nghiên cứu bào chế và thiết lập tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc từ dược liệu tam thất chế

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.44 MB, 101 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:TS. LÊ THỊ HỒNG VÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết quả nêu trongluận văn là trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Vũ Trường

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Luận văn thạc sĩ – khóa 2020-2022

Chun ngành: Cơng nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO ĐẶCTỪ DƯỢCLIỆU TAM THẤT CHẾ

Mã số: 8720202Nguyễn Vũ Trường

Người Hướng Dẫn: TS. LÊ THỊ HỒNG VÂNĐặt vấn đề

Tam thất là một loại dược liệu quý đã được chứng minh qua các cơng trình nghiêncứu khoa học, đặc biệt là Tam thất chế (Tam thất được hấp ở nhiệt độ cao) đã đượcnghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư. Đồng thời, nghiên cứu về Tam thất chếtại Việt Nam chưa có nhiều. Vậy nên, đề tài này được đề xuất nghiên cứu bào chế vàtiêu chuẩn hoá cao đặc từ dược liệu Tam thất chế. Nghiên cứu sẽ là nền tảng pháttriển các chế phẩm từ Tam thất chế.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng: Tam thất chế (Processed Panax notoginseng) được cung cấp bởi đề tài

của nhóm nghiên cứu đạt tiêu chuẩn cơ sở về các chỉ tiêu: mô tả, soi bột, tro tồnphần, độ ẩm, định tính và định lượng thành phần saponin (G-Rg1, G-Rd, G-Rb1, N-R1 và G-Rg3).

Phương pháp nghiên cứu: Kiểm tra nguyên liệu Tam thất chế, tối ưu hóa cơng thức

quy trình bào chế cao đặc Tam thất chế bằng việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đếnkết quả chiết cao Tam thất là loại dung môi, tỷ lệ dung môi và dược liệu, số lần chiết,và thời gian chiết. Sau đó, sử dụng phần mềm tối ưu hóa Design – Expert v 12.0 đểxuất điều kiện chiết cao và dự đốn tính chất cao Tam thất chế. Từ đó thực nghiệm lại đánhgiá cơng thức tối ưu. Cuối cùng cao đặc Tam thất chế được xây dựng tiêu chuẩn cơ sở vớitiêu chuẩn độ ẩm, độ tro toàn phần, giới hạn kim loại, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính vàđịnh lượng.

Kết quả: Quy trình chiết cao đặc Tam thất chế sử dụng ethanol 80% làm dung môi chiết

cao, tỷ lệ dược liệu (kl) : dung môi (tt) là 1:10, số lần chiết: 2 lần, với thời gian chiết là 3giờ/lần. Cao đặc Tam thất chế đã được thiết lập TCCS và đã được thẩm định bởi viện Kiểmnghiệm thuốc Tp. HCM. Chỉ tiêu định lượng đã được thiết lập bằng phương phápHPLC/PDA với tổng hàm lượng của 5 thành phần chính G-Rg1, G-Rd, G-Rb1, G-Rh1và G-Rg3.

Kết luận: Nghiên cứu đã xây dựng thành cơng quy trình chiết cao đặc Tam thất chế và đã

xây dựng được TCCS. Cao đặc Tam thất chế với TCCS được thiết lập đáp ứng đượctiêu chuẩn cho một cao chiết dược liệu để phát triển các chế phẩm liên quan.

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Master's thesis - course 2020-2022

Specialization: Pharmaceutical Technology and Drug Preparation

RESEARCH ON THE PREPARATION AND HIGH STANDARDIZATION

OF PHARMACEUTICAL MATERIALS EXTRACTED FROM PANAXNOTOGINSENG

Code: 8720202Nguyen Vu Truong

Instructor: Dr. LE THI HONG VANIntroduction

Sanqi (Panax notoginseng) is a valuable medicinal herb that has been proven through

scientific research, especially Sanqi extract (Sanqi steamed at high temperature),which has been studied for its ability to inhibit cancer cells. However, there have beenlimited studies on Sanqi extract in Vietnam. Therefore, this research proposal aims tostudy the formulation and standardization of high-concentration products derivedfrom Sanqi extract. The research will serve as a foundation for the development ofproducts from processed Sanqi extract.

Materials and methods

Materials: Sanqi extract (Processed Panax notoginseng) provided by the research

group, meeting basic criteria including description, powder examination, total ash,moisture content, qualitative and quantitative analysis of saponin components (G-Rg1, G-Rd, G-Rb1, N-R1, and G-Rg3).

Methods: Inspecting the Sanqi extract raw material, optimizing the formulation of

the high-concentration Sanqi extract process by studying factors that influence theextraction results, such as the type and ratio of solvent and raw material, number ofextractions, and extraction time. Afterwards, using Design - Expert v 12.0 optimization

software to export the extract conditions and predict the properties of the steamed Panaxnotoginseng extract. From there, experiment again to evaluate the optimal formula. Finally,the steamed Panax notoginseng extract is built with basic standards with humidity, total

ash, metal limits, bacterial contamination limits, qualitative and quantitative.

Results: The process of extracting high-concentration Sanqi using 80% ethanol as the

solvent, with a ratio of herbal material:solvent of 1:10 (w/v), two extraction rounds,and an extraction time of 3 hours per round. The concentrated Sanqi extract has beenestablished according to the Vietnamese Pharmacopoeia and validated by the DrugTesting Institute of Ho Chi Minh City. The quantification criteria have beenestablished using the HPLC/PDA method, with the total content of the 5 maincomponents G-Rg1, G-Rd, G-Rb1, G-Rh1, and G-Rg3.

Conclusion: The study has successfully developed the process of producing

high-concentration Sanqi extract and established the Vietnamese Pharmacopoeia. Theconcentrated Sanqi extract with the Vietnamese Pharmacopoeia meets the standardsfor a herbal extract to develop related products.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

1.1. Tổng quan về Tam thất ... 3

1.2. Tổng quan về Tam thất chế ... 13

1.3. Tổng quan về cao chiết ... 21

1.4. Tổng quan về chiết xuất ... 22

1.5. Tổng quan về tối ưu hóa quy trình chiết xuất ... 24

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 28

2.1. Đối tượng nghiên cứu... 28

2.2. Dung mơi, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ... 28

2.3. Phương pháp nghiên cứu ... 29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ... 42

3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết cao đặc Tam thất chế ... 42

3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao đặc từ Tam thất chế. ... 52

3.3. Đề xuất tiêu chuẩn cho cao đặc Tam thất chế ... 54

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ... 60

4.1. Tối ưu quy trình chiết cao đặc từ Tam thất chế ... 60

4.2. Tiêu chuẩn cơ sở của cao đặc từ Tam thất chế ... 62

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 65

5.1. Kết luận ... 65

5.2. Kiến nghị ... 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 67

PHỤ LỤC ... 73

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

-DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Dung mơi, hóa chất được sử dụng nghiên cứu. ... 28

Bảng 2.2. Thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu ... 28

Bảng 2.3. Chất chuẩn được sử dụng trong nghiên cứu ... 29

Bảng 2.4. Mơ hình thực nghiệm khảo sát chiết xuất cao Tam thất chế ... 30

Bảng 2.5. Các biến phụ thuộc trong thiết kế thực nghiệm ... 35

Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất chiết cao của các công thức khảo sát... 44

Bảng 3.2. Kết quả hiệu suất chiết các ginsenosid của các công thức khảo sát ... 45

Bảng 3.3. Biến phụ thuộc trong thiết kế nghiên cứu ... 46

Bảng 3.4. Biến độc lập trong thiết kế nghiên cứu. ... 46

Bảng 3.5. Không gian thực nghiệm và kết quả của từng thực nghiệm... 47

Bảng 3.6. Hàm lượng các ginsenoside trong cao đặc Tam thất chế của thực nghiệmkiểm chứng. ... 51

Bảng 3.7. Tổng kết kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết cao đặc từ Tam thất chế ... 51

Bảng 3.8. Kết quả đo độ ẩm cao đặc từ Tam thất chế ... 52

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ tro toàn phần cao đặc từ Tam thất chế... 52

Bảng 4.1. So sánh tiêu chuẩn của Tam thất trong các Dược điển ... 63

Bảng 5.1. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở của cao đặc Tam thất chế ... 65

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Tồn cây (A) và rễ củ (B) Tam thất 8 ... 4

Hình 1.2. Một số saponin chính có trong Tam thất ... 5Hình 1.3. Một số polyacetylen phân lập từ Tam thất ... 6Hình 1.4. Sự thay đổi thành phần saponin trong Tam thất qua quá trình chế biến 12.

... 13

Hình 1.5. Sự chuyển hóa các saponin trong q trình hấp Tam thất.3 ... 15

Hình 2.1. Lưu đồ quy trình bào chế đã được tối ưu hóa cao Tam thất ... 37Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn biến thiên hiệu suất chiết cao theo biến số quy trình

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen) hay còn gọi là Kim bất hoán, Nhân

sâm tam thất, Sâm tam thất là một dược liệu có nguồn gốc từ Trung Quốc, được sửdụng lâu đời ở các quốc gia Châu Á. Hiện nay, Tam thất được trồng chủ yếu ởWeshan, thuộc tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Rễ Tam thất được sử dụng trong Y họcnhờ khả năng cầm máu và tác dụng hỗ trợ hệ tim mạch trong hơn 400 năm qua. Đếnnay, vị thuốc này vẫn giữ một vai trò quan trọng trong Y học. Từ năm 1970, ViệtNam bắt đầu nhập trồng ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam như Sapa, Lào Cai, LaiChâu…1.

Saponin là thành phần hóa học chính trong Tam thất, trong đó các thành phần chính làG-Rg1, N-R1, G-Re, G-Rb1 và G-Rd.2 Trên thực tế, Tam thất có giá trị khơng kém Nhânsâm do có hàm lượng saponin cao hơn rất nhiều. Tương tự như Nhân sâm, Tam thất cóthể được sử dụng dưới dạng thô hoặc đã qua chế biến bằng cách hấp ở nhiệt độ cao.Qua quá trình chế biến, nhiều saponin mới đã được hình thành hay gia tăng hàm lượngnhư G-Rh1, G-Rg3, G-Rk1, G-Rg5,… Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Tam thất chếđược phân biệt với Tam thất thô bởi tác dụng bổ máu. Một số nghiên cứu gần đây chorằng Tam thất đã qua chế biến có nhiều tác dụng dược lý mạnh hơn Tam thất thô nhưchống kết tập tiểu cầu, chống đông máu, chống ung thư... Thơng qua q trình chế biến,nhiều saponin mới được hình thành và làm thay đổi tác dụng dược lý, trong đó,ginsenosid-Rg3 được cho là có hoạt tính mạnh nhất, đặc biệt là tác dụng kháng ung thưtrên nhiều dịng tế bào.3 Chính vì vậy, Tam thất chế được xem rất có tiềm năng tronghỗ trợ điều trị ung thư.

Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về Tam thất chế, các sản phẩm trên thị trườngchủ yếu từ ngun liệu Tam thất thơ. Vì vậy, việc phát triển các sản phẩm bào chế từTam thất chế là hướng nghiên cứu đầy tiềm năng. Trước đó, nhóm nghiên cứu củaTS. Lê Thị Hồng Vân đã xây dựng thành cơng quy trình bào chế Tam thất thành Tamthất chế và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu Tam thất chế. Để phát triển cácsản phẩm từ Tam thất chế, việc xây dựng quy trình bào chế cao chiết từ Tam thất chếvà xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao chiết từ Tam thất chế là việc hết sức cần thiết.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Do vậy, đề tài “Nghiên cứu bào chế và thiết lập tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc từ dượcliệu Tam thất chế”, được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu chính sau đây:

- Nghiên cứu tối ưu hố quy trình bào chế cao đặc từ Tam thất chế- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc từ Tam thất chế.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về Tam thất1.1.1. Danh pháp

Tên Việt Nam: Tam thất

Tên khoa học: Panax notoginseng (Buck) F.H.Chen, họ Araliaceae 4.

Tên đồng nghĩa: Panax pseudogiseng var. notoginseng (Burkill) G.Hoo &

Tên khác: Tam thất bắc, Kim bất hoán, Nhân sâm tam thất, Sâm tam thất.

1.1.2. Vị trí phân loại

Vị trí phân loại của Tam thất (Panax notoginseng) theo hệ thống phân loại thực vật

Takhtajan (2009) 5 như sau:Giới Thực vật (Plantae)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Cúc (Asteridae)

Liên bộ Thù du (Cornanae)Bộ Hoa tán (Apiales)

Họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

Chi Sâm (Panax)

Lồi Tam thất (Panax notoginseng)

1.1.3. Đặc điểm hình thái

Thân: Cây thân cỏ nhỏ, sống lâu năm. Phát triển đến chiều cao 30-60 cm. Thân cây

thẳng đứng, đơn giản, mọc thẳng và không phân nhánh.

Lá: Lá màu xanh đậm, phân nhánh từ thân, mọc vòng 3-4 lá một, cuống lá dài

3-6 cm, mỗi cuống có lá mang từ 3-7 lá chét hình mác dài 0,6 -1,2 cm. Cụm hoa hìnhtán mọc ở đầu cành mang hoa.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Hoa: Có hoa đơn tính, có hoa lưỡng tính, cùng tồn tại. Lá đài 5, màu xanh. Cánh hoa

5, màu xanh nhạt. Nhị 5. Bầu hạ hai ngăn.

Quả, hạt: Quả mọng hình thận, khi chín có màu đỏ, trong có hạt hình cầu.

Rễ: Rễ chính có hình nón hoặc hình trụ và dài từ 1-6 cm. Các rễ chính có màu

vàng nâu trên bề mặt, có một số nếp nhăn và vết rễ.

Thu hoạch: Tam thất được thu hoạch trước khi nở hoa vào mùa thu 6,7.

Hình 1.1. Toàn cây (A) và rễ củ (B) Tam thất 8

1.1.4. Thực trạng, phân bố

Dược liệu phát triển chủ yếu ở vùng núi Wenshan thuộc tỉnh Vân Nam (TrungQuốc). Tam thất có mơi trường sống hẹp, nằm khoảng 23,5 độ Bắc và104 độ Đơng, ở vùng có độ cao từ 1200-2000 m 7. Tại Việt Nam, Tam thất chủ yếuđược trồng ở tỉnh Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, … 6.

1.1.5. Thành phần hóa học1.1.5.1. Saponin

Tương tự các lồi thuộc chi Panax, Tam thất (P. notoginseng) có thành phần

học chính là các saponin hay còn gọi là ginsenosid thuộc khung cấu trúcprotopanaxadiol (PPD) và protopanaxatriol (PPT). Đặc biệt, hàm lượng ginsenosid

có trong Tam thất cao hơn hàm lượng trong Nhân sâm (P. ginseng) và sâm Mỹ (P.quinquefolius). Tuy nhiên, ginsenosid thuộc khung ocotillol và acid oleanolic hầu

như chưa được phát hiện trong Tam thất 9.

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Thành phần ginsenosid chính có trong rễ củ Tam thất là G-Rg1, N-R1, G-Re,G-Rb1 và G-Rd. Hàm lượng các ginsenoid này khác nhau tùy vào từng bộ phận củacây Tam thất. Ginsenosid-Rg1 chủ yếu có mặt ở rễ củ và thân rễ, G-Rb1 có nhiềutrong nụ hoa, trong khi đó, G-Rb1 có mặt ở tất cả các bộ phận 10. Đáng chú ý, hàmlượng notoginsenosid-R1 trong Tam thất rất cao, xấp xỉ 1,1% (khối lượng/ khối lượng

dược liệu khô). Bên cạnh đó, tỷ lệ G-Rb1/ G-Rg1 cũng khác nhau giữa P. ginseng,P. quinquefolius, P. notoginseng. Tỷ lệ này là 1-3 ở P. ginseng và P. notoginseng,lớn hơn hoặc bằng 10 ở P. quinquefolius 11. G-Rb1, G-Rg1 và N-R1 thường đượcchọn làm thành phần tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của Tam thất 12.

Rễ củ Tam thất chứa các polysaccharid khung heteroglycan với khối lượng phântử từ 37-760 kD, cấu tạo từ glucose, galactose, arabinose, mannose và xylose với cáctỷ lệ mol khác nhau 13; 1,4-β-D-galactan, 1,5-α-L-arabinan và arabinogalactan,

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

rhamnogalacturonan với dây nhánh 1,4-β-D-galactan và 1,5/1,3,5-α-L-arabinan 14.Polysaccharid với khung arabinogalactan cũng đã được phân lập từ hoa của

P. notoginseng 15.

1.1.5.3. Polyacetylen

Phân tích các thành phần hóa học từ dịch chiết ether dầu hỏa thu được 2 hợp chấtpolyacetylen chính là panaxynol và panaxydiol.. Trong đó, panaxynol và panaxydioltuy chỉ chiếm 0,01% và 0,033% về hàm lượng nhưng lại thể hiện tác dụng ức chế

Staphylococcus aureus đáng kể 16.

1.1.5.4. Flavonoid

Nhìn chung, có rất ít ﬂavonoid từ P. notoginseng, hầu hết chúng tồn tại ở dạng

ﬂavonols 17. Hàm lượng flavonoid trong hoa cao hơn rễ cây, chiếm 1,43%18.

Lần đầu tiên Wei và cộng sự đã phân lập được quercetin và quercetin glycosid từ

rễ con của P. notoginseng. Sau đó, một số flavonoid khác cũng đã được phân lập từthân và rễ của loài cây này: kaempferol, kaempferol-7-O-α-L-rhamnosiosid,kaempferol-3-O-β-D-galactosid, kaempferol 3-O-(2″-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid và quercetin-3-O-(2″-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid,quercetin-3-O-β-D-xylopyranosyl-β-D-galactopyranosid 7,19,20. Nụ hoa của Tam thất

cũng đã được báo cáo là có chứa kaempferol‐3‐O‐α‐L‐rhamnosid vàkaempferol‐3‐O‐(2″,3″‐di‐E‐p‐coumaroyl)‐α‐L‐rhamnosid 21.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Trong những năm qua, phương pháp điều trị ung thư là phẫu thuật cắt bỏ, xạtrị, hóa trị liệu và những nỗ lực trong phát triển liệu pháp gen, liệu pháp miễn dịch.Tuy nhiên, mỗi phương pháp điều trị đều có những mặt hạn chế. Để giảm thiểu bệnhung thư và tử vong do ung thư, người ta quan tâm nhiều hơn tới việc phòng ngừa ungthư bằng các biện pháp như thay đổi lối sống và việc sử dụng các sản phẩm có nguồngốc từ dược liệu có tác dụng phịng chống ung thư. Tam thất là một loại thảo dượcđược sử dụng lâu đời tại Trung Quốc để ngăn ngừa ung thư. Gần đây, nhiều nghiêncứu đã chỉ ra rằng dịch chiết Tam thất ức chế sự phát triển và di căn của các dòng tế

bào ung thư khác nhau trên in vitro và in vivo. Tác dụng ức chế của dịch chiết Tam

thất liên quan đến khả năng diệt và ức chế tế bào ung thư phát triển và kích thích qtrình apoptosis 22. Qua q trình chế biến, thành phần saponin của Tam thất thay đổi, đặc

biệt sự gia tăng của các thành phần saponin kém phân cực như G-Rg3 (R&S), G-Rh1(R&S), -Rk3, -Rh4, -Rk1 và -Rg5, các thành phần này đã được chứng minh có tác dụng

kháng ung thư mạnh hơn các thành phần saponin nguyên thủy, đặc biệt là G-Rg3.

Dịch chiết Tam thất đã được chứng minh có hoạt tính chống ung thư tiềm năngvới ung thư ruột kết 23-25, ung thư gan 26,27, ung thư phổi 28, lymphocytoma 29,30, ungthư tuyến tụy31, ung thư vú 32. Cơ chế chính có thể là ức chế sự tăng sinh tế bào vàgây ra apoptosis thông qua giảm biểu hiện Bcl-2 và kích hoạt con đường caspase-3

Tác dụng chống tăng sinh khối u của dịch chiết P. notoginseng chế biến bằng

cách hấp cho thấy hiệu quả hơn dạng chưa chế biến 34 ở tế bào ung thư đại trực tràngHCT-116 và có khả năng giảm các tác dụng phụ của doxorubicin 35,25.

Cao chiết saponin toàn phần từ Tam thất thể hiện độc tính mạnh đối với các tếbào ung thư ruột kết ở người (LoVo), tế bào ung thư biểu mô gan (SMMC-7721), tếbào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) và tế bào ung thư vú (MCF-7) 36-40.Những saponin này cịn có thể làm giảm sự tác động của các bệnh ác tính đối vớicơ thể cũng như phòng ngừa ung thư. Sự ức chế tăng sinh tế bào có thể là kết quả củaviệc ức chế pha S hoặc pha G/M2 của chu kỳ tế bào. Trong thí nghiệm trên tế bào

LoVo, ở liều 100 μg/mL và 500 μg/mL, cao chiết saponin toàn phần Tam thất

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

(hàm lượng khoảng 81,7%) làm tăng tỷ lệ tế bào chết từ 10,1% (ở nhóm chứng) lên35,7% và 40,9% 36.

1.1.6.2. Tác dụng chống oxy hóa

Chống oxy hóa là một tác dụng được nhắc đến khá nhiều của Tam thất. Tác

dụng chống oxy hóa trên in vitro của dịch chiết từ Tam thất được nghiên cứu trên các

phương pháp xét nghiệm chống oxy hóa khác nhau. Tam thất thể hiện khả năng tạophức chelat với ion kim loại cao, hoạt động quét các gốc tự do hydrogen peroxid, cácgốc hydroxyl cao và yếu hơn với superoxid anion và các gốc tự do DPPH. Những tácdụng chống oxy hóa của Tam thất có thể là một trong những nguyên nhân mà Tamthất có hiệu quả trong việc phòng và điều trị các bệnh về mạch máu 41. Trong nghiêncứu của Zhao và cộng sự, cao chiết nước của Tam thất thể hiện khả năng thu gommạnh các gốc tự do hydroxyl và hydrogen peroxid, do đó ức chế q trình peroxy hóalipid và bảo vệ màng tế bào 42. Arabinoglucogalactan cũng là một chất có hoạt tínhthu gom các gốc tự do DPPH mạnh với SC50 là 11,72 ± 0,91 μg/mL 43. Khả năng bảo

vệ tế bào não trước stress oxy của các saponin trong lá P.notoginseng cũng đã được

nghiên cứu 44. Kết quả cho thấy saponin toàn phần từ lá cây Tam thất làm giảm sựgiải phóng LDH do H2O2 gây ra trong tế bào hình sao ở vỏ não chuột. Thành phầnnày cũng bảo vệ các u nguyên bào thần kinh người (SH-SY5Y) trước các tổn thươngdo q trình oxy hóa gây ra.

1.1.6.3. Tác dụng kháng viêm

Có một số nghiên cứu cho thấy Tam thất có tác dụng chống viêm. Tam thấtthực hiện tác dụng chống viêm thông qua sự ức chế chức năng bạch cầu trung tínhbao gồm phân hủy, sản sinh các gốc superoxide và leukotriene B4, và giảm sản sinhoxyd nitric (NO) và prostaglandin PGE2, mà có thể là nhờ giảm sự biểu hiện củaiNOS và COX-2. Chiết xuất từ hoa của Tam thất ức chế đáng kể các quá trình sản

sinh của NO, PGE2, TNF-α và IL-1β trên các tế bào RAW264.7 bị kích thích bởi

LPS. Ngồi ra, chiết xuất từ hoa Tam thất cũng làm giảm biểu hiện của các 19 mRNA

và protein iNOS, COX-2, TNF-α và IL-1β trong tế bào RAW264. Cơ chế phân tử của

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

q trình này có liên quan đến ức chế phosphoryl hóa của các phân tử MAPK nhưERK1/2, JNK và p38 MAPK, và di chuyển của tiểu đơn vị NF-κB p65 vào trong nhântế bào41.

Cao chiết ethanol từ rễ Tam thất cho thấy tác dụng ức chế sản xuất TNF-α và

IL-6 do lipopolysaccharid (LPS) gây ra trên các đại thực bào RAW 264.7 phụ thuộc

nồng độ, cũng như làm giảm biểu hiện của mRNA mã hóa cho COX-2 và IL-1β.Ginsenosid-Rb1 và -Rg1 cũng ức chế sản xuất TNF-α của đại thực bào nhưng ở

mức độ thấp hơn so với cao chiết toàn phần 45. TNF-α và IL-1β cũng bị ức chế bởi

cao chiết n-butanol của rễ Tam thất trong thí nghiệm trên chuột bị viêm khớp 46.

Bên cạnh đó, cao chiết nước từ P. notoginseng có thể ức chế chức năng của bạch cầu

trung tính, làm giảm sản xuất NO và PGE2 trong đại thực bào phúc mạc chuột bịkích thích bởi LPS, làm giảm đáng kể tình trạng phù chân chuột do carrageenan 47.

1.1.6.4. Tác dụng trên hệ tim mạch

Saponin trong Tam thất có tác dụng bảo vệ các tế bào cơ tim khỏi quá trìnhapoptosis in vitro và cả in vivo thông qua việc kích hoạt đường truyền tín hiệuPI3K/AKT. Các saponin này cịn giúp cải thiện chức năng tim của chuột, biểu hiệnlà sự tăng phân suất tống máu và phân suất co rút thất trái, giảm kích thước thất tráiở cuối kỳ tâm trương và tâm thu 48.

Tam thất có tác dụng cầm máu trong y học dân gian và đã được chứng minhtrong y học hiện đại. Bôi bột dược liệu, cao cồn hay cao chiết saponin toàn phần lênvết thương ở đi chuột thí nghiệm giúp làm giảm thời gian chảy máu đáng kể 49,50.

Các 20(S)-PPD giúp làm giảm các mảng xơ vữa ở động mạch chủ chuột đến 41,3 %,

bên cạnh đó cũng làm giảm tình trạng viêm mạch máu do NF-κB51.

1.1.6.5. Tác dụng chống huyết khối

Huyết khối, một bệnh lý phức tạp, đề cập đến sự hình thành cục máu đông(huyết khối) trong tim hoặc mạch máu. Huyết khối tĩnh mạch sâu, huyết khối độngmạch (đột quỵ do thiếu máu cục bộ, nhồi máu cơ tim cấp tính, v.v.) và huyết khối vitrùng (đông máu nội mạch lan tỏa, ban xuất huyết giảm tiểu cầu, v.v.) tùy theo vị trí1.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Ở Hoa Kỳ, hơn 900.000 trường hợp xảy ra hàng năm và khoảng 30% trong số bệnhnhân đã khỏi tử vong mỗi năm 2. Bất kỳ yếu tố nào dẫn đến ứ máu, tăng đông máu vàrối loạn chức năng nội mô đều là những yếu tố nguy cơ cao khởi phát và phát triểnhuyết khối.

Tam thất đã được sử dụng theo truyền thống để cầm máu, làm ngừng chảymáu trong và ngoài, giảm sưng và đau, cũng như để làm tan huyết khối, loại bỏ ứ máuvà thúc đẩy tuần hoàn máu. Các nghiên cứu cũng cho thấy Tam thất có tác dụng cólợi cho hệ tim như giảm cholesterol trong máu, giảm huyết áp, điều trị các bệnh timmạch vành, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực Tam thất với liều 200 mg/kg ức chế đángkể quá trình kết tập tiểu cầu ở chuột bị tắc lâu ở động mạch não giữa. Kết tập tiểu cầugây ra bởi ADP trên in vitro cũng bị ức chế bởi Tam thất theo cách phụ thuộc vàonồng độ. Hơn nữa, Tam thất có thể làm tăng tính lưu động của màng tiểu cầu 41.

1.1.6.6. Các tác dụng khác

Một số tác dụng khác của Tam thất cũng đã được báo cáo như hoạt tính chốngtăng lipid máu, tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch, giúp điều hòa đường huyết,cải thiện chức năng thận, bảo vệ tế bào gan 7.

Bổ sung P. notoginseng vào chế độ ăn của chuột giúp cải thiện thành phần

lipid máu và làm giảm cholesterol toàn phần cũng như triglicerid 52,53. Saponin từTam thất có tác dụng tăng cường hấp thu glucose dưới sự kích thích của insulin, tăngcường biểu hiện và hoạt động của GLUT4 trong tế bào mỡ 3T3-L1 54. Saponin toàn

phần, saponin loại PPD, ginsenosid-Rh4, notogisenosid-K được phân lập từ P.notoginseng có khả năng tăng cường miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào chống

lại ovalbumin (OVA) ở chuột 55-58. Bên cạnh đó, β-D-galactopyranosid chiết xuất từ rễ cây Tam thất cho thấy tiềm năng trong việc

quercetin-3-O-β-D-xylopyranosyl-phòng ngừa hoặc hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer 20.

1.1.7. Độc tính của Tam thất

Có rất ít nghiên cứu báo cáo về độc tính của Tam thất, một vài tác dụng phụcủa Tam thất được ghi nhận trên sử dụng lâm sàng do việc sử dụng Tam thất khá phổ

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

biến Tang et al., 2012. Yin et al. (2014) báo cáo 4 bệnh nhân lớn tuổi (1 nam và 3 nữ)bị phát ban khi sử dụng cao chiết saponin của Tam thất dạng tiêm. Bốn bệnh nhânnày đều có cùng triệu chứng như nổi mụn mủ, sốt và tăng bạch cầu trung tính.

Dạng chưa chế biến của Tam thất được biết đến với tác dụng cầm máu và tácdụng trên tim mạch, được dùng để trị xuất huyết nội hoặc ngoại, loại bỏ máu ứ, cảithiện tuần hoàn máu, tiêu vết bầm và giảm xưng đau. Tuy nhiên, dạng chế biến bằngcách hấp được cho là dược liệu có tác dụng bổ dưỡng, sử dụng bổ máu, tăng sản xuấttế bào máu trong điều trị thiếu máu. Do dạng chưa chế biến và dạng chế biến bằngcách hấp thể hiện hoạt tính dược lý khác nhau, do vậy cần sử dụng cho đúng loại đểtránh các tác dụng phụ không đáng có. Sử dụng quá liều Tam thất có thể dẫn đến mộtsố tác dụng phụ như buồn nôn, nôn mửa và chảy máu mũi. Thêm vào đó, vì giá trịcao nên Tam thất thường cũng bị giả mạo. Một điều đáng lưu ý là chống chỉ định chophụ nữ mang thai 41.

1.1.8. Tác dụng và liều dùng của Tam thất trong y học cổ truyền

Trong y học cổ truyền, Tam thất có tính vị Cam, vị khổ, ơn. Vào kinh can, vị,để sử dụng Tán ứ chi huyết, tiêu sưng giảm đau. Chủ trị: Các loại chảy máu, nhất làchảy máu có ứ huyết như: Thổ huyết, khối huyết, nục huyết, tiểu tiện ra huyết, sưngđau do chấn thương, ngực bụng đau nhói.59

Ngày dùng từ 3 g đến 9 g, tán bột, uống mỗi lần từ 1 g đến 3 g. Dùng ngồi:Lượng thích hợp. 59

1.1.9. Các nghiên cứu trên lâm sàng

Tam thất từ lâu được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều công dụng, gầnđây, một số nghiên cứu lâm sàng đã được thực hiện nhằm chứng minh các tác dụngdược lý của Tam thất.

Phân tích tổng hợp từ 20 thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng đượcthực hiện trên 1891 bệnh nhân xuất huyết não cho thấy chiết xuất saponin toàn phầntừ Tam thất thể hiện tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương não do xuất huyết nội sọgây ra bởi khả năng cầm máu, chống đông máu, chống huyết khối tắc mạch, giãn

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

mạch não, tăng cường động lực máu, chống viêm, chống oxy hóa và ngăn ngừa tăngđường huyết. Chiết xuất từ Tam thất cho hiệu quả vượt trội hơn phương pháp điều trịhiện tại và ít tác dụng phụ. Kết quả này cùng phù hợp với các tài liệu cho rằng Tamthất là một loại thảo dược có tác dụng hiệu quả trong việc làm lành vết thương vàcầm máu.60

Trong một nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả điều trị và cơ chế tácdụng của saponin toàn phần từ Tam thất trong điều trị viêm khớp dạng thấp, đồngthời theo dõi tính an tồn và ảnh hưởng của nó đối với hệ miễn dịch, 84 bệnh nhânđược phân ngẫu nhiên vào nhóm sử dụng liệu pháp thơng thường và nhóm có kết hợpđiều trị bằng saponin toàn phần từ Tam thất. Kết quả cho thấy nhóm điều trị kết hợpcó cải thiện tốt hơn các triệu chứng lâm sàng gồm chỉ số sưng khớp, chỉ số đau khớp,thời gian cứng khớp buổi sáng, đồng thời mức giảm số lượng tiểu cầu, ceruloplasmin,alpha1-acid glycoprotein và C-reactive protein ở nhóm điều trị cao hơn đáng kể. Dođó, Tam thất được cho là có khả năng nâng cao hiệu quả điều trị trong điều trị viêmkhớp dạng thấp thơng qua việc điều hịa các rối loạn miễn dịch và cải thiện tác dụngchống viêm, giảm đau.61

Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của dịch chiết saponin toàn phần Tam thất đếnchức năng tâm trương thất trái ở bệnh nhân tăng huyết áp vô căn, người ta thấy rằngTam thất có khả năng cải thiện hoạt động của bơm canxi, ức chế tình trạng quá tảicanxi nội bào và làm giảm phì đại thất trái, từ đó làm cải thiện chức năng của tâmtrương thất trái.62

1.1.10. Các sản phẩm từ Tam thất sản xuất trong nước

Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có sản phẩm ở Việt Nam phát triển từ loại Tamthất chế theo kiểu Hồng sâm, cũng như sản phẩm dạng cao đặc, tiện dùng, dễ hấp thu.Do vậy, việc nghiên cứu hồn thiện quy trình chiết xuất cao chiết từ Tam thất chế vàbào chế sản phẩm cao đặc từ Tam thất chế trong hỗ trợ điều trị ung thư sẽ tạo ra mộtgiá trị kinh tế lớn cho nhà sản xuất trong nước cũng như mang đến sản phẩm có hàmlượng khoa học và chất lượng cao đến cho người dân.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

1.2. Tổng quan về Tam thất chế1.2.1. Phương pháp chế biến

Tam thất thường được chế biến bằng cách hấp ở nhiệt độ cao. Tam thất chế ởcác điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau sẽ có thành phần hóa học và tác dụngdược lý khác nhau.

Hình 1.4. Sự thay đổi thành phần saponin trong Tam thất qua quá trình chế biến 12.Trong một nghiên cứu về thành phần của Tam thất sau quá trình hấp, kết quảcho thấy 5 saponin chính trong Tam thất thơ gồm ginsenosid-Rb1, Rd, Rg1, Re vànotoginsenosid- R1 giảm dần sau 8 giờ hấp, đồng thời một số saponin mới được hìnhthành. Trong quá trình hấp, có thể thấy rõ sự giảm Rg1, Rb1, Rd, Re và R1 sau 2 giờhấp. Sau đó, mức độ biến đổi của saponin tăng đều trong quá trình hấp. Sau 4 giờhấp, khó phát hiện Re trên sắc ký đồ; Rg1, Rb1, Rd và R1 ở nồng độ rất thấp;

ginsenosid-20(S)-Rg3, 20(S)-Rh1 và F2 hiện diện hàm lượng rất thấp trong Tam thất

thô nhưng tăng đáng kể trong Tam thất hấp. 63

Theo Toh và cộng sự, hàm lượng 20(S)-G-Rg3 trong Tam thất chế đạt mức tối đa

sau 6 giờ hấp ở 120°C và việc kéo dài thời gian hấp sẽ không làm tăng đáng kể hàm

lượng 20(S)-G-Rg3. 64 Trong nghiên cứu của Sun và cộng sự, rễ Tam thất khi hấp ở 120

oC trong 4 giờ cho hàm lượng G-Rg3 và tác dụng kháng tế bào ung thư SW-480 caonhất26.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Theo Feng Ge và cộng sự đã nghiên cứu năm (2016) củ tam thất (khô) đượchấp ở 120°C trong 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 6 và 8 giờ. Kết quả cho thấy .ginsenosidesRb1, Rd, Rg1, Re và notoginsenoside R1, 5 thành phần saponin chính trong Tam thất,giảm dần trong quá trình hấp, đồng thời hình thành một số hàm lượng saponin

ginsenosid-Rh1, Rk3, Rh4, 20(S)-Rg 3 và 20 (R)-Rg3 tăng dần . Sự biến đổi

ginsenoside Rb1 thành ginsenoside Rd.

Qian Wang và cộng sự đã cho thấy kết quả sau khi hấp Tam thất làm tăng hàm

lượng saponin Rh1, Rk3, Rh4, 20(S)-Rg3 và 20 (R)-Rg3. Saponin của tam thất chế

đã được chứng minh thơng qua nghiên cứu trong việc cải thiện tình trạng tăng lipidmáu và giảm trọng lượng cơ thể như là giảm lượng mỡ cơ thể, cũng như ức chế quátrình tạo mỡ ở chuột béo phì. Vậy nên, Tam thất chế làm giảm lipid máu, béo phì vàcác hội chứng chuyển hóa liên quan đến lipid khác.

Một nghiên cứu khác của Jiajia Dong và cộng sự cho thấy Tam thất thô đượcHấp 2, 4 và 6 h ở 100 °C và sấy khô ở nhiệt độ 50 °C đến khối lượng khơng đổi bằngcách sử dụng lị sấy khơng khí gia nhiệt, sau đó nghiền thành bột và sàng qua rây 40mesh. Bột Tam thất được ngâm trong 600 mL nước trong 30 phút trước khi siêu âmba lần, mỗi lần 20 , sau đó lọc. Phần cắn được hịa tan trong 400 mL nước và sau đólặp lại các bước trên. Dịch lọc gộp lại được cô dưới áp suất giảm ở 40 °C để thu đượcnồng độ 0,4 g/mL. Kết quả cho thấy, hàm lượng ginsenosides bị thay đổi trong quátrình hấp, hàm lượng saponin của tam thất giảm khi thời gian hấp tăng, hàm lượngsaponin Rg5 và Rk1 tăng đáng kể. Nhiệt độ cao làm phân cắt liên kết glycosid C-20của GRb1 và GRd tạo thành saponin mới, hàm lượng 5 saponin chính (GRg1 , GRe,GRb1 , GRd và N-GR1 ) trong RPN giảm dần, trong khi đó các saponin mới(GRg5 và GRk1 ) được hình thành. Sự thay đổi hàm lượng của saponin trong Tamthất chế trở nên ổn định sau 6 giờ hấp.

Trong đề tài “Nghiên cứu bào chế dược liệu Tam thất chế”, Luận văn Thạc sĩ Dượchọc (Dương Diễm Mai, 2022), tác giả đã khảo sát các điều chế biến Tam thất ở 100

oC và 120 oC trong 2, 4, 6, 8, 10 giờ; kết quả cho thấy Tam thất hấp ở 120 oC trong4 giờ cho thấy sự thay đổi đáng kể như thành phần ginsenosid kém phân cực tăng lên

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

(G-Rh1 và G-Rg3), các thành phần ginsenosid phân cực giảm đáng kể (G-Rg1, R1, G-Rd và G-Rb1) và thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231mạnh nhất. Chính vì vậy, nghiên cứu đã chọn điều kiện chế biến hấp Tam thất ở 120

N-oC trong 4 giờ để chế biến Tam thất ở quy mô pilot.67

1.2.1.1. Thành phần hố học

Tương tự như Hồng sâm, thành phần chính của Tam thất chế là các ginsenosid cónhững thay đổi đáng kể sau khi chế biến. Ngoại trừ ginsenosid-Rc, các saponinnguyên thủy bao gồm N-R1, G-Rg1, G-Re, G-Rb1 và G-Rd có hàm lượng giảm mạnh

và saponin mới xuất hiện bao gồm các cặp đồng phân: 20(S)-G-Rg3 và 20(R)-G-Rg3,20(S)-G-Rh1 và 20(R)-G-Rh1, G-Rk1 và G-Rg5, G-Rk3 và G-Rh4. Trong đó, G-Rh4và G-Rg5 có hàm lượng cao hơn đáng kể, ngoài ra ginsenosid 20(S/R)-Rh2 cũng được

phát hiện trong Tam thất đã qua chế biến với hàm lượng rất nhỏ. 68,69

Cơ chế chuyển hóa saponin thành sapogenin/prosapogenin trong q trình hấp đượcngoại suy từ cấu trúc hóa học của saponin, chủ yếu là do quá trình cắt đường và khử

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Một số báo cáo nghiên cứu cho thấy P. notoginseng đã qua chế biến có nhiều hoạttính sinh học mạnh hơn P. notoginseng thô, như tác dụng chống ung thư, chống đông

máu, ức chế kết tập tiểu cầu,...

So với Tam thất thô, Tam thất sau khi hấp được cho là có tác dụng chống đơng

máu mạnh hơn trên mơ hình in vitro và ex vivo, và tác dụng này có thể được tăng khi

kéo dài thời gian hấp.70

Theo Wang và cộng sự, Tam thất chế được chứng minh có khả năng cải thiệntình trạng tăng lipid máu, giúp làm giảm trọng lượng cơ thể, trọng lượng của mô mỡcũng như ức chế quá trình tạo mỡ ở chuột thông qua cơ chế thúc đẩy q trìnhphosphoryl hóa con đường truyền tín hiệu protein kinase.71

Tam thất chế là dược liệu tiềm năng trong điều trị Alzheimer nhờ làm tăng tác

dụng bảo vệ thần kinh và chống oxi hóa. Trong đó, ginsenosid-Rg2 và 20(S)-G-Rg3

được cho là thành phần chính có tác dụng chống Alzheimer. 72

Về tác dụng kháng ung thư, thành phần G-Rg3 có tác dụng chống tăng sinhđáng kể so với thành phần G-Rg1 và G-Rb1.26 Thành phần này cũng được tăng lêntrong quá trình chế biến Tam thất. So với dạng chế biến của Nhân sâm và Sâm Mỹ,Tam thất chế có khả năng chống tăng sinh mạnh hơn khi thử nghiệm trên các dòng tếbào ung thư đại trực tràng HCT-116 và SW480.11 Khi thử nghiệm trên các dòng tế

bào ung thư gan ở người, các G-Rh2, -Rk1, -Rk3 và 20(S)-Rg3 cũng làm tăng khả

năng ức chế tăng sinh đáng kể.

1.2.2. Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của nguyên liệu Tam thất chế

Tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu Tam thất chế đã được thẩm định bởi viện

Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh (Phụ lục 3).

Quy trình chế biến (Processed radix Panasis notoginseng)

Tam thất nguyên củ được rửa sạch sau đó hấp ở nhiệt độ 120 oC trong vịng 4 giờ.Dược liệu sau khi hấp được sấy ở nhiệt độ 60 oC cho tới khô.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Tiêu chuẩn nguyên phụ liệu

01 Tam thất chế (Processed radix Panacis notoginseng) TCCS

Yêu cầu chất lượng thành phẩm

Mô tả: Rễ củ có hình dạng thay đổi, hình trụ hay hình chùy, dài 1,5 - 4,0 cm,đường kính 1,2 - 2,0 cm. Mặt ngồi màu nâu đỏ, có những vết xém đen, trên mặtcó những vết nhăn dọc rất nhỏ. Trên một đầu có những bướu nhỏ là vết tích của

rễ con, phần dưới có khi phân nhánh. Trên đỉnh cịn vết tích cùa thân cây. Thể chất

mềm dẻo, dễ cắt. Mặt cắt ngang có lớp vỏ màu nâu, có những chấm nhỏ màu nâu(ống tiết), phần gỗ ở trong màu đỏ nâu, mạch gỗ xếp hình tia tỏa trịn. Mùi thơm

nhẹ đặc biệt, vị đắng hơi ngọt.

Soi bột: Mảnh mạch vạch, mạch mạng. Tinh thể canxi oxalat màu nâu đỏ. Những hạt

tinh bột hình chng, hình trịn hay hình khối, đường kính 3-13 μm, thường tụ thành

đám, có khi đứng riêng rẽ.

Độ ẩm: Khơng q 10 %

Tro tồn phần: Khơng q 6 %Định tính

Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của dung dịch thử phải có các vết có màu sắc và Rf trùng

với các vết của sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu 20(R)-ginsenosid-Rh1,

20(S)-Rg3, Rg1, Rd, notoR1 và Rb1 khi quan sát ở dưới ánh sáng thường và dưới ánh sáng tử ngoại (365nm).

ginsenosid-Sắc ký đồ sắc ký lỏng hiệu năng cao của dung dịch thử phải có các pic chính có thờigian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1,

ginsenosid-Rd, 20(R)-ginsenosid-Rh1 và 20(S)-ginsenosid-Rg3.

Hàm lượng chất chiết được trong dược liệu: Khơng dưới 16% .

Định lượng: Khơng ít hơn 3,0% tổng hàm lượng ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1,

20(R)-ginsenosid-Rh1, ginsenosid-Rd và 20(S)-ginsenosid-Rg3 tính trên dược liệu

khơ kiệt.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Giới hạn kim loại nặng

Độ nhiễm khuẩn

Staphylococcus aureus Khơng được có Trong 1g

Phương pháp thử

Mơ tả: Kiểm tra hình thái, màu sắc mùi vị dược liệu bằng cảm quan, kiểm tra kích

thước bằng cách đo trực tiếp.

Soi bột: Dược liệu được xay nhỏ và rây qua rây 0,5 mm để thu được bột có độ mịn

đồng nhất. Nhận xét cảm quan của bột dược liệu bằng mắt thường, soi bột bằng kínhhiển vi.

Độ ẩm: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 1g, 100 oC, 5 giờ.Tro toàn phần: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8.

Hàm lượng chất chiết được trong dược liệu: Tiến hành theo phương pháp chiết nóng(DĐVN V, phụ lục 12.10), dùng methanol làm dung môi.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Phát hiện bằng thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol.

Dung dịch chuẩn: Các chuẩn 20(R)-ginsenosid-Rh1, 20(S)-ginsenosid-Rg3,

ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rd, notoginsenosid-R1 và ginsenosid-Rb1 cónồng độ 1 mg/ml trong methanol.

Dung dịch thử: Cân 200 mg bột dược liệu, thêm 5 mL methanol siêu âm trong 20

phút. Lọc/ly tâm lấy dịch.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 µl của mẫu thử và 5 µl mỗi mẫu

chuẩn. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, phun dungdịch acid sulfuric 10% trong ethanol. Sấy bản mỏng ở 110 oC trong 10 phút. Quan sátdưới ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại (365 nm).

Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho vết phát quang có cùng màu sắc và giá trị

Rf với vết phát quang trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu 20(R)-ginsenosid-Rh1,

20(S)-ginsenosid-Rg3, ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rd, notoginsenosid-R1 và ginsenosid-Rb1.Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao: Trong phần định lượng, pic chính trên sắcký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic

ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, 20(R)-ginsenosid-Rh1 và

20(S)-ginsenosid-Rg3 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.

Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Chuẩn bị các dung dịch

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 100 mg bột dược liệu (rây qua số 355) vào ống

nghiệm có nắp, thêm chính xác 10 ml methanol 80 % vặn chặt nắp, cân, sau đó siêuâm trong 60 phút ở 45 °C, để nguội, cân lại và bổ sung methanol 80% để được khối

lượng ban đầu. Trộn đều và lọc qua màng lọc 0,22 µm.

Dung dịch chuẩn: Hòa tan các chất chuẩn ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1,ginsenosid-Rd, 20(R)-ginsenosid-Rh1 và 20(S)-ginsenosid-Rg3 trong methanol để

được dung dịch chuẩn có nồng độ mỗi chuẩn chính xác khoảng 0,1 mg/ml.Điều kiện HPLC:

- Cột HPLC C18 Phenomenex (150 mm × 4,6 mm; 3 µm).

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

- Detector PDA tại bước sóng 203 nm.- Thể tích tiêm: 10 l.

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.- Nhiệt độ cột: 30 °C.- Pha động:

Pha động A: AcetonitrilPha động B: Nước.

Tiến hành sắc ký theo chương trình dung mơi như sau

Thứ tự rửa giải: ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, Rh1 và 20(S)-ginsenosid-Rg3.

20(R)-ginsenosid-Kiểm tra tính phù hợp hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Độ lệch chuẩntương đối của diện tích pic của ginsnenosid-Rb1 trong 6 lần tiêm lặp lại không đượclớn hơn 2,0%.

Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Căn cứ vào diện tích pic thuđược từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng của các chất chuẩn ginsenosid-

Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, 20(R)-ginsenosid-Rh1 và 20(S)-ginsenosid-Rg3.

Dược liệu phải khơng chứa ít hơn 3,0% ((mg/100 mg) tổng hàm lượng

ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, 20(R)-ginsenosid-Rh1, ginsenosid-Rd và

20(S)-ginsenosid-Rg3, tính theo dược liệu khơ kiệt.

Thời gian(phút)

Acetonitril(% tt/tt)

Nước(%tt/tt)

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Kim loại nặng

Hàm lượng chì: AOAC 999.11/ TCVN 7602: 2007 (AOAC 972.25)Hàm lượng cadimi: AOAC 999.11/ TCVN 7603: 2007 (AOAC 973.34)

Hàm lượng thủy ngân: TCVN 7604: 2007

Hàm lượng asen: AOAC 986.15/ TCVN 9588: 2013.

Giới hạn nhiễm khuẩn

Tổng số vi sinh vật hiếu khí: TCVN 4884-2:2015/ISO 4833-2:2013 đính chính kỹthuật 1:2014.

Tổng số nấm men và nấm mốc: TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)Coliforms: TCVN 6848:2007/ISO 4832:2007

Staphylococcus aureus: TCVN 7927:2008/ISO 6888-3:2003

Clostridium perfringens: TCVN 4991:2005/ISO 7937:2004

1.3. Tổng quan về cao chiết

Cao dược liệu là một trong những chế phẩm được bào chế từ dược liệu. TheoDĐVN V, cao dược liệu được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy địnhtừ các dịch chiết từ dược liệu thực vật hay động vật với dung mơi thích hợp 1. Trongđó, cao dược liệu có nguồn gốc thực vật là phổ biến bao gồm các bước: xử lý dượcliệu (làm khô, xay nghiền, diệt enzyme, loại tạp, làm trương nở), chiết xuất, tinh chếloại tạp chất, cô đặc, làm khô, điều chỉnh hàm lượng hoạt chất và/hoặc chất đánh dấu(marker) và hồn chỉnh chế phẩm 2, 3. Các dung mơi hay sử dụng để điều chế caodược liệu là nước và hỗn hợp cồn-nước 2-5. Cao dược liệu là sản phẩm trung giantrong quy trình chiết xuất và bào chế các dạng thuốc. Hiện nay, cao dược liệu ngàycàng được ứng dụng thay thế bột dược liệu trong sử dụng và sản xuất các dạng thuốcvới các ưu điểm: dễ sử dụng, giảm liều, thuận lợi khi bào chế, cải thiện sinh khả dụng,tăng độ ổn định, tăng tính đồng nhất và đặc biệt dễ tiêu chuẩn hóa chất lượng 11. Caodược liệu là một chế phẩm chứa nhiều thành phần phức tạp, đặc trưng và phổ biếnnhất 18, 25, 26. Cao dược liệu có thể gồm các chất chuyển hóa sơ cấp (protein, lipid, acidamin và đường 27) và các chất chuyển hóa thứ cấp (các chất phân tử nhỏ, hoạt chất

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

hoặc các chất khác 28) từ dược liệu. Tương tác giữa các thành phần trong cao là hiệntượng phổ biến và rất phức tạp, xảy ra dưới nhiều hình thức như hiệp đồng tăngcường, hiệp đồng cộng hoặc đối kháng, theo cơ chế dược động học, dược lực họchoặc các cơ chế khác 13, 15-17. Có nhiều cách phân loại cao dược liệu, trong đó hầu hếtcác Dược điển đều phân loại theo thể chất, gồm: cao lỏng, cao đặc (cao mềm) và caokhô 1, 4, 5, 8. Trong đó cao đặc (cao mềm): Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung mơisử dụng để chiết xuất cịn lại trong cao ≤ 20%. Cao được điều chế bằng cách cô loạidung môi từ dịch chiết dược liệu, cao đặc thường kém ổn định và dễ bị khuẩn nênphần lớn được thay thế bằng cao khô. Ứng dụng chủ yếu của cao đặc là sản xuất cácdạng thuốc bán rắn, thuốc rắn hoặc dùng trực tiếp 5, 8. Theo y học cổ truyền, thườngđược sử dụng dưới dạng bột, hạt hoặc thái lát (thuốc phiến), dùng đơn dược liệu hoăcphối hợp thành bài thuốc và được chiết bằng các phương pháp như (như hầm, hãm,sắc), sử dụng theo đường uống là chủ yếu. cùng Với sự phát triển của công nghệ dượcphẩm và thuốc từ dược liệu và dạng dùng của dược liệu là rất cần thiết. Do đó, caodược liệu cần được sản xuất, kiểm soát chất lượng một cách chặt chẽ. Không ngừngnâng cao chất lượng cao dược liệu là những vấn đề được quan tâm nghiên cứu.

Các chỉ tiêu trong quá trình sản xuất, cao dược liệu có các đặc trưng sau:- Tính đồng đều: Sự dao động về chất lượng giữa các lô sản phẩm phần lớn do thànhphần phức tạp, hoạt chất kém ổn định, dao động về chất lượng dược liệu đầu vàotrong sản xuất, khó đạt độ đồng nhất và khó kiểm sốt quy trình 21.

- Tính ổn định: Phần lớn cao dược liệu có hàm lượng hoạt chất thấp và kém ổn địnhdo cao lẫn nhiều tạp chất. Tính ổn định của quy trình sản xuất từ quy mơ nghiên cứulên quy mơ pilot và quy mơ sản xuất thực tế khó đạt được.

- Tính an tồn: Cao dược liệu khơng tinh khiết do lẫn các tạp chất (kim loại nặng,chất bảo vệ thực vật, vi sinh vật, nội độc tố, chất gây sốt,…) từ dược liệu hoặc trongquy trình sản xuất 49, 50.

1.4. Tổng quan về chiết xuất

Chiết xuất là quá trình tách một số thành phần ra khỏi dược liệu bằng cách sửdụng dung mơi có khả năng hịa tan chọn lọc các thành phần đó. Dịch chiết thu được

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

có thể ở dạng thuốc sắc, cồn thuốc dạng lỏng, sau đó có thể bào chế thành nhiều dạngkhác như cao đặc, cao khô hoặc dùng để phân lập thành các chất tinh khiết.73

1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình chiết xuất

Có 3 yếu tố chính ảnh hưởng đến q trình chiết xuất:

- Ngun liệu: bản chất của nguyên liệu, mức độ chia nhỏ của nguyên liệu vàchất tan.

- Dung môi: khả năng hịa tan của dung mơi, độ nhớt của dung mơi, sự thấmcủa dung môi qua vách tế bào.

- Kỹ thuật chiết: sự chênh lệch nồng độ, sự khuấy trộn, nhiệt độ, áp suất, chấttrợ tan, siêu âm và vi sóng.

Từ đó, có thể suy ra các thơng số cần lưu ý trong chiết xuất là:- Độ mịn của dược liệu

- Loại dung môi

- Tỉ lệ dung môi/ dược liệu

- Phương pháp chiết: phương pháp chiết (ngâm hay ngấm kiệt, chiết riêng lẻhay ngược dòng), thời gian, nhiệt độ chiết, số lần chiết, …

1.4.2. Một số phương pháp chiết

Phương pháp ngâm lạnh: dược liệu được ngâm trong dung mơi ở nhiệt độphịng trong thời gian từ 1 đến nhiều ngày tùy theo loại dược liệu, có kết hợp khuấytrộn cho đến khi q trình thẩm thấu xảy ra hồn tồn.

Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi: dược liệu được chiết ở nhiệt độ sôi của dungmôi nhầm tăng tốc độ của q trình hịa tan. Phương pháp này địi hỏi thiết bị chiết cầncó bộ phận gia nhiệt và ngưng tụ dung môi nên cũng được gọi là phương pháp chiết hồilưu.

Phương pháp ngấm kiệt: dược liệu được chiết trong bình ngấm kiệt ở nhiệt độphòng hoặc nhiệt độ cao hơn. Q trình chiết này diễn ra liên tục, dung mơi đi từ nơicó nồng độ hoạt chất thấp đến nơi nồng độ hoạt chất cao hơn với một tốc độ nhấtđịnh.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Các phương pháp khác: để đẩy nhanh tốc độ hòa tan chiết xuất, người ta cònsử dụng các kỹ thuật hỗ trợ như siêu âm, vi sóng, chiết áp suất,…74

1.5. Tổng quan về tối ưu hóa quy trình chiết xuất

Khi nghiên cứu phát triển thuốc, các nhà bào chế thường quan tâm đến nhữngvấn đề sau: yếu tố nào ảnh hưởng đến tính chất của dược phẩm và ảnh hưởng theonhững quy luật nào, làm sao để tối ưu công thức phù hợp với mục tiêu, bằng cách nàodự đốn các ảnh hưởng trên tính chất sản phẩm do sự thay đổi thành phần công thức.Những vấn đề trên được giải quyết bước đầu bằng sự nghiên cứu mối liên quan nhânquả. Trong đó, thành phần công thức và/hoặc điều kiện pha chế (nhân) - được xem làbiến độc lập xi (i=1,2,…,k) - thường ảnh hưởng đến tính chất sản phẩm (quả) - đượcxem là biến phụ thuộc yj (j=1,2,…,l). mối quan hệ nhân quả này có tính biện chứngvà đơi khi rất phức tạp. Việc tối ưu hóa cơng thức có liên quan đến biến số độc lập(X: nhân) và biến số phụ thuộc (Y: quả) như đã đề cập ở trên. Nếu biến số phụ thuộcchỉ có một giá trị y, nhà bào chế có thể chọn các giá trị xi của biến độc lập X sao choy được tối đa (maximum) hoặc tối thiểu (minimum). Trong thực tế, mỗi sản phẩm córất nhiều tính chất, tức biến phụ thuộc Y có nhiều giá trị yj, do đó nhà bào chế phảitối ưu hóa nhiều biến số phụ thuộc (multiple optimization) tức là dung hòa các giá trịx1, x2, x3 … sao cho các giá trị y1, y2, y3 … đạt được tối ưu thay vì tối đa hay tốithiểu. Trước đây việc tối ưu hóa thường được thực hiện bởi các phương pháp truyềnthống như tốn thống kê, đơn hình… việc tối ưu hóa truyền thống tuy đạt được mộtsố thành tựu song vẫn còn nhiều giới hạn: chỉ phù hợp với những dữ liệu đơn giản vàtuyến tính; mỗi lần chỉ tối ưu hóa một biến độc lập và phải có mơ hình tốn học rõràng. Ngày nay việc tối ưu hóa có thể được thực hiện bởi phần mềm thơng minh vớinhiều ưu thế: hữu hiệu với dữ liệu phức tạp hay phi tuyến; có thể tối ưu hóa cùng mộtlúc nhiều biến phụ thuộc; khơng cần mơ hình tốn vì mạng thần kinh có khả năng học(luyện) từ dữ liệu thực nghiệm và có khả năng dự đốn chính xác.

Tối ưu hóa cũng đã được áp dụng nhiều vào quy trình chiết xuất cao địnhchuẩn. Quy trình chiết xuất cao đặcthường trải qua nhiều bước với nhiều thông số kỹthuật khác nhau. Trong trường hợp chiết xuất thông thường, các thông số kỹ thuật có

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

thể liệt kê gồm: Loại dung mơi (nếu là hỗn hợp hai dung mơi, ví dụ như cồn: nước,thì có thêm tỷ lệ giữa hai dung môi thành phần); Tỷ lệ dược liệu: dung môi, thời gianchiết xuất, nhiệt độ chiết xuất và một số thông số khác (thời gian ủ, sự đảo trộn ...).Theo một số quan điểm truyền thống, việc nghiên cứu cần hướng đến xác lập một bộthông số kỹ thuật của quy trình (ứng với từng giai đoạn) để tạo ra sản phẩm đạt theomục tiêu đã đề ra. Tuy nhiên, quan điểm hiện nay cho rằng việc nghiên cứu còn phảiđạt được một bộ thơng số kỹ thuật có tính “tối ưu”. Thuật ngữ “tối ưu” cần được hiểulà quy trình sử dụng vừa đủ các nguồn lực (lượng nguyên liệu, thời gian quy trình,năng lượng ...) nhưng mang đến hiệu suất cao nhất, thu được sản phẩm có một haynhiều tính chất phù hợp và được chứng minh là khơng có quy trình nào khác phù hợphơn. Vì vậy, việc áp dụng các lý thuyết tối ưu trong nghiên cứu hiện nay có giá trịthực tiễn cao, nhất là đối với nghiên cứu ứng dụng để triển khai sản xuất (cần tối thiểuhóa chi phí và tối đa hóa sản phẩm, đồng nghĩa với lợi nhuận).

1.5.1. Các hoạt động chính của tối ưu hóa quy trình

Hoạt động 1: Sàng lọc các thông số kỹ thuật của quy trình thật sự có ảnh

hưởng đến chất lượng của cao chiết.

Bước này về thực chất là đánh giá mối liên quan nhân-quả giữa các biến số quy trìnhchiết và chất lượng của cao chiết thu được tương ứng. Trong trường hợp liên quannhân-quả được thiết lập đối với một biến quy trình cụ thể (gọi là Xi), biến số đó sẽđược đưa vào giai đoạn tối ưu hóa để tạo ra cao chiết có tính chất (Yi) mong muốn.Về lý thuyết, các thơng số kỹ thuật có thể ảnh hưởng đến chất lượng của cao chiếtgồm: loại dung môi; tỷ lệ dược liệu: dung môi; thời gian chiết xuất; nhiệt độ chiếtxuất. Tuy nhiên, điều này không phải luôn đúng với mọi trường hợp. Hơn nữa, quyluật và mức độ ảnh hưởng rất biến động tùy thuộc vào đối tượng được chiết xuất. Dovậy, sàng lọc các thông số kỹ thuật của quy trình thật sự có ảnh hưởng đến chất lượngcủa cao đặccần được tiến hành trước khi bước vào tối ưu hóa.

Hoạt động 2: Tối ưu hóa các thơng số kỹ thuật của quy trình đã sàng lọc.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Cơng việc này nhằm tạo ra sản phẩm có tính chất tối ưu. Dự kiến tối thiểu hai chỉ tiêuđầu ra cần phải xem xét là định lượng hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm và hiệusuất thu sản phẩm của quy trình.

Hoạt động 3: Tiêu chuẩn hóa cao chiết.

Giai đoạn tiêu chuẩn hóa cao chiết là rất cần thiết, đặc biệt là trong các nghiên cứuứng dụng, nhằm đảm bảo tính ổn định của quy trình điều chế chế phẩm tiếp theo.Trên cơ sở cao chiết thu được, các chỉ tiêu chất lượng của cao cần phải được xem xétvà thiết lập các mức giới hạn. cao đáp ứng được các yêu cầu của bộ tiêu chuẩn kỹthuật theo quy định sẽ được gọi là cao định chuẩn.

+ Mục đích:

Thiết lập và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao Tam thất chế theo định hướng tácdụng sinh học trên cơ sở thành phần hóa học saponin hoạt tính đã xác định. Cơ sở đểđánh giá lựa chọn quy trình chiết cao phải được dựa trên thử nghiệm sàng lọc hoạt

tính sinh học in vitro của cao thu được.

+ Cách tiến hành:

Tiến hành các thực nghiệm với các thơng số kỹ thuật của quy trình chiết được biếnđổi. Các sản phẩm tạo ra được kiểm định lượng các thành phần hóa học chính và thử

tác dụng sinh học in vitro. Lựa chọn các khoảng giá trị phù hợp của các thơng số quy

trình để làm cơ sở cho q trình tối ưu hóa ở bước tiếp theo.

1.5.2. Sử dụng phần mềm tối ưu hóa quy trình chiết xuất

Phần mềm thiết kế thực nghiệm và tối ưu hóa ngày càng được sử dụng phổbiến trong nghiên cứu phát triển và nghiên cứu cơng thức – quy trình sản xuất dượcphẩm. Các phần mềm này là cơng cụ hữu ích trong việc xác lập mối liên quan nhânquả giữa các yếu tố độc lập và yếu tố phụ thuộc nhờ các thuật tốn và phương phápphức tạp. Từ đó giúp tối ưu hóa và dự đốn các giá trị của biến độc lập tương ứng vớigiá trị kỳ vọng của biến phụ thuộc. Nghiên cứu sử dụng phần mềm Design Expert v12.0 được mua bản quyền từ nhà sản xuất Stat-Ease (Mỹ).

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

+ Mục đích:

Một quy trình chiết xuất thường có nhiều thơng số kỹ thuật có thể ảnh hưởngđồng thời đến các tính chất của cao chiết tạo thành. Do vậy, dùng các phương phápkhảo sát thơng thường rất khó để xác định một bộ giá trị của các thông số đầu vào đểtạo ra sản phẩm với các chỉ tiêu chất lượng tối ưu. Việc dùng phần mềm tối ưu hóatrong trường hợp này là cần thiết, có thể giúp tiết kiệm thời gian, chi phí cũng nhưcho kết quả tối ưu.

Tùy vào số biến Xi được xác định, sử dụng phần mềm Design - Expert v 12.0để xây dựng mơ hình thực nghiệm.

Từ mơ hình thực nghiệm, lần lượt tiến hành các thí nghiệm, thu thập và xácđịnh các chỉ tiêu chất lượng đầu ra của sản phẩm (gọi là Yi).

Sử dụng phần mềm Design - Expert v 12.0 để phân tích, tìm ra quy luật ảnhhưởng và mối quan hệ định lượng giữa các biến Xi lên các giá trị Yi.

Thiết lập các ràng buộc mong muốn đối với các giá trị Yi. Sử dụng chức năng dựđoán của phần mềm để đề xuất 1 bộ giá trị của các biến Xi (được tiên đoán sẽ cho Yi tốiưu). Các yếu tố Yi được nghiên cứu nên bao gồm các chỉ tiêu sang lọc tác dụng sinh học.Thực nghiệm kiểm chứng để xác nhận tính chính xác của giá trị dự đốn, đồngthời cũng là xác nhận quy trình chiết xuất tối ưu.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Đối tượng nghiên cứu

Tam thất chế (Processed Radix et Rhizoma Panax notoginseng) (10 kg khô) được

cung cấp bởi TS. Lê Thị Hồng Vân, là kết quả của đề tài “Nghiên cứu bào chế dượcliệu Tam thất chế”, Luận văn Thạc sĩ Dược học (Dương Diễm Mai, 2022). 67 Nguyênliệu đạt tiêu chuẩn cơ sở (Phụ lục 1) về các chỉ tiêu: Độ ẩm, độ tan, độ tro, định tínhvà định lượng thành phần saponin (G-Rg1, G-Rd, G-Rb1, N-R1 và G-Rg3).66

2.2. Dung mơi, hóa chất và thiết bị nghiên cứu2.2.1. Dung mơi, hóa chất.

Dung mơi và hóa chất được thực hiện trong nghiên cứu được sử dụng trong nghiên

cứu được thể hiện qua Bảng 2.1

Bảng 2.1. Dung mơi, hóa chất được sử dụng nghiên cứu.

Dung mơi khác: Nước cất 1 lần, nước RO, và ethanol tuyệt đối2.2.2. Trang thiết bị nghiên cứu

Trang thiết bị được sử dụng trong cứu đề tài được thể hiện qua Bảng 2.2Bảng 2.2. Thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu

4 Máy sắc ký lỏng siêu

5 Cân phân tích 4 số lẻ CP-2250 Sartorius độ nhạy 0,01 mg Đức

6 Cân phân tích 5 số lẻ CP-2250 Sartorius độ nhạy 0,01 mg Đức

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

7 Máy cô quay Büchi 1 lít - 210S Nhật

8 Hệ thống chiết hồi lưu 3 vỏ, có áp suất, làm nóng bằng

Dụng cụ khác: micropipet, pipet 5, 10, 25 ml; đầu tip, màng lọc milipore 0,22 µm;

găng tay.

Nơi thực hiện: Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh2.2.3. Chất chuẩn

Các chất tinh khiết ginsenosid do nhóm nghiên cứu của TS. Lê Thị Hồng Vân cung

cấp với độ tinh khiết được thể hiện trong Bảng 2.3

Bảng 2.3. Chất chuẩn được sử dụng trong nghiên cứu

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Kiểm tra nguyên liệu Tam thất chế

Nguyên liệu đầu vào được kiểm tra các chỉ tiêu: Cảm quan, vi học, độ ẩm, độ tro,

hàm lượng chất chiết được, định tính, định lượng theo TCCS (Phụ lục 1).

Dược liệu đạt TCCS sẽ được chuẩn bị thành 2 phần:

Phần 1. Nguyên liệu để tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao đặc

Dược liệu được xay và rây để lấy kích thước < 355 µm.

Phần 2. Dược liệu sử dụng cho quy trình chiết xuất cao đặc

Dược liệu được xay thơ để thu lấy kích thước < 1 cm.

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

2.3.2. Thiết kế mơ hình tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao đặc từ Tam thất chế2.3.2.1. Các điều kiện khảo sát nghiệm thức

- Loại dung môi: nước, ethanol 45%, và ethanol 80%- Tỷ lệ dung môi / dược liệu: 15:1, 10:1, và 8:1(tt/kl)

- Nhiệt độ của quá trình chiết: Tương ứng nhiệt độ sôi của dung môi.- Thời gian chiết: 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ

- Phương pháp chiết: Chiết đun hồi lưu.- Số lần chiết: 1 lần, 2 lần và 3 lần.

Các nghiệm thức khảo sát dựa trên thay đổi của loại dung môi (3 loại dung môi), tỷlệ dung môi (3 tỷ lệ khác nhau), thời gian chiết (khảo sát trên 3 thời gian chiết khácnhau) và số lần chiết (khảo sát số lần chiết là 3). Vậy số nghiệm thức khảo sát đượcthực hiện với thiết kế thủ cơng:

3 loại dung mơi × 3 tỷ lệ dung mơi × 3 thời gian × 3 lần chiết = 81 cơng thức.

Bảng 2.4. Mơ hình thực nghiệm khảo sát chiết xuất cao Tam thất chế

10 ET45 8 1 1 37 ET45 8 1 2 64 ET45 8 1 3

11 ET45 8 2 1 38 ET45 8 2 2 65 ET45 8 2 3

12 ET45 8 3 1 39 ET45 8 3 2 66 ET45 8 3 3

13 ET45 10 1 1 40 ET45 10 1 2 67 ET45 10 1 3

14 ET45 10 2 1 41 ET45 10 2 2 68 ET45 10 2 3

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

TN A B C D TN A B C D TN A B C D15 ET45 10 3 1 42 ET45 10 3 2 69 ET45 10 3 3

16 ET45 15 1 1 43 ET45 15 1 2 70 ET45 15 1 3

17 ET45 15 2 1 44 ET45 15 2 2 71 ET45 15 2 3

18 ET45 15 3 1 45 ET45 15 3 2 72 ET45 15 3 3

19 ET80 8 1 1 46 ET80 8 1 2 73 ET80 8 1 3

20 ET80 8 2 1 47 ET80 8 2 2 74 ET80 8 2 3

21 ET80 8 3 1 48 ET80 8 3 2 75 ET80 8 3 3

22 ET80 10 1 1 49 ET80 10 1 2 76 ET80 10 1 3

23 ET80 10 2 1 50 ET80 10 2 2 77 ET80 10 2 3

24 ET80 10 3 1 51 ET80 10 3 2 78 ET80 10 3 3

25 ET80 15 1 1 52 ET80 15 1 2 79 ET80 15 1 3

26 ET80 15 2 1 53 ET80 15 2 2 80 ET80 15 2 3

27 ET80 15 3 1 54 ET80 15 3 2 81 ET80 15 3 3

Chú thích: A: loại dung môi, B: tỷ lệ dung môi/dược liệu, C: thời gian chiết (giờ),D: số lần chiết (lần), W: nước, ET45 là ethanol 45%, ET80: ethanol 80%

2.3.2.2. Quy trình chiết xuất

- Cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu Tam thất chế (qua rây số 355) vào các erlen100 ml, thêm dung môi cồn 80% hoặc cồn 45% hoặc nước (ứng với tỉ lệ dược liệu:dung môi 1:8, 1:10, 1:15), vặn chặt nắp, cân. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

- Tiến hành chiết đun hồi lưu ở nhiệt độ sôi tương ứng với từng lọại dung môi chiếtxuất trong 1, 2 và 3 giờ. Để nguội, cân lại và bổ sung bằng dung môi chiết tương ứngđể được khối lượng ban đầu.

- Lọc lấy dịch chiết lần 1, rút 10 ml dịch chiết cô dịch chiết thành cắn để xác địnhkhối lượng. Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,22 µm để phân tích định lượngginsenosid bằng HPLC.

- Bã dược liệu được rửa qua dung môi chiết, tiếp tục bổ sung dung môi với tỉ lệ dượcliệu : dung môi tương tứng (1:8; 1:10; 1:15). Chiết lần 2 với quy trình như lần 1.

</div>