nghiên cứu bào chế phytosome từ cao vỏ bưởi citrus maxima

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.31 MB, 103 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN LÊ HỒNG SƠN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME

TỪ CAO VỎ BƯỞI (CITRUS MAXIMA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN LÊ HỒNG SƠN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME

TỪ CAO VỎ BƯỞI (CITRUS MAXIMA)

NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐCMÃ SỐ: 8720202

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:PGS. TS. PHẠM ĐÌNH DUY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận vănlà trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 11 năm 2023

Nguyễn Lê Hoàng Sơn

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Luận văn thạc sĩ Dược học – Khóa học 2021 – 2023

Ngành: Cơng nghệ Dược phẩm và bào chế thuốc

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME TỪ CAO VỎ BƯỞI (Citrus maxima)

Nguyễn Lê Hoàng Sơn

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Đình DuyMục tiêu

Bưởi (Citrus maxima) được biết đến là một loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao và

tiềm năng trong điều trị các bệnh mãn tính. Thành phần hóa học chính của bưởi bao gồmcác hợp chất nhóm flavonoid, các carotenoid và tinh dầu. Trong đó, các hợp chất thuộcnhóm flavonoid (naringin, hesperidin, melitidin,…) hiện diện chủ yếu ở vỏ bưởi, gópphần quan trọng tạo nên những tác dụng sinh học trên. Tuy nhiên, các hợp chất nhómflavonoid thường kém tan trong nước, sinh khả dụng đường uống thấp và dễ bị biến đổibởi các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ và độ pH. Chính vì vậy, để gia tăng tính hiệu quảkhi sử dụng các chế phẩm từ bưởi, việc nghiên cứu các dạng bào chế giúp cải thiện độtan và nâng cao sinh khả dụng đường uống của các hoạt chất sinh học trong cao chiếtvỏ bưởi cần được quan tâm. Trong đó, Phytosome là phức hợp của hoạt chất dược liệu(cấu trúc polyphenol, triterpen…) gắn với phospholipid ở mức độ phân tử giúp cải thiệnđược sinh khả dụng của các hoạt chất trong dược liệu. Mục tiêu của đề tài là bào chếphytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mơ phịng thí nghiệm và đánh giá các đặc tính củaphytosome cao vỏ bưởi.

Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng naringin và melitidin trong phytosome từcao vỏ bưởi bằng HPLC – PDA

Khảo sát và xây dựng quy trình điều chế phytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mơ phịng thínghiệm.

Kết quả và bàn luận

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin trongphytosome cao vỏ bưởi bằng HPLC – PDA thông qua việc xây dựng và thẩm định 2 quytrình định lượng gồm: quy trình định lượng hoạt chất tồn phần trong phytosome và quytrình định lượng hoạt chất dạng tự do. Cả hai quy trình định lượng đều đạt các u cầukhi thẩm định. Thơng qua quy trình định lượng xác định được hiệu suất phytosome hóađạt 51,99 % đối với tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL là 1:5.

Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế phytosome cao vỏ bưởi ở quy mơ phịngthí nghiệm với tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL là 1:5, các thơng số kỹ thuật của q trình bào chế:thời gian tạo phức là 3 giờ; nhiệt độ phản ứng là 60 oC, tốc độ quay của máy cô quay là50 vịng/phút. Thu được phytosome cao vỏ bưởi có kích thước tiểu phân trung bình là246,8 ± 3,7 nm, chỉ số đa phân tán khoảng 0,305 ± 0,026, giá trị thế zeta trung bình là -33,7 ± 1,7 mV.

Kết luận

Đề tài đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng naringin và melitidin trongphytosome từ cao vỏ bưởi bằng HPLC – PDA. Khảo sát và xây dựng thành cơng quytrình điều chế phytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mơ phịng thí nghiệm.

Từ khóa: phytosome, cao vỏ bưởi

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

MỤC LỤC

1.1. Tổng quan về dược liệu bưởi ... 3

1.2. Tổng quan về phytosome ... 10

2.1. Đối tượng nghiên cứu ... 22

2.2. Phương pháp nghiên cứu ... 23

3.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng naringin và melitidin trong phytosomecao vỏ bưởi bằng HPLC ... 31

3.2. Nghiên cứu bào chế phytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mơ phịng thí nghiệm ... 54

4.1. Về xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidintrong phytosome cao vỏ bưởi bằng HPLC và hiệu suất phytosome hóa... 61

4.2. Về nghiên cứu bào chế phytosome cao vỏ bưởi ... 63

5.1. Kết luận... 67

5.2. Kiến nghị ... 67

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DLS Dynamic light scattering Phương pháp tán xạ ánhsáng động

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid chính trong trái Bưởi ... 4

Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hoá chất sử dụng trong bào chế và kiểm nghiệm ... 22

Bảng 2.2. Danh mục thiết bị sử dụng trong bào chế và kiểm nghiệm ... 22

Bảng 2.3. Chương trình rửa giải khảo sát 1 ... 23

Bảng 2.4. Các thông số sắc ký và yêu cầu theo hướng dẫn ICH ... 25

Bảng 2.5. Các công thức khảo sát phức hợp cao vỏ bưởi và phospholipid ... 28

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ cột sắc ký ... 33

Bảng 3.2. Kết quả tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng đồng thời naringinvà melitidin tồn phần ... 37

Bảng 3.3. Kết quả các thơng số sắc ký của naringin và melitidin ... 37

Bảng 3.4. Kết quả diện tích pic các mẫu trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình địnhlượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần ... 40

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của naringin ... 40

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của melitidin ... 41

Bảng 3.7. Biện giải phương trình hồi quy tuyến tính của naringin và melitidin ... 41

Bảng 3.8. Nồng độ LOD và LOQ của hai chất khảo sát ... 42

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại và hàm lượng của naringin, melitidin toàn phầntrong mẫu Phytosome ... 42

Bảng 3.10. Hàm lượng của naringin và melitidin toàn phần trong khảo sát độ chính xáctrung gian ... 43

Bảng 3.11. Kết quả độ đúng của naringin ... 44

Bảng 3.12. Kết quả độ đúng của melitidin ... 44

Bảng 3.13. Kết quả tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng đồng thờinaringin và melitidin dạng tự do ... 46

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Bảng 3.14. Kết quả các thông số sắc ký của naringin và melitidin ... 47

Bảng 3.15. Kết quả diện tích pic các mẫu trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình địnhlượng đồng thời naringin và melitidin dạng tự do ... 49

Bảng 3.16. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của naringin ... 49

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của melitidin ... 50

Bảng 3.18. Biện giải phương trình hồi quy tuyến tính của naringin và melitidin ... 50

Bảng 3.19. Nồng độ LOD và LOQ của hai chất khảo sát ... 51

Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ lặp lại và hàm lượng của naringin và melitidin dạng tựdo ... 51

Bảng 3.21. Hàm lượng của naringin và melitidin tự do trong khảo sát độ chính xác trunggian ... 52

Bảng 3.22. Kết quả độ đúng của naringin ... 53

Bảng 3.23. Kết quả độ đúng của melitidin ... 53

Bảng 3.24. Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được vào chế với tỷ lệ cao vỏ bưởi :PL (kl/kl) khác nhau (n = 3) ... 54

Bảng 3.25. Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được vào chế với các mức thời gianphản ứng khác nhau (n = 3) ... 55

Bảng 3.26. Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được vào chế với các mức nhiệt độphản ứng khác nhau (n = 3) ... 56

Bảng 3.27. Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được bào chế khi thay đổi tốc độ củamáy cô quay (n = 3) ... 57

Bảng 3.28. Kết quả phân tích nhiệt lượng vi sai quét của các mẫu thử ... 59

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Bưởi (Citrus grandis (Burm. f.) Merr.). ... 3

Hình 1.2. Cấu trúc của Phytosome . ... 11

Hình 1.3. Cấu tạo của phosphatidylcholine . ... 11

Hình 3.1. Sắc ký đồ (SKĐ) của các chương trình rửa giải được khảo sát ... 32

Hình 3.2. Biểu đồ kết quả diện tích pic của naringin và melitidin trong khảo sát dungmơi hịa tan mẫu ... 34

Hình 3.3. Biểu đồ kết quả diện tích pic của naringin và melitidin trong khảo sát phươngpháp hòa tan mẫu ... 35

Hình 3.4. Biểu đồ kết quả diện tích pic của naringin và melitidin trong khảo sát thể tíchdung mơi hịa tan mẫu ... 36

Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu của naringin và melitidin trong quy trìnhđịnh lượng đồng thời naringin và melitidin tồn phần ... 39

Hình 3.6. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời naringin vàmelitidin tồn phần ... 39

Hình 3.7. SKĐ ở nồng độ LOD của naringin và melitidin ... 42

Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu của naringin và melitidin trong quy trìnhđịnh lượng đồng thời naringin và melitidin dạng tự do... 48

Hình 3.9. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời naringin vàmelitidin dạng tự do ... 48

Hình 3.10. SKĐ ở nồng độ LOD của naringin và melitidin ... 51

Hình 3.11. Mối tương quan giữa tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL và hiệu suất phytosome hóa . 54Hình 3.12. Phổ IR của: (A) cao vỏ bưởi, (B) Lipoid s100, (C) Hỗn hợp vật lý, (D)Phytosome cao vỏ bưởi ... 58

Hình 3.13. Giãn đồ phân tích nhiệt vi sai qt của các mẫu Lipoid s100, cao vỏ bưởi,hỗn hợp vật lý và phytosome cao vỏ bưởi. ... 60

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

MỞ ĐẦU

Bưởi (Citrus maxima) được biết đến là một loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao

và tiềm năng trong điều trị các bệnh mãn tính. Thành phần hóa học chính của bưởi baogồm các hợp chất nhóm flavonoid, các carotenoid và tinh dầu 1,2. Trong dân gian, lábưởi được sử dụng để xông chữa cảm cúm, vỏ bưởi chữa chứng ăn không tiêu và dịchép múi bưởi làm thuốc chữa tiêu khát (đái tháo) 3. Ngày nay, qua nhiều nghiên cứu chothấy bưởi có các tác dụng dược lý nổi bật bao gồm chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệgan, hạ lipid máu và hạ đường huyết 4,5. Trong đó, các hợp chất thuộc nhóm flavonoid(naringin, hesperidin, melitidin,…) hiện diện chủ yếu ở vỏ bưởi 2, góp phần quan trọngtạo nên những tác dụng sinh học trên. Tuy nhiên, các hợp chất nhóm flavonoid thườngkém tan trong nước, sinh khả dụng đường uống thấp 6 và dễ bị biến đổi bởi các yếu tốnhư ánh sáng, nhiệt độ và độ pH. Chính vì vậy, để gia tăng tính hiệu quả khi sử dụngcác chế phẩm từ bưởi, việc nghiên cứu các dạng bào chế giúp cải thiện độ tan và nângcao sinh khả dụng đường uống của các hoạt chất sinh học trong cao chiết vỏ bưởi cầnđược quan tâm.

Nhiều công nghệ đã được áp dụng để cải thiện độ tan cũng như sinh khả dụngđường uống của các flavonoid có mặt trong cao chiết vỏ bưởi. Trong đó có thể kể đếnnhư sử dụng phương pháp kết tủa naringin với polyvinylpyrrolidone (PVP) là giá mangưa nước 7, bao bọc naringin với phức hợp tan trong nước bao gồm amylose, acid α-linoleic and β-lactoglobulin 6, bao bọc hesperidin với giá mang PLGA/Poloxamer 407 8hay phức hợp hesperidin – phospholipid (Phytosome) 9. Tất cả những phương pháp trênđều góp phần làm gia tăng hoạt tính sinh học của các flavonoid, tuy nhiên, những nghiêncứu trên đều bắt đầu từ nguyên liệu là những hoạt chất tinh khiết, chưa có nghiên cứunào thực hiện trên nguyên liệu ban đầu là cao chiết toàn phần từ vỏ bưởi.

Phytosome là phức hợp của hoạt chất dược liệu (cấu trúc polyphenol, triterpen…)gắn với phospholipid (PL) ở mức độ phân tử. Trong mơi trường nước, phytosome tạothành dạng micell có cấu trúc tương tự liposome. Phytosome dược liệu cải thiện đượckhả năng vận chuyển, hấp thu từ môi trường thân nước trong lịng ống tiêu hóa vào mơitrường thân chất béo trong tế bào ruột, sau đó vào trong tuần hồn. Cơng nghệ bào chế

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

hiện đại này đã và đang tạo ra một dòng sản phẩm từ dược liệu có hiệu quả điều trị cao,giảm tác dụng phụ, giảm liều dùng và tăng giá trị của thuốc thảo dược. Trong phytosome,hoạt chất được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành bộ phận cấu tạo củamàng, có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của hoạt chất và ionphosphate trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất trong cao dược liệu 10.Chính vì vậy, nghiên cứu bào chế phytosome từ cao chiết vỏ bưởi là một hướng nghiêncứu đầy tiềm năng góp phần nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu bưởi. Để làm rõ hơn

về kĩ thuật này, đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome từ cao vỏ bưởi (Citrus

maxima)” được thực hiện với những mục tiêu chính:

1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng naringin và melitidin trongphytosome từ cao vỏ bưởi bằng HPLC - PDA.

2. Khảo sát và xây dựng quy trình điều chế phytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mơphịng thí nghiệm.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về dược liệu bưởi

1.1.1. Mô tả

Bưởi thuộc dạng cây gỗ cao 5-10 m hay hơn. Vỏ đơi khi để tốt ra một chất gơm.Cành có gai nhỏ mọc đứng ở kẽ lá, có lơng rồi nhẵn. Lá hình trái xoan tù 2 đầu, nguyên,dai; gân bên 8 đôi, gân nhỏ chỉ nổi rõ ở mặt dưới; cuống lá có cánh dài, có lơng ở mặtdưới, nhất là trên sống giữa.

Hoa mọc thành chùm 6 - 10 hoa; cuống hoa có lơng; lá bắc hình vạch, có lơng.Hoa trắng, to, rất thơm; lá đài 4-5, trịn, có lơng; cánh hoa 5; nhị khoảng 24, rời, ngắnbằng nửa các cánh hoa; đĩa mật dày; bầu hình cầu, có lơng, vịi dài, đầu nhuỵ hình đầu,to. Quả gần hình cầu và cầu phẳng, đường kính 15-30 cm, có cùi dày và màu sắc thayđổi tuỳ loại Bưởi, thường có 12 múi, cơm quả chua hay ngọt cũng khác nhau tuỳ loại 3.

Hình 1.1. Bưởi (Citrus grandis (Burm. f.) Merr.).

(a): Hình tồn cây Bưởi(b): Hình hoa Bưởi(c): Hình quả Bưởi

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.1.2. Thành phần hóa học

1.1.2.1. Các hợp chất nhóm flavonoid

Năm 2014, Pan-lin Li và các cộng sự đã xác định các aglycon flavanon chính trongvỏ Bưởi gồm naringenin, hesperetin và eriodictyol 11. Trong vỏ Bưởi cũng chứa hai loạiglycosid flavanon là neohesperidosid và rutinosid. Neohesperosid trong vỏ Bưởi baogồm naringin, neohesperidin và neoeriocitrin, rutinoside bao gồm eriocitrin, narirutin,hesperidin và neoponcirin 12-14. Ngoài ra, vỏ Bưởi còn chứa flavon tồn tại ở cả dạngaglycon và glycosid, 6 aglycon flavon chính được báo cáo bao gồm sinensetin, nobiletin,tangeretin, apigenin, luteolin và diosmetin; các glycosid flavon gồm có lucinen-2,vicinen-2, apigenin 6-C-glucosyl-7-O-glucosid, diosmetin 6,8-di,-C-glucosid, anddiosmetin 6-C-glucosid 14.

Năm 2021, Yihan Zhao và các cộng sự đã đánh giá sự tích lũy và tổng hợpcarotenoid trong các giai đoạn phát triển của quả Bưởi. Kết quả nghiên cứu cho thấyhàm lượng carotenoid tổng được tích lũy cao hơn ở quả Bưởi non 15.

Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid chính trong trái Bưởi

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Melitidin Tangeretin

1.1.2.2. Các hợp chất nhóm coumarin

Các hợp chất chính thuộc nhóm coumarin được xác định trong vỏ Bưởi bao gồmlimettin, meranzin, xanthotoxin, isomeranzin, 7-hydroxycoumarin, mexoticin, paniculinII, epoxyaurapten, meranzin hydrate, auraptene và oxypeucedanin hydrate. Một số chấtnhóm furanocoumarin được xác định trong vỏ Bưởi bao gồm bergapten, bergaptol, 6′,7′dihydroxybergamottin, bergamottin, epoxybergamottin và imperatorin 16-18.

1.1.2.3. Các hợp chất nhóm carotenoid

Một số hợp chất thuộc nhóm carotenoid chính trong Bưởi bao gồm phytoene,phytofluene, zeta-carotene, lycopene, 𝛼-carotene, 𝛽-carotene, lutein, 𝛽-cryptoxanthin,9-cis-violaxanthin và zeaxanthin 19.

1.1.2.4. Tinh dầu

Đa số các cấu tử tinh dầu trong vỏ Bưởi thuộc một lớp hợp chất hữu cơ là terpenoid,bao gồm cả monoterpenoid mạch hở, monoterpenoid đơn vòng, monoterpenoid haivòng, diterpenoid, sesquiterpenoid mạch hở, sesquiterpenoid đơn vòng, sesquiterpenoidhai vòng và sesquiterpenoid ba vòng 20.

1.1.3. Tác dụng dược lý

1.1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2016, Fidrianny và các cộng sự đã nghiên cứu để xác định hoạt tính chốngoxy hóa từ những phần khác nhau của Bưởi bằng cách sử dụng DPPH vàphosphomolybdenum. Kết quả cho thấy dịch chiết bằng ethyl acetate từ vỏ Bưởi giá trịIC50 thấp nhất là 0,68 µg/ml đối với phương pháp DPPH, trong khi đó giá trị EC50 thấp

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

nhất là 101,36 µg/ml đối với phương pháp phosphomolybdenum thuộc về dịch chiếtbằng dung môi ethyl acetate từ lá Bưởi 21.

Năm 2019, Sanjay Kumar và các cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa củadịch chiết vỏ Bưởi. Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất vỏ Bưởi trong cồn được đánhgiá bằng cách tính chỉ số acid béo tự do, chỉ số iod và chỉ số p-anisidine của dầu lạctrong thời gian bảo quản 21 ngày ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được lấy và phân tích địnhkỳ sau 7 ngày và sau 21 ngày bảo quản, dầu lạc được thêm vào 1500 và 2000 ppm chiếtxuất vỏ Bưởi, cho thấy chỉ số acid béo tự do (2,66 và 2,15%), chỉ số p-anisidine (6,6;4,68) thấp hơn và chỉ số iod cao hơn (52,8 và 51,46) so với mẫu dầu lạc đối chứng (chỉsố acid béo tự do 9,32%, chỉ số p- anisidine 9,85 và chỉ số iod 33,9) 5.

1.1.3.2. Tác dụng kháng viêm

Năm 2018, M Ibrahim và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng giảm đau và khángviêm của dịch chiết vỏ Bưởi bằng methanol. Kết quả cho thấy dịch chiết ở mức 500mg/kg cho thấy hoạt tính giảm đau đạt mức 73,34% chống lại cơn đau do acetic acidgây ra ở chuột so với chứng dương diclofenac sodium thể hiện hoạt tính 87,13% ở liều10 mg/kg. Tác dụng chống viêm của dịch chiết tương đương với thuốc ibuprofen đốichứng và hiệu quả duy trì trong 2-4 giờ 22.

Năm 2019, Momoko Ishida và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống viêm

của dịch chiết nước từ vỏ Bưởi in vitro và in vivo. Kết quả cho thấy dịch chiết nước từ

vỏ Bưởi ức chế đáng kể việc sản xuất các cytokin gây viêm như interleukin (IL)-6 vàyếu tố hoại tử khối u (TNF)-α bởi các tế bào RAW264.7 được LPS kích hoạt mà khơnggây độc tế bào. Dịch chiết nước từ vỏ Bưởi cũng ức chế đáng kể mức độ biểu hiệnmRNA của IL-6 và TNF-α trong tế bào, ức chế sản xuất các cytokin gây viêm bằng cáchức chế mức độ biểu hiện gen. Phân tích Immunoblot cho thấy tác dụng chống viêm trênđại thực bào thông qua việc ức chế quá trình phosphoryl hóa p38 và chuyển vị trí củaNF-κB vào nhân. Việc uống dịch chiết nước từ vỏ Bưởi đã ức chế nồng độ trong huyếtthanh của các cytokin gây viêm và cải thiện tỷ lệ sống sót ở chuột trong mơ hình hội

chứng phản ứng viêm tồn thân (SIRS). Ngồi ra, các thí nghiệm in vivo cho thấy việc

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

uống dịch chiết nước từ vỏ Bưởi ức chế nồng độ cytokin gây viêm trong huyết thanh vàcải thiện tỷ lệ sống sót ở chuột trong mơ hình SIRS 23.

1.1.3.3. Hạ lipid máu

Năm 2020, Peace Nwanneka Ani và cộng sự đã nghiên cứu trên mơ hình chuộtWistar bị gây bệnh cảnh tiểu đường bằng alloxan. Kết quả cho thấy chiết xuất từ vỏBưởi làm giảm đáng kể mức đường huyết, đồng thời làm tăng tỷ lệ cholesterollipoprotein tỷ trọng cao (4,43%) và giảm cholesterol toàn phần (30,86%), triglyceride(10,58%) và cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp (10,20%) 24.

Năm 2020, Li-Yun Lin và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng hạ lipid máu củaBưởi thơng qua mơ hình chuột Wistar và mơ hình HepG2. Kết quả nghiên cứu cho thấytất cả các bộ phận của quả Bưởi đều tăng cường khả năng bài tiết lipid thô và steroltrong phân. Do đó, quả Bưởi có thể đóng vai trị như một chất chống tăng lipid máu kháhứa hẹn 25.

Năm 2020, Fansheng Kong và cộng sự đã làm nghiên cứu cho thấy chất naringin(một flavonoid có trong vỏ Bưởi) giúp tăng đáng kể lượng lipoprotein tỷ trọng cao(HDL)-cholesterol đồng thời làm giảm mức cholesterol toàn phần, tổng chất béo trungtính và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL)-cholesterol ở chuột mắc bệnh tiểu đường 26.

1.1.3.4. Hạ đường huyết

Năm 2013, Temitope A. Oyedepo và cộng sự đã đánh giá tác động của nước épBưởi đối với sự dung nạp glucose và lipid ở chuột bị gây bệnh đái tháo đường tuýp IIbằng streptozotocin. Các nhóm chuột khác nhau được điều trị bằng nước ép Bưởi cónồng độ 25% và 50% trong 8 tuần. Sau 8 tuần điều trị, các thơng số sinh hóa máu đượcphân tích cho thấy sự khác biệt đáng kể của glucose, cholesterol, HDL, LDL,triglyceride, trong 50% nhóm được điều trị bằng nước ép Bưởi so với nhóm bị tiểuđường đối chứng. Nghiên cứu cho thấy nước ép Bưởi có tác dụng có lợi đối với sự dungnạp glucose và lipid ở chuột bị đái tháo đường tuýp II do streptozotocin gây ra 27.

Năm 2018, Anayt Ulla và các cộng sự đã thực hiện đánh giá tác dụng của việc bổsung vỏ bưởi ở chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra. Chuột Long Evans đực bịgây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm alloxan monohydrat vào màng bụng (90 mg/kg thể

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

trọng). Mức đường huyết, sự dung nạp glucose đường uống, các xét nghiệm mơ bệnhhọc được đánh giá để kiểm tra tình trạng viêm và xơ hóa trong gan. Kết quả cho thấyviệc sử dụng vỏ bưởi đã giúp ngăn ngừa stress oxy hóa trong gan của chuột mắc bệnhtiểu đường do alloxan, đồng thời giúp cải thiện bệnh tiểu đường do alloxan gây ra ởchuột và giảm thiểu các biến chứng 28.

1.1.3.5. Tác dụng bảo vệ gan

Năm 2015, Hasan Chowdhury và các cộng sự đã xác định hoạt động bảo vệ gancủa bột vỏ quả Bưởi bằng cách sử dụng mơ hình chuột đã xử lý carbon tetrachloride(CCl4). Tổn thương gan ở chuột được xác nhận bằng cách đo hoạt động của enzymeaspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) và alkalinephosphatase (ALP). Ngồi ra, các sản phẩm peroxy hóa lipid (MDA), nitric oxide, mứcđộ sản phẩm oxy hóa protein nâng cao (APOP) và các hoạt động của catalase cũng đượcphân tích cùng với mơ tả về sự thâm nhập tế bào viêm, sự lắng đọng collagen và sắttrong gan. Chế độ ăn bổ sung bột vỏ quả Bưởi làm giảm đáng kể hoạt động của AST,ALT và ALP trong huyết thanh ở chuột được xử lý bằng CCl4. Hơn nữa, bột vỏ quảBưởi cũng làm giảm đáng kể các dấu hiệu stress oxy hóa (MDA, NO, và mức APOP)và khơi phục hoạt động của catalase ở chuột được xử lý CCl4. Kiểm tra mô học của phầngan cho thấy sự giảm thâm nhập tế bào viêm, sự lắng đọng collagen và sắt ở những conchuột được xử lý bằng CCl4. Các kết quả từ nghiên cứu này đã chứng minh rằng bột vỏquả Bưởi tạo ra tác dụng bảo vệ gan đáng kể ở chuột được sử dụng CCl4 4.

Năm 2017, Yilong Liu và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và cho thấy rằngchất bergamottin, là một hợp chất furanocoumarin tự nhiên có trong vỏ Bưởi, giúp chốngtăng sinh đáng kể trên ba dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư gan ở người HepG2,bệnh bạch cầu nguyên bào HL-60 và tế bào ung thư dạ dày BGC-823. Ngoài ra,bergamottin làm tăng đáng kể mức tiêu thụ glucose trong tế bào HepG2, đây là báo cáođầu tiên về tiềm năng của nó trong các ứng dụng chống bệnh tiểu đường 29.

Năm 2019, Anayt Ulla và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu để đánh giá hiệuquả của việc bổ sung vỏ Bưởi cho chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra. Bệnhtiểu đường được gây ra ở chuột Long Evans đực bằng cách tiêm vào màng bụng alloxan

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

monohydrate (90 mg/kg thể trọng). Các chỉ số mức đường huyết, khả năng dung nạpglucose đường uống, chỉ số men gan và các xét nghiệm mô bệnh học được tiến hànhbằng cách sử dụng các phần gan để kiểm tra tình trạng viêm và xơ hóa. Bổ sung vỏ Bưởitrong 21 ngày giúp cải thiện tình trạng khơng dung nạp glucose và enzyme gan hoạtđộng gần mức bình thường (p <0,05). Hơn nữa, bổ sung vỏ Bưởi giúp ngăn ngừa stressoxy hóa trong gan của chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra. Nghiên cứu cũngcho thấy rằng sử dụng alloxan ở chuột gây ra chứng viêm xâm nhập và xơ hóa tế bàogan, các sự tổn thương này được cải thiện bằng cách bổ sung vỏ Bưởi 28.

Năm 2020, Ran An và các cộng sự đã kết hợp trà xanh, trà vàng và trà đen với vỏBưởi để đánh giá tác động làm giảm lắng đọng lipid ở gan. Kết quả cho thấy cả ba hỗnhợp trà với vỏ Bưởi đều làm giảm đáng kể sự lắng đọng lipid trong tế bào HepG2 bằngcách kích hoạt con đường tín hiệu AMPK/ACC, điều chỉnh sự biểu hiện của các proteinp-AMPK, p-ACC và CPT-1, đồng thời điều chỉnh sự biểu hiện của SREBP1c và proteintổng hợp acid béo để ức chế tổng hợp chất béo, do đó làm giảm sự lắng đọng lipid trongtế bào gan 30.

1.1.3.6. Tác dụng chống ung thư

Năm 2019, Ruiyi Fan và các cộng sự đã chiết xuất và tinh chế một polysaccharidecó tính acid từ bột vỏ Bưởi (gọi tắt là CGTP-AP). Đặc điểm cấu trúc chỉ ra rằng CGTP-AP là một dị trùng hợp đồng nhất bao gồm arabinose, galactose và galacturonic acidtheo tỷ lệ mol 2,45:1:2,77, với trọng lượng phân tử trung bình là 2721,68 kDa. Thủyphân một phần acid, methyl hóa và đo phổ NMR cho thấy cấu trúc của CGTP-AP chủyếu bao gồm (1 → 4)-α-D-galacturonan, trong khi nhánh chủ yếu bao gồm (1 → 5)-α-L-Araf. Ngoài ra, CGTP-AP thể hiện khả năng chống tăng sinh hiệu quả chống lại cáctế bào ung thư ruột kết là tế bào LOVO và SW620, phụ thuộc vào liều lượng và thờigian, với các giá trị IC50 là 5,55; 4,35 và 3,52 mgmL-1 sau 24, 48 và 72 giờ, và lần lượtlà 5,33; 3,63 và 2,97mgmL-1 sau 24, 48 và 72 giờ. Nghiên cứu này chỉ ra rằng CGTP-AP có thể được sử dụng như một loại thực phẩm bổ sung đầy hứa hẹn cho những bệnhnhân bị rối loạn đại tràng 31.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Năm 2021, Mursiti và các cộng sự đánh giá tác dụng gây độc tế bào của chiết xuấtvỏ Bưởi đối với tế bào MDA-MD-231 ung thư vú di căn. Hoạt tính gây độc tế bào củachiết xuất vỏ Bưởi được đánh giá bằng xét nghiệm MTT, mức ROS được tính tốn dướiphép đo lưu lượng. Sự hiện diện của chiết xuất vỏ Bưởi làm tăng quá trình chết tế bàovới giá trị IC50 là 338 μg/mL trong 24 giờ thông qua cảm ứng mức ROS. Các nghiêncứu gắn kết phân tử cho thấy rằng hesperidin thể hiện năng lượng liên kết tốt nhất ở -21,4766 (NF-κB) kcal/mol. Tương tác gắn kết của hesperidin với vị trí hoạt động củaprotein NF-κB gợi ý rằng các gốc amino acid (His537, Asp519, Gly407, Gln479,Arg416) có thể đóng một vai trị trong chuyển hóa ROS. Những phát hiện này đã chỉ rarằng chiết xuất vỏ Bưởi ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư bằng cách tăng mức ROS 32.

1.2. Tổng quan về phytosome1.2.1. Khái niệm

Từ “phyto” nghĩa là thực vật, còn “some” là giống như tế bào. Vì vậy, phytosomecó cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và thuận lợi hơn đểđược vận chuyển vào nội bào. Phytosome là phức hợp của hoạt chất dược liệu (cấu trúcpolyphenol, triterpen…) gắn với phospholipid (PL) ở mức độ phân tử . Trong mơi trườngnước, phytosome tạo thành dạng micell có cấu trúc tương tự liposome.

Phytosome dược liệu cải thiện được khả năng vận chuyển, hấp thu từ môi trườngthân nước trong lịng ống tiêu hóa vào mơi trường thân chất béo trong tế bào ruột, sauđó vào trong tuần hồn. Cơng nghệ bào chế hiện đại này đã và đang tạo ra một dịng sảnphẩm từ dược liệu có hiệu quả điều trị cao, giảm tác dụng phụ, giảm liều dùng và tănggiá trị của thuốc thảo dược.

Liên kết phospholipid - cơ chất là liên kết hydro giữa đầu phân cực củaphosphorlipid và các nhóm chức phân cực của hoạt chất. Trong phytosome, hoạt chấtđược gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành bộ phận cấu tạo của màng, cósự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của hoạt chất và ion phosphatetrên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất trong cao dược liệu. Tính chất củaphytosome được quyết định bởi các yếu tố như kích thước tiểu phân, tính thấm qua

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

màng, tỷ lệ (%) chất tan hấp phụ, thành phần hóa học cũng như số lượng và độ tinh khiếtcủa nguyên liệu ban đầu 10.

Hình 1.2. Cấu trúc của Phytosome 33.

1.2.2. Cấu tạo của phytosome

Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần chính: hoạt chất và phospholipid

1.2.2.1. Phospholipid

Phospholipid là phân tử được cấu tạo bao gồm một phân tử glycerol liên kết với hai phântử acid béo và một nhóm phosphat. Phosphatidylethanolamin, phosphatidylserin vàphosphatidylcholin là các phospholipid được sử dụng chủ yếu trong các chế phẩmphytosome, trong đó, phosphatidylcholine (PC) được sử dụng nhiều hơn các loại khác.Trong cấu tạo của phosphatidylcholine, choline đóng vai trò là đầu thân nước.Phosphatidylcholine là thành phần chính cấu tạo nên màng tế bào, mang lại lợi ích képkhi sử dụng trong điều chế phytosome: hoạt động như một phương tiện vận chuyển hoạtchất thích hợp và là một chất dinh dưỡng có tác dụng trong điều trị các bệnh về gan 34.

Hình 1.3. Cấu tạo của phosphatidylcholine 35.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

1.2.2.2. Hoạt chất

Hoạt chất có nguồn gốc từ dược liệu, thường là các hoạt chất thuộc nhómpolyphenol như flavonoid (rutin, quercetin, silybin…), saponin, terpenoid….Polyphenol là nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học có tác dụng cung cấp dinh dưỡng vàsử dụng trong điều trị bệnh. Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của polyphenol tương đối khơngổn định trên nền thực phẩm và các điều kiện tiêu hóa. Cơng nghệ phytosome giúp cácpolyphenol được bảo vệ trong một cấu trúc tương tự tế bào, nhờ đó bảo vệ chúng khỏibị phá hủy bởi các yếu tố môi trường (oxy, ánh sáng, nhiệt độ cao, kim loại…), enzymtiêu hóa và vi khuẩn đường ruột trong đường tiêu hóa. Một số hợp chất polyphenol cótính chất thân chất béo cao, hịa tan kém trong nước và dịch tiêu hóa. Những chất khácrất ưa nước và không thể vượt qua màng sinh học. Phytosome là chất mang có khả năngcải thiện các vấn đề về độ hòa tan của chất thân chất béo trong môi trường nước vàchuyển tiếp những chất thân nước từ pha nước vào môi trường thân chất béo rồi cuốicùng đến máu 36.

1.2.3. Ưu điểm và nhược điểm của phytosome1.2.3.1. Ưu điểm

- Tăng sinh khả dụng của hoạt chất

Xiangrong Zhang và các cộng sự đã điều chế phức hợp phospholipid của 25 OCH3PPD bằng cách làm bay hơi dung môi và nhận thấy rằng AUC(0–24 giờ) của phức hợp tăngtừ 26,65 lên 97,24; cao gấp 3,65 lần so với 25-OCH3-PPD tự do và sinh khả dụng tươngđối là 365% 37. Kexia Zhang điều chế phức hợp quercetin-phospholipid và thấy rằngAUC(0–t) của phức hợp trên tăng từ 2,04 lên 8,12 38. Khả năng cải thiện hấp thu củaphytosome cũng được chứng minh trên mơ hình chuột thí nghiệm với hoạt chấtcurcumin. Cụ thể, Cmax của curcumin và hỗn hợp vật lý curcumin - PC lần lượt là 258,64và 297,32 ng/ml với Tmax tương ứng là 1,72 và 2,03 giờ. Trong khi đó, Cmax củaphytosome curcumin là 803,86 ng/ml với Tmax 2,21 giờ. Thông số AUC0-120phút củaphytosome (Meriva) với liều 340 mg/kg cho giá trị cao gấp 5 lần so với curcumindạng tự do 39. Năm 2013, Sauvik Bhattacharyya và các cộng sự đã tiến hành đánh giá

-khả năng cải thiện sinh -khả dụng đường uống và tác dụng bảo vệ gan in vivo trên mơ

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

hình gây độc gan chuột do carbon tetracloride (CCl4) của phytosome acid gallic. Kếtquả thu được như sau: dạng phytosome làm tăng khả năng hấp thu đường uống của acidgallic gấp khoảng 4,31 lần so với hoạt chất tinh khiết, thời gian bán thải cũng được cảithiện khi sử dụng dạng phytosome (2,12 ± 0,18 giờ) so sánh với hoạt chất tinh khiết(0,98 ± 0,07 giờ). Phức hợp với PL của acid gallic làm tăng hiệu quả bảo vệ gan (doCCl4 gây ra) so với acid gallic tinh khiết (p < 0,05) thông qua các chỉ số: tăng nồng độcác enzym chống oxy hóa ở gan (CAT, SOD, GPx) và làm giảm nồng độ các enzym gantrong máu (SGOT, SGPT, ALP), làm giảm tổng lượng bilirubin trong máu 40.

- Tăng khả năng hấp thụ qua da

Phytosome có thể dễ dàng chuyển từ môi trường thân nước vào môi trường thânchất béo của màng tế bào, sau đó thấm sâu vào tế bào 41. Đặc tính này đã được chứngminh trong một số nghiên cứu. Stefano TOGNI và các cộng sự đã bào chế kemQuercetin-phytosome 2%, qua đó chứng minh tính an tồn và khả năng dung nạp quada của chế phẩm trên 42. Trên mơ hình thử hoạt tính kháng nấm, dạng gel chứa 2 %phytosome Lawson đã thể hiện hiệu quả cao hơn so với gel chứa Lawson cũng như chếphẩm chứa ketoconazol sau 3 ngày sử dụng. Kết quả này có được là do sự gia tăng tínhthấm của phytosome (sau 6 giờ có 92,91 % hoạt chất thấm qua da) 43.

- Khả năng bảo vệ gan

So sánh với những chất mang được sử dụng trong các hệ thống phân phối thuốckhác, phosphatidylcholine không chỉ hoạt động như một thành phần được thêm vào côngthức của phức hợp phyto-phospholipid mà cịn hoạt động như một chất bảo vệ gan 44.Vì vậy, khi phosphatidylcholine được bệnh nhân sử dụng, nó sẽ cho thấy tác dụng hiệpđồng bảo vệ gan. Trong một số trường hợp, phospholipid cũng có lợi ích dinh dưỡng.

1.2.3.2. Nhược điểm

Mặc dù có rất nhiều ưu điểm như trên nhưng hiện nay phytosome vẫn chưađược sử dụng rộng rãi vì một số nhược điểm sau: phytosome sử dụng PL là thànhphần nhạy cảm với pH, dễ bị thủy phân trong môi trường pH acid hoặc kiềm, giảmđộ ổn định của phytosome 35. Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụngcác dung môi hữu cơ độc hại như: dicloromethan, methanol… để hòa tan lipid gây

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

ảnh hưởng đến sức khỏe con người, môi trường và có thể cịn tồn dư dung mơi trongsản phẩm. Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn có thể khắc phục đượcnhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu áp suất cao.

1.2.4. Phương pháp bào chế phytosome1.2.4.1. Phương pháp bốc hơi dung môi

PL, hoạt chất từ dược liệu được và các thành phần khác được hịa tan vào dung mơihữu cơ thích hợp trong một bình chứa. Hỗn hợp phản ứng này được giữ ở mức nhiệt độtối ưu (thường là 40 – 50 oC) trong khoảng thời gian thích hợp (1 - 2 giờ) để đạt đượcsự hình thành các liên kết trong phức hợp. Dung mơi hữu cơ sau đó được loại bỏ bằngcách sử dụng thiết bị bốc hơi ở áp suất giảm và thu được lớp màng film lipid. Lớp màngfilm này được lưu trữ trong bình hút ẩm để qua đêm. Phytosome mới hình thành đượclưu trữ trong chai thủy tinh màu hổ phách tránh ánh sáng, rửa bằng nitơ ở nhiệt độ phòngđể giữ sự ổn định 45.

1.2.4.2. Phương pháp kết tủa trong dung môi

PL, hoạt chất từ dược liệu được và các thành phần khác được đưa vào bình cầu đáytrịn và đun hồi lưu với dung mơi hữu cơ thích hợp ở nhiệt độ không quá 60oC trongkhoảng 1 - 2 giờ. Hỗn hợp sau đó được cơ đặc đến 5-10 ml. Thêm từ từ hexan và khuấyliên tục để có được kết tủa, lọc thu kết tủa và lưu trữ trong bình hút ẩm qua đêm. Kếttủa thô được nghiền và sàng qua rây có kích thước mắt lưới phù hợp. Phức hợp dạng bộtđược đặt trong chai thủy tinh màu hổ phách và được bảo quản ở nhiệt độ phòng 46.

1.2.4.3. Phương pháp siêu tới hạn

Phương pháp này dùng để bào chế các tiểu phân phytosome có kích thước daođộng từ 5 - 2000 nm. Phương pháp này tương tự phương pháp kết tủa trong dung mơi.Trong đó, dung mơi kết tủa là một chất lỏng đặc biệt tồn tại ở trạng thái siêu tới hạn(thường dùng CO2) 47.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

1.2.5. Đánh giá phytosome

1.2.5.1. Hình thái tiểu phân phytosome

Hình thái tiểu phân được quan sát bằng các loại kính hiển vi điện tử và quang phổhiện đại như:

+ Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (transmission electron microscopy) chohình ảnh về hình thái, cấu trúc tinh thể, số lượng và hướng của tiểu phân với độ phângiải cao. Các đặc tính bề mặt này thu được khi một chùm tia điện tử truyền qua một mẫusiêu mỏng, tương tác với mẫu khi nó đi qua 48. Nhược điểm của phương pháp này là quytrình chuẩn bị mẫu đo TEM phức tạp và tốn khá nhiều thời gian.

+ Kính hiển vi điện tử quét SEM (scanning electron microscopy) cung cấp hìnhảnh bề mặt tiểu phân với độ phân giải từ 10 - 300.000 lần và đánh giá sơ bộ kích thướctiểu phân. Độ phân giải của SEM được xác định từ kích thước chùm điện tử hội tụ, màkích thước này bị hạn chế bởi quang sai, chính vì thế mà SEM không thể đạt được độphân giải tốt như TEM. Mặc dù vậy, nhưng SEM có điểm mạnh là phân tích mà khơngcần phá hủy mẫu vật, các thao tác điều khiển đơn giản hơn và giá thành của SEM thấphơn rất nhiều so với TEM, vì thế đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong đánhgiá hình ảnh bề mặt tiểu phân 48.

1.2.5.2. Đánh giá sự tương tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome

- Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi fourier (FT – IR)

FT – IR là cho phép đo độ hấp thụ đặc trưng của các dao động các nguyên tử củanhóm chức trong mẫu. Các nhóm chức có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những sốsóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó. Sau khi quét phổ và giải được phổ FT – IRcủa phytosome, ta sẽ phân tích sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trênphổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi. Từ đó, có thể chứngminh liên kết tạo phức giữa phospholipid và hoạt chất 49.

- Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)

Dựa vào sự khác biệt về đặc tính nhiệt của phytosome và hỗn hợp vậtlý của hoạt chất - PL để đánh giá về sự hình thành của phức hợp. Khi hoạt

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

chất và tá dược có tương tác với nhau sẽ làm các quá trình nhiệt bị thay đổi,điều đó được thể hiện bằng những thay đổi trên đồ thị DSC. Từ những phântích về sự thay đổi trên đồ thị DSC, ta có thể chứng minh được sau khi tạothành phức hợp đã có sự thay đổi về nhiệt chuyển pha và mức độ tinh thể củahoạt chất cũng như trạng thái tồn tại của phức hợp 50.

1.2.5.3. Đánh giá hiệu suất phytosome hóa

Hiệu suất phytosome hóa (hiệu suất tạo phức) được đánh giá bằng tỷ số giữa lượnghoạt chất ở trong phytosome trên lượng hoạt chất tồn phần:

Hiệu suất phytosome hóa (%) =𝐿ượ𝑛𝑔 ℎ𝑜ạ𝑡 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑦𝑡𝑜𝑠𝑜𝑚𝑒

Việc xác định lượng hoạt chất đã tạo liên kết với phospholipid trongcác nghiên cứu thường được tiến hành theo nhiều phương pháp:

- Đối với hoạt chất tự do kị nước:

+ Phương pháp vi lọc: Lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc 3 µm. Lúc này tiểu phân(kỵ nước) khơng bao gói trong cấu trúc sẽ giữ lại trên giấy lọc và hệ tiểu phân chấtmang nano sẽ đi qua giấy lọc 51.

+ Phương pháp ly tâm: Phần hoạt chất tự do được lắng bằng cách ly tâm ở tốc độ lytâm vừa phải (2.000 - 5.000 vòng/phút) trong thời gian phù hợp. Phần hệ mang thuốcđược gạn lọc tách khỏi phần hoạt chất tự do lắng ở dưới 52.

- Đối với hoạt chất tự do ưa nước:

+ Phương pháp dùng ống siêu lọc: Mẫu được cho vào trong ống siêu lọc (10kDahoặc 30kDa), sau đó ly tâm ở tốc độ và thời gian thích hợp. Phần hoạt chất tự dokhông nằm trong hệ mang thuốc sẽ thu được ở phần buồng phía dưới của ống lọc 53.

+ Phương pháp siêu ly tâm: Mẫu được hịa vào trong một dung mơi thích hợp, sauđó ly tâm ở tốc độ vòng thường từ 12.000 vòng/phút trở lên trong thời gian thíchhợp. Phần hoạt chất tự do thu được ở phần dịch nổi phía trên 54.

Phương pháp sử dụng một dung mơi hịa tan chọn lọc phức hợp hoạt chất phosphoplipid. Hoạt chất tự do sẽ không tan trong dung mơi hịa tan chọn lọc 55.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

-1.2.5.4. Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân

Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân có thể đo trực tiếp bằngSEM, TEM, hoặc được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS (dynamiclight scattering). DLS là một trong những phương pháp nhanh nhất và phổ biến nhất đểxác định kích thước của các tiểu phân chuyển động Brown trong hỗn dịch keo với kíchthước trong khoảng nano và dưới micromet 56.

Kích thước phytosome thay đổi trong phạm vi khá rộng, từ hàng chục đến hàngnghìn nanomet, nên các mẫu phytosome nói chung có chứa một phân bố các kích thướckhác nhau, mẫu càng đồng nhất có độ ổn định càng cao. Số liệu về sự sai khác kíchthước được gọi là chỉ số đa phân tán PDI (polydispersity index). PDI là số liệu khơngcó đơn vị, tương ứng với sai số tương đối của sự phân bố kích thước. u cầu hệ cóphân bố kích thước càng hẹp càng tốt, khi PDI > 0,5 thì kích thước đo được khơng có ýnghĩa, dựa vào vị trí của các pic trên đồ thị phân bố KTTP để so sánh kích thước giữacác mẫu 57.

1.2.5.5. Thế Zeta

Thiết bị đo kích thước dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng động còn cho phép xácđịnh thế Zeta. Bản chất của phytosome là hệ phân tán, kích thước của phytosome ứngdụng trong dược phẩm thường dưới 1 µm, vì vậy thế Zeta phản ánh độ ổn định của hệvà ảnh hưởng tới phân bố sinh học của phytosome. Trong thực nghiệm, tiểu phân phântán có giá trị tuyệt đối của thế Zeta khoảng từ 30 và 60 mV sẽ tạo sự ổn định tĩnh điệnhọc nhờ lực đẩy giữa các tiểu phân tích điện cùng dấu. Nếu giá trị này từ 5 đến 15 mVsẽ giới hạn độ bền vững của hệ phân tán hoặc từ 3 đến 5 mV thường xuất hiện hiệntượng không bền 56.

1.2.6. Một số nghiên cứu về bào chế phytosome1.2.6.1. Một số nghiên cứu về phytosome ở Việt Nam

Năm 2015, Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự đã tiến hành bào chế phytosomecurcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi như sau: Hòa tan HSPC và curcumin (tỷlệ mol 1 : 1) trong ethanol (tỷ lệ curcumin : ethanol = 1 : 50). Tiến hành cất quay với tốcđộ 200 vòng/phút trong 2 giờ, sau đó bốc hơi dung mơi dưới áp suất giảm đến khi còn

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

10% thể tích. Bột phytosome được lấy ra và tiếp tục sấy chân không ở 40oC để đảm bảobột đạt hàm ẩm dưới 5 %. Phytosome thu được có hiệu suất quy trình 82,48 ± 2,76 %;hàm lượng curcumin 31,54 ± 2,09 %; KTTP: 283,6 nm; PDI 0,489; thế zeta -8,09 mV.Phytosome đã làm tăng độ tan của curcumin trong cả pha nước và pha dầu tương ứng6,6 và 9,7 lần. Thông qua phổ DSC, bước đầu nghiên cứu đã chứng minh có phản ứngliên kết hố học giữa curcumin và HSPC 58.

Năm 2016, Nguyễn Thị Thúy và cộng sự đã tiến hành bào chế phytosomesaponin toàn phần của củ cây Tam thất (Panax notoginseng) bằng phương pháp kết tủatrong dung mơi như sau: Saponin tồn phần tách chiết từ Tam thất hòa tan trong aceton,phospholipid hòa tan trong methylen clorid, sau đó phối hợp hai dung dịch trên, đun hồilưu trong 3 giờ ở 50oC. Loại bỏ dung mơi bằng máy cất quay chân khơng sau đó tiếp tụctủa với n-hexan. Với tỷ lệ saponin/PL là 1:3 (kl/kl) đạt hiệu suất quy trình cao nhất88,76%. Tương tác giữa saponin và phospholipid được đánh giá bằng các phổ hồngngoại và phân tích nhiệt lượng vi sai quét 59.

Năm 2018, Vũ Thị Quỳnh đã nghiên cứu bào chế phytosome cao bạch quả theophương pháp bốc hơi dung mơi. Q trình tạo phytosome được thực hiện ở nhiệt độ50oC trong thời gian 3 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy phytosome bào chế với tỷ lệcao bạch quả (tính theo hàm lượng flavonoid tồn phần) so với lecithin là 1: 4 (kl/kl) cóhiệu suất phytosome hóa > 90 % và hệ số phân bố log D tại các pH 4,5; 6,8; 7,4 tăng sovới cao nguyên liệu. Khả năng hình thành phytosome bước đầu được chứng minh quaphân tích phổ IR và DSC 60.

Năm 2018, phytosome rutin được bào chế theo phương pháp bốc hơi dungmôi và phương pháp phun sấy, sử dụng PC và cholesterol. Quy trình bào chế vớithông số kỹ thuật như sau: Tốc độ khuấy từ là 150 vòng/phút, thời gian khuấy từ 12 giờở nhiệt độ 25oC, phun sấy loại dung môi với nhiệt độ đầu vào 90oC và tốc độ phun dịch1600 ml/giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy phytosome bào chế theo phương pháp phunsấy với tỷ lệ mol rutin:PC: cholesterol là 1:1:0,2 có kích thước tiểu phân nhỏ nhất (266,4± 7,1 nm) với phân bố kích thước tiểu phân trong khoảng hẹp (PDI = 0,292 ± 0,080) vàhiệu suất phytosome hóa cao nhất (95,61 ± 0,24 %). Kết quả nghiên cứu phổ FT-IR,DSC và XRD khẳng định sự hình thành phức hợp giữa rutin và phospholipid 61.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Năm 2020, Nguyễn Hồng Trang đã nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằngphương pháp bốc hơi dung môi với tỷ lệ quercetin:HSPC:cholesterol (mol:mol:mol) là1:1:0,2, xây dựng quy trình bào chế phytosome quercetin ở quy mô 500 g/mẻ.Phytosome quercetin bào chế có tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa trên 90 %, các tiểuphân thu được có kích thước từ 450 - 500 nm, phân bố kích thước đồng đều với giá trịPDI < 0,4, ổn định trong 6 tháng theo dõi ở cả điều kiện thực và lão hóa cấp tốc 62.

1.2.6.2. Một số nghiên cứu về phytosome trên thế giới

Huizhen Wang và cộng sự (2015) đã nghiên cứu bào chế phytosome với cao

chiết hắc mai biển (Hippophae rhamnoiedes) nhằm nâng cao SKD đường uống của

flavonoid (quercetin, keampferol, isorhamnetin) trong cao theo phương pháp bốc hơidung môi như sau: PL và cao (tỷ lệ 1:1 kl/kl) hòa tan trong 100 ml tetrahydrofuran, hỗnhợp được khuấy trộn trong bình cất quay ở điều kiện 20 oC trong 1 giờ để tạo phức. Sauđó dung môi được bốc hơi dưới áp suất giảm tạo lớp film. Phytosome được nghiền vàrây qua rây 80 mesh. Sự tạo phức giữa PL và flavonoid trong cao được chứng minh bằngphổ IR, XRD, DCS. Hiệu suất phytosome hóa của isorhamnetin, keampferol, quercetinlần lượt là 97,7 %, 95,97 % và 92,23 %. Độ tan trong nước của flavonoid trongphytosome thu được tăng từ 22,0 đến 26,8 lần so với cao thông thường. Độ hịa tan trongmơi trường Tween-80 0,5% của isorhamnetin, keampferol, quercetin trong phytosomelà 84,32 %, 90,77 % và 100 % trong 10 phút. Sinh khả dụng đường uống khi thử nghiệmtrên chuột với liều tương ứng 60 mg/kg tổng flavonoid tăng 223 %, 172 %, và 242 %tương ứng với isorhamnetin, keampferol, quercetin trong phytosome so với cao thôngthường. Như vậy, dạng phytosome tăng độ tan và tốc độ hòa tan của thành phần

flavonoid trong cao hắc mai biển (Hippophae rhamnoiedes) cũng như cải thiện SKD

đường uống so với dạng cao thông thường 63.

Amisha Kamlesh Vora và cộng sự (2015) tiến hành bào chế phytosome với caolựu chuẩn hóa (chứa 30% punicalagin) theo phương pháp phun sấy: PC và cao lựu chuẩnhóa (tỷ lệ mol PC : punicalagin là 2 : 1) hoà tan trong hỗn hợp dung môi dioxan -methanol trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng kết hợp với khuấy trộn để tạo phức. Sau đó phứcđược tách bằng phương pháp phun sấy hỗn hợp phản ứng. Sự tạo phức giữa PL và caolựu được chứng minh thông qua phổ IR, XRD, DSC; hiệu suất quy trình 75 %, hiệu suất

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

phytosome hóa là 99,7 % (tính theo hàm lượng punicalagin). Độ tan của punicalagintrong n-octanol tăng từ 0,005 mg/ml với cao lựu chuẩn hóa đến 0,26 mg/ml vớiphytosome, chứng tỏ sự tạo phức với PC đã làm tăng độ tan của punicalagin trong lipid.

Nghiên cứu độ hòa tan in vitro của punicalagin trong cao nguyên liệu và phytosome ở

môi trường dịch dạ dày mô phỏng không chứa pepsin trong 2 giờ hoặc môi trường dịchruột mơ phỏng trong 8 giờ đều cho thấy độ hịa tan của punicalagin trong phytosome rấtthấp (khoảng 3,04 %) so với cao lựu chuẩn hóa (gần 100 %) điều này cho thấypunicalagin hạn chế giải phóng trong mơi trường tiêu hóa bởi sự tạo phức với PC nêntránh được q trình chuyển hóa bởi vi khuẩn trong đường tiêu hóa, do đó tăng sinh khả

dụng của punicalagin. Đánh giá khả năng làm tăng tính thấm ex vivo trên ruột non cô

lập cho thấy dạng phytosome làm tăng thấm gấp 2 lần so với dạng cao nguyên liệu. Nhưvậy, sự tạo phức giữa PL và cao lựu chuẩn hóa vừa làm tăng độ tan trong lipid, tăng tínhthấm và tăng khả năng bảo vệ punicalagin trước sự chuyển hóa trong đường tiêu hóacủa punicalagin, vì vậy làm tăng sinh khả dụng đường uống của punicalagin trong caolựu chuẩn hóa 64.

Suprit D. Saoji và cộng sự (2016) đã tiến hành bào chế phức hợp của HSPCvới cao chuẩn rau má (chứa 30 % triterpen) theo phương pháp bốc hơi dung môi nhưsau: cao chuẩn rau má và PL hòa tan với 40 ml ethanol trong bình cầu. Hỗn hợp đượckhuấy trộn trong điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp để tạo phức. Sau đó dung mơiđược bay hơi dưới điều kiện áp suất giảm đến thể tích 2-3 ml, lượng dư n-hexanđược thêm vào đồng thời với khuấy trộn thu được tủa phytosome, sau đó sản phẩmđược làm khô loại bỏ dung môi tồn dư. Sự tạo phức hợp giữa HSPC và cao chuẩn raumá được chứng minh bằng phổ IR, XRD, DSC. Phytosome với tỷ lệ HSPC: cao chuẩnrau má là 3:1 (kl/kl), thời gian phản ứng 3 giờ, nhiệt độ 60 oC đạt hiệu quả tạo phứccao nhất là 93,9 ± 1,3 %, KTTP 450 ± 20,0 nm, thế zeta -35,0 ± 1,0 mV. Phức hợpthu được tăng độ tan của triterpen trong nước gấp 12 lần (98,0 ± 1,4 μg/mL) so với

cao (13,6 ± 0,4 μg/mL). Độ hòa tan in vitro của phức hợp (99,2 ± 4,7 %) tăng lên

đáng kể so với cao nguyên liệu (39,2 ± 2,3 %) trong 12 giờ. Khả năng cải thiện tính

thấm ex vivo trên ruột non chuột cô lập tăng từ 26,8 ± 2,4 % với cao chuẩn lên 82,8± 3,7 % với phức hợp. Nghiên cứu tác dụng in vivo đến khả năng ghi nhớ trên chuột

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

(22 - 24 tháng tuổi) cho thấy cải thiện rõ rệt khi sử dụng dạng phức. Như vậy, dạngphức hợp với cao chuẩn rau má không chỉ tăng độ tan trong nước, tốc độ hịa tan, cảithiện tính thấm, mà còn tăng hiệu quả điều trị của cao chuẩn rau má 65.

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu và hoá chất

Các nguyên liệu và hố chất được sử dụng, mục đích sử dụng và tiêu chuẩn chấtlượng được trình bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hoá chất sử dụng trong bào chế và kiểm nghiệm

7 Methanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích8 Methanol HPLC Merk – Đức Tinh khiết cho HPLC9 Acetonitril Merk – Đức Tinh khiết cho HPLC10 Acid acetic Merk – Đức Tinh khiết cho HPLC11 Nước khử khoáng Việt Nam Tinh khiết cho HPLC

2.1.2. Máy móc và thiết bị

Bảng 2.2. Danh mục thiết bị sử dụng trong bào chế và kiểm nghiệm

4 Máy khuấy từ gia nhiệt SCI280 Scilogex Mỹ

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

5 Máy xác định kích thước hạt và thế zeta

6 Hệ thống HPLC - PDA Water 2895e Water Mỹ

7 Kính hiển vi điện tử quét (SEM)

9 Máy đo quang phổ hồng ngoại Frontier

10 Máy phân tích nhiệt vi sai DSC 204 F1 NETZSCH Đức11 Hệ thống cô quay chân không 4001 Heidolph Đức

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidintrong phytosome cao vỏ bưởi bằng HPLC

Để xác định được hàm lượng naringin và nelitidin (sau đây gọi là hoạt chất) trongphytosome cao vỏ bưởi, đề tài tiến hành xây dựng và thẩm định 2 quy trình: quy trìnhđịnh lượng hoạt chất tồn phần (bao gồm hoạt chất dạng tự do và hoạt chất trong phứchợp phytosome) và quy trình định lượng hoạt chất dạng tự do, từ đó có thể xác địnhđược lượng hoạt chất trong phức hợp phytosome bằng hiệu số giữa hàm lượng hoạt chấttoàn phần và hàm lượng hoạt chất dạng tự do.

2.2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký

Chương trình rửa giải: khai triển trên mẫu thử, khảo sát chế độ rửa giải đẳng môi

hay gradient sao cho pic của hoạt chất tách rõ so với peak kế cận, ngoài ra peak cần địnhlượng phải đạt các thông số sắc ký như độ tinh khiết peak, hệ số kéo đuôi (As), độ phângiải, hệ số dung lượng, số đĩa lý thuyết…

Chương trình rửa giải khảo sát 1 được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.3. Chương trình rửa giải khảo sát 1

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Nhiệt độ cột: triển khai trên mẫu thử với chương trình rửa giải và tốc độ dịng đã

được lựa chọn ở các nhiệt độ cột là 30 oC, 35 oC và 40 oC.

2.2.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Đối với quy trình định lượng hoạt chất tồn phần

- Khảo sát dung mơi hịa tan mẫu: Cân chính xác khoảng 0,0500 g mẫu phytosome vào

bình định mức 10 ml, thêm khoảng 8 ml dung môi khảo sát (MeOH 100%, nước, Ethanoltuyệt đối, Acetonitril, MeOH : H2O tỷ lệ 9:1, MeOH : H2O tỷ lệ 7:3), lắc đều hoà tan,thêm dung mơi đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,22 µm trước khi phân tích trên hệ thốngHPLC theo điều kiện đã chọn. Với mỗi dung môi khảo sát cần tiến hành lặp lại 2 lần đểghi nhận kết quả giá trị diện tích pic trung bình, so sánh các kết quả và đưa ra lựa chọndung mơi hịa tan mẫu tốt nhất cho các chất định lượng.

- Khảo sát phương pháp hồ tan mẫu: Cân chính xác khoảng 0,0500 g mẫu phytosome

vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 8 ml methanol, tiến hành thực hiện các phươngpháp hòa tan mẫu khác nhau bao gồm: lắc đều hòa tan, siêu âm, khuấy từ và sử dụngmáy Vortex, sau đó thêm methanol đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,22 µm trước khi phântích trên hệ thống HPLC theo điều kiện đã chọn. Với mỗi phương pháp khảo sát cần tiếnhành lặp lại 2 lần để ghi nhận kết quả giá trị diện tích pic trung bình, so sánh các kết quảvà đưa ra lựa chọn phương pháp chiết xuất tốt nhất cho các chất định lượng.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

- Khảo sát thể tích dung mơi hịa tan mẫu: Cân chính xác khoảng 0,0500 g mẫu

phytosome vào bình định mức với các mức thể tích khảo sát khác nhau (5 ml, 10 ml và20 ml), thêm một lượng methanol phù hợp, lắc đều hoà tan, thêm methanol đến vạch.Lọc qua màng lọc 0,22 µm trước khi phân tích trên hệ thống HPLC theo điều kiện đãchọn. Với mỗi phương pháp khảo sát cần tiến hành lặp lại 2 lần để ghi nhận kết quả giátrị diện tích pic trung bình, so sánh các kết quả và đưa ra lựa chọn thể tích dung mơi hịatan mẫu tốt nhất cho các chất định lượng.

Đối với quy trình định lượng hoạt chất dạng tự do

- Khảo sát khối lượng mẫu thử: Cân chính xác khoảng một lượng mẫu phytosome tương

ứng với khối lượng 0,010 g, 0,020 g và 0,050 g vào cốc có mỏ, thêm chính xác 10 mlnước, khuấy từ cho phân tán hoàn toàn. Ly tâm trong 30 phút với tốc độ 5000 vòng/phút.Lọc qua màng lọc 0,22 µm trước khi phân tích trên hệ thống HPLC theo điều kiện đãchọn. Với mỗi mức khối lượng khảo sát cần tiến hành lặp lại 2 lần để ghi nhận kết quảgiá trị diện tích pic trung bình, so sánh các kết quả và đưa ra lựa chọn khối lượng mẫuthử tốt nhất cho các chất định lượng.

2.2.1.3. Thẩm định quy trình định lượng

Tính tương thích hệ thống

Mục đích: Đảm bảo hệ thống sắc ký HPLC-PDA có hiệu năng phù hợp để xác định độ

phân giải và độ lặp lại đối với phép phân tích.

Tiến hành: Triển khai lặp lại 6 lần dung dịch mẫu thử theo điều kiện đã khảo sát. Ghi

nhận các thông số theo yêu cầu ở Bảng 2.3.

Bảng 2.4. Các thông số sắc ký và yêu cầu theo hướng dẫn ICH

Mục tiêu: Đảm bảo hệ thống sắc ký có khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích

khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

Tiến hành: Tiêm các dung dịch mẫu trắng, hỗn hợp các chất chuẩn, mẫu thử và mẫu thử

thêm chuẩn phân tích trên hệ thống sắc ký theo điều kiện đã khảo sát. Ghi nhận và sosánh các sắc ký đồ, thời gian lưu của các mẫu trên.

Mục tiêu: Nhằm thể hiện kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng

nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử.

Tiến hành: Pha 6 dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần trong khoảng 80 – 120 % so với

nồng độ mẫu thử. Tiến hành sắc ký các dung dịch này, ghi nhận kết quả sắc ký đồ vàcác thơng số cần thiết để xác định phương trình hồi quy, hệ số tương quan tuyến tínhgiữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu. Kết quả này được đánh giá bằng phương pháp thốngkê theo phương pháp bình phương tối thiểu, phương trình y = ax + b.

Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính R2 ≥0,995, sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tratính thích hợp của phương trình hồi quy và trắc nghiệm t kiểm tra ý nghĩa của các hệ sốcủa phương trình này.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Mục tiêu: Xác định hàm lượng thấp nhất của các chất phân tích trong mẫu thử có thể

phát hiện được (giới hạn phát hiện - LOD) và có thể xác định được độ đúng và độ lặplại phù hợp (giới hạn định lượng - LOQ).

Tiến hành: Mẫu đối chiếu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và phân tích ở điều

kiện sắc ký đã lựa chọn. Xác định các thông số S và N, thiết lập tỷ số S/N, trong đó Slà tín hiệu chiều cao của pic đối chiếu trong dung dịch chuẩn, N là tín hiệu chiều caocủa nhiễu đường nền.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Yêu cầu: LOD có tỷ số S/N là 2/1 hoặc 3/1; LOQ được suy ra từ giá trị LOD với tỷ số

của S/N là 9/1 hoặc 10/1.

Độ lặp lại

Mục tiêu: Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và trong khoảng thời

gian ngắn, cụ thể là việc tiến hành thử nghiệm được thực hiện bởi một người trong cùngmột phịng thí nghiệm, cùng một trang thiết bị và trong cùng một thời gian.

Tiến hành: Triển khai 6 mẫu thử khác nhau, mỗi mẫu thực hiện bởi một người một lần

trong cùng ngày, cùng phịng thí nghiệm, cùng một hệ thống UPLC theo điều kiện sắcký đã khảo sát.

Độ chính xác liên ngày

Mục tiêu: Biểu thị độ chính xác của quy trình theo các biến số của phịng thí nghiệm tại

các ngày khác nhau (độ chính xác liên ngày).

Tiến hành: Tiến hành với 6 mẫu thử khác nhau, so sánh kết quả thực hiện trong cùng

một phịng thí nghiệm nhưng khác ngày.

Độ đúng

Mục tiêu: Là mức độ khảo sát gần của các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng

quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trong cùng điều kiệnxác định.

Tiến hành: Chuẩn bị 3 loại mẫu bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn

naringin, melitidin ở các mức nồng độ khác nhau vào các mẫu thử. Tại mỗi mức nồngđộ, thức hiện lặp lại ít nhất 3 mẫu độc lập. Tiến hành phân tích sắc ký theo điều kiện đãkhảo sát. Công thức xác định độ đúng (tỷ lệ thu hồi):

Độ đúng/Tỷ lệ thu hồi (%) = Hàm lượng hoạt chất đo được

Ứng dụng quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin

Áp dụng quy trình định lượng đã xây dựng và thẩm định để xác định hàm lượngnaringin và melitidin toàn phần và dạng tự do trong mẫu thử phytosome theo cơng thức:

X = St

Sc× Cc×k

m(1 − h)× p × 100

Trong đó:

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

X : hàm lượng naringin hoặc melitidin trong mẫu thử (%)St : diện tích pic naringin hoặc melitidin của mẫu thửSc : diện tích pic naringin hoặc melitidin của mẫu chuẩnCc : nồng độ của mẫu chuẩn (mg/mL)

k : độ pha loãng mẫu thửm : khối lượng mẫu thử (mg)h : độ ẩm của mẫu thử (%)

p : độ tinh khiết của chất đối chiếu (%)

2.2.2. Nghiên cứu bào chế phytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mơ phịng thí nghiệm2.2.2.1. Xây dựng cơng thức và quy trình điều chế phytosome chứa cao vỏ bưởi ởquy mơ phịng thí nghiệm

Cân cao vỏ bưởi và phospholipid với tỷ lệ hoạt chất : PL (kl/kl) từ 1:1 đến 1:5, hoàtan trong dung mơi ethanol tuyệt đối. Chuyển vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệthống cô quay. Tiến hành cô quay hỗn hợp này với các mức tốc độ 50, 100 hoặc 150vòng/phút) ở nhiệt độ từ 60 đến 80 oC, thời gian từ 3 đến 5 giờ. Sau đó loại dung môibằng cách cô quay dưới áp suất 100 mbar với tốc độ quay bằng với tốc độ khi thực hiệnphản ứng tạo phức, nhiệt độ bằng với nhiệt độ phản ứng trong vòng 1 giờ. Phytosomesau khi được tạo thành được sấy bằng tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC trong vịng 8 giờ, sau đóđược bảo quản trong bình kín tránh ánh sáng, ở nhiệt độ phịng. Các công thức khảo sátphức hợp cao vỏ bưởi và phospholipid được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.5. Các cơng thức khảo sát phức hợp cao vỏ bưởi và phospholipid

2.2.2.2. Đánh giá một số đặc tính của phytosome từ cao vỏ bưởi.

- Kích thước tiểu phân trung bình (nm) và chỉ số đa phân tán (polydispersity index –PDI)

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Giá trị kích thước tiểu phân trung bình và chỉ số đa phân tán được xác định dựa vàocơ chế tán xạ ánh sáng động trên thiết bị ZS Zen 3600 có đèn laser 35 mW. Cân khoảng0,1 g phytosome cho vào cốc có mỏ, thêm vào cốc có mỏ 100 ml, phân tán mẫu bằngcách khuấy từ với tốc độ khuấy 500 vòng/phút trong vòng 15 phút. Để đạt được mật độtiểu phân phù hợp, mẫu được pha loãng 50 lần bằng nước cất 2 lần trước khi đo. Tiếnhành đo ở nhiệt độ 25 oC, góc tán xạ cố định 173o. Kết quả được xác định là giá trị trungbình của 3 lần đo lặp lại.

- Thế Zeta

Thế zeta cũng được xác định trên thiết bị ZS Zen 3600, dựa vào tần số dịch chuyểncủa ánh sáng laser. Cân khoảng 0,1 g phytosome cho vào cốc có mỏ, thêm vào cốc cómỏ 100 ml, phân tán mẫu bằng cách khuấy từ với tốc độ khuấy 500 vòng/phút trongvòng 15 phút. Mẫu được pha loãng 50 lần bằng dung dịch KCl 1 mM trước khi đo. Tiếnhành đo ở nhiệt độ 25 oC, góc tán xạ cố định 90o. Kết quả được xác định là giá trị trungbình của 3 lần đo lặp lại.

- Đánh giá khả năng tạo phức giữa cao vỏ bưởi và PL trong phytosome

* Phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Tiến hành quét phổ IR đối với các mẫu: PL; cao vỏ bưởi; hỗn hợp vật lýcủa cao vỏ bưởi và PL; phytosome cao vỏ bưởi.

Lấy khoảng 5 – 10 mg mẫu đã làm khô, trộn đều và nghiền mịn với KBr, khi đượchỗn hợp đồng nhất đem dập thành viên mỏng. Tiến hành quét phổ với viên nén thu được.

* Phân tích nhiệt lượng vi sai quét

Tiến hành thực nghiệm đối với các mẫu: PL; cao vỏ bưởi; hỗn hợp vật lý giữa caovỏ bưởi và PL; phytosome cao vỏ bưởi.

Cân khoảng 5 - 10 mg mẫu đã làm khơ, cho vào đĩa nhơm, hàn kín, đưa vào buồngmáy, sử dụng một đĩa nhôm trắng để làm mẫu so sánh và nắp được đục 2 lỗ để phânbiệt. Dùng kẹp đưa 2 đĩa nhôm vào buồng gia nhiệt, khoảng nhiệt độ khảo sát từ 25 –250 oC với tốc độ gia nhiệt là 10 oC/phút. Lưu lượng khí nitrogen 40 ml/phút.

- Đánh giá hiệu suất phytosome hoá

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Định lượng hoạt chất (naringin và melitidin) toàn phần (hoạt chất dạng tự do vàhoạt chất trong phức hợp phytosome): Cân chính xác khoảng 0,0500 g mẫu phytosomevào bình định mức, thêm khoảng 8 ml methanol, lắc đều hoà tan, thêm methanol đếnvạch. Lọc qua màng lọc 0,22 µm trước khi phân tích trên hệ thống HPLC theo điều kiệnđã chọn.

Định lượng hoạt chất dạng tự do: Cân chính xác khoảng một lượng mẫu phytosomecho vào cốc có mỏ, thêm chính xác 10 ml nước, khuấy từ cho phân tán hoàn toàn. Lytâm trong 30 phút với tốc độ 5000 vịng/phút. Dịch nổi phía trên được lọc qua màng lọc0,22 µm trước khi phân tích trên hệ thống HPLC theo điều kiện đã chọn.

Hiệu suất phytosome hóa (%) = 𝑚1−𝑚2

𝑚1 × 100%Trong đó:

- m1: tổng hàm lượng naringin và melitidin trong mẫu thử

- m2: tổng hàm lượng naringin và melitidin tự do trong mẫu thử không tạo phức với PL.

</div>