Tìm hiểu quy trình phát hiện Clostridium Botulinum trong thịt

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì điều mà
họ quan tâm là vệ sinh ăn uống. Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm
phải nhập viện, gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khoẻ của cộng đồng. Điều này
không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà ngay cả các nước khác trên thế giới cũng
vậy. Một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức
cho phép các vi sinh vật gây hại trong thực phẩm. Để có các biện pháp phòng
tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ độc thực phẩm. Mà sự hiện diện là
các chuẩn gây hại như: E.Coli, Salmonella, Clostridium tạo ra độc tố khi nhiễm
vi sinh vật này.
Bệnh ngộ độc botulism là một bệnh nhiễm độc do độc tố của vi khuẩn
Clostridium botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển và sinh ra độc tố.
Người ǎn phải thức ǎn có độc tố sẽ bị nhiễm độc. Gần đây, vai trò các bào tử của
vi khuẩn có mặt trong thực phẩm có khả nǎng gây ngộ độc là vấn đề đang được
nghiên cứu.
Là một sinh viên sắp ra trường, tầm hiểu biết mới chỉ có giới hạn trong lý
thuyết, kinh nghiệm còn non kém nên không tránh khỏi những thiếu sót. Kính
mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý Thầy, Cô để khóa luận của em
được hoàn thiện.
Trang 1
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Từ xa xưa, con người đã biết đến sử dụng vi sinh vật và ứng dụng của vi
sinh vật trong thực phẩm. Các quá trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối
chua thực phẩm đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật.
Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi sinh vật, thì việc ứng dụng vi sinh
vật trong sản suất ngày càng rộng rãi có hiệu quả.
Và cũng không vì thế mà người ứng dụng tất cả các chủng vi sinh vật tồn
tại trong tự nhiên. Ngoài những vi sinh vật có lợi cũng có những vi sinh vật có

hại gây bệnh cho cây trồng, động vật thủy hải sản và nhất là ảnh hưởng tới con
người. Hiện nay, khi xã hội phát triển thì mặt hàng thực phẩm cũng khá phong
phú và tiện lợi cho người tiêu dùng lựa chọn. Thực phẩm đóng hộp có trên thị
trường và được nhiều người sử dụng. Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ
gia đình thường lại càng quan tâm đến vấn đề dự trữ các loại thực phẩm trong
nhà để đối phó với những khó khăn có thể xảy ra. Một trong những thực phẩm
thường được dự trữ là các loại thực phẩm đóng hộp. Nếu khi mua và sử dụng các
loại đồ hộp không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh
phát triển ở trong loại thực phẩm này. Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị
nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có trong đồ hộp, còn gọi là ngộ
độc botulism, có thể gây tử vong.
Ngộ độc botulism là bệnh ngộ độc thực phẩm mang tính chất cấp tính xảy
ra rất nặng, nó có thể phá hủy hệ thần kinh trung ương và gây tử vong cao. Bệnh
thường xảy ra sau khi ăn các loại thực phẩm dự trữ được đóng hộp như thịt hộp,
Trang 2
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
cá hộp, pa tê, xúc xích, rau quả Bệnh ngộ độc botulism thường do loại vi khuẩn
Clostridium botulinum type A và B gây nên, vi khuẩn tiết ra độc tố botulin, một
ngoại độc tố có độc tính rất cao, cao hơn hẳn độc tố Aflatoxin và các độc tố của
vi khuẩn khác. So với độc tố gây bệnh uốn ván, nó mạnh gấp 7 lần (liều gây chết
của độc tố uốn ván là 0,250 mg và của botulin là 0,035 mg). Mặc dù vậy nhưng
độc tố của nó dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, chỉ cần đun thực phẩm lên đến
100
0
C trong 10-30 phút thì độc tố sẽ bị phá hủy hoàn toàn. Nhưng độc tố này rất
bền vững với men tiêu hóa. Bệnh ngộ độc botulism là một bệnh nhiễm độc do
độc tố của vi khuẩn C.botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển và sinh ra
độc tố. Người ǎn phải thức ǎn có độc tố sẽ bị nhiễm độc. Còn vi khuẩn thường
không gây nên bệnh vì nó không sinh sản được trong cơ thể con người.
Chính vì vậy ta cần phải tìm hiểu toàn bộ những gì có liên quan đến vi

sinh vật để chúng ta sử dụng tối đa đặc tính có hại và đề phòng những ảnh hưởng
của chúng đem lại. Với ý nghĩa thực tế như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện
khóa luận “ Tìm hiểu quy trình phát hiện Clostritridium botulinum trong
thịt” .
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu những vi sinh vật gây bệnh trong thịt và đi sâu tìm hiểu quy
trình phát hiện C.botulinum và độc tố botulin của vi khuẩn này. Sau đó đưa ra
một số biện pháp phòng ngừa và kiểm soát vi khuẩn trên. Và từ đó tìm ra những
ứng dụng của chúng vào trong thực tiễn để đem lại lợi ích cho con người.
Trang 3
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
1.3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản về hình thái, cấu tạo di truyền, hoạt động
sinh lý, hoá học, yếu tố độc lực, cơ chế gây độc và những ứng dụng tuyệt vời của
C.botulinum.
Khả năng gây bệnh của vi sinh vật trong thực phẩm và mối liên quan của
chúng với các thực phẩm .
Nghiên cứu độc tố botulin của vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm nhằm
ngăn ngừa các độc tố này.
Trang 4
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Chương 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về thịt và vệ sinh an toàn thực phẩm trên thịt
2.1.1. Giá trị dinh dưỡng của thịt
Thịt là một trong những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, thịt các
động vật máu nóng như thịt lợn, thịt bò, thịt gia cầm có chứa nhiều acid amin
cần thiết, các chất béo, chất khoáng, vitamin và một số các chất thơm hay còn
gọi là chất chiết xuất. Thịt các loại nói chung nghèo canxi, giàu photpho. Tỉ lệ
Ca/P thấp.
Thịt tất cả các loài nói chung chứa nhiều nước, lượng nước lên tới 70-

75%. Protein chiếm 15-20%, lượng lipid dao động nhiều (1-30%) tùy thuộc vào
loại súc vật và độ béo của nó. Glucid trong thịt chỉ có rất ít. Lượng tro khoảng
1%. Giá trị sinh học protein thịt 74%, độ đồng hóa protein thịt 96-97%. Trong
thịt ngoài các protein có giá trị sinh học cao, còn có colagen và elastin là loại
protein khó hấp thu, giá trị dinh dưỡng thấp vì thành phần của nó hầu như không
có tryptophan và cystein là hai acid amin có giá trị cao. Loại này tập trung nhiều
ở phần thịt bụng, thủ, chân giò. Colagen khi đun nóng chuyển thành gelatin là
chất đông keo. Còn elastin gần như không bị tác dụng của men phân giải protein.
Vì vậy ăn vào và thải ra nguyên dạng. Trong thịt còn chứa một lượng chất chiết
xuất tan trong nước, dễ bay hơi, có mùi vị thơm đặc biệt, số lượng khoảng 1,5-
2% trong thịt. Nó có tác dụng kích thích tiết dịch vị rất mạnh. Các chất chiết xuất
gồm có creatin, carnosin (có nitơ) và glycogen, glucose, acid lactic (không có
nitơ). Khi luộc thịt phần lớn các chất chiết xuất hòa tan vào nước làm cho nước
thịt có mùi vị thơm ngon đặc hiệu.
Trang 5
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Chất béo có ở tổ chức dưới da, bụng, quanh phủ tạng, bao gồm các axit
béo no và chưa no. Các xịt béo no chủ yếu là palmitic (25-30%) và stearie (16-
28). Các acid béo chưa no chủ yếu là oleic (35-43%), acid béo chưa no có nhiều
mạch kép khoảng 2-7%. Riêng mỡ gà có 18% acid linoleic và mỡ ngựa có 16%
linolenic, đó là những acid béo chưa no cần thiết mà cơ thể không tự tổng hợp
được. Mỡ lợn lớp ngoài có nhiều acid béo chưa no hơn lớp sâu. Về chất khoáng,
thịt là nguồn photpho (116-117 mg%), kali (212-259 mg%) và Fe ( 1,1-2,3 mg
%) tập trung nhiều ở gan. Vì yếu tố có Cu, Zn, Coban. Lượng Canxi trong thịt rất
thấp (10-15 mg%).
Vitamin: Thịt là nguồn vitamin nhóm B trong đó chủ yếu là B1 tập trung ở
phần thịt nạc. Các vitamin tan trong chất béo chỉ có ở gan, thận. Ngoài ra, ở gan,
thận, tim, não có nhiều colesteron và photphatit.
Thịt gia cầm thuộc loại thịt trắng có nhiều protein, lipid, khoáng và
vitamin hơn so với thịt đỏ.[7]

Hình 2.1 Hình ảnh về thịt
Trang 6
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
2.1.2. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của thịt
Thịt là nguồn dinh dưỡng giàu năng lượng, thành phần của thịt gồm có:
nước, protein, glucid, lipid, chất trích ly chứa nitơ và phi nitơ, chất
khoáng, vitamin và enzyme…Tuy nhiên giá trị của thịt phụ thuộc chủ yếu vào
protein. Protein có thành phần cân bằng thích hợp và tất cả các acid amin
cần thiết cho cơ thể. Hàm lượng lipid chứa trong thịt cũng có ảnh hưởng
quyết định đến độ tăng năng lượng của thịt, làm cho thịt vừa có giá trị năng
lượng cao vừa góp phần tăng hương vị thơm ngon của thịt. Các chất trích ly
trong thịt kích thích sự ăn ngon miệng và sự tiết dịch tiêu hoá. Thành phần hóa
học của các mô thịt, gồm có: Mô cơ: 50 ÷ 70%, Mô mỡ: 2 ÷ 20%, Mô xương: 15
÷ 22%, Mô liên kết: 9 ÷ 14%. Ngoài ra còn có mô thần kinh và mô máu.
Bảng 2.1: Tỷ lệ giữa các mô trong thịt heo ( % theo khối lượng)[5]
Thịt
loại
mô
Mô cơ Mô mỡ Mô liên kết Mô xương Sụn và mô
máu thịt heo
40÷ 5 8 % 15÷ 4 6 % 0,6÷ 0 , 8 % 0,8÷ 1 8 % 0,6÷ 0 , 8 %
Bảng2.2: Thành phần dinh dưỡng trong 100g thịt heo
Thành phần hoá học của thịt tuỳ thuộc vào giống, tuổi giết thịt và vị trí của
miếng thịt trên cơ thể (tỉ lệ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết ).
STT Protein Lipid Glucid Nước Tro
Béo 20,3 6,8 0,48 71,9 0,52
Trung bình 17,0 25,3 0,3 56,8 0,6
Gầy 14,5 37,0 0,2 47,8 0,5
Trang 7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Bảng 2.3: Thành phần acid amin không thay thế trong thịt heo[5]
STT Acid Amin Hàm lượng % trong protein
1 Lysine 7,82
2 Methionine 2,53
3 Trytophan 1,44
4 Phoyllalanine 4,15
5 Threonine 5,16
6 Valine 5,17
7 Leucine 7,58
8 Isoleucine 4,99
9 Arginine 6,410
10 Histidine 3,2
Theo (Bảng 2.3) thì protein của thịt chứa hầu hết các acid amin không
thay thế với lượng đáng kể đáp ứng nhu cầu acid amin hằng ngày. Khi
vào cơ thể protein phân giải tạo thành khoảng 20 loại acid amin. Trong
số các loại acid amin đó có chứa 8 loại acid amin không thay thế được đối
với người. Nó giúp cho cơ thể người tổng hợp và sản xuất các tế bào một cách
tốt nhất.
Do đó, thịt là một sản phẩm đặc biệt quan trọng trong việc giúp cơ thể
phát triển, rất cần thiết đối với phụ nữ mang thai và những người trong giai đoạn
Trang 8
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
dưỡng bệnh. Ngoài ra, protein không thay thế của thịt rất cần thiết để
xây dựng các mô và phục hồi các tế bào đã mất, tham gia tạo thành enzyme,
acid amin, hoocmon và các thể miển dịch …Không có protein cơ thể không tồn
tại được. Trong thịt heo chứa hầu hết các chất khoáng cần thiết cho cơ thể duy trì
những hoạt động bình thường của các quá trình sống cân bằng áp suất thẩm thấu
trong tế bào và mô…Ngoài ra, thịt heo còn chứa nhiều loại vitamin: B1, B2, B6,
PP và các nguyên liệu khác. Tóm lại, hai thành phần protein và lipid của

thịt chứa hàm lượng cao quyết định giá trị dinh dưỡng của thịt. Hơn
nữa, mùi vị và màu sắc của thịt có tác dụng kích thích tiêu hoá. Do đó,
trong khẩu phần thức ăn hằng ngày thịt đóng vai trò đặc biệt quan trọng. Tuy
nhiên, cần lưu ý là không nên ăn quá nhiều lượng thịt trong một bữa ăn
mà phải kèm theo các loại rau quả để giảm hàm lượng chất đạm tích tụ
trong cơ thể sau khi ăn và tạo sự cân bằng cho cơ thể.
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của thịt
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt như điều kiện nuôi
dưỡng, giới tính, tuổi giết thịt, giống loài nhưng yếu tố ảnh hưởng đến chất
lượng thịt sau quá trình giết mổ là quá trình vận chuyển, tồn trữ và giết mổ.
2.1.3.1. Quá trình vận chuyển
- Tránh tác động môi trường làm cho con vật hoảng sợ, căn thẳng
thần kinh, gây tiêu hao các chất dự trữ.
- Hạn chế va chạm cơ học.
- Đảm bảo cung cấp đầy đủ nước cho con vật.
2.1.3.2. Tồn trữ
Trang 9
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
-Tránh các chất cặn bã và thức ăn thừa nhiễm vào súc thịt sau khi
giết mổ con vật.
- Cho uống nước đầy đủ, không làm giảm trọng lượng thịt.
- Cho thú nghỉ ngơi đúng thời gian.
2.1.3.3. Giết mổ
- Nếu thời gian lấy máu dài, tim suy yếu, máu ngưng chảy, thịt bị thâm và
có mùi vị xấu.
- Ngoài những yếu tố trên, phẩm chất thịt của con vật còn phụ
thuộc nhiều vào môi trường, bệnh lý và các thuốc điều trị bệnh các hóa
chất lạ có trong thức ăn.
2.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nguyên liệu thịt tươi [9]
Trang 10

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
 Chọn thịt còn tươi mới, không bị đập nát, không có màu, mùi lạ.
Bảng 2.4: Cách lựa chọn thịt tươi
STT CHỈ SỐ THỊT TƯƠI THỊT KÉM TƯƠI VÀ ÔI
1 Trạng thái
bên ngoài
- Màng ngoài khô.
- Màu sắc đỏ tươi hoặc đỏ
sẫm, óng ả.
- Mỡ có màu sắc, độ rắn, mùi
vị bình thường.
- Mặt khớp láng và trong.
- Dịch hoạt trong.
- Màng ngoài nhớt nhiều hay
bắt đầu nhớt.
- Màu hơi xanh nhạt hoặc hơi
thẩm, thậm chí còn đen,
không bóng.
- Mỡ màu tối, độ rắn giảm
sút, mùi vị ôi.
- Mặt khớp có nhiều nhớt.
- Dịch hoạt đục.
2 Vết cắt - Màu sắc bình thường, sáng,
khô.
- Màu sắc kém, hơi ướt.
3 Độ rắn và
đàn hồi
- Rắn chắc, đàn hồi cao.
- Lấy ngón tay ấn vào thịt,
không để lại vết lõm, khi

bỏ ngón tay ra không bị
dính
- Khi ấn ngón tay, để lại vết
lõm, sau đó trở về bình
thường, dính tay.
- Thịt ôi vết lõm không trở
về bình thường ngay được,
dính nhiều.
4 Tủy - Bám chặt vào thành ống
tủy, màu trong đàn hồi.
- Tủy róc ra khỏi ống tủy,
màu tối hoặc màu nâu, mùi
hôi.
5 Nước luộc - Nước luộc trong, mùi vị
thơm ngon.
- Trên mặt nồi có một lớp
với vết mỡ to.
- Nước luộc đục, mùi vị hôi.
- Trên mặt lớp mỡ tách thành
những vết nhỏ.
- Thịt ôi nước luộc đục, mùi
hôi, hầu như không còn vết
mỡ nữa.
 Chỉ tiêu hóa sinh( TCVN 7046 : 2002)
Trang 11
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
- pH= 5.5 ÷ 6.2
- NH
3
< 35 mg / 100g thịt

- Phản ứng H
2
- Độ trong của nước luộc thịt cho phép hơi đục khi
phản ứng với CuSO
4
 Chỉ tiêu vi sinh
- Tổng số vi sinh vật hiếu khí 10
6
Cfu/g
- E. Coli 10
2
Cfu/g
- Samonella 0
- B. cereus 10
2
Cfu/g
- Clostridium perfringens 0
- Clostridium botulinum 0
2.1.5. Vệ sinh an toàn thực phẩm trên thịt
Thịt là nguồn thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, được xếp vào thức ăn
nhóm I, đồng thời lại là thức ăn dễ chế biến dưới nhiều dạng món ăn ngon vì vậy
nó là thức ăn thường gặp hàng ngày trong bữa ăn của nhân dân ta. Nếu chúng ta
sử dụng thịt không đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thì thịt trở nên gây hại cho người
sử dụng.
Thịt có thể là nguồn lây các bệnh nhiễm khuẩn như lao, than, tị thư , các
bệnh ký sinh trùng như sán dây, sán chó Thịt còn có thể gây ngộ độc thức ăn
do vi khuẩn nhiễm vào thịt hoặc do độc tố chứa sẵn trong thịt và phủ tạng như
cóc (bao gồm da, buồng trứng và gan) chứa độc chất Bufotonin, Bufotoxin. Các
loại nhuyễn thể khi chết dễ phân hủy sinh độc tố Mytilotoxin. Các độc tố này
gây liệt thần kinh trung ương. Nếu ngộ độc nặng người bệnh có thể chết do liệt

hô hấp hoặc tuần hoàn.
Trang 12
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
2.1.6. Các hệ vi sinh vật gây hư hỏng và ngộ độc trên thịt
2.1.6.1. Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn thương hàn (salmonella)
Thường gặp do ăn thức ăn có nguồn gốc động vật bị nhiễm vi khuẩn
thương hàn: gỏi thịt cá, thịt gia cầm: gà, vịt, cá, Bệnh thường biểu hiện sau khi
ăn khoảng 4 giờ đến 48 giờ thấy: sốt đau bụng, buồn nôn và nôn, đi ngoài nhiều
lần trong ngày, đi ngoài phân có máu…nếu không được điều trị kịp thời và đúng
cách, người bệnh có thể tử vong.
Bệnh có thể chuyển sang dạng người lành mang vi khuẩn gây bệnh khi
không được điều trị đủ liều, đúng cách. Những người mang vi khuẩn ở dạng này
thường xuyên thải vi khuẩn thương hàn ra theo phân, nếu không được phát hiện
và điều trị kịp thời sẽ là nguồn ô nhiễm với thực phẩm và môi trường xung
quanh.
2.1.6.1. Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn tụ cầu vàng (staphylococcus aureus)
Thường gặp do ăn thức ăn giàu đạm bị nhiễm vi khuẩn tụ cầu như: thịt, cá,
trứng, sữa, các loại súp Vi khuẩn tụ cầu có nhiều trên da, họng khi bị viêm
nhiễm, và có trong không khí, nước nên quá trình chế biến và bảo quản không
hợp vệ sinh rất dễ nhiễm các vi khuẩn này vào thực phẩm.
Ăn thức ăn có nhiễm tụ cầu hoặc độc tố của chúng đều có thể bị ngộ độc.
Bình thường, triệu chứng xuất hiện sớm trong 30 phút đến 4 giờ sau khi ăn.
Người bệnh thường nôn thức ăn vừa ăn xong, đi ngoài nhiều lần phân toàn nước,
mệt mỏi, có thể có đau đầu hôn mê nếu nhiễm phải độc tố của tụ cầu. Bệnh
không được điều trị kịp thời dễ tử vong do mất nước và điện giải. Điều trị tích
cực, bệnh thường khỏi nhanh và phục hồi tốt.
2.1.6.3. Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn độc thịt (Clostridium botulium)
Trang 13
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Đây là loại vi khuẩn kỵ khí có nha bào, thường có trong thức ăn đóng

hộp, để lâu. Biểu hiện ngộ độc thường sau khi ăn 2 giờ đến 48 giờ có các dấu
hiệu: buồn nôn, nôn, chóng mặt, nhức đầu, mệt mỏi, người bệnh khó thở và hôn
mê. Nếu không được điều trị và xử lý kịp thời tỷ lệ tử vong rất lớn.
2.1.6.4. Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn Escherichia coli (E.Coli)
Vi khuẩn này có nhiều trong phân người và gia súc. Trong quá trình chế
biến thiếu vệ sinh, không có thói quen rửa tay trước khi ăn hay trước khi chế
biến thực phẩm, bảo quản thực phẩm không tốt để các loại côn trùng xâm nhập
mang theo vi khuẩn E.Coli từ phân, rác vào thức ăn. Biểu hiện ngộ độc thức ăn
do nhiễm E.Coli thường sau 4 giờ đến 48 giờ có các dấu hiệu đau bụng đi ngoài
phân có máu hay nhiều nước tùy theo từng loại vi khuẩn E.Coli.
Bệnh có thể tử vong do nhiễm độc hay mất nước nếu nhiễm E.Coli 0.157
hay các loại E.Coli khác gây bệnh giống như vi khuẩn tả. Bệnh được điều trị
sớm và xử trí đúng cách sẽ phục hồi nhanh chóng.
2.2. Giới thiệu về C.botulinum
2.2.1. Giới thiệu chung
C.Botulinum
- Giới (domain) : Bacteria
Trang 14
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
- Ngành (phylum) : Firmicutes
- Lớp (class) : Clostridia
- Bộ (ordo) : Clostridiales
- Họ (familia) : Clostridiaceae
- Chi (genus) : Clostridium
- Loài (species) : C. Botulinum
Hình 2.2 Clostridium botulinum
2.2.2. Lịch sử phát hiện
Clostridium botulinum lần đầu tiên được công nhận và cô lập năm 1896
bởi Emile van Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi lợn dính líu vào một ổ dịch
botulism. Các cô lập ban đầu được đặt tên là Botulinus bacillus. Tuy nhiên, cô

lập từ các ổ dịch tiếp theo luôn luôn tìm thấy là những bào tử dạng kỵ khí, do đó,
Bengston đề xuất sinh vật được đặt vào chi Clostridium.
Từ năm 1953 tất cả các loài sản xuất độc tố thần kinh botulinum (loại AG)
được xác định là C. botulinum. Bằng chứng tồn tại số kiểu hình và kiểu gen đáng
kể đã chứng minh sự đa dạng trong loài. Điều này đã dẫn đến sự phân loại lại
của C. botulinum loại G giống như là một loài mới Argentinense clostridium.
Chủng C.botulinum không sản xuất ra chất độc botulin được gọi là
sporogenes Clostridium .
Năm 2003 bộ gen của C.botulinum được công bố với công trình của viện
Sanger với Tiến sĩ Roger Huston và Tiến sĩ M. Peck .
2.2.3. Kiểu hình
Trang 15
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Các danh pháp của C.botulinum công nhận bốn nhóm sinh lý (I-IV). Điều
này chủ yếu dựa trên khả năng sinh vật có thể tiêu hóa protein phức tạp. Nghiên
cứu DNA và cấp rRNA hỗ trợ các phân khu của loài này thành các nhóm I-IV.
Hầu hết các ổ dịch của botulism con người là do nhóm I (thủy phân protein) hoặc
II (không thủy phân protein) C. botulinum nhóm III chủ yếu là các sinh vật gây
bệnh ở động vật. Hiện đã có hồ sơ về C.botulinum nhóm IV con người và động
vật gây bệnh.
2.2.4. Đặc điểm chung của C.botulinum
Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử,
phần lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu
nhận năng lượng. Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt vừa tuy nhiên có một
số loài ưa nhiệt và một số loài thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài gây ngộ độc thực
phẩm quan trọng là C.botulinum và C.perfringens.
C. botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được trong môi
trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng
trong loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và có 6 kiểu kháng nguyên
được ký hiệu từ A–F. K. Kiểu kháng nguyên A, B và F có hoạt tính thủy phân

protein tạo nên một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis
và Hobbs, còn các kiểu C, D, E không có khả năng này. Kiểu A thường thấy trên
các mẫu thịt trong khi kiểu E chỉ được phân lập trên các mẫu cá.
Trang 16
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường
có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 37
0
C trong 1 – 2 ngày.
Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 50
0
C. Trên môi trường này các khuẩn lạc
Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S
2-
) và ion sắt (Fe
2+
) có
trong môi trường.
Độc tố botulin được sản xuất bởi C.botulinum được cho rằng là vũ khí
sinh học tiềm năng, mất khoảng 75 ng để giết một người (LD50 của 1ng/kg, giả
định một người trung bình nặng ~ 75kg); 500 gram của nó sẽ là đủ để giết một
nửa số dân số toàn bộ con người.
C.botulinum là một loại vi khuẩn đất. Các bào tử có thể tồn tại ở hầu hết
các môi trường và rất khó để giết.
Sự tăng trưởng của vi khuẩn có thể được ngăn chặn bởi acid cao, tỷ lệ của đường
hòa tan cao, nồng độ oxy cao, độ ẩm thấp hoặc lưu trữ ở nhiệt độ dưới 38° F
(loại A).
Ví dụ: Mật ong, siro bắp và chất ngọt khác có thể chứa các bào tử nhưng
không có thể phát triển trong nồng độ đường cao độ tuy nhiên khi nồng độ
đường bị pha loãng trong oxy thấp, acid thấp trong hệ thống tiêu hóa của trẻ sơ

sinh thì các bào tử có thể phát triển và sản xuất chất độc. Ngay sau khi trẻ bắt
đầu ăn thức ăn rắn, các loại nước tiêu hóa trở nên quá chua cho vi khuẩn phát
triển.
2.2.5. Đặc điểm sinh hóa
C.botulinum không thể phát triển ở pH acid thấp hơn 4.5. Nồng độ muối
trên 1% có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. C.botulinum không thể sử
dụng lactose như một nguồn cacbon chính. C.botulinum có thể được chia thành 4
Trang 17
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
nhóm và 7 độc tố vào đặc điểm sinh lý và sinh hóa cũng như tính nhạy cảm của
độc tố.
Bảng 2.5: Phân loại và đặc điểm của độc tố botulin [12]
Nhóm Đặc điểm Các loại
I Phân giải protein, sản xuất bào
tử kháng nhiệt độ tăng trưởng tối
thiểu 10
0
C.
Tấc cả các loại A, các chủng
phân giải protein của B và F.
II Không phân giải protein, sản
xuất bào tử có khả năng chịu
nhiệt thấp và tăng trưởng ở nhiệt
độ thấp.
Tất cả các loại E, và chủng
phân giải protein của B và F.
III Không phân giải protein, ít được
biết đến vì dòng này không liên
quan bệnh ngộ độc botulin ở
người.

Tất cả các loại C và D chủng.
IV Phân giải protein, không phân
giải saccharose, ít biết đến khả
năng chịu nhiệt của bào tử.
2.2.6. Cấu trúc
2.2.6.1. Cấu trúc phân tử
Bộ gen của C.botulinum là 3.886.916 bp, trong đó G + C của khoảng
28,2%. Ngoài ra còn có một plasmid 16.344 bp.
Toxin được tổng hợp từ một chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử gần
150.000 dalton. Ở cấu trúc này, phân tử độc tố có hoạt lực tương đối thấp, nhưng
khi bị một số enzym của vi khuẩn và trypsin tách ra thành hai chuỗi nặng
(100.000 dalton) và nhẹ (50.000 dalton) nối với nhau bằng cầu nối sulfur có gắn
với một phân tử Zn. Cầu nối S-S đóng vai trò quan trọng trong việc thâm nhập
và sự phân cắt của nó bằng cách phân hủy bỏ độc tính.
Trang 18
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử
Chuỗi nặng có thể được chia theo chức năng dựa vào nhóm amin khởi đầu
và kết thức bằng nhóm cacboxyl.
Chuỗi nhẹ ( amino acid 1- 448) hoạt động như một enzym tiêu hóa kẽm,
với hoạt động thủy phân protein tập trung tại đầu tận cùng – N ( đầu tổng hợp
đầu tiên của nhóm NH
2
tự do). Chuỗi nặng ( amino acid 499 – 1280) cung cấp
tính đặc thù tiết axetycholin, thúc đẩy sự vận chuyển của chuỗi nhẹ qua màng
endosomal của chất truyền thần kinh.
Nếu liên kết disulphide bị gãy trước khi độc tố vào trong tế bào, chuỗi nhẹ
không thể vào màng cuối sợ trục, và gần như mất độc tính hoàn toàn.
Trang 19
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT

2.2.7. Yếu tố độc lực của C.botulinum
2.2.7.1. Đặc điểm của độc tố
Độc tố botulin do vi khuẩn C.botulinum sinh ra (độc tố gây chết do làm
suy hô hấp). Vi khuẩn C.botulinum có dạng hình que, sinh nha bào có sức đề
kháng cao (đun sôi ở độ cao bằng mặt nước biển cũng không giết chết được vi
khuẩn). Để tồn tại, C.botulinum cần rất ít oxy. Độc lực của botulin rất cao (chỉ
cần 1 microgam hay 1 phần triệu gam đã có thể làm chết một người, một giọt
chất độc này có thể làm chết cả trăm ngàn người). Nếu quy trình chế biến bảo
quản không tốt trong chế biến thực phẩm (nhất là đồ hộp), thực phẩm có thể bị
nhiễm vi khuẩn này. Phương pháp làm sôi kết hợp với điều áp có thể diệt được
vi khuẩn. Nha bào của vi khuẩn không phát triển trong những đồ hộp có hàm
lượng đường cao như mật ong, sirô nhưng có khả năng phát triển khi vào đường
tiêu hóa của trẻ sơ sinh.
Ngộ độc botulin là một loại ngộ độc thực phẩm nặng do ăn các loại thực
phẩm có chứa chất độc thần kinh mạnh được hình thành trong sự phát triển của
cơ thể. Độc tố không bền nhiệt và có thể bị phá hủy nếu đun nóng ở 80
0
C trong
10 phút hoặc lâu hơn. Các tỷ lệ mắc bệnh thấp, nhưng bệnh được quan tâm đáng
kể vì tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị ngay lập tức và đúng cách.
 Có ba loại chính của botulism
- Botulism thực phẩm là kết quả từ thực phẩm bị ô nhiễm, trong đó
bào tử C.botulinum được sinh ra trong điều kiện yếm khí, điều này
thường xảy ra trong thực phẩm đóng hộp.
- Vết thương botulism là do độc tố sản xuất từ một vết thương bị
nhiễm C.botulinum, điều này trở nên phổ biến hơn ở người dùng
thuốc tiêm tĩnh mạch kể từ năm 1990, đặc biệt là những người sử
Trang 20
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
dụng ma túy đen (black tar heroin) và những người tiêm ma túy vào

da hơn là tiêm vào các tĩnh mạch.
- Botulism trẻ sơ sinh là do tiêu thụ các bào tử của vi khuẩn
C.botulinum, mà sau đó phát triển trong ruột và được hấp thu vào
máu, việc tiêu thụ mật ong trong những năm đầu tiên của cuộc sống
được xác định là yếu tố nguy cơ botulism trẻ sơ sinh .
Tất cả các hình thức botulism có thể gây tử vong và được xem là trường
hợp khẩn cấp y tế. Botulism thực phẩm có thể được đặc biệt nguy hiểm vì nhiều
người có thể bị ngộ độc do ăn thực phẩm bị ô nhiễm.
Bảng 2.6: Bảng phân loại yếu tố độc lực
Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV
Độc tố A, B, F B, E, F C, D G
Proteolysis + - Yếu -
Saccharolysis - + - -
Species Con người,
động vật
Con người,
động vật
Động vật -
Độc tố gen Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc
thể
Bacteriophage Plasmid
Close relative C.spororgenes
C.putrificum
C.butyricum
C.beijernickii
C.haemolyticum
C.novyi type A
C.subterminale
C.haemolyticum
2.2.7.2. Cơ chế gây độc

Trang 21
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Hình 2.4 Cơ chế gây độc của độc tố botulin [12]
Khi phát triển trên thực phẩm, C.botulinum tiết độc tố acethylcholine là
một chất dẫn truyền thần kinh gây đáp ứng bằng tình trạng co thắt cơ. Botulin tác
động như một độc tố thần kinh mạnh làm ức chế phóng thích acetylcholine, do
đó gây kết quả như cắt dây thần kinh bằng chất hóa học, gây liệt phản hồi. Mặc
dù có đến 7 loại BTX ( A, B, C1, D, E, F, G) gây liệt phản hồi do ức chế phóng
thích acetylcholine tại đường nối thần kinh - cơ của các sợi cơ vân, chúng lại
không giống nhau tại vị trí gắn kết trên tế bào niêm mạc và vị trí tác động. Có 7
loại nhưng 3 loại A, B và E thuộc loại hay gây ngộ độc và nguy hiểm, gây chết
người do tác động lên hệ thống thần kinh. Thời kỳ ủ bệnh thường là 12-36 giờ
nhưng cũng có thể từ 2 giờ đến 8 ngày với các triệu chứng lâm sang như đau
bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt có khi nhìn đôi, khó nuốt, khó
thở Ngộ độc C. botulinum còn phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như yếu tố
môi trường, đặc tính thực phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt và ăn
uống của nhân dân mà nguồn thực phẩm gây ngộ độc cũng khác nhau.
2.2.7.3. Cơ chế gây bệnh
Khi hoạt động của dây thần kinh vận động tạo nên sự khử cực ở đầu cuối
của sợi trục (axon), acetylcholine sẽ được phóng thích từ tế bào chất vào khe
synapse. Sự phóng thích acetylcholine được thực hiện bởi một chuỗi protein vận
chuyển, phức hợp solule N-ethylmalemide-senitive factor attachment protein
receptor (SNARE) ( yếu tố có thể hòa tan nhạy với N-ethylmalemide gắn lên thể
nhận protein).
Khi độc tố botulin thâm nhập vào mô dịch, chuỗi nặng của độc tố thần
kinh botulin này sẽ gắn chuyên biệt lên phân tử glycoprotein được tìm thấy ở
Trang 22
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
điểm cuối của dây thần kinh tác động kiểu cholin. Sự gắn chuyên biệt này
nguyên nhân cho tính chọn lọc cao của độc tố botulin đối với synapse tác động

kiểu synapse. Sau khi xâm nhập, chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh botulin gắn
chuyên biệt lên phức hợp SNARE. Tùy các loại botulinum toxin khác nhau sẽ có
các protein đích khác nhau. Botulinum toxin-A được tách thành SNAP-25,
botulinum toxin-B được tách thành vách VAMP. Sự phân cắt chuỗi nhẹ của
phức hợp protein trong màng tế bào là kết quả là dẫn tới sự khóa chặt các lỗ
hổng. Khi mô đích là một phần cơ, xảy ra sự liệt nhẹ do xảy ra sự cắt bó dây thần
kinh hóa học. Khi mô đích là tuyến ngoại tiết thì sự liên kết các chất ở các tuyến
ngoại tiết thì sự tiết các chất ở các tuyến này bị khóa chặt. Sự ức chế quá trình
xuất bào của acetylcholine bị loại bỏ bằng cách khôi phục lại sự thay thế của
phức hợp protein SNARE.
Hình 2.5 Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum
2.2.8. Hội chứng ngộ độc thịt [7]
Trang 23
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
Botulism là một căn bệnh bại liệt hiếm nhưng nghiêm trọng do botulin là
độc thần kinh và là sản phẩm của vi khuẩn C.botulinum.
2.2.8.1. Bệnh và các triệu chứng
Các triệu chứng cơ bản của botulism gồm : làm tổn thương hệ thần kinh
trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là
liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi
hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn
đến tử vong.
Hình 2.6 Vịt bị tê
liệt do độc tố botulin
Trẻ sơ sinh với botulism sẽ xuất hiện nôn nửa, kém ăn, táo bón, khóc yếu
và cơ không phát triển. Nếu không chữa trị, những triệu chứng này có thể phát
triển gây tê liệt cánh tay, chân, thân và các cơ bắp hô hấp. Các triệu chứng
Trang 24
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT
thường bắt đầu từ 18 – 36h sau khi tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm, nhưng cũng

có thể xảy ra sớm nhất là 6g hoặc trễ là 10 ngày sau khi tiêu thụ. Botulism có
nhiều loại A, B, C, D, E nhưng loại A, B, E cho độc tố mạnh nhất.

Hình 2.7 Trẻ em bị
nhiễm botulism
2.2.8.2. Phát hiện và điều trị
Cách trực tiếp và hiệu quả nhất để xác định chẩn đoán lâm sàng của
botulism trong phòng thí nghiệm là chứng minh sự hiện diện của chất độc trong
huyết thanh hoặc phân của bệnh nhân hoặc trong thực phẩm bệnh nhân tiêu thụ.
Hiện nay, phương pháp sử dụng rộng rải nhất để phát hiện chất độc là thử
nghiệm trung hòa ở chuột, trong đó bao gồm việc tiêm huyết thanh hoặc phân
người bệnh vào chuột và tìm kiếm các dấu hiệu của botulism, thử nghiệm này
thường mất 48 giờ. Nuôi mẫu vật mất từ 5 – 7 ngày.
Những suy hô hấp và tê liệt nghiêm trọng xảy ra với botulism có thể để
bệnh nhân sử dụng máy thở (thông gió) cho 1 tuần, cộng với chuyên sâu về y tế
và chăm sóc điều dưỡng. Sau vài tuần, tê liệt từ từ được cải thiện. Nếu chẩn đoán
sớm, botulism thực phẩm và botulism vết thương có thể được điều trị bằng một
Trang 25