Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat sử dụng acid poly (lactic co glycolic) và acid hyaluronic

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN ĐỨC TUẤN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO
CHỨA ARTESUNAT SỬ DỤNG POLY
(LACTIC-CO-GLYCOLIC) ACID VÀ
HYALURONIC ACID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC TUẤN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO CHỨA ARTESUNAT SỬ
DỤNG POLY (LACTIC-CO-GLYCOLIC) ACID VÀ HYALURONIC ACID


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
Nơi thực hiện:
Viên Công nghệ Dược phẩm Quốc gia
Bộ môn công nghiệp dược
HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến
Là thầy giáo đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo em tận tình trong suốt thời gian
thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Nguyễn Hạnh Thủy, ThS.
Trần Tuấn Hiệp mặc dù đang du học tại Hàn Quốc nhưng đã hết lòng hướng dẫn em.
Em xin cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị nghiên cứu viên, kĩ thuật viên, các bạn
sinh viên đang nghiên cứu khoa học và thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Viện Công
nghệ dược phẩm Quốc gia, Bộ môn Công Nghiệp Dược, Bộ môn Bào Chế, Bộ môn
Vật Lý – Hóa Lý đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu Nhà trường và
phòng Đào tạo đã giúp đỡ tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã dành cho em sự giúp
đỡ, ủng hộ, động viên trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận.

Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Đức Tuấn


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1. ĐẠI CƯƠNG VỀ ARTESUNAT 2
1.1 Cấu trúc phân tử - đặc tinh lý hóa 2
1.2 Đặc tính dược động học 2
1.3 Tác dụng dược lý 3
1.4 Chỉ định, chống chỉ định và liều dùng 4
1.5 Tác dụng không mong muốn 5
1.6 Các cách cải thiện sinh khả dụng artesunat 5
2. ĐẠI CƯƠNG VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO 6
2.1 Khái niệm 6
2.2 Phân loại 6
2.3 Các phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 9
3. HỆ TIỂU PHÂN NANO POLYME SỬ DỤNG PLGA VÀ HA 10
3.1 Đặc tính sinh hóa của PLGA 10
3.2 Đặc tính của chất diện hoạt didecyldimethylammonium bromid 12
3.3 Ưu điểm của tiểu phân nano có gắn hyaluronic acid 13
3.4 Các nghiên cứu về hệ tiểu phân nano sử dụng PLGA 14
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 16
2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 16
2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIÊN CỨU 17
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.4.1 Phương pháp bào chế 17
2.4.2 Các phương pháp đánh giá 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ARTESUNAT 22
3.2. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH HỆ TIỂU PHÂN
NANO 23

3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ chất diện hoạt mang điện tích dương đến hệ tiểu
phân nano 23
3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ artesunat đến đặc tính của tiểu phân 26
3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ HA lên đặc tính tiểu phân 29
3.2.4 Đánh giá khả năng nạp thuốc của tiểu phân nano PLGA-DDAB-HA 31
3.2.5 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất của tiểu phân nano 32
KẾT LUẬN 35
ĐỀ XUẤT 36
PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ ĐO KÍCH THƯỚC TIỂU PHÂN
PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ ARTESUNAT



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ART
Artesunat
BCS
Bioavailability classification system – Hệ thống phân loại sinh khả
dụng
DCM
Dicloromethan
DDAB
Didecyldimethylammonium bromide
ECM
Extra cellular matrix – mạng lưới ngoại bào
EP
European Pharmacopoiea – Dược điển Châu Âu
FDA
Food and Drug Administration – Cục quản lý thực phẩm dược phẩm
HA

Hyaluronic acid
HPLC
High-performance liquid chromatography – sắc kí lỏng hiệu năng cao
IP
International Pharmacopoiea – Dược điển Quốc tế
KTTP
Kích thước tiểu phân
MWCO
Trọng lượng phân tử giới hạn
PDI
Polydispersity index – chỉ số đa phân tán
PEG
Polyethylene glycol
PLGA
Poly (lactic – co – glycolic) acid
TCCS
Tiêu chuẩn cơ sở



DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1 Đặc điểm của các loại tiểu phân nano………………………
…… 7
Bảng 2.1 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng…………………………………
….…16
Bảng 3.1 Nồng độ artesunat và diện tích pic tương ứng…………………
…….22
Bảng 3.2 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ DDAB:PLGA đến đặc tính

của hệ tiểu phân nano………………………………………………
…….24
Bảng 3.3 Đặc tính và khả năng nạp dược chất của các hệ tiểu phân nano
với tỷ lệ DDAB:PLGA khác nhau…………………………………………
…….24
Bảng 3.4 Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất:polyme đến
đặc tính của hệ……………………………………………………………
…….27
Bảng 3.5 Kết quả KTTP và thế zeta từ công thức có tỷ lệ ART thay đổi
…….27
Bảng 3.6 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ HA đến hệ tiểu phân
…….29
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ HA đến hệ tiểu phân
…….30
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá khả năng nạp dược chất của tiểu phân nano
sau khi bao HA…………………………………………………………
…….31




DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của artesunat 2
Hình 1.2: Phân loại tiểu phân nano theo bản chất [14] 8
Hình 1.3: Cấu trúc tiểu phân nano PLGA – DDAB - HA. 10
Hình 1.4: Cấu trúc phân tử của PLGA 11
Hình 1.5: Cấu trúc phân tử của DDAB. 12
Hình 1.6: Cấu trúc phân tử HA 13
Hình 2.1: Sơ đồ bào chế tiểu phân nano PLGA-DDAB 18
Hình 3.1. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ artesunat. 22

Hình 3.2 : Ảnh hưởng của tỷ lệ DDAB:PLGA đến đặc tính của hệ tiểu phân 24
Hình 3.3 : Ảnh hưởng của tỷ lệ DDAB:PLGA đến hiệu suất nạp dược chất của hệ
tiểu phân 25
Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất lên đặc tính của hệ tiểu phân nano. 28
Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ HA lên đặc tính của hệ tiểu phân 30
Hình 3.6: Tỷ lệ nạp dược chất của tiểu phân có gắn HA 32
Hình 3.7: Đồ thị giải phóng dược chất theo thời gian của tiều phân trước và sau khi
gắn HA 33

1

Đặt vấn đề
Kể từ khi được các nhà khoa học Trung Quốc phân lập thành công từ cây Thanh
hao hoa vàng (Artemisia annua) vào những năm 1970, dẫn chất serquiterpent lactones
của artemisinin đã được sử dụng điều trị các bệnh sốt rét, gần đây lại được chứng
minh tác dụng diệt tế bào ung thư và sán máng. Một trong các dẫn chất của artemisinin
có tiềm năng nhất và được các nhà khoa học chú ý là artesunat (ART). Artesunat có
tác dụng chống sốt rét tốt, có thể sử dụng qua đường uống, đường trực tràng hay
đường tiêm tĩnh mạch và có tác dụng nhanh trên các bệnh nhân nhiễm sốt rét gây bởi
chủng Plasmodium falciparum [16]. Đồng thời, những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra
rằng artesunat cũng có tác dụng chống tăng sinh tế bào khá mạnh, tạo tiền đề cho việc
điều trị ung thư. Tuy nhiên khó khăn đặt ra đó chính là bản chất ART có tính tan kém
dẫn đến sinh khả dụng tương đối thấp (~ 40%), bị thủy phân trong môi trường acid
và có độc tính. Hơn nữa, ART có thời gian bán thải rất ngắn và bị chuyển hóa qua
gan lần đầu khá nhiều. Do đó cần nghiên cứu bào chế để cải thiện được sinh khả dụng
của ART [1].
Trong điều trị ung thư, nhằm tăng tác dụng tại đích là các khối u hay tế bào
bệnh, ART cần được nạp bởi hệ chất mang có khả năng tăng độ tan cũng như bảo vệ
dược chất khỏi các yếu tố ảnh hưởng từ môi trường bên ngoài. Nhiều nghiên cứu
trong và ngoài nước đã tập trung vào vấn đề tìm ra hệ mang thuốc thích hợp cho mục

tiêu này với nhiều hướng nghiên cứu như: hệ phân tán rắn, liposome, hay tiểu phân
nano [12]. Trong đó, hệ vi tiểu phân nano polyme hiện nay được đánh giá là giải pháp
tiềm năng cho việc đưa thuốc đến đích cũng như giải phóng kiểm soát các dược chất
khó tan và thấm tốt như ART, đồng thời có thể bảo vệ dược chất giúp tăng tính ổn
đinh khi sử dụng.
Vì lý do đó đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat sử dụng
poly (lactic-co-glycolic) acid và hyaluronic acid” được tiến hành với các mục tiêu
sau:
1. Xây dựng được công thức bào chế tiểu phân nano artesunat - poly(lactic –
co-glycolic) acid (PLGA), bao ngoài với hyaluronic acid (HA).
2. Đánh giá một được số đặc tính của hệ tiểu phân nano.

2

Chương I. Tổng quan
1. Đại cương về Artesunat
1.1. Cấu trúc phân tử - đặc tinh lý hóa
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của artesunat
Artesunat là sản phẩm bán tổng hợp tử Artemisinin qua 2 giai đoạn: Khử hóa
artemisinin thành dihydroartemisinin, sau đó ester hóa sản phẩm thành artesunat
Artesunat là chất kế tinh có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 132
o
C – 135
o
C.
Tính tan của artesunat rất kém, độ tan 56,2 mg/L tại 25
o
C. Artesunat tan tốt trong các
dung môi hữu cơ như dicloromethan, ethyl acetat, chloroform, acetonitrile…Bản chất
artesunat là dẫn xuất hemisuccinate của artemisinin, mặc dù có thể tan trong nước,

nhưng có độ ổn định thấp trong dung dịch nước ở pH trung tính hoặc acid.
1.2 Đặc tính dược động học
Mặc dù artemisinin có các dạng bào chế đa dạng như viên uống, thuốc tiêm bắp,
tiêm tĩnh mạch dạng nước, ART thường chỉ dùng đường tiêm dạng dung dịch trong
nước. ART được hấp thu nhanh chóng, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 0,5
giờ; 1,5 giờ và 2 giờ giờ lần lượt ứng với tiêm bắp, đường uống, trực tràng.
Trong cơ thể, ART chuyển hóa gần như hoàn toàn thành dihydroartemisinin (được
phát hiện trong huyết tương vào 15 phút ngay sau khi sử dụng ART), dẫn chất này
vẫn còn hoạt tính. Quá trình thải trừ ART cũng diễn ra rất nhanh chóng, do đó hoạt
tính chống sốt rét được xác định bằng cách gián tiếp thông qua dihydroartemisinin
(thời gian bán hủy khoảng 45 phút).

 Công thức phân tử: C
19
H
28
O
8

 Khối lượng phân tử: 384,421 g/mol
 Artesunat có tên danh pháp là 4-Oxo-
4-(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-
trimethyldecahydro-3,12-epoxypyrano[4,3-
j]-1,2-benzodioxepin-10-yl hydrogen
butanedioate (USAN).
 Tên gọi khác như Artesunic acid,
Artesunatum…

3

Tiêm bắp thường đạt được nồng độ trong huyết tương cao và kéo dài hơn so với
các đường dùng khác, nhất là với những chất thuộc loại II của hệ thống phân loại sinh
dược học [10] hoặc dược chất sử dụng đường tiêm truyền liên tục như artesunat.
Thuốc phân bố rộng ra nhiều mô, màng não và rau thai, lắng đọng ở gan, thận, mật.
Hơn 80% lượng thuốc dùng sau 24 giờ đầu được thấy trong nước tiểu và phân. Thời
gian điều trị sốt rét trong 3 ngày bằng cách cho uống 1 lần hoặc tiêm 1 lần một ngày.
1.3 Tác dụng dược lý
1.3.1. Tác dụng chống sốt rét
Tác dụng chống sốt rét của artesunat chủ yếu do các cầu nối endoperoxide trong
cấu trúc hóa học của dẫn chất này [4]. Thông thường các chất có cấu trúc tương tự
artemisinin có một cầu nối đơn oxy đơn phân tử nhưng thường ở trạng thái bất hoạt.
Sự hoạt hóa một gốc oxy hóa được giải phóng từ cầu nối được cho là nguyên nhân
chính tạo nên tác dụng chống sốt rét của artesunat.
Cùng với artemether, artesunat là một trong hai dẫn chất của artemisinin được
ứng dụng rộng rãi nhất trong điều trị số rét. Tuy nhiên, các nghiên cứu chứng minh
rằng hiệu lực của artesunat cao hơn đáng kể so với artemether trên cùng một chủng
sốt rét (Plasmodium falciparum) [36]. Tác dụng chống sốt rét của artesunat được giải
thích theo hai cơ chế chính: một là khả năng ức chế quá trình sản xuất hoặc ức chế
hoạt động của các enzym chống oxy hóa trong các tế bào hồng cầu; hoặc nâng cao
sản lượng của oxy hoạt tính trong hồng cầu, dẫn đến tăng nồng độ các gốc oxy. Các
nghiên cứu chuyên sâu trên chủng P. falciparum cho thấy cơ chế thứ hai là cơ chế
chính tạo nên tác dụng của artesunat. Ở cấp độ enzyme, artesunat ức chế hoạt động
của enzyme cytochrome oxydase, một enzyme đóng vai trò tự dưỡng của tế bào kí
sinh trùng sốt rét, qua đó ức chế quá trình phát triển của thể bào tử [4].

4

1.3.2. Tác dụng khác
1.3.2.1. Tác dụng lên các chủng virus viêm gan B và viêm gan C
Kết quả của những nghiên cứu tiến hành gần đây đã cho thấy khả năng ức chế sự

phát triển trên các chủng virus viêm gan B và C của ART. Đối với viêm gan siêu vi
B, artesunat thể hiện tác dụng này ngay ở nồng độ thuốc trong huyết tương tương tự
với nồng độ thuốc trong huyết tương của các bệnh nhân được sử dụng ART trong
điều trị sốt rét (trong khoảng ~7µM) [5]. Đối với viêm gan siêu vi C, cơ chế tác động
của ART có những điểm khác biệt do virus viêm gan C chỉ có một chuỗi RNA đơn
độc. ART ngăn chặn quá trình tự nhân bản của virus bằng cách ức chế điểm khởi đầu
của quá trình sao mã. Sự kết hợp của ART và hemin – chất ức chế enzyme polymerase
của virus – tạo nên tác dụng diệt virus và ngăn ngừa virus nhân bản mà không gây
ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào đích [30].
1.3.2.2. Tác dụng chống ung thư
Mặc dù là thuốc điều trị đầu tay trong phác đồ điều trị sốt rét, tuy nhiên đã có
những nghiên cứu in vitro cho rằng ART có hoạt tính chống tăng sinh tế bào ở khối
u khá tốt, điều này mở ra hướng nghiên cứu mới về tác dụng chống ung thư của
ART. Cơ chế chống ung thư của ART hiện vẫn chưa được sáng tỏ nhưng các nghiên
cứu gần đây trên các dòng tế bào ung thư đã đặt ra giả thuyết ART có tác dụng đến
các protein có vai trò quan trọng chu trình tế bào như: ức chế điểm R trong pha G1;
làm gián đoạn quá trình tự hủy của tế bào; chống tân tạo mạch và giảm tốc độ di căn
của các tế bào ung thư thông qua việc ức chế yếu tố nhân Kappa B (NF-kB - là một
yếu tố sao mã thiết yếu kiểm soát quá trình biểu hiện gene mã hóa của các cytokine,
chemokine) [24, 25].
1.4. Chỉ định, chống chỉ định và liều dùng
1.4.1. Chỉ định
Theo dược thư quốc gia 2013, ART được sử dụng trong các trường hợp sốt rét ác
tính, đặc biệt là đối với các trường hợp được chẩn đoán xác định nguyên nhân do
chủng P.falciparum đã kháng quinin.

5

1.4.2. Chống chỉ định
Các trường hợp phụ nữ trong 3 tháng đầu thai kỳ tuyệt đối không được sử dụng

1.4.3. Liều dùng
Theo hướng dẫn của WHO 2010 [42]:
Đường tiêm:
ART được pha trong dung dịch natri bicarbonat để tạo dạng muối natri artesunat.
Trước khi tiêm được pha loãng trong 5ml dung dịch dextrose 5%, sau đó sử dụng
theo đường tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp với liều như sau: 2,4 mg/kg vào ngày 0h
ngày 0, sau đó lặp lại vào 12h và 24h, và dùng mỗi ngày 1 lần vào những ngày sau
đó cho đến khi bệnh nhân có chỉ định điều trị tiếp theo.
1.5. Tác dụng không mong muốn
Theo nghiên cứu của Riberio và Olliaro, các dẫn chất của Artemisinin nói
chung hay ART nói riêng có mức độ an toàn cao cũng như khả năng dung nạp tốt.
Các tác dụng phụ của ART đã được WHO ghi nhận bao gồm các triệu chứng rối loạn
tiêu hóa, đa đầu, chóng mặt và chậm nhịp tim [34]. Đồng thời các tác dụng phụ trên
hệ thần kinh như mất thăng bằng, giảm thính lực, cản trở khả năng phát âm cũng xuất
hiện trên các bệnh nhân điều trị dài ngày, tuy nhiên đến nay các dấu hiệu này vẫn
chưa có ý nghĩa lâm sàng rõ rệt.
1.6. Các biện pháp cải thiện sinh khả dụng artesunat
Các nghiên cứu tại Việt Nam hay các quốc gia khác cho thấy sinh khả dụng ART
theo đường uống là thấp, thường dao động trong khoảng 55-80% và không ổn định
giữa các cá thể trong cùng nhóm nghiên cứu [8]. Sinh khả dụng đường uống thấp do
tính hấp thu kém của dược chất qua niêm mạc hoặc do khả năng hòa tan của dược
chất kém. Tuy nhiên khả năng hấp thu của ART qua niêm mạc không bị ảnh hưởng
nhiều bởi môi trường đường tiêu hóa, vì vậy, nguyên nhân chính làm sinh khả dụng
thấp được cho là do độ tan và tốc độ hòa tan.
Trên thực tế, ART thuộc loại II trong bảng phân loại sinh dược học, do đó tính
tan của ART trong nước không cao nhưng tính thấm tốt [10]. Vì vậy để cải thiện được
sinh khả dụng của ART, cần làm tăng độ tan của ART trong nước trước khi đưa vào
6

dạng bào chế. Có nhiều phương pháp đã được áp dụng cho ART ví dụ như giảm kích

thước tiểu phân, sử dụng tiền chất dễ tan, sử dụng chất diện hoạt, sử dụng kỹ thuật hệ
phân tán rắn hoặc sử dụng hệ chất mang dược chất. Trong đó, hệ tiểu phân kích thước
nano thể hiện sự ưu việt trong việc tăng độ tan cũng như bảo vệ dược chất khỏi tác
động của môi trường.
2. Đại cương về tiểu phân nano
2.1 Khái niệm
Các vật liệu tiểu phân nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước
nanomet. Công nghệ nano ứng dụng trong y dược học có giới hạn khác phục vụ cho
mục tiêu điều trị: tiểu phân nano là các hạt có kích thước đường kính từ 1 đến 100
nanomet [13]. Tuy nhiên để ứng dụng trong điều trị, người ta cho rằng khoảng tối ưu
là 10-100 nm. Giới hạn dưới có cơ sở từ việc kích thước vi cầu thận khoảng 10 nm,
nên các tiểu phân có kích thước lớn hơn mức này sẽ tránh được sự chuyển hóa bước
một qua thận. Trái với sự rõ ràng của giới hạn dưới, giới hạn trên 100 nm vẫn còn
chưa được chứng minh. Trên thực tế, các thí nghiệm trên mô hình động vật cho thấy
những tiểu phân có kích thước dưới 150 nm và tích điện bề mặt trung hòa hoặc âm
có thể qua được tế bào khối u tốt hơn [29]. Như vậy, với mục đích ứng dụng trên bào
chế, hệ tiểu phân nano là hệ tập hợp gồm các tiểu phân có kích thước trong khoảng
từ 10-300 nm tùy đích tác dụng [15].
2.2 Phân loại
Công nghệ nano nói chung và việc ứng dụng công nghệ nano trong y dược nói
riêng phát triển vô cùng nhanh chóng và liên tục có những công bố mới về khả năng
ứng dụng hệ nano như một hệ mang thuốc hiệu quả. Tuy nhiên nhìn chung, tiểu phân
nano có thể phân loại theo bản chất của chất mang như sau:

7

Bảng0.1.1: Đặc điểm của các loại tiểu phân nano [35]
Tên
Đặc điểm cấu trúc
Liposome

Cấu trúc dạng cầu có lõi nước và vỏ ngoài là 1 lớp
phospholipid kỵ nước
Nano lipid rắn (SLN)
Được hình thành từ việc nhũ hóa chất lipid có trạng thái rắn
ở nhiệt độ thường cùng với chất diện hoạt và nhiệt độ để tạo
thành tiểu phân nano
Chất mang lipid có cấu
trúc nano (NLC)
Cấu trúc ở thể rắn tại nhiệt độ cơ thể, là hỗn hợp của 1 lipid
lỏng và lipid rắn
Nhũ tương nano
Cấu trúc dạng cầu có lõi nước và vỏ ngoài là 1 lớp
phospholipid kỵ nước
Nano nang
(Nanocapsule)
Cấu trúc hình thành từ polymer tạo nên nang bao lấy dược
chất
Nano cầu
(Nanospheres)
Cấu trúc hình thành từ polyme tạo nên lõi cầu, và dược chất
được tóm giữ trên bề mặt hoặc phân tán đều với chất mang
Nano siêu từ tính
Có cấu trúc từ các ion kim loại, bị ảnh hưởng bởi từ trường
nhưng không tích từ tính khi từ trường bị loại bỏ
Nano chấm lượng tử
Có cấu trúc là các tinh thể nano có 2 lớp lõi và vỏ tạo bởi
các vật liệu bán dẫn khác nhau
8

Hình 01.2: Phân loại tiểu phân nano theo bản chất [13]
Ngoài ra, với các nghiên cứu thay đổi bề mặt của tiểu phân nano, hiện nay cũng
có thể chia các tiểu phân nano thành 3 loại chính:
- Tiểu phân nano thụ động (passive nanoparticle): bề mặt cấu trúc của tiểu phân
không được thay đổi và thường dễ bị opsonim hóa.
- Tiểu phân nano tàng hình (stealth nanoparticle): là thế hệ nano đã được thay đổi
cấu trúc bề mặt bằng cách gắn thêm PEG, thường gọi là PEG hóa (PEGylated). Nhờ
có liên kết với PEG mà tỉ lệ bị bắt giữ bởi hệ thống đại thực bào của các tiểu phân
được giảm xuống, kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu, tăng sinh khả dụng của
dược chất.
- Tiểu phân nano chủ động (active nanoparticle): là thế hệ nano được thay đổi cấu
trúc bề mặt bằng cách gắn với các yếu tố bề mặt như các phối tử (ligand) giúp tế bào
Tiểu phân
nano
Cấu tạo polyme
Nanocapsule (NC)
Nanosphere (NS)
Cấu tạo lipid
Liposome Nano lipid
Nano lipid
rắn (SLN)
Chất mang lipid cấu trúc
nano (NLC)
Nhũ tương
nano (NE)
Cấu tạo vô cơ
Nano từ tính
(MN)
Nano chấm
lượng tử (QD)

Micelle
9

có thể hướng đến các bề mặt có các receptor thích hợp, tăng tính bám dính và tăng
cường hiệu quả điều trị.
Trong nghiên cứu này, hệ tiểu phân được bào chế có cấu trúc polyme và được
thay đổi bề mặt.
2.3 Các phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme
Nhiều phương pháp đã được phát triển để bào chế các tiểu phân nano polyme,
tuy nhiên dựa vào nguyên liệu được sử dụng, có thể chia làm hai loại chính: trùng
hợp từ monome hoặc sử dụng polyme đã qua tổng hợp hay thiên nhiên [31].
Với các phương pháp sử dụng monome, trừ trường hợp alkylcyanoacrylates và
poly (dialkylmethylidene malonate) thì hầu hết các polyme sau khi được trùng hợp
sẽ rất khó phân hủy sinh học trong cơ thể và thường có độ an toàn thấp. Do đó hướng
nghiên cứu hiện tại là sử dụng các polyme tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng phân
hủy sinh học tốt. Các phương pháp bào chế tiểu phân nano từ các dạng polyme này
được chia làm 4 nhóm chính:
- Phương pháp nhũ tương hóa/bốc hơi dung môi
Polyme được hòa tan vào dung môi không đồng tan với nước, sau đó dung dịch
này sẽ được nhũ tương hóa vào nước bằng lực khuấy từ hay lực siêu âm. Tiếp theo
dung môi hữu cơ sẽ được bốc hơi hết để các hạt tiểu phân được hình thành do sự kết
lắng của polyme [39].
- Phương pháp thay đổi dung môi/kết lắng bề mặt
Các polyme được hòa tan trong một dung môi có thể trộn lẫn với nước dẫn đến
sự kết tủa của các tiểu phân nano. Polyme lắng đọng trên bề mặt phân cách giữa các
nước và các dung môi hữu cơ, gây ra bởi sự khuếch tán nhanh chóng của dung môi,
dẫn đến sự hình thành hệ keo [17].
- Phương pháp nhũ tương hóa/ khuếch tán dung môi
Polyme được hòa tan vào dung môi tan một phần trong nước và sau đó cho bão
hòa với nước để đảm bảo cân bằng nhiệt động. Sau đó, hỗn hợp này được phân tán

vào nước có chứa chất ổn định để tạo các tiểu phân nano. Cuối cùng dung môi được
loại bỏ theo cách bốc hơi hoặc lọc, tùy theo nhiệt độ sôi của dung môi [32].
10

- Phương pháp tạo muối kết lắng với polyme
Polyme cùng dược chất được hòa tan trong dung môi tan trong nước, sau đó dung
dịch này được phân tán vào gel nước có các tác nhân tạo muối (ví dụ Magnesi clorid,
calci clorid hay sucrose) và các chất ổn định tao gel. Sau đó, hỗn hợp này được hòa
loãng với một lượng nước vừa đủ để tăng sự khuếch tán của tiểu phân vào nước, từ
đó hình thành tiểu phân nano. Cuối cùng, tác nhân tạo muối cũng như dung môi được
loại đi sau khi lọc [32].
3. Hệ tiểu phân nano polyme sử dụng PLGA và HA

Hình 1.3: Cấu trúc tiểu phân nano PLGA – DDAB - HA.
3.1 Đặc tính sinh hóa của PLGA
PLGA là một trong những polyme được sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất trong
bào chế ứng dụng tiểu phân nano polyme với mục đích trở thành hệ vận chuyển thuốc
[21]. Lý do chính đó là đặc tính sinh hóa của PLGA, quan trọng nhất có thể kể đến
đó là khả năng phân hủy sinh học, tương thích sinh học và độ bền cơ học của polyme
này [15]. Khả năng phân hủy sinh học của PLGA xảy ra trong cơ thể, polyme này bị
thủy phân tạo thành hai polyme không có hại cho cơ thể, thậm chí có thể chuyển hóa
dễ dàng, tham gia các quá trình sinh học khác, đó là acid lactic và acid glycolic [21].
11

Do đó, PLGA đã được FDA thông qua và cho phép sử dụng trong các chế phẩm
nano ứng dụng trong chữa trị trên người [14].

Hình 01.4: Cấu trúc phân tử của PLGA
Tính chất hóa lý:
PLGA là một trong những polyme có khả năng tạo được các cấu trúc hình học đa

dạng, với các kích thước tùy biến, do đó có khả năng bao gói được các phân tử có
kích thước khác nhau. Ưu điểm này là lý do PLGA được ứng dụng trong các loại
nano khác nhau như siêu vi nang, siêu vi cầu…
PLGA tan tốt trong các dung môi hữu cơ thông thường như: dicloromethane,
acetone, tetrahydrofuran hay ethyl acetat.
PLGA dễ dàng bị thủy phân liên kết ester trong nước [15].
 Tính chất của PLGA thay đổi theo tỷ lệ, thành phần các polyme cấu thành:
Các polyme acid polylactic có thể tồn tại ở dạng hoạt quang (acid L-polylactic)
và ở dạng racemic không hoạt quang (D, L-acid polylactic). PLGA copolyme điều
chế từ acid L-polylactic và polyglycolide là dạng kết tinh, trong khi nếu thay thế bằng
đồng phân D,L-acid polylactic và polyglycolide thì copolyme sản phẩm lại ở dạng vô
định hình. Nếu PLGA có chứa ít hơn 70% glycolide thì sản phẩm thu được sẽ ở dạng
vô định hình.
Độ bền cơ học, khả năng trương nở, quá trình thủy phân, và tốc độ phân hủy sinh
học, chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi sự kết tinh của polyme PLGA, hay nói cách khác,
là phụ thuộc vào loại và tỷ lệ mol của các thành phần polyme (lactic và glycolide)
trong chuỗi copolyme. Acid lactic kỵ nước hơn so với acid glycolic và, do đó, PLGA
có tỉ lệ lactic cao ít thấm nước, ít hấp thụ, và do đó, làm chậm quá trình thủy phân.
12

 Độ nhớt của PLGA
Mặc dù co-polyme PLGA với tỉ lệ 50:50 có độ nhớt vào khoảng 0.55-0.75 dL/g
nhưng khi tạo thành dung dịch polyme, độ nhớt của hệ có thể thay đổi tùy thuộc vào
bản chất của dung môi, điều này có ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất
của hệ tiểu phân được bào chế [2]. Theo nghiên cứu của Vega-González và cộng sự,
các nghiên cứu khảo sát trên các dung môi dicloromethan, aceton và ethyl acetat cho
thấy độ nhớt của dung dịch pha trong dicloromethan có độ nhớt cao nhất. Đó cũng là
lý do trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dicloromethan làm dung môi hữu cơ
hòa tan PLGA [3].
 Dược động học và phân bố sinh học

Các nghiên cứu cho thấy, dược động học và phân bố của PLGA là phi tuyến tính
và phụ thuộc liều [43]. Độ thanh thải trong máu và khả năng nhập bào cũng phụ thuộc
vào liều và cấu trúc của PLGA. Tiểu phân nano PLGA tích lũy nhanh tại gan, tủy
xương, hệ bạch huyết, lá lách và màng bụng. PLGA cũng bị chuyển hóa nhanh qua
vòng tuần hoàn đầu và bị chuyển hóa chậm hơn ở phổi. Do đó, hướng nghiên cứu để
cải thiện sinh khả dụng của tiểu phân nano là sử dụng PLGA có sự phối hợp với các
yếu tố cải thiện bề mặt sẽ làm tăng thời gian tồn tại của tiểu phân trong hệ tuần hoàn,
tránh bị bắt giữ và thực bào [6].
3.2 Đặc tính của chất diện hoạt didecyldimethylammonium bromid


Hình 01.5: Cấu trúc phân tử của DDAB.
Didecyldimethylammonium bromid (DDAB) là một chất diện hoạt mang điện
tích dương, có cả hai đầu ưa nước và kỵ nước được sử dụng nhiều trong các nghiên
cứu về hệ vận chuyển thuốc, đặc biệt đối với việc vận chuyển gen hay các dược chất
kỵ nước. Ví dụ, liposome có chứa DDAB có khả năng cung cấp các chuỗi
oligopeptides vào tế bào myeloma của người, hay chuyển DNA vào tế bào động vật
13

có vú [20, 27]. Trong nghiên cứu phối hợp PLGA và chất diện hoạt mang điện tích
dương tương tự DDAB – DMAB đã cho thấy kết quả tiểu phân nano có kích thước
phù hợp, và điện thế zeta dương (+35mV – 45mV) tùy vào nồng độ của chất diện
hoạt, do đó tăng khả năng tương tác với tế bào ung thư [7]. Bên cạnh đó, Theo nghiên
cứu của Kuo Y.C và đồng nghiệp [22], cấu trúc của tiểu phân PLGA-DDAB sau khi
bào chế sẽ có thêm các phân tử DDAB được biểu hiện trên bề mặt tiểu phân, do đó
PDI của tiểu phân cũng sẽ thay đổi, không đồng nhất.
Do vậy, trong nghiên cứu này, DDAB được sử dụng với mục đích thay đổi điện
thế bề mặt, tạo điều kiện để gắn yếu tố hướng đích cho tiểu phân nano – đó là
Hyaluronic acid.
3.3 Ưu điểm của tiểu phân nano có gắn hyaluronic acid

 Cấu trúc và đặc điểm đáng chú ý của hyaluronic acid

Hình 01.6: Cấu trúc phân tử HA
Cấu trúc HA là một polysaccarid mạch thẳng, cấu tạo bởi một chuỗi lặp
disaccharide của n-acetyl-D-glucosamine và D-glucuronic acid bởi liên kết 1-4
disaccharide, còn liên kết giữa các chuỗi lặp là β-1-3[33].
HA được tổng hợp ở màng trong của tế bào chất nhờ các enzyme có bản chất là
các protein xuyên màng: hyaluronic acid synthetase bao gồm HAS1, HAS2, HAS3.
Trong quá trình tổng hợp này, HA được tiết ra bên ngoài của các tế bào vào tế bào bề
mặt, hoặc được tiết ra cấu trúc ngoại bào (ECM). Ngoài bề mặt tế bào và ECM, HA
cũng được tìm thấy bên trong tế bào [40]. Do đó có thể nói, HA là một chất thân thiện
với cơ thể và không gây ra các độc tính cho tế bào.
 Protein gắn đặc hiệu với HA - Hyaladherins
14

Hyaladherins có một trung tâm liên kết gồm những proteoglycan khác nhau đó là
HA receptor và protein liên kết.
2 receptor quan trọng của HA là CD44 và LYVE-1, trong đó CD44 có vai trò quan
trọng trong ổn định cấu trúc của nhiều tế bào thông qua sự liên kết giữa các tế bào.
Đặc biệt, CD44 là yếu tố quan trọng hình thành hình thái, tân tạo mạch máu, phát
triển và di căn khối u của các tế bào ung thư [11].
Vai trò cụ thể của CD44 đã dẫn đến sự biểu hiện vượt trội receptor này trên bề
mặt của các tế bào ung thư, điển hình nhất là cấu dạng iso của receptor này có tên gọi
CD44v6. Do đó, các tiểu phân nano có bề mặt gắn với HA có khả năng bám dính tốt
và có ái lực cao với các tế bào ung thư có biểu hiện CD44v6 [11, 19], từ đó giảm định
hướng đến tế bào khỏe mạnh và giảm bớt tác dụng phụ của thuốc điều trị ung thư.
3.4 Các nghiên cứu về hệ tiểu phân nano sử dụng PLGA
Nhiều nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam đã được tiến hành với mục tiêu cải
thiện đặc tính điều trị sốt rét (khắc phục nhược điểm về sinh khả dụng) và việc phát
hiện ra tác dụng chống tế bào ung thư của các thuốc nhóm artemisinin. Quá trình này

đã thúc đẩy việc nghiên cứu bào chế các hệ chứa ART có kích thước nano nhằm khắc
phục các nhược điểm cũng như tạo ra đặc tính hướng đích mới cho dược chất ART.
Renu Chadha và các cộng sự đã nghiên cứu và đánh giá bước đầu về hệ tiểu phân
nano lipid bằng cách sử dụng chất mang là lecithin, đồng thời thay đổi điện thế bề
mặt của tiểu phân bằng cách sử dụng chitosan. Tiểu phân nano được hình thành bằng
cách tiêm dung dịch lecithin trong cồn vào dung dịch chitosan với dung môi nước,
sau đó sử dụng lực phân tán bằng máy khuấy từ để tạo nên các hạt vi nhũ tương. Kết
quả kích thước tiểu phân đều nhỏ hơn 300nm và hình ảnh chụp TEM của tiểu phân
chứng minh cấu trúc gồm một lớp chitosan bao quanh lõi lecithin. Hiệu suất quá trình
cũng cho thấy kết quả khả quan đạt tới 90% đối với tiểu phân chứa 100mg ART (nồng
độ 2 mg/ml). Sự có mặt của ART trong tiểu phân được chứng minh bằng kết quả phân
tích nhiệt DSC, đồng thời pic của sản phẩm phân hủy từ ART không xuất hiện, chứng
tỏ độ bền lý hóa của dược chất đã được cải thiện đáng kể. Các thí nghiệm in vitro
khác đã đánh giá được khả năng giải phóng ổn định của dược chất đồng thời tác dụng
15

chống sốt rét cũng được gia tăng khi đánh giá trên chuột có mang kí sinh trùng sốt rét
Plasmodium berghei [9].
Trong một nghiên cứu khác, Haiji Meng và các đồng sự đã sử dụng cách biến đổi
hóa học bằng cách ester hóa tinh thể ART bằng mPEG với xúc tác 1, 3, 3-
tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) trong dung môi dicloromethan có
mặt chất diện hoạt triethylamin để tạo phức hợp mPEG-ART. Sau đó phức hợp
mPEG-ART được hòa tan trong dung môi tetrahydrofuran (THF) trước khi được
phân tán trong đệm phosphate thích hợp. Kết quả thu được các tiểu phân nano đều có
kích thước nằm trong khoảng 22-120nm, trung bình 88.7 nm. Thế zeta trung bình đạt
-12.4mV, với điện thế bề mặt âm sẽ kéo dài thời gian luân chuyển trong máu của tiểu
phân. Khả năng giải phóng thuốc của tiểu phân khá ổn định, sau thời gian 48h mức
độ giải phóng trong môi trường pH 7.4 là 30% và với pH 5.0 là 40%. Nghiên cứu
cũng đánh giá khả năng chống tăng trưởng tế bào bằng phương pháp nhuộm màu tế
bào sống (cell viability) và kết quả tiểu phân nano tạo bởi mPEG-ART cho hiệu quả

cao hơn 20-30% ART tự do, thay đổi theo nồng độ [26].
Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Hanh Thuy Nguyen đã tiến hành bào chế và
đánh giá tiểu phân nanopolyme chứa ART với chất mang là polyme PLGA. ART
được hòa tan trong dumg môi hữu cơ trước khi được phân tán vào pha nước là dung
dịch chất diện hoạt. Hỗn hợp được khuấy trong vòng 3 tiếng để quá trình bốc hơi
dung môi hữu cơ được diễn ra. Tiểu phân thu được được đánh giá các tiêu chí về kích
thước, điện thế bề mặt và các thí nghiệm in vitro như khả năng giải phóng, độc tính
tế bào. Kết quả thu được khá khả quan khi kích thước tiểu phân trung bình vào khoảng
166 đến 305 nm tùy theo đặc tính của chất diện hoạt. Chất diện hoạt tốt nhất cho mô
hình thí nghiệm được đánh giá là Tween 80 với khoảng kích thước 166-177 nm với
hiệu suất nạp dược chất đạt 77,5-83,4% với các nồng độ thay đổi. Các kết quả đánh
giá in vitro về khả năng chống tăng trưởng tế bào trên các dòng tế bào ung thư SCC7
(ung thư biểu mô), A549 (ung thư phổi trên người), MCF-7 (ung thư vú) cho thấy
hiệu quả vượt trội so với ART tự do ở nồng độ 50-100 µg/ml [28].
16

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN LIỆU, DUNG MÔI NGHIÊN CỨU
Bảng 2.1 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
TT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn chất
lượng
Dược chất
1.
Artesunat
Sao Kim Pharma
TCCS

Nguyên liệu và hóa chất
2.
PLGA (Lakeshore 5050
DLG 2A)
Evonik – Đức
EP
3.
DDAB
Sigma - Aldrich - Pháp
EP
4.
Hyaluronic acid
Gattefossé - Pháp
EP
5.
Dikali hydrophosphat
Trung Quốc
Dùng cho HPLC
6.
Kali dihydrophosphat
Trung Quốc
Dùng cho HPLC
7.
Acid phosphoric
Merck
Dùng cho HPLC
Dung môi
8.
Acetonitril
Merck

Dùng cho HPLC
9.
Dicloromethan
Merck
Dùng cho HPLC
10.
Ethanol
Trung Quốc
Tinh khiết phân tích
11.
Nước cất
Việt Nam
Nước cất pha tiêm
17

2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
- Cân phân tích Sartorius (Đức)
- Máy khuấy từ IKARH basic (Đức)
- Máy lắc Votex mixer VM300 (Đài Loan)
- Bể siêu âm WUC-A10H (Hàn Quốc)
- Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 (Đức)
- Máy đo kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90-Malvern (Anh)
- Máy li tâm lạnh HERMLE Labortechnik GmbH - Z 326k (Đức)
- Máy siêu âm Viber-cells VC 505 (Mỹ).
- Màng thẩm tích 10000 Dalton (Mỹ).
- Ống siêu ly tâm – lọc 10000 MWCO Milipore (Mỹ).
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano polyme chứa
artesunat sử dụng chất mang là PLGA, bao ngoài bằng chất diện hoạt mang điện tích
dương DDAB để thay đổi điện thế bề mặt của tiểu phân.

- Gắn hyaluronic acid lên bề mặt tiểu phân với vai trò như một yếu tố hướng
đích cho tiểu phân nano.
- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân bào chế được.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Phương pháp bào chế
2.4.1.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme artesunat.
Tiểu phân nano polyme được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung
môi. Sơ đồ quy trình được trình bày ở hình 2.1
Mô tả quy trình
- Chuẩn bị pha hữu cơ: Hòa tan dược chất ART, chất diện hoạt mang điện tích
dương DDAB và polyme PLGA vào dung môi hữu cơ DCM.
- Chuẩn bị pha nước: Pha dung dịch Tween 80 1.5% trong nước.
- Giai đoạn nhũ hóa: Pha hữu cơ được nhỏ từ từ bằng micropipette vào pha nước
với tốc độ 1 ml/phút. Đồng thời, hỗn hợp được hình thành bằng lực phân tán. Thiết