Kích thước tiểu phân nano và PDI khi tái phân tán trong nước

Tùy vào tỷ lệ giá mang/hàm lượng chất rắn trong hỗn dịch nano mà cân lượngbột phun sấy sao cho sau khi phân tán vào 50 mL nước cất thu được nồng độ silymarintương tự nồng độ silymarin trong hỗn dịch nano silymarin trước khi phun sấy. Tiếptục pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần đã được lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hànhđo kích thước tiểu phân và PDI bằng máy Zetasizer SZ90 ở nhiệt độ 25 °C. Khoảng1,5 mL hỗn dịch nano đã pha loãng đươc cho vào cốc đo. Mỗi mẫu được đo 3 lầntrong cùng điều kiện nhiệt độ 25°C. Kết quả đo kích thước tiểu phân và PDI đượctrình bày bằng kích thước tiểu phân trung bình ± độ lệch chuẩn, và PDI trung bình ±độ lệch chuẩn.

2.3.4.3. Thời gian tái phân tán trong nước

Cân 0,1 g bột phun sấy, cho vào cốc có sẵn 50 mL nước cất, khuấy từ ở tốc độ700 vòng/phút. Đánh giá bằng cảm quan và ghi nhận thời gian bột phun sấy phân tánhoàn toàn trong nước

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

<b>KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU</b>

<b>3.1. Xây dựng cơng thức và quy trình điều chế tiểu phân nano chứa silymarin3.1.1. Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình định lượng silymarin trong hệtiểu phân nano bằng UV-Vis</b>

3.1.1.1. Độ đặc hiệu

Kết quả quét phổ UV-Vis của mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫuplacebo trong khoảng bước sóng 200 nói đến 400 nm được trình bày trong Hình 3.8.

Với (A) mẫu chuẩn, (B) mẫu thử, (C) mẫu thử thêm chuẩn và (D) mẫu placebo

<i>Nhận xét: Đỉnh hấp thu cực đại và độ hấp thu của mẫu thử gần tương đồng với</i>

mẫu chuẩn, với lmax = 287 nm. Trái lại, mẫu placebo khơng có đỉnh hấp thu cực đạiở bước sóng 287 nm như mẫu chuẩn và mẫu thử. Đồng thời, với mẫu thử thêm chuẩn,đỉnh hấp thu cực đại vẫn giữ nguyên tại 287 nm và độ hấp thu ở bước sóng này caohơn so với mẫu chuẩn. Vì vậy, có thể kết luận độ hấp thu của silymarin không bị ảnhhưởng bởi các tá dược và phương pháp đ ạt yêu cầu đ ộ đặc hiệu đ ể định lượngsilymarin trong hệ tiểu phân nano.

</div>

điều chế tiểu phân nano chitosan chứa phức hợp silymarin phospholipid

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về