nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép cyprinus carpio trong nito lỏng

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vi
TÓM TẮT vii
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1.Một số đặc điểm sinh học cá Chép 3
1.1.1. Hệ thống phân loại 3
1.1.2. Phân bố 3
1.1.3. Đặc điểm hình thái 3
1.1.4. Đặc điểm sinh thái 4
1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sinh sản 4
1.2. Đại cƣơng về tinh trùng 4
1.2.1. Quá trình tạo tinh trùng 4
1.2.1.1. Giai đoạn tăng sinh 4
1.2.1.2. Giai đoạn sinh trưởng 5
1.2.1.3. Giai đoạn thành thục 5
1.2.2. Cấu tạo tinh trùng 5
1.2.2.1. Phần đầu 6
1.2.2.2. Phần cổ 6
1.2.2.3. Phần đuôi 6
1.2.3. Đặc điểm sinh học của tinh trùng 6
1.2.3.1. Kích thước và số lượng 6
1.2.3.2. Đặc điểm vận động 7
1.3. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng 13
ii

1.3.1. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trên thế giới 13
1.3.2. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng ở Việt Nam 16
Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu 18
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Cá đực và vuốt tinh 19
2.2.1.1. Cá đực 19
2.2.1.2. Vuốt tinh 19
2.2.2. Đánh giá sơ bộ chất lượng tinh dịch cá 19
2.2.2.1. Màu sắc tinh dịch 19
2.2.2.2. Thể tích tinh dịch 19
2.2.2.3. Kiểm tra hoạt lực tinh trùng 20
2.2.2.4. Kiểm tra mật độ tinh trùng 21
2.2.3. Bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng 22
2.2.4. Ảnh hưởng của chất bảo quản và chất chống đông lên kết quả bảo
quản tinh 22
2.2.5. Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 24
2.2.6. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 25
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu 25
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 26
3.2. Ảnh hƣởng của chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh 27
3.3. Ảnh hƣởng của quy trình làm lạnh đến kết quả bảo quản tinh 29
3.4. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 30
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 32
4.1. Kết luận 32
4.1.1. Ảnh hưởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 32
4.1.2. Ảnh hưởng của chất chống đông lên bảo quản tinh 32
4.1.3. Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 32

4.1.4. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên chất lượng tinh bảo quản 32
iii

4.2. Đề xuất ý kiến 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34














iv

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Chiều dài, khối lƣợng, thể tích tinh dịch, màu sắc tinh dịch của
cá chép đƣa vào thí nghiệm………………………………………………

20
Bảng 2.2. Hoạt lực ban đầu của tinh trùng……………………………….…
21

Bảng 2.3. Mật độ trung bình tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm (*10
9
tb/ml)
22
Bảng 2.4. Thành phần các ion trong dịch tƣơng của một số loài cá [56] ….
23
Bảng 2.5. Thành phần các chất bảo quản đƣợc sử dụng cho nghiên cứu…

24














v

DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Hình dạng ngoài cá chép [57]…… ……………………….……
3

Hình 1.2. Cấu tạo tinh trùng [44]……………………………………………
5
Hình 2.1. Quy trình nội dung nghiên cứu …………………………………
18
Hình 2.2. Các quy trình làm lạnh sử dụng cho thí nghiệm.… ……………
25
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh…………
26
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của các chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh….
27
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh
29
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh……
30













vi

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

CCSE: Common carp sperm chất bảo quản.
DMSO: Dimethyl sunfoxide.
MET: Methanol.
GLY: Glycerol.
Đv: Đơn vị.
GTTB: Giá trị trung bình.
HL: Hoạt lực.
TGHL: Thời gian hoạt lực.
s: Giây.
V: Thể tích.
SD: Độ lệch chuẩn.
tb: Tế bào.
TGHL: Thời gian hoạt lực.
tt: Tinh trùng.
ctv: Cộng tác viên.
TTTD: Thể tích tinh dịch.
MSTD: Màu sắc tinh dịch.
TT: Thứ tự.

vii

TÓM TẮT

Bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng là phương pháp đã và đang được
nghiên cứu rộng rãi ở nhiều quốc gia bởi vì lợi ích của chúng trong công tác chọn
giống và bảo tồn nguồn gen. Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản,
chất chống đông, quy trình làm lạnh thích hợp nhất cho việc bảo quản tinh trùng cá
Chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng. Về thí nghiệm tìm ra chất bảo quản tốt nhất:
tinh trùng được pha loãng trong các chất bảo quản (common carp sperm extender)

CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 hoặc CCSE-4 và bổ sung 10% DMSO như là chất chống
đông ở tỉ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng). Về thí nghiệm tìm ra chất chống
đông tốt nhất: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung
các chất chống đông như là DMSO (dimethyl sulfoxide), Glycerol, và Methanol ở
nồng độ là 10% với tỷ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng). Thí nghiệm về chất
bảo quản và chất chống đông được bảo quản theo qui trình: hơi nitơ lỏng -76
o
C
khoảng 6 phút và sau đó cho thẳng xuống nitơ lỏng -196
o
C. Thí nghiệm về quy trình
làm lạnh: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung
DMSO ở nồng độ 10% như là chất chống đông, sau đó tiến hành bảo quản theo ba
quy trình: (1) đưa các cọng rạ xuống nhiệt độ -20◦C trong 3 phút rồi chuyển xuống
-76◦C trong 3 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C; (2) đưa các cọng
rạ xuống nhiệt độ -76◦C trong 6 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C;
(3) đưa thẳng các cọng rạ vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C. Kết quả thí nghiệm
cho thấy chất bảo quản CCSE-2, chất chống đông là DMSO ở nồng độ 10%, và quy
trình làm lạnh (2) cho kết quả tốt nhất. Kết quả thí nghiệm này góp phần cung cấp
thông tin về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng.
Từ khóa: Cá chép, Cyprinus carpio, chất bảo quản, chất chống đông
1

MỞ ĐẦU
Bảo quản tinh có vai trò quan trọng trong các chƣơng trình chọn giống và các
chƣơng trình bảo tồn nguồn gen của vật nuôi. Bảo quản tinh sẽ góp phần cung cấp
nguồn nguyên liệu cho công nghệ di truyền phân tử áp dụng trong các chƣơng trình
chọn giống. Nhờ bảo quản tinh có thể chủ động trong quá trình sản xuất giống nhân
tạo, nhất là trong trƣờng hợp có hiện tƣợng lệch pha trong sự thành thục giữa giới đực
và cái. Việc bảo quản tinh góp phần làm đơn giản hóa quá trình vận chuyển cá bố từ

nơi này đến nơi khác. Ngoài ra, bảo quản tinh còn hạn chế tối đa việc lƣu giữ cá đực
bảo tồn dòng thuần ngăn cản suy giảm chất lƣợng di truyền do lai cận huyết [6].
Hiện nay, bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là phƣơng pháp đơn giản nhất của
việc lƣu trữ tinh trùng cá trong thời gian dài. Từ các dữ liệu của Ashwood-Smith
[13], Whittingham [52] và Stoss and Holtz [46] đã ƣớc tính thời gian lƣu trữ tinh
trùng trong nitơ lỏng là từ 200 đến 32.000 năm. Thành công của việc bảo quản lạnh
tinh trùng từ các loài cá biển đến các loài cá nƣớc ngọt, Cloud và Patton [21] chứng
minh rằng bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là một phƣơng pháp có thể đƣợc sử
dụng để bảo quản tinh trùng của nhiều loài cá.
Cá Chép (Cyprinus carpio) là một trong những loài có giá trị kinh tế quan trọng
đƣợc nuôi ở khắp châu Á và châu Âu. Sản lƣợng cá đƣợc nuôi toàn cầu chiếm
khoảng 6,14% (3.172.488 tấn) tổng sản lƣợng nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới
[22]. Ở Việt Nam, cá Chép là đối tƣợng nuôi có giá trị thƣơng phẩm, thịt thơm ngon
và đƣợc nuôi khá phổ biến [8].
Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh cá
Chép Cyprinus carpio đƣợc công bố rộng rãi với nhiều phƣơng pháp bảo quản khác
nhau. Tuy nhiên, hiện nay do quá trình di nhập cá Chép giữa các vùng trên cả nƣớc
và di nhập cá Chép từ nƣớc ngoài dẫn tới quá trình lai tạp xảy ra nhiều làm cho biến
đổi nguồn gen, nên việc lƣu trữ và bảo tồn giống thuần phục vụ công tác lai tạo,
chọn giống là yêu cầu đặt ra của ngành thủy sản. Bên cạnh đó, do đặc điểm sinh lý,
hóa của mỗi loài cá khác nhau nên việc tìm ra quy trình bảo quản tinh thích hợp cho
từng loài cá trong điều kiện cụ thể là rất cần thiết [39].
2

Và để góp phần cung cấp thêm thông tin về kỹ thuật bảo quản tinh cho các đối
tƣợng thủy sản, đề tài: “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus
carpio trong nitơ lỏng” đƣợc thực hiện.
Đề tài thực hiện gồm những nội dung chính sau đây:
- Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.
- Ảnh hƣởng của chất chống đông lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.

- Ảnh hƣởng của quy trình bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.
- Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản trong nitơ lỏng lên hoạt lực tinh trùng.
Mục tiêu chính của đề tài là:
- Tìm ra một số dung dịch bảo quản và chất chống đông phù hợp với việc bảo
quản tinh trùng cá Chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng tại Việt Nam.
- Góp phần bổ sung dữ liệu về quy trình kỹ thuật bảo quản tinh trùng cá chép
Cyprinus carpio trong nitơ lỏng tại Việt Nam.
- Lƣu trữ nguồn gen và bảo tồn giống thuần phục vụ cho công tác lai tạo.
Do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế, nên trong quá trình viết báo cáo
không thể tránh thiếu sót. Kính mong nhận đƣợc góp ý từ thầy, cô và các bạn để đồ
án đƣợc hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012
Sinh viên thực hiện


Võ Thị Thu Hiền






3

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Một số đặc điểm sinh học cá Chép
1.1.1. Hệ thống phân loại
Ngành: Chordata

Lớp: Actinopterygii
Bộ: Cypriniformes
Họ: Cyprinidae
Giống: Cyprinus
Loài: C. carpio
Tên tiếng anh: Common carp.

Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá chép [57].
1.1.2. Phân bố
Trên thế giới: Cá chép (Cyprinus carpio) phân bố rộng khắp các vùng trên toàn
thế giới trừ Nam Mỹ, Tây Bắc Mỹ, Madagasca và châu Úc [8].
Ở Việt Nam: Cá phân bố rộng trong sông ngòi, ao hồ, ruộng ở hầu hết các tỉnh
phía Bắc Việt Nam. Cá có nhiều dạng hình nhƣ: Cá chép trắng, chép cẩm, chép hồng,
chép đỏ, chép lƣng gù, chép thân cao, chép Bắc Cạn v.v [8].
1.1.3. Đặc điểm hình thái
Thân cá hình thoi, mình dây, dẹp bên. Viền lƣng cong, thuôn hơn viền bụng. Đầu
cá thuôn, cân đối. Mõm tù, lƣng xanh đen, hai bên thân phía dƣới đƣờng bên vàng
xám, bụng trắng bạc. Gốc vây lƣng và vây đuôi hơi đen. Vây đuôi và vây hậu môn
đỏ da cam [8].
4

1.1.4. Đặc điểm sinh thái
Cá chép sống ở tầng đáy cá vực nƣớc, nơi có nhiều mùn bã hữu cơ, thức ăn đáy
và cỏ nƣớc. Cá có thể sống đƣợc trong điều kiện khó khăn khắc nghiệt, chịu đựng
đƣợc nhiệt độ từ 0-40
o
C, thích hợp ở 20-27
o
C [8].
1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sinh sản

Thức ăn của cá khá đa dạng nhƣ mảnh vụn thực vật, rễ cây, các loài giáp xác
(Copeporda, Decaporda, Gatstropoda), ấu trùng muỗi, ấu trùng côn trùng, thân
mềm. Tuỳ theo kích cỡ cá và mùa vụ dinh dƣỡng mà thành phần thức ăn có sự thay
đổi nhất định. Ngoài thức ăn tự nhiên có trong thuỷ vực thì cá còn ăn thức ăn nhân
tạo nhƣ cám nổi [8].
Cá chép là loài có kích cỡ trung bình, lớn nhất có thể đạt tới 15-20kg. Tốc độ tăng
trƣởng giảm dần theo chiều dài nhƣng lại tăng dần theo trọng lƣợng [8].
Cá chép thành thục ở 1
+
tuổi. Sức sinh sản của cá lớn, khoảng 150.000-200.000
trứng/kg cá cái. Mùa vụ sinh sản kéo dài từ mùa xuân đến mùa thu nhƣng tập trung
nhất vào các tháng xuân-hè khoảng tháng 3-6 và mùa thu khoảng tháng 8-9. Trứng
cá chép ở dạng dính.Trứng cá sau khi đẻ bám vào thực vật thuỷ sinh. Ở các sông cá
thƣờng di cƣ vào các bãi ven sông, vùng nhiều cỏ nƣớc. Cá thƣờng đẻ nhiều vào
ban đêm, nhất là từ nửa đêm đến lúc mặt trời mọc hoặc đẻ nhiều sau các cơn mƣa
rào, nƣớc mát [8].
1.2. Đại cƣơng về tinh trùng
1.2.1. Quá trình tạo tinh trùng
Tinh trùng trƣớc khi thành thục trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau cuối
cùng mới phân hóa cao độ hình thành tế bào sinh dục đực hoàn thiện có năng lực
thụ tinh. Quá trình tạo tinh trùng của cá diễn ra trong tinh sào [5], bắt đầu từ tế bào
sinh dục nguyên thủy và trải qua các giai đoạn sau:
1.2.1.1. Giai đoạn tăng sinh
Từ tế bào sinh dục nguyên thủy phân chia nguyên nhiễm nhiều lần tạo thành các
tinh nguyên bào. Tinh nguyên bào có một nhân to, chất nguyên sinh trong nhân phân
bố đều. Đƣờng kính của tinh nguyên bào dao động từ 9-16 µm [1].
5

1.2.1.2. Giai đoạn sinh trưởng
Ở giai đoạn này, chất dinh dƣỡng do tinh nguyên bào hấp thụ đƣợc đồng hóa và

chuyển thành nguyên sinh chất của tế bào. Do đó tế bào sinh trƣởng mãnh liệt, thể
tích tăng lên và hình thành tinh bào sơ cấp (tinh bào cấp 1). Nguyên sinh chất trong
nhân tế bào từ dạng hạt đã biến thành thể nhiễm sắc sợi mảnh hoặc thô chuẩn bị cho
giai đoạn phân chia tiếp theo.
1.2.1.3. Giai đoạn thành thục
Tinh bào sơ cấp trải qua 2 lần phân chia liên tục:
- Lần 1: Từ 1 tinh nguyên bào sơ cấp phân chia giảm nhiễm hình thành 2 tế bào thứ
cấp. Số lƣợng nhiễm sắc thể trong nhân giảm đi một nửa (thể đơn bội kép).
- Lần 2: Tinh bào thứ cấp phân chia nguyên nhiễm tạo nên 2 tinh tử có bộ nhiễm
sắc thể 1n. Nhƣ vậy, từ 1 tế bào sinh dục nguyên thủy sẽ tạo thành 4 tinh tử có bộ
nhiễm sắc thể 1n. Tinh tử trải qua các quá trình biến thái đặc biệt để hình thành nên
tinh trùng.
1.2.2. Cấu tạo tinh trùng
Tinh trùng của các lớp động vật khác nhau thì khác nhau khá nhiều về hình thái,
tuy nhiên tất cả đều có nét chung về hình thái có liên quan mật thiết đến chức năng
chủ yếu là khả năng sống và thụ tinh [1]. Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu,
phần cổ và phần đuôi.

Hình 1.2. Cấu tạo tinh trùng [44].
6

1.2.2.1. Phần đầu
Đầu tinh trùng là phần có khả năng kích thích trứng và chuyển vật chất di truyền
vào trong trứng. Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình đa
giác, hình xoắn (ở cá sụn) hay hình ovan, ở cá xƣơng đầu tinh trùng có cấu tạo đơn
giản gần nhƣ hình tròn [1].
Đầu tinh trùng thƣờng rất to so với các phần khác. Trên cùng của đầu là thể đỉnh.
Thể đỉnh có hình nhƣ chiếc mũ trùm xuống phía dƣới, trong nó chứa enzyme
Hialuronidaza có tác dụng hòa tan màng tế bào trứng mở đƣờng cho tinh trùng xâm
nhập vào khi thụ tinh. Thể đỉnh do bộ máy Golgii tạo thành. Nhân tinh trùng nằm

dƣới thể đỉnh, rất to và đơn độc, chứa nguyên liệu di truyền của giao tử đực. Bao
quanh nhân và thể đỉnh là một lớp tế bào chất khá mỏng [3].
1.2.2.2. Phần cổ
Phần cổ tƣơng đối ngắn, cách đầu bằng một màng mỏng. Trong cổ chứa trung tử
đầu và trung tử đuôi nằm vuông góc với nhau. Từ trung tử đuôi phát ra các sợi trục
của tinh trùng. Trung tử đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia trứng
đã đƣợc thụ tinh [3].
1.2.2.3. Phần đuôi
Đuôi tinh trùng cá là cơ quan vận động dài và mảnh tùy theo loài. Phần đầu của
đuôi tinh trùng là vòng xoắn ty thể. Ty thể là bào quan mang các enzyme oxy hóa
và enzyme oxy phosphorine hóa do vậy nó có liên quan đến quá trình chuyển hóa
năng lƣợng của tinh trùng. Phần cuối của đuôi gồm 10 đôi sợi trục: 1 đôi phân bố ở
giữa và 9 đôi ở ngoại vi. Đuôi đảm bảo cho tinh trùng hoạt động gặp trứng và tham
gia vào quá trình thụ tinh. Sự di chuyển đƣợc thực hiện bằng cách chuyển động co
duỗi lƣợn sóng và chuyển động đập của đuôi [3].
1.2.3. Đặc điểm sinh học của tinh trùng
1.2.3.1. Kích thước và số lượng
Kích thƣớc của tinh trùng thƣờng rất bé so với tế bào trứng của cùng 1 loài. Ví
dụ: Hầu 75µm, tôm He 10µm, cá Rô 20 µm,… [1].
7

Ngƣợc lại với kích thƣớc tinh trùng có số lƣợng vô cùng lớn. Ví dụ: 1ml tinh
dịch cá trắm cỏ có 31,1±1,7 triệu tinh trùng; cá mè trắng có 31,6±2,8 triệu tinh
trùng; cá trắm đen có 16,2±0,9 triệu tinh trùng [3].
1.2.3.2. Đặc điểm vận động
a. Hoạt lực của tinh trùng
Khi còn ở trong tuyến sinh dục, tinh trùng không vận động nhƣng khi rơi vào
nƣớc nó vận động mạnh [1].
Hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc vào đặc điểm của loài, mức độ thành thục của
nó và điều kiện môi trƣờng mà nó đang sống. Sự chuyển động và thời gian vận

động của tinh trùng có thể giúp đánh giá đƣợc chất lƣợng tinh trùng. Persov (1941)
(dẫn theo Trịnh Thị Nguyên [6]) đã đề nghị một bảng để đánh giá mức độ (5 mức:
Mức 5:Tất cả tinh trùng đều chuyển động tiến thẳng, mức 4: Đa số tinh trùng
chuyển động tiến trong hiển vi thƣờng thấy chỉ có một số ít tinh trùng dao động,
mức 3: Số tinh trùng chuyển động ít hơn số tinh trùng dao động, đã có một số tinh
trùng bất hoạt, mức 2: Rất ít tinh trùng chuyển động tiến, một số ít chuyển động dao
động,
3
4
số tinh không chuyển động, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động)
chuyển động của tinh trùng sau khi cho vào môi trƣờng kích hoạt.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng
Các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trùng gồm:
- Nhiệt độ:
Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp thì tốc độ hoạt động của tinh trùng tăng khi
nhiệt độ tăng nhƣng thời gian sống của tinh trùng sẽ ngắn lại, vì nhiệt độ tăng làm
tăng nhanh quá trình oxy hóa vật chất trong tinh trùng và sự tiêu hao năng lƣợng
tăng lên. Tuy nhiên nếu nhiệt độ vƣợt quá giới hạn cho phép của phạm vi thích hợp
thì tinh trùng nhanh chóng mất khả năng vận động và chết. Ở nhiệt độ thấp sự vận
động của tinh trùng bị ức chế và tăng thời gian sống của tinh trùng. Tinh trùng có
thể duy trì khả năng thụ tinh của mình khá lâu nếu đƣợc giữ ở nhiệt độ thấp 0-4
o
C
[1]. Đây là cơ sở khoa học của việc bảo quản lạnh tinh trùng ở nhiệt độ thấp.
Ví dụ: Tinh trùng cá chép bảo quản ở nhiệt độ 0-2ºC thì sống đƣợc 8 ngày.
8

- Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng:
Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng cũng ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tinh
trùng. Đối với cá nƣớc ngọt, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng tƣơng

đƣơng với dung dịch nƣớc muối NaCl 0,5% . Đối với cá biển, áp suất thẩm thấu của
tế bào chất tƣơng đƣơng với dung dịch nƣớc muối NaCl 0,75% [11].
- Ion kim loại:
Tinh trùng nhạy cảm với ion kim loại hóa trị 2 và 3 hoặc acid, sự có mặt của các
ion này làm cho tinh trùng kết vào nhau. Ở môi trƣờng kiềm hóa tinh trùng hoạt
động tích cực hơn nhƣng mau chóng hết năng lƣợng và chóng chết [1].
- Độ pH của môi trƣờng cũng có liên quan đến sự vận động của tinh trùng: tinh
trùng cá Hồi vận động tốt nhất khi pH=8,3 [11].
- Tuổi thọ của tinh trùng còn phụ thuộc vào chất lƣợng thành thục của cá.
- Ảnh hƣởng của việc bảo quản lạnh tinh trùng:
Quá trình bảo quản lạnh tinh trùng cũng góp phần vào làm giảm chất lƣợng tinh
trùng sau khi bảo quản. Một số nghiên cứu này cũng đã đƣợc nhiều tác giả công bố
[19, 47]. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng
bao gồm:
Kỹ thuật chọn cá bố mẹ: Đây là khâu đầu tiên quan trọng vì chất lƣợng tinh
trùng của cá đực có tốt hay không phụ thuộc vào mức độ thành thục của nó và điều
kiện đang sống. Khả năng vận động của tinh trùng chƣa thành thục hay quá thành
thục đều rất kém so với thành thục vừa. Ngoài ra, việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh
hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng.
Thao tác thu mẫu tinh: Trƣớc khi thu mẫu, dụng cụ cần đƣợc khử trùng và để
nơi thoáng mát, cá bố mẹ phải đƣợc kiểm tra lại. Trƣớc khi thu mẫu nên lâu khô
phần dọc theo bụng cá. Khi thu mẫu phải hết sức cẩn thận và nhẹ nhàng, tránh
không để phân cá, máu chảy vào tinh dịch, nếu không tinh trùng dễ bị kích hoạt dẫn
đến thời gian cất giữ ngắn. Nên lấy tinh dịch vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát để
tinh dịch không bị biến đổi, không nên lấy tinh dƣới ánh sáng mặt trời để tránh tinh
trùng bị sát thƣơng.
9

Những ống đựng tinh dịch nên đƣợc để trên khay đá khô, không nên nắm trong
tay bởi nhiệt độ cơ thể cao làm giảm tuổi thọ tinh trùng.

Tinh dịch thu xong nên đƣợc vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để kiểm tra
và xử lý mẫu. Tinh dịch nên đƣợc vận chuyển ở nhiệt độ 0-4
o
C.
Chất bảo quản: Chất bảo quản (chất bảo quản) là một dung dịch muối, có tác
dụng làm tăng dung tích và duy trì trạng thái vô hoạt cũng nhƣ thời gian sống tiềm
sinh của tinh trùng. Nghiên cứu về Chất bảo quản không những có thể đạt đƣợc mục
đích pha loãng tăng dung tích của tinh dịch mà còn có thể nâng cao tỉ lệ thụ tinh của
tinh dịch, kéo dài thời gian sống cũng nhƣ tiết kiệm đƣợc nhiều tinh dịch.
Lựa chọn chất bảo quản cần chú ý các điều kiện sau:
- Có chất dinh dƣỡng cần cho việc trao đổi chất của tinh trùng.
- Tránh đƣợc sự kích thích của nhiệt độ.
- Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dich hoặc nguyên
sinh chất trong tinh trùng.
- Có pH thích hợp với pH tinh dịch.
- Giúp tinh trùng sống nhƣng không vận động.
Chất bảo quản khác nhau theo loài, và quan trọng nhất là phải giữ đƣợc tinh trùng
ở trạng thái bất động. Chất bảo quản có thể đƣợc pha chế trƣớc và giữ trong tủ lạnh
trƣớc khi sử dụng. Tỷ lệ pha loãng tối ƣu cần đƣợc xác định theo từng loài [50].
Công thức của chất bảo quản không nhất thiết phải phức tạp. Một vài dung dịch
đơn giản nhƣ dung dịch chứa NaCl, NaHCO
3
và Leceithin [39] cũng cho hiệu quả
tốt. Ở một số loài cá biển nhƣ cá Trích Clupea harengus và cá Đối Mugil cephalus
[16]; các tác giả đã sử dụng thành công nƣớc biển pha loãng cho thêm chất chống
đông. Những nghiên cứu gần đây trên cá Rô phi cho thấy sử dụng nƣớc pha thêm
5% Methanol và 15% sữa bột để pha loãng sẹ cũng có kết quả [39].
Gần đây một số tác giả đã sử dụng đƣờng để làm chất bảo quản cho một số loài
cá nƣớc ngọt. Horváth và ctv [28] đã sử dụng chất bảo quản với thành phần là
350mM glucose, 30mM Tris, pH 8,0 và 10% Methanol cho cá Chép. Yavas và

Bozkurt [55] sử dụng 350mM glucose, 30mM Tris, và 5% Glycerol (pH = 8,0) cho
10

cá Trắm cỏ và kết quả tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau bảo quản là 85,6±2,8%, hoạt
lực tinh trùng sau bảo quản là 83,4±2,1%.
Tóm lại, việc lựa chọn và sử dụng chất bảo quản là một khâu quan trọng góp
phần vào sự thành công của kỹ thuật bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.
Tỷ lệ pha loãng: Mật độ tinh trùng trong tinh dịch pha loãng ảnh hƣởng đến quá
trình đông lạnh, khi pha loãng tinh dịch, tinh dịch nào có mật độ tinh trùng cao thì
khả năng đông lạnh kém hơn tinh dịch có mật độ tinh trùng thấp [6].
Tỷ lệ pha loãng giữa tinh dịch và chất bảo quản có thể từ 1:1 đến 1:20, khi tỷ lệ
pha loãng lớn hơn 1:20 thƣờng cho tỷ lệ hoạt động của tinh trùng bảo quản thấp [7].
Theo Stein và Bayrle [45] tỷ lệ thích hợp cho cá Chép là 1:3; Legendre và Billard
[33] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá Hồi là 1:3; Harvey [25] tỉ lệ pha
loãng thích hợp cho tinh dịch cá Rô phi là 1:5.
Việc lựa chọn đƣợc tỷ lệ pha loãng thích hợp sẽ nâng cao sức sống của tinh trùng
khi rã đông, vì vậy nghiên cứu để đƣa ra các tỷ lệ thích hợp cho từng loài là cần
thiết [42].
Chất chống đông và nồng độ chất chống đông: Chất chống đông (chất bảo vệ
tế bào) là những hợp chất nhỏ có khả năng xâm nhập vào các tế bào tinh trùng. Chất
chống đông đƣợc thêm vào chất bảo quản để hạn chế tối đa ảnh hƣởng của sốc
nhiệt, giúp tinh trùng sống lâu trong quá trình làm lạnh và rã đông. Một số nghiên
cứu cho thấy, ở nhiệt độ thấp, khi trong dung dịch bảo quản không có chất chống
đông, chất nguyên sinh của tinh trùng có hiện tƣợng bị kết lại và tế bào bị phá hủy,
dẫn đến tinh trùng bị chết. Hiện nay, các chất chống đông thƣờng đƣợc sử dụng
nhất là DMSO, Glycerol và Methanol.
Một việc quan trọng nữa là nồng độ chất chống đông. Nồng độ chất chống đông
phải thích hợp thì mới bảo vệ đƣợc các tế bào tốt nhất trong quá trình làm lạnh và rã
đông. Nồng độ các chất chống đông của các loài cá khác nhau thì khác nhau, và
nồng độ tốt nhất cho các loài cá thƣờng từ 10-15% bao gồm cả DMSO, Glycerol và

Methanol.
11

Trong nghiên cứu bảo quản tinh cá Rô phi vằn O. niloticus của Rana và
McAndrew [43] cho thấy DMSO có độc tố nặng hơn Methanol khi so sánh các mức
nồng độ giống nhau. Có loài có phổ DMSO khá rộng nhƣ cá Đù đỏ (Sciaenop
ocellatusa) 7-15%, nhƣng cá Hồi (Salmonid sp) chỉ cho kết quả tốt khi sử dụng
Methanol 10%. Tóm lại, việc lựa chọn chất chống đông và nồng độ các chất chống
đông là một trong những yếu tố góp phần vào thành công của bảo quản tinh trùng
trong nitơ lỏng.
Chất bảo vệ màng tế bào: Một lƣợng lớn các hợp chất hoặc hỗn hợp sinh học
đƣợc trộn trong dung dịch làm lạnh với mục đích bảo vệ, ổn định bề mặt ngoài tế
bào tinh trùng trong quá trình bảo quản. Baynes và Scott [14] đã chứng minh rằng
việc thêm 5-10% lòng đỏ trứng gà vào dung dịch bảo quản sẽ làm tăng khả năng thụ
tinh của tinh trùng sau khi rã đông.
Thời gian cân bằng: Thời gian cần thiết để chất chống đông thẩm thấu vào tinh
trùng gọi là thời gian cân bằng [51]. Trong hầu hết các trƣờng hợp, thời gian cân
bằng có thể kéo dài từ 10 đến 30 phút nhƣng có thể thay đổi phụ thuộc vào chất
chống đông đƣợc sử dụng. Nếu nồng độ chất chống đông cần thiết gây độc cho tế
bào thì thời gian cân bằng để chất chống đông thẩm thấu vào tế bào cần đƣợc rút
ngắn. Một số tài liệu cho rằng, thời gian cân bằng là không cần thiết. Rana và
McAndrew [43] đã kết luận thời gian cân bằng ảnh hƣởng không có ý nghĩa tới hoạt
lực tinh trùng cá Rô phi (O. niloticus) sau khi rã đông, vì trƣớc khi làm lạnh thời
gian từ khi pha loãng đến khi đóng cọng đã mất khoảng 30 phút.
Tốc độ hạ nhiệt: Một trong những yếu tố quan trọng trong kỹ thuật bảo quản
lạnh là tốc độ hạ nhiệt. Tốc độ hạ nhiệt phải đủ chậm để cho nƣớc ra khỏi các tế bào
để các tinh thể băng không hình thành trong các tế bào và nhanh chóng gia tăng
nồng độ muối trong các tế bào để không làm hỏng các thành phần trong tế bào [37,
38]. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hƣởng lớn đến thành công của việc bảo quản tinh, vì vậy
cần tìm đƣợc chu trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu. Có nhiều

phƣơng pháp làm lạnh hỗn hợp tinh dịch trƣớc khi chuyển vào lƣu giữ trong nitơ
lỏng. Có thể làm lạnh trong nitơ lỏng cách bề mặt của nó khoảng 3-10 cm, hoặc làm
12

lạnh trong đá. Thuận lợi hơn cả là làm lạnh bằng chƣơng trình hạ nhiệt đƣợc cài sẵn
trong máy tính. Tốc độ làm lạnh đƣợc điều chỉnh với các tốc độ khác nhau tùy theo
loài. Trong thực tế, phƣơng pháp làm lạnh thành công và thực tế nhất về bảo quản
lạnh tinh trùng cá là phƣơng pháp làm lạnh hai bƣớc. Bƣớc đầu tiên là giảm nhiệt
độ của tinh trùng từ nhiệt độ lƣu giữ (ví dụ, nhiệt độ lƣu giữ bình thƣờng tinh trùng
cá Hồi là 4
o
C) đến khoảng -70
o
C. Tốc độ làm lạnh tối ƣu cho tinh trùng từng loài
khác nhau ở bƣớc này là khác nhau. Bƣớc thứ hai là đƣa tinh dịch vào nitơ lỏng -
196
o
C [21].
Theo Forgason và ctv [23] phƣơng pháp làm lạnh trong hơi nitơ lỏng ở mức cao
vào khoảng 5-10cm trong khoảng thời gian từ 10-12 phút sau đó chuyển từ từ
xuống nitơ lỏng, phƣơng pháp này không cần thời gian cân bằng. Moczarski [40]
cũng làm lạnh tinh cá Chép Nhật bản trên bề mặt và cách nitơ lỏng 3-5cm. Phƣơng
pháp của Bouysson và Chupin [10] đã thử nghiệm trên các mức nhiệt độ khác nhau
trong nitơ lỏng nhƣ: nhiệt độ cách bề mặt nitơ lỏng 2mm là -80
o
C xuống -85
o
C,
4mm là -70
o

C xuống -75
o
C, và 20mm là -50
o
C xuống -55
o
C. Dung dịch tinh cá Hồi
có chứa 7-10% DMSO làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt 30-35
o
C / phút bằng chƣơng
tình đã cài đặt sẵn trong máy tính, kết quả từ 0-98% trứng đƣợc thụ tinh. Tốc độ hạ
nhiệt ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần tìm ra qui trình hạ nhiệt
phù hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu.
Phƣơng pháp rã đông: Sau quá trình bảo quản, tinh cá cần phải đƣợc rã đông để
đƣa vào sử dụng. Do điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp, tinh trùng đang ở trạng
thái kết tinh nên cần áp dụng phƣơng pháp rã đông chính xác mới đảm bảo tinh
trùng sống lại sau khi rã đông. Tùy vào các loài cá khác nhau, tùy vào việc sử các
chất chống đông và tùy vào điều kiện thí nghiệm mà tiến hành rã đông ở các thang
nhiệt độ và thời gian rã đông khác nhau. Ví dụ Horvath và Urbanyri [27] rã đông
tinh trùng cá Trê ở 40
o
C trong 5 giây, tỷ lệ vận động của tinh trùng đạt 50%. Yasui
và ctv [54] rã đông tinh trùng cá Chạch Misgurnus anguillicaudatus ở nhiệt độ 25
o
C
trong 10 giây cho kết quả thụ tinh là 47%. Le và ctv [32] rã đông tinh trùng cá Đù
13

vàng Larimichthys polyactis ở nhiệt độ 37
o

C trong 30 giây, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở
sau 1 tuần lần lƣợt là 45,7±3,2% và 27,2±5,0% .
Dựa vào những đặc điểm trên của tinh trùng, ngày nay ngƣời ta nghiên cứu ứng
dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng nguyên tinh dịch trong các dụng
cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp và kín đã có thể kéo dài tuổi thọ của tinh trùng một cách
hiệu quả. Đặc biệt là phƣơng pháp bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng đang đƣợc
nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới.
1.3. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng
1.3.1. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trên thế giới
Tình hình nghiên cứu chung: Trƣớc những năm 50 của thế kỉ XX, việc lƣu giữ
tinh ban đầu chỉ là việc cất giữ tinh trong điều kiện nhiệt độ thấp nhƣ tủ lạnh hay đá
khô. Tuy nhiên, kể từ khi công trình của Blaxter đƣợc công bố vào năm 1953 trên
đối tƣợng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã đƣợc tiến hành phổ biến
trên nhiều đối tƣợng thủy sản. Cho đến nay nhiều công trình nghiên cứu bảo quản
tinh đƣợc tiến hành trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [47] với
việc sử dụng các dung dịch muối làm chất bảo quản [31] và một số chất làm chất
chống đông nhƣ DMSO (Dimethyl sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol,
Trehalose. Tóm lại, ở các đối tƣợng khác nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh
khác nhau. Và có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng đã đƣợc
nghiên cứu thành công và công bố rộng rãi nhƣ cá Trích [16]; cá Hồi ([14], [15],
[17]); cá Mú đen [24]; cá Trê châu Âu [34]; cá Chình Nhật [41]; cá Chép ([35],
[29], [49], [48], [30]); cá Đù vàng [32] …….
Đối với cá nƣớc ngọt: Năm 1986, Chao và ctv [18] công bố kết quả bảo quản
tinh 6 loài cá Rô phi bao gồm Oreochromis aureus, O. mossambicus, O. niloticus,
Tilapia zilli, cá Rô lai giữa O. niloticus và O. mosambicus, và Oreochromis spp. Độ
pH của tinh dịch các loài cá Rô phi dao động từ 6,2-8,2. Dung dịch bảo quản bao
gồm 15% sữa và 5% Methanol. Sau khi pha loãng tinh với tỉ lệ 1:1 nhanh chóng
làm lạnh xuống -35
o
C và hạ tiếp tục với tốc độ 5

o
C/ phút cho tới -70
o
C rồi chuyển
vào giữ trong nitơ lỏng. Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt đƣợc sau 22 ngày
14

bảo quản là 72,7%, đối chứng là 85,7%; với con lai đạt đƣợc tỉ lệ thụ tinh là 93,4%,
đối chứng là 90,0%. Riêng cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) sau 304 ngày bảo quản,
tinh vẫn có khả năng thụ tinh.
Năm 1978, Stein và Bayrle [45] tiến hành bảo quản tinh trùng các loài cá Hồi
nƣớc ngọt theo phƣơng pháp của Nagase. Dung dịch bảo quản bao gồm 10%
DMSO và hai chất bảo quản khác nhau; chất bảo quản 1 có các thành phần nhƣ sau:
750 mg NaCl, 200 mg NaHCO
3
, 53 mg Na
2
HPO
4
, 23 mg MgSO
4
.7H
2
O, 38 mg
KCl, 46 mg CaCl
2
, 100 mg glucose, 500 mg glycine, 100 ml nƣớc cất và 200 ml
lòng đỏ trứng gà; chất bảo quản 2 gồm có: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO
3
, 38 mg

KCl, 100 mg glucose, 100 ml nƣớc cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà. Tỉ lệ pha loãng
tinh dịch là 1:3, tinh đƣợc lƣu trữ trong nitơ lỏng. Sau 7 ngày bảo quản, tinh đƣợc rã
đông nhanh trong 10 ml dung dịch NaHCO
3
1%. Có hơn 70% tinh trùng hoạt động
sau khi rã đông, thời gian hoạt động của tinh trùng chỉ trong 30 giây.
Năm 2000, Horváth và Urbanyi [27] đã công bố kết quả về bảo quản tinh trùng
cá Trê (Clarias gariepilus). Tinh đƣợc thu bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo
quản gồm 6% đƣờng fructose và 10% chất chống đông DMSO, độ pH đƣợc điều
chỉnh bằng dung dịch đệm NaHCO
3
0,1N. Tinh sau khi pha loãng với dung dịch
theo tỉ lệ 1:1, đƣợc cân bằng ở nhiệt độ 3
o
C trong 10 phút. Sau đó chuyển tinh vào
cọng rạ thể tích 0,25 ml và làm lạnh theo chƣơng trình chạy nhiệt áp dụng theo
Magyary và ctv [36]. Phƣơng pháp rã đông nhanh (trong thời gian 5 giây) ở nhiệt
độ trong tủ ấm 40
o
C. Kết quả thụ tinh là 90,0-95,0% so với đối chứng hoạt lực tinh
trùng sau khi rã đông là 50,0%.
Năm 2003, Horváth và ctv [29] công bố kết quả về bảo quản tinh trùng cá Chép
bằng cách sử dụng 5 chất bảo quản là sucrose, glucose, fructose, KCl và dung dịch
muối đẳng trƣơng, hai chất chống đông đƣợc sử dụng là DMSO và Methanol 10%.
Kết quả là glucose và fructose kết hợp với Methanol 10% cho tỉ lệ thụ tinh cao nhất
lần lƣợt là 74,0±15,0% và 71,0±12,0%.
Năm 2009, Yasui và ctv [54] đã công bố kết quả về ảnh hƣởng của phƣơng pháp
rã đông lên hoạt lực của tinh trùng cá Trắm cỏ Ctenophayryngodon idella sau khi
15

bảo quản trong nitơ lỏng bằng các cách rã đông khác nhau, kết quả là rã đông các cọng rạ
ở nhiệt độ 35◦C trong 30 giây cho phần trăm hoạt lực cao nhất 83,4±2,1%.
Đối với các loài cá nƣớc mặn lợ: Blaxter là ngƣời đầu tiên thành công trong
việc nghiên cứu bảo quản tinh. Năm 1953, ông đã nghiên cứu bảo quản thành
công tinh trùng cá Trích (Lupea herenffus), thời gian bảo quản là sáu tháng ở nhiệt
độ -70
o
C trong dung dịch nƣớc biển, nồng độ 0,34% và chất chống đông Glycerol
12,5%, tỷ lệ pha loãng tinh dịch với nƣớc biển là 1:4. Kết quả thu đƣợc là 80-85,0%
trứng thụ tinh với tinh trùng đƣợc bảo quản sau khi rã đông và cho thụ tinh.
Cho đến nay đối tƣợng cá biển còn chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều, khoảng 30 loài
đã và đang đƣợc nghiên cứu [47], nhiều nhất là cá Song (Epinephlus taurina). Theo
nghiên cứu của Withler và ctv [53] ở cá Song. Dung dịch bảo quản gồm có hai chất
bảo quản, chất bảo quản 1 gồm 7,65 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO
3
, 251 mg buffer hòa
trong 1000 ml nƣớc cất, chất bảo quản 2 bao gồm 6,57 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO
3
,
251 mg buffer hòa trong 1000 ml nƣớc cất. Chất chống đông là DMDO 10%. Sau
khi cân bằng ở 5-10
o
C tinh đƣợc chuyển vào trong các cọng rạ có thể tích 1 ml và
lạm lạnh trong hơi nitơ lỏng. Nhiệt độ rã đông ở 21-26
o
C trong tủ ấm. Kết quả thu
đƣợc là khoảng 50-75% tinh trùng có hoạt lực sau khi rã đông.
Năm 2011, Le và ctv [32] đã công bố bảo quản tinh cá Đù vàng trong nitơ lỏng.
Chất bảo quản là artificial seminal plasma (ASP), chất chống đông là 10% ethylene
glycol (EG) và bảo quản theo qui trình hạ nhiệt từ hơi nitơ lỏng (-76

o
C) rồi đến nitơ
lỏng (-196
o
C). Sau đó, các cọng rạ đƣợc rã đông ở nƣớc ấm (37
o
C). Kết quả thu
đƣợc là tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần và 1 năm rã đông lần lƣợt là 45,7±3,2%,
27,2±5,0% và 37,5±4,4%, 27,2±5,0%.
Cùng trên một đối tƣợng, nhƣng ở trong từng điều kiện cụ thể sẽ có một quy
trình bảo quản lạnh khác nhau. Ví dụ nhƣ cùng trên một đối tƣợng là cá Hồi,
Stein và Bayrle [45] đã bảo quản tinh trùng các loài cá Hồi nƣớc ngọt theo phƣơng
pháp của Nagase. Sau 7 ngày bảo quản, tinh đƣợc rã đông nhanh trong 10 ml dung
dịch NaHCO
3
1%. Hơn 70,0% tinh trùng hoạt động sau khi rã đông, thời gian hoạt
động của tinh trùng 30 giây. Trong khi đó, Cabrita và ctv [17] đã tiến hành nghiên
16

cứu bảo quản tinh trùng cá Hồi vân trong cọng rạ có thể tích lớn 0,5 ml, 1,8 ml và 5
ml. Tỉ lệ pha loãng tinh dịch là 1:3 trong dung dịch theo Erdahl và Graham với 7%
DMSO, 10% lòng đỏ trứng và 7,5 mg/ml promine. Kết quả là tỉ lệ thụ tinh ở cọng rạ
0,5 ml là 84,0%, cọng rạ 1,8 ml là 73,2%, cọng rạ 5 ml là 73,0%.
Cùng trên đối tƣợng là cá Chép, nhƣng Irawan và ctv ở Thái Lan [30] sử dụng 6
chất bảo quản CCSE1-CCSE6 và 3 chất chống đông DMSO, Propylene glycol và
Methanol, kết quả là CCSE2-DMSO cho tỷ lệ thụ tinh cao nhất 73,6±6,5% . Trong
khi đó, Horváth và ctv ở Hungary [29] sử dụng 5 chất bảo quản là sucrose, glucose,
fructose, KCl và dung dịch muối đẳng trƣơng, hai chất chống đông đƣợc sử dụng là
DMSO và Methanol 10%. Kết quả là glucose và fructose kết hợp với Methanol
10% cho tỉ lệ thụ tinh cao nhất lần lƣợt là 74,0±15,0% và 71,0±12,0%.

Kurokura và ctv [31] nghiên cứu trên cá Chép Nhật Bản đạt đƣợc tỉ lệ thụ tinh là
68,6%. Cũng trên cá Chép Nhật Bản [10] đã bảo quản thành công với kết quả đạt
đƣợc là 53,0±6,0% tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ nở đạt 75,0±9,0%.
Qua đó, ta thấy đƣợc rằng ở các đối tƣợng khác nhau sẽ có quy trình bảo quản tinh
khác nhau, và cùng trên một đối tƣợng nhƣng tùy vào điều kiện cụ thể mà sẽ có
phƣơng pháp bảo quản khác nhau. Vì vậy, mặc dù cá Chép là một trong những đối
tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều trên thế giới, nhƣng việc tiếp tục nghiên cứu để đƣa ra
quy trình cụ thể phù hợp với điều kiện thực tế của từng quốc gia là hết sức thiết thực.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bảo quản tinh cũng đã đƣợc nghiên cứu, song chủ yếu là trên các
đối tƣợng là gia súc. Trong đó, phƣơng pháp bảo quản tinh chủ yếu là bảo quản
ngắn hạn, tinh dịch đƣợc cất giữ ở nhiệt độ thấp có thể đƣợc duy trì khả năng thụ
tinh trong thời gian 1 đến 2 tuần [11]. Các nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mới
đƣợc thực hiện từ những năm 2000, nhƣng phần lớn chỉ bảo quản trong thời gian
ngắn, khoảng một vài ngày.
Năm 2002, tác giả Hồ Kim Diệp và ctv [2] đã công bố kết quả nghiên cứu bảo
quản tinh một số loài cá nƣớc ngọt nhƣ cá Chép, Trắm cỏ, Mrigan, cá Bỗng. Kết
quả nhƣ sau: tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng cá Chép đạt đến 81,7%, tỉ lệ nở cá con là
17

75,0%; cá Trắm cỏ có tỉ lệ từ 47,3% đến 97,4%, tỉ lệ nở cá con là 77,0%; cá Bỗng tỉ
lệ thụ tinh từ 34,7% đến 51,7%, tỉ lệ nở cá con là 74,0%.
Năm 2003, Nguyễn Minh Thành và ctv [9] đã công bố kết quả đề tài nghiên
cứu bảo quản tinh cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong nitơ lỏng.
Nghiên cứu sử dụng hai chất bảo quản là Hanks và Hanks không canxi, chất
chống đông là DMSO 10%, tỉ lệ pha loãng là 1:6 và 1:9. Tinh dịch pha loãng
đƣợc làm đông trong máy đông tinh Ncool LM10, sau đó nhúng thẳng vào nitơ
lỏng. Các cọng rạ chứa tinh đông đƣợc rã đông sau thời gian bảo quản từ 7 ngày
đến 3 tháng trong nitơ lỏng. Các cọng rạ đƣợc nhúng trong nƣớc ấm 40◦C trong
10 giây để rã đông đƣợc kiểm tra hoạt lực và thụ tinh với trứng ngay sau khi rã

đông. Tỷ lệ thụ tinh trung bình là 30,3% đối với dung dịch Hanks và 44,5% đối
với dung dịch Hanks không canxi.
Bên cạnh đó, một số công trình nghiên cứu của sinh viên về bảo quản tinh trùng
cá chép trong nitơ lỏng cũng đƣợc công bố [4, 6, 7, 10]. Tuy nhiên, các kết quả thu
đƣợc chỉ là bƣớc đầu, còn khá sơ khai vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu để đƣa ra quy
trình cụ thể hơn cho từng đối tƣợng là điều hết sức cần thiết.












18

Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn sinh học nghề cá, khoa Nuôi trồng thủy sản.
Thời gian: 20/2/2012 đến 2/6/2012.
Đối tƣợng nghiên cứu: cá Chép Cyprinus carpio.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sơ đồ quy trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Chép trong nitơ lỏng.

Hình 2.1. Quy trình nội dung nghiên cứu.
Chuẩn bị dụng cụ, vật liệu thí nghiệm
Kiểm tra hoạt lực, mật độ
Thu mẫu
Xác định đặc điểm sinh học
Chất bảo quản và chất chống đông
Pha loãng
Cân bằng nhiệt ở 4-6
o
C
Đóng và hàn cọng rạ
Hạ nhiệt theo các bƣớc

Bảo quản trong nitơ lỏng
Rã đông và kiểm tra hoạt lực
Nhận xét và thảo luận