báo cáo ''''đánh giá các đặc tính probiotic của bacillus trong ống nghiệm phân lập từ cháo lên men tự nhiên từ vùng mông cổ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 
BÀI BÁO CÁO
SEMINAR CHUYÊN NGÀNH
ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA
BACILLUS TRONG ỐNG NGHIỆM PHÂN LẬP TỪ
CHÁO LÊN MEN TỰ NHIÊN TỪ VÙNG MÔNG CỔ
CỦA TRUNG QUỐC

GV hướng dẫn: Thầy Nguyễn Văn Minh
Cô Dương Nhật Linh
Nhóm sinh viên:
Ngô Văn Quang 30700406
Hồ Sơn Hải 30700106
Văn Đặng Hồng Cẩm 30700035
Thái Duy Tân 30700442
Nguyễn Anh Tôn 30700536
Đào Minh Thịnh 30660234
TPHCM, ngày 29 tháng 9 năm 2010.
MỤC LỤC
Danh mục các bảng 3
Lời mở đầu 4
Phần 1: Probiotic 5
I. Khái niệm, các định nghĩa :……………………………………………5
1 Giới thiệu về probiotic:………………………………………….5
2. Các định nghĩa:………………………………………………….6
II. Tính an toàn của probiotic:…………………………………………….6
1. Tính an tòan về probiotic trước đây và sau này:……………………6
2. Tính an tòan về probiotic trên động vật:……………………………8

3. Tính an tòan về probiotic trên người:………………………………9
4. An tòan của vi khuẩn đề kháng kháng sinh:……………………… 10
5. Nghiên cứu lâm sàng:………………………………………………11
6. Giám sát dịch tễ học:……………………………………………….11
Phần 2: Đánh giá các đặc tính probiotic của Bacillus trong ống nghiệm phân lập từ
cháo lên men tự nhiên ở Inner Mongolia của Trung Quốc 12
I. Giới thiệu 12
II. Nguyên liệu và phương pháp 13
1. Phân lập Bacillus từ cháo lên men tự nhiên…………………… 13
2. Nhận dạng 16 rDNA…………………………………………… 13
3. Thử nghiệm hoạt động kháng khuẩn……………………………….15
4. Các thử nghiệm khuếch tán agar………………………………… 15
Phần 3: Kết quả và thảo luận 16
I. Sự cô lập và nhận diện của vi khuẩn Bacillus bằng kết quả phân tích trình tự
gen 16S rDNA…………………………………………………………16
II. Hiệu quả của việc mô tả khả năng vận chuyển của tế bào thực vật của
Bacillus…………………………………………………………… 17
III. Sự đề kháng muối mật…………………………………………………18
IV. Hoạt tính kháng sinh……………………………………………… 19
V. Kết luận…………………………………………………………………20
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bàng 1. Một số vi khuẩn sử dụng làm probiotic và có khả năng gây bệnh
Bảng 2. Nhận dạng và phân loại 33 chủng Bacillus phân lập từ cháo lên men tự nhiên
ở Inner Mongilia dựa trên trình tự 16S rDNA
Bảng 3. Tỷ lệ sống sót của các chủng Bacillus phân lập được lựa chọn từ cháo lên
men tự nhiên ở Inner Mongolia trong môi trường nuôi cấy ở pH 2.5 và dịch
dạ dày nhân tạo ở pH 2.0
Bảng 4. Khả năng chịu mật của 4 chủng Bacillus được chọn
Bảng 5. Khả năng chịu mật của Bacillus licheniformis IMAUB1002 ở mức độ mật
khác nhau

Bảng 6. Vùng ức chế (mm) của 4 chủng Bacillus được chọn
Probiotics thường được sử dụng như là chất bổ sung hữu hiệu đối với động vật bằng
cách cải thiện các vi khuẩn ký sinh đường ruột “cân bằng” (Fuller 1992). Hiện tại không
có lớp chung cho vi khuẩn probiotic và các loại hình thương mại nhất hiện có là vi khuẩn
acid lactic và vi khuẩn bifidus (Kleerebezem and Vaughan 2009). Có nhiều nghiên cứu
tập trung vào Bacillus spp, Bifidobacteriumspp cho thực phẩm chức năng sử dụng chế
phẩm sinh học (Kabir et al. 1997; Singh et al. 1997). Ngoài ra, một số chủng Bacillus
cũng cho thấy tiềm năng để có probiotic (Cavazzoni and Adami 1993; Kumprecht and
Zobac 1996).
Cháo lên men tự nhiên (acidic-guel), một thực phẩm lên men truyền thống ở Inner
Mongolia của Trung Quốc, có thể sử dụng như là nguồn tiềm năng để cô lập probiotics.
Nó được sản xuất tại hộ gia đình từ nguyên vật liệu ngũ cốc khác nhau như: cỏ đuôi
chồn, hạt kê và gạo. Hạt kê và gạo được lên men tự nhiên bởi nước bã canh chua trong
một bình ở nhiệt độ phòng để qua đêm và sau đó được sử dụng để nấu cho đến khi chín.
Do đó, cháo lên men được làm đồ ăn với cả hai hương vị thú vị và có chức năng nâng cao
sức khỏe.
Bacillus là một chi của vi khuẩn hình que và là chi của bộ phận Firmicutes. Bacillus
là một loài vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi, và xét nghiệm dương tính đối với
enzyme catalase (Turnbull 1996). Bacillus được xem là dễ dàng lây lan từ môi trường tự
nhiên qua nhiều loại thức ăn thực vật (Roberts et al 1982). Một số chủng vi khuẩn
Bacillus đã được phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống bao gồm ngũ cốc
khác nhau, họ đậu và thực vật dựa trên các loại thực phẩm lên men (Gadaga et al. 1999;.
Roy et al. 2007; Valero et al. 2007). Đặc tính chức năng của các loại thực phẩm ngũ cốc
lên men truyền thống dựa trên liên kết chặt chẽ giữa vi sinh vật có lợi và vi khuẩn Bacillus
đã chứng minh là gây một tác dụng đồng lên men với các vi sinh vật khác (Blandino et al.
2003;. Mante et al. 2003).
So với loài lactobacillus mà chủ yếu nhạy cảm với điều kiện sinh lý bình thường,
một số chủng trực khuẩn có thể tồn tại ở nhiệt độ cao, độ chua của dạ dày và các axít mật
(Hyronimus et al. 2000).Bacillus coagulans Ganeden BC30
TM

được chứng minh là an
toàn cho con người (Endres et al. 2009). Hơn nữa, Bacillus subtilis (Hong et al. 2009) đã
được phân lập từ đường tiêu hóa của con người và hội sinh ở ruột. Do đó, trực khuẩn cho
thấy một cái mới lạ và nguồn đầy hứa hẹn của các vi khuẩn probiotic.
Probiotic được định nghĩa là vi sinh vật sống có thể chống lại dạ dày, mật, và tuyến
tụy tiết ra (Del piano et al. 2006). Những đặc điểm có thể được quan sát trong ống nghiệm
và có thể được sử dụng để lựa chọn các chủng (Salminen và Wright von et al.1998). Mục
tiêu của nghiên cứu để đánh giá tính chất tiềm năng probiotic (kháng pH thấp, dịch dạ
dày mô phỏng, muối mật và hoạt tính kháng khuẩn) của một số trực khuẩn phân lập từ
cháo lên men tự nhiên trong ống nghiệm với một nỗ lực để đưa vào danh sách có thể sử
dụng được trong y học như là probiotics.
Phần 1: PROBIOTIC
I. Khái niệm, các định nghĩa về probiotics:
1.Giới thiệu về probiotic:[1]
Theo (Fuller,1922) , probiotic là những vi khuẩn sống mà nó có ảnh hưởng tốt đến
vật chủ bằng cách cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột và có lợi cho vật chủ. Định nghĩa này
được mở rộng ra probiotic bao gồm cả một vi khuẩn hay một hệ vi khuẩn sống được dùng
cho người hay động vật ảnh hưởng tích cực đến vật chủ bằng cách cải thiện tính chất hệ vi
khuẩn đường ruột giúp cho dễ tiêu hóa ,chúng cũng tác động trực tiếp đến hệ tiêu hóa .
Trong giới hạn của sự nghiên cứu , probiotic có giới hạn rõ ràng là hệ vi khuẩn chỉ
phù hợp với một hoặc một vài sản phẩm (theo WHO, 1994).
Về lịch sử thì vi khuẩn và nấm men rất có ích trong nông nghiệp và khoa học dinh
dưỡng . Ví dụ phổ biến như là sử dụng vi khuẩn (chủ yếu là vi khẩn Lactic) cho những sản
phẩm lên men như cải bắp (món dưa cải) và những sản phẩm lên men từ sữa như sữa
chua, ngoài ra còn có phomat và kefir. Còn nấm men (chủ yếu là Saccharomyces
cerevisiae) cho sản phẩm như bánh mì, bia và rượu.
Hệ thống nghiên cứu trong probiotic cho người bắt đầu sử dụng vào thế kỉ 20.
Elie Metchnikoff là nhà sinh học Nga người mà làm việc vào khoảng 1900 ở Institut
Pasteur tại Pháp học được sự màu nhiệm, kỳ vọng có đời sống thọ của người Cô –đắc ở
Bungari. Ông ấy kỳ vọng vào việc nâng cao tuổi thọ lên 115 năm và họ đã sử dụng nhiều

sản phẩm lên men từ sữa. Ông tìm ra tên thích hợp cho sự lên men Bacillus bulgaricus và
sau đó phân loại là Lactobacillus bulgaricus mà được sử dụng lần nữa giúp giảm được
bệnh đau dạ dày ở người sớm vào năm 1920.
Có một chủ đề hấp dẫn về probiotic trong suốt 10 năm từ 1960-1970 khi họ đã tái
phát hiện khoa học dinh dưỡng ở người và động vật. Sản phẩm có hiệu lực đầu tiên về
khoa học dinh dưỡng trên động vật là đáp ứng nhu cầu đặc trưng là chất cho thêm vào
thức ăn của động vật. Không xuất hiện ở thị trường châu Âu cho tới giữa 1980.
Ngày nay, nguồn khoa học dinh dưỡng hiện đại ở động vật có sự xuất hiện đầy đủ
những định nghĩa của probiotic bao gồm nhóm vi khuẩn Lactic, bào tử Bacillus và nấm
men.
2. Các định nghĩa:
Probiotic là những vi sinh vật như vi
khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm
với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột
của sinh vật chủ (Parker, 1974).
Định nghĩa của Guamer và Schaafsma (1998):
" những vi sinh vật sống, nếu được đưa vào có thể với
một số lượng đủ có thể đem lại sức khoẻ cho người sử dụng”.
Định nghĩa của FAO/WHO[4]: “Probiotic là những vi thể
sống mà với số lượng được kiểm soát hợp lý sẽ giúp bồi bổ
sức khoẻ cho người tiếp nhận”.
Vậy: Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm
men nếu được đưa vào cơ thể với số lượng được kiểm soát
hợp lí sẽ đem lại sức khỏe cho người sử dụng.
Ngoài ra, chúng có thể được thêm vào sản phẩm lên men sữa, và cũng góp một phần
trong việc hình thành sản phẩm lên men, hoặc được bổ sung dưới dạng bột đông khô.
II. Tính an toàn của probiotics:
1. Tính an toàn về probiotic trước đây và hiện nay:[2]
Hiện tại, thông thường probiotic có lợi ích chung là bảo vệ hệ đường ruột và cải thiện
khả năng tiêu hóa. Những chủng vi khuẩn khác thì đang được nghiên cứu cho khả năng

chữa trị bệnh viêm ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh, cải thiện bệnh tiêu chảy của những
bệnh nhân khác, ngăn ngừa bệnh sâu răng, và làm giảm bớt chứng dị ứng.
Đó là những yêu cầu đối với probiotic có vai trò trong sự miễn dịch và ngăn chặn
được sự phát sinh bệnh ung thư. Trong khi nghiên cứu tập trung trên probiotic sao cho phù
hợp với hệ vi khuẩn đường ruột bao gồm dùng qua đường uống, đường hô hấp trên hay
niệu sinh dục (dùng tại chỗ).
Probiotic thông thường là những chủng Lactobacillus và Bifidobacterium. Ngoại lệ
trong số đó cũng có loài Enterococcus và Saccharomyces .Các chủng này được coi là an
toàn bởi vì chúng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất bơ sữa. Có những vi khuẩn
khác không phải là probiotic thích nghi sống trong vùng ruột non và chúng thường là điều
kiện dẫn đến sự nhiễm trùng và gây bệnh.
Hệ vi sinh vật được xem là probiotic khi có ảnh hưởng tích cực trong sản phẩm bơ
sữa và những thực phẩm lên men truyền thống.
Thành phần của các sản phẩm probiotic trong nhiều thế kỉ thì không có tác dụng phụ
rõ ràng. Probiotic tiêu thụ trong thực phẩm và bổ sung vào chế độ ăn kiêng được công
nhận là an toàn theo GRAS.
Và không cần thực hiện thêm một nguyên tắc nghiêm ngặt nào hơn đối với probiotic,
mà đòi hỏi phải được cải thiện hoặc ngăn chặn bệnh khi đưa vào phân tích “lịch sử của
tính an toàn khi sử dụng “ như là một tiêu chuẩn phân loại an toàn đối với vi sinh vật thực
phẩm .
Trước đây định nghĩa này chưa được xác định pháp lý.
Để khắc phục tình trạng này, liên đoàn Quốc tế ngành sữa và thực phẩm châu Âu
cùng nhau xem xét hệ vi sinh vật và lịch sử sử dụng trong sản xuất thực phẩm. Kiểm tra
danh sách phân loại và ứng dụng của vi khuẩn Lactic ở loài Enterococcus và
Streptococcus, nấm men và nấm mốc.
Nó mở ra sự thay đổi định nghĩa về vi sinh vật là thêm vào hay bớt ra với những thay
đổi trong nguyên tắc phân loại. Bắt đầu là mục lục có hệ thống các vi sinh vật được cho là
hợp lý và cho là an toàn. Vì mức độ sử dụng của chúng trong thực phẩm thì không gây
bệnh
Nó quy định căn bản cho những chủng, loài, giống về tính an toàn và nguồn gốc từ

những giống vi khuẩn mới thì luôn luôn làm ra những sản phẩm probiotic mới.
Mức độ an toàn hợp lý của vi khuẩn probiotic mới thì không thể được giả đinh.
Trước khi kết hợp của những giống mới trong sản phẩm hiệu lực của chúng phải được
đánh giá cẩn thận và sự đánh giá phải dựa vào mức độ an toàn của vi sinh vật trong sản
phẩm.
Người tiêu dùng chống lại sự biến đổi gen của vi sinh vật trong sản phẩm. Như vậy
sự biến đổi gen của probiotic thì ít có khả năng được sử dụng gần đây. Ngoại trừ có thể có
của các ứng dụng lâm sàng.
Và đã chứng tỏ một probiotic Lactococcus lactics đã tiết ra cytokine interleukin (IL)-
10 ngăn ngừa viêm kết tràng trong thí nghiệm trên chuột.
Một chủng tái tổ hợp của Bacilus subtilis 2335 được dùng trong sản xuất protein với
tính chất kháng khuẩn và virus là tăng hiệu quả trị liệu trên chuột.
Từ việc thí nghiệm trên một loài chuột người ta đã phát triển hơn và ứng dụng điều
trị cho người theo đánh giá yêu cầu về mức độ an toàn đối với probiotic theo GMO.
Việc chứng minh tính hiệu lực của probiotics đã mang lại những cơ hội lớn để phát
triển đối với các sản phẩm cho người và động vật. Việc bổ sung những chủng vi khuẩn
mới trong thực phẩm và các sản phẩm điều trị cần được xem xét lại tính an toàn.
Những sản phẩm probiotic có yêu cầu về dinh dưỡng chức năng hoặc điều trị. Sự
khác biệt giữa những hình thức bổ sung vào chế đô ăn hoặc uống thuốc đang là những
thách thức để điều chỉnh phù hợp với người tiêu dùng.
Bằng chứng cho sự an toàn và hiệu quả của probiotic gần đây được đưa vào những
nghiên cứu nhỏ.Vi khuẩn lactic và nấm men dùng trong sản xuất các loại thực phẩm lên
men truyền thống được xem là an toàn mà không có bất kì tiêu chuẩn khoa học nào bởi vì
chúng tồn tại rất rộng rãi và sự hiện diện của chúng không gây bất lợi nào.
Sự giới thiệu một probiotic mới đòi hỏi phải có những chỉ tiêu an toàn, được đề ra
bao gồm bản chất của vi khuẩn, cũng như sự hoạt động của enzym, sự đề kháng kháng
sinh và sự nhiễm trùng.
2. Tính an toàn probiotic trên động vật: [2]
Việc sử dụng probiotic ở động vật và nuôi trồng thủy sản thì được đánh giá
cao.Probiotic giúp cải thiện sức khỏe của động vật, giúp tăng trọng và ngăn chặn tác nhân

gây bệnh. Sự lạm dụng kháng sinh trong ngành chăn nuôi và khả năng đề kháng kháng
sinh đã làm tăng mối quan tâm đến probiotics.
Việc sử dụng probiotics trong thực phẩm được đề xuất rằng có thể làm giảm nguy cơ
gây bệnh truyền từ thực phẩm sang người.
Thí nghiệm phân lập E.faecalis và E faecium từ người, gà, lợn có tính nhạy cảm đối
với 12 chủng vi sinh khác và mã hóa gen đề kháng bằng phương pháp PCR. Những sự kết
hợp của tính đề kháng kháng sinh được giám sát trong quá trình phân lập mẫu từ người và
động vật và các gen mã hóa cho tính đề kháng đã được phát hiện.
Ủy ban khoa học châu Âu (EC) về dinh dưỡng động vật (2003) đã khuyến cáo rằng,
những giống vi khuẩn trước đây có thể chấp nhận như một probiotic động vật thì bản chất
của gen đề kháng kháng sinh phải được xác định.
Đối với các loài biết được bản chất của sự đề kháng kháng sinh ví dụ như khả năng
đề kháng vancomycin của lactobacillus, cần xác nhận các gen đề kháng chưa được biết
đến.
Những chủng mang gen đề kháng kháng sinh được sử dụng trong y dược thì không
nên bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trừ khi vi khuẩn đó có đột biến trên gen đề kháng
kháng sinh. Chính sách này sẽ ngăn chặn được việc sử dụng các vi khuẩn có khả năng
truyền gen kháng kháng sinh sang các vi khuẩn khác làm probiotic bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi. Điều này cũng hạn chế ứng dụng của probiotic cho người.
Thực tế probiotic cần thiết được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trong nông nghiệp
và nuôi trồng thủy sản và an toàn đối với người.
Probiotic sử dụng cho động vật có nguy cơ nhiễm vào thức ăn của người hoặc truyền
khả năng đề kháng kháng sinh, do đó nó cần được chứng minh là an toàn đối với người và
động vật.
Sự bám dính lên niêm mạc đường tiêu hóa của vi khuẩn probiotic được xem là cơ
chế quan trọng để ngăn chặn các tác nhân gây bệnh.
3. Tính an toàn của probiotic trên người: [3]
Những tiêu chuẩn an toàn về probiotic được đề cập rất nhiều. Một vấn đề gây tranh
cãi là có nhất thiết probiotic phải bắt buộc có nguồn gốc từ người hay không.Tuy nhiên
hầu hết các chủng probiotic được sử dụng thành công hiện nay đều có nguồn gốc từ

người.Ngoài ra cũng có những tranh luận khác cho rằng chức năng hoạt động của
probiotic sẽ tốt hơn trong một môi trường mà có những tính chất ban đầu mà chúng được
phân lập( chẳng hạn như đường ruột của người). Khía cạnh an toàn bao gồm:
• Có định danh chính xác
• Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người
• Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh
• Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh
• Không liên quan tới bệnh tật, (nhiễm trùng nội mạc cơ tim,hay gây rối loạn tiêu
hóa)
• Không gây khử liên hợp muối mật
• Đặc điểm di truyền ổn định
• Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được.
Bảng 1: Một số vi khuẩn sử dụng làm probiotic và có khả năng gây bệnh
4. An toàn của vi khuẩn đề kháng kháng sinh: [3]
Việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi ở người và thú y đã góp phần gia tăng
tình trạng đề kháng kháng sinh và dẫn đến vấn đề nghiêm trọng trong việc điều trị nhiễm
trùng do tự nhiên hoặc mắc phải. Đề kháng tự nhiên được xem như là một đặc điểm tự
nhiên của loài, trong khi đó đề kháng mắc phải là do những đột biến về di truyền hay thu
được từ gen của những vi khuẩn đề kháng kháng sinh khác.
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng đề kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh,
nhưng trong hầu hết các trường hợp thì các chủng này không có khả năng truyền gen đề
kháng kháng sinh. Các chủng Lactobacillus có gen đề kháng kháng sinh không truyền
được chưa hẳn được xem là an toàn khi sử dụng một vài chủng Lactobacillus như L.
rhamnosus, L. casei có tính đề kháng tự nhiên dối với vancomycin.đã có một lịch sử được
sử dụng lâu dài một cách an toàn như là probiotic, và không có biểu hiện nào cho thấy
chúng truyền gen đề kháng này cho những vi khuẩn khác.
5. Nghiên cứu lâm sàng: [2]
Tên vi sinh vật Khả năng gây bệnh
Lactobacillus
Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các

bệnh nhân suy giảm miễn dịch
Streptococcus Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng cơ hội
Enterococcus Một vài chủng là tác nhân gây bệnh cơ hội với hoạt tính
và có khả năng đề kháng kháng sinh.
Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh và một số gây nhiễm trùng ở
người
Saccharosemyce
s
Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở
người.
Nghiên cứu lâm sàng ở người đã điều tra về hiệu lực khi uống probiotic với sự cân
bằng hệ vi khuẩn đường ruột và các dạng rối loạn. Cho đến gần đây có nhiều nghiên cứu
với cách bố trí không phù hợp và các số liệu không đáng tin cậy. Đặc điểm của cá nghiên
cứu không phù hợp bao gồm: (a) sự vắng mặt của một nhóm bệnh nhân cần kiểm soát ; (b)
các nhóm điều trị nhỏ; (c) các nhóm điều trị không được xác định; (d) phạm vi rộng lớn về
tuổi trong một nhóm điều trị; (e) đa dang về phương pháp điều trị kháng sinh; (f) thiếu
những tiêu chuẩn về liều lượng và thời gian; (g) các đối tượng với những triệu chứng xảy
ra đồng thời gây nhầm lẫn trong sự theo dõi của những tác dụng bất lợi. Các tiêu chuẩn
vàng là nghiên cứu được kiểm soát một cách ngẫu nhiên, các kết quả kế thừa phải được xử
lý, dùng giả dược, những nhóm không được điều trị.
Sự an toàn của probiotic liên hệ mật thiết đến hiệu quả của nó. Những nghiên cứu
thử nghiệm đối với probiotic mới sẽ đưa ra bằng chứng lý tưởng về sự hiện diện của nó,
tính bền hoặc là sự lấn át giữa những nhóm điều trị dùng giả dược trước khi điều trị và
những nhóm sau khi điều trị, số lượng các vi sinh vật và khả năng sống trong lúc khởi
phát và kết luận các thử nghiệm lâm sàng cũng phải được liệt kê.
6. Giám sát dịch tễ học: [2]
Hai nghiên cứu của Phần Lan đã điều tra tỉ lệ mắc bệnh nhiễm trùng kết hợp với
LAB. Trong nghiên cứu đầu tiên, phương pháp 16S rRNA được sử dụng để mô tả và định
danh những vi khuẩn lactic phân lập từ máu của người bệnh ở phía nam Phần Lan. Tổng
số ca nhiễm bởi lactobacilli thì rất thấp, và các chủng probiotic mới vừa được giới thiệu

trong sữa lên men không liên quan đến các trường hợp nhiễm trùng.
Trong một nghiên cứu tiếp theo, Lactobacilli phân lập từ bệnh nhân nhiễm trùng từ
năm 1989 đến năm 1994 được đối chiếu với các chủng trong chế biến sữa hoặc dược
phẩm.
Từ tổng số 5192 mẫu máu, 12 kết quả dương với lactobacilli , tỉ lệ 0.23%. Không có
trường hợp lâm sàng liên quan đến lactobacilli được sử dụng trong công nghiệp sữa.
Trong cả 2 nghiên cứu, bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lactic thì có mang thêm một căn bệnh
khác.
Trong một nghiên cứu gần đây , Salniment và cộng sự khảo sát tỉ lệ mắc bệnh nhiễm
trùng do lactobacilli trong dân số Phần Lan vào khoảng thời gian mức tiêu thụ chủng L.
rhamnosus GG (ATCC53103) gia tăng nhanh chóng. Chủng này được phân lập từ vùng
ruột non của người và đưa vào các sản phẩm sữa trong năm 1990. Đến năm 1999, mức
tiêu thụ bình quân đầu người ước tính khoảng 6L (3.10
11
CFU)/người/năm.
Đại học Helsenki đã thu thập tất cả các chủng Lactobacillus được phân lập từ máu và
dịch não tủy trong khu vực đó từ năm 1990-2000. Các chủng phân lập từ máu được sưu
tầm lại để báo cáo tất cả các trường hợp nhiễm trùng do Lactobacilus đến Ủy ban đăng ký
các bệnh truyền nhiễm quốc gia vào năm 1995-2000. Loài được đặc trưng và so sánh với
L. Rhamnosus GG bằng phương pháp dịch tễ học phân tử.
Trong số 5,2 triệu người dân Phần Lan, chín mươi trường hợp nhiễm Lactobacillus
đã được xác định từ 1995 đến 2000. Trong số 66 chủng phân lập được định danh cấp loài,
có 48 chủng được phân lập là Lactobacillus, với các chủng phổ biến như L. rhamnosus
(26, 54%), L. fermentum (9, 19%) và L. casei (7, 15%). Trong 35 trường hợp có nhiều hơn
một loài vi khuẩn ngoại trừ Lactobacillus cũng được xác định. Mười tám trong số 66
chủng (27%) đã được phân lập không phải là Lactobacillus. Mười một trong 26 chủng L.
rhamnosus từ probiotic L. rhamnosus GG đã không thể phân biệt bằng PFGE (điện di
trong trường xung).
Theo khảo sát, không có sự gia tăng tỷ lệ nhiễm Lactobacillus mặc dù số ca nhiễm
trùng tăng lên rõ rệt trong giai đoạn này.

Lactobacillus được phân lập gồm có 0.24% được phân lập từ máu không thay đổi
trong báo cáo ở Phần Lan các quốc gia có tỷ lệ trung bình hằng năm của nhiễm
lactobacillus ước tính là 0.29/100.000 người/năm.
Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng bằng mức tiêu thụ của L. rhamnosus GG đã
không dẫn đến sự gia tăng tương ứng trong lactobacillus nhiễm trùng máu.
Phần 2: Đánh giá các đặc tính probiotic của Bacillus trong ống
nghiệm phân lập từ cháo lên men tự nhiên ở Inner Mongolia
của Trung Quốc
I. Giới thiệu:
Có tất cả 33 chủng Bacillus được phân lập từ 16 mẫu cháo lên men tự nhiên ở Inner
Mongolia của Trung Quốc và được xác định bằng phân tích trình tự 16S rDNA. Đặc tính
của chế phẩm vi sinh bao gồm acid, khả năng chịu mật và chịu được dịch tiêu hóa nhân
tạo cũng như sự ức chế vi khuẩn gây bệnh đã được áp dụng để sàng lọc Bacillus. Sau khi
lựa chọn sơ bộ, trong đó có 4 chủng Bacillus licheniformis IMAUB1002, Bacillus subtilis
IMAUB1011, Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens
IMAUB1034 cho thấy sức chịu đựng cao đối với dịch dạ dày nhân tạo ở pH 2.0 trong 3h
với tỷ lệ sống trên 92%. Và sau đó cho đi qua đường tiêu hóa, tỷ lệ sống của 4 giống được
trên 90%. Hơn nữa, trong 4 chủng Bacillus, Bacillus licheniformis IMAUB1002 hoạt động
tốt trong muối mật (0,6%) và ức chế được hoạt động của 5 mầm bệnh trong thực phẩm.
Kết quả cho thấy rằng Bacillus licheniformis IMAUB1002 cần được xem xét như là một
probiotic tiềm năng. Nghiên cứu sâu hơn nữa sẽ tập trung đánh giá đặc tính của những chế
phẩm sinh học trong cơ thể và làm rõ chức năng của các đặc tính khác để sử dụng nó
trong sản xuất thực phẩm chức năng trong tương lai.
II.Nguyên liệu và phương pháp:
1. Phân lập Bacillus từ cháo lên men tự nhiên:
Mẫu thu
Mười sáu mẫu cháo lên men tự nhiên được thu thập từ các vùng khác nhau của Mông
Cổ.

Các mẫu được lưu giữ trong thùng đá và vận chuyển đến phòng thí nghiệm của chúng

tôi để phân tích trong vài giờ.
pH
của các mẫu đã được xác định bằng cách sử dụng giấy
pH.
Phân lập Bacillus
Một ml mẫu được chuyển vô trùng vào các ống 1,5 ml EP, sau đó ngâm trong nước
nóng ở 90
o
C trong 10 phút. Sau khi làm nóng, 0,2 ml pha loãng thích hợp được trãi trên
đĩa của thạch dinh dưỡng (dung dịch peptone cantaining 0,5%, dịch chiết thịt bò 0,3% và
1,5% agar, pH 7,0-7,2).
Đại diện các mẫu đã phát triển trên đĩa sau khi ủ đã được phân lập và được cấy vào
dung dịch chất dinh dưỡng. Tinh sạch mẻ cấy được thực hiện bằng cách cấy truyền trong
dung dịch dinh dưỡng. Các mẻ cấy được kiểm tra dưới kính hiển vi về độ tinh khiết.
Mẻ cấy Bacillus được duy trì bằng cách cấy truyền trong canh dinh dưỡng sử dụng
inoculums 1%, và ủ 24h ở 37
o
C và được lưu trữ ở nhiệt độ 4
o
C. Mỗi mẻ cấy đã được cấy
truyền hai lần trong canh dinh dưỡng trước khi sử dụng (Sgorbati et al. 1982).
2. Nhận dạng 16 rDNA:
Tách chiết DNA
Tế bào vi khuẩn được thu thập từ 5ml của một mẻ cấy tinh khiết giữ qua đêm tại
37
o
C bằng cách ly tâm (12.000xg, 5 phút). DNA được chiết xuất bằng phương pháp cổ
điển CTBA (Walker et al. 1991).
Khuếch đại gen 16S rRNA bằng phản ứng dây chuyền polymerase (PCR)
Các đoạn của gen 16S rRNA đã được khuếch đại bởi mồi của vi khuẩn (Scarpellini

et al. 2002). Các trình tự của mồi như sau: mồi trước (5'-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và mồi ngược (5'-CTACGG CTACCTTGTTACGA-
3'). 25µl hỗn hợp phản ứng PCR chứa 100g mẫu DNA, 2.5µl 10x đệm với 1.5 mmol
MgCl
2
, 3.0 đơn vị Tag DNA polymerase, 0.2 mmol của dNTP, 10pmol của mỗi mồi.
Các điều kiện phản ứng như sau: 94
o
C trong 5 phút, 30 chu kỳ ở 94
o
C trong 1 phút,
58
o
C trong 1 phút, 72
o
C trong 2 phút, và sau đó 72
o
C trong 10 phút và 4
o
C torng 30
phút. Sản phẩm phản ứng được chuyển điện di trên gel agarose 1.0% và đọc kết quả sau
khi nhuộm ethidium bromide. Và sau đó kết quả được xác thực (1.4kb) bởi Tổng công ty
Sangni Biosciences Thượng Hải - Trung Quốc.
Phân tích rình tự 16S rDNA
Trình tự được phân tích và liên kết bằng cách sử dụng phần mềm DNAMAN (phiên
bản 4.0). Trình tự tìm kiếm đã được kiểm tra tính tương đồng bằng chương trình BLAST
trong cơ sở dữ liệu NCBI ( với các chủng loại trình
tự như trình tự tham khảo. Các trình tự thu được được giải trình trong cơ sở dữ liệu
NCBI. 33 chủng phân lập từ mẫu cháo sản xuất thủ công ở mông cổ và các chủng loại đã
được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài.Cây phát sinh loài dựa trên dữ liệu trình tự

được xây dựng theo phương pháp ghép nhóm không quá tải với trung bình số học
(UPGMA) của MEGA4.0 (Tamura et al.2007).
Chuẩn bị các loại dịch đường dạ dày mô phỏng
Dịch vị giả được chuẩn bị mới mỗi ngày gồm 0,35g pepsin (Sigma, MO, USA)
trong 100ml nước muối 0,2%. pH được điều chỉnh từ 2.0 với nồng độ acid hydrochloric
tập trung, và nước trái cây đã được khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc 0,22 µm.
Một lượng nhỏ dịch ruột mô phỏng đã được chuẩn bị bằng cách đình chỉ 0.1g của
trypsin (Sigma, MO, USA) và 1.8g của muối mật trong 100ml nước cất của 1.1g
bicarbonate natri và clorua natri 0.1g. pH được điều chỉnh đến 8.0 với NaOH 0,5M. Giải
pháp này đã được tiệt trùng bằng cách lọc qua bộ lọc 0.45μm (Kos et al. 2000).
Lựa chọn các chủng kháng acid
Canh trường Man Rogosa Sharpe(MRS, pH 2,5) đã được chuẩn bị và tiêm với 1%
vào huyền phù để qua đêm với tất cả các chủng. Khoảng 0.5ml đã được đổ bỏ tại 0giờ và
3giờ để xác định tính khả thi của tổng số. Vùng đếm trên MRS agar từ huyền phù ban đầu
và cuối cùng đã được thực hiện để đánh giá khả năng sống sót ở pH 2,5 (Pereira và
Gibson et al. 2002).
Chủng cho thấy sức đề kháng cao ở pH acid 2,5 đã được cấy vào dịch vị ở nồng độ
pH 2.0, và ủ ở 37
o
C. Khoảng 0.5ml đã được đổ bỏ tại 0giờ và 3giờ để xác định tính khả thi
của tổng số. Chủng cho thấy sức đề kháng cao với dịch vị mô phỏng ở pH 2.0 đã được
chọn.
Xác định khả năng chống chịu
Các chủng có sức đề kháng cao ở pH acid 2,5 đã được cấy khoảng 1% vào dịch vị
mô phỏng ở pH 2.0. Các hỗn hợp được trộn trong 10s và ủ ở 37
o
C. Dịch dạ dày nhân tạo
đã được nghiên cứu bằng cách xác định tính khả thi trong tổng số dịch dạ dày bị thu hồi
tại thời điểm 0, 1, 2, và 3giờ.
Sau đó 0.5ml các loại dịch dạ dày mô phỏng nuôi cấy trong 3giờ được cấy để 4.5ml

dịch đường ruột mô phỏng ở pH 8,0, và ủ ở 37
o
C trong điều kiện yếm khí. Sức chịu đựng
khi đi qua dịch ruột non đã được nghiên cứu bằng cách xác định tính khả thi trong tổng số
dịch ruột chiết rút ở 0, 3, 6, và 24 giờ (Hashimoto và Tabata et al. 2004).
Xác định tổng số có thể tồn tại
Tổng số sống được của các loài vi khuẩn Bacillus được xác định bằng một phương
pháp đổ đĩa bằng cách sử dụng môi trường thạch MRS sau khi pha loãng nhiều lần tại
phục hồi tối đa. Môi trường thạch MRS đã được ủ trong điều kiện yếm khí ở 37
o
C trong
48 giờ.
Tính chịu mật
Tác dụng của muối mật đối với tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn Bacillus
licheniformis IMAUB1002, Bacillus subtilis IMAUB1011, Bacillus licheniformis
IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 được thực hiện bằng cách sử
dụng một phương pháp mô tả bởi Walker và Gilliland (1993). Canh trường MRS-Thio
[MRS có bổ sung natri thioglycollate 0,2% (Kanto, CICA, Nhật Bản)] có bổ sung 0,3%
(w/v) oxgall (mật tươi khử nước, DIFCO, PQ, Canada) được chuẩn bị tươi và cấy với 1%
dịch huyền phù để qua đêm đối với các chủng được chọn. Mẫu kiểm soát không có oxgall
đã được chuẩn tốt. Hấp thụ ở 600nm được đo mỗi giờ so với mẫu không cấy tương ứng.
Sự tăng trưởng này được tiếp tục cho đến khi đạt được một sự khác biệt 0,3 đơn vị trong
hấp thụ. Và sự khác biệt về thời gian (h) giữa các môi trường nuôi cấy được xem như là
pha lag (LT).
Sức chịu đựng muối mật ở nồng độ tối đa của Bacillus licheniformis IMAUB1002
được xác định. Canh trường MRS bổ sung muối mật với nồng độ khác nhau được chuẩn
bị và cấy với 1% huyền phù để qua đêm của Bacillus licheniformis IMAUB1002 ở 37
o
C.
Hấp thụ được đo tại 600nm lúc 24h. Các chủng được cấy trên đĩa thạch MRS, và ủ trong

điều kiện yếm khí ở 37
o
C trong 48 giờ để xác định sự tăng trưởng.
3. Thử nghiệm hoạt động kháng khuẩn
Chuẩn bị phi tế bào nổi trên mặt
CFS thu được bằng ly tâm (3.300 × g, 10min) của các mẻ nuôi cấy qua đêm (37
o
C.
Aerobic, canh trường MRS) và khử trùng bằng cách lọc qua một lỗ lọc 0.22μm.
Chủng chỉ thị
Các chủng chỉ thị bao gồm Escherichia coli O157882364, Shigella flexneri CMCC
(B) 51592, Salmonella typhimurium S50333, Listeria monocytogenes C53-3,
Staphylococcus aureus AC1.2465, với môi trường nuôi cấy LB, NB, BHI và TSB tương
ứng. Các chủng này được cung cấp bởi Học viện Khoa học Trung Quốc, Bộ sưu tập Trung
tâm Văn hóa y tế Trung Quốc (CMCC) và Bộ sưu tập của Văn hóa Nông Trung Quốc
(ACCC).
4. Các thử nghiệm khuếch tán agar
Các thạch thử nghiệm phổ biến được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
của CFS theo tài liệu (Ouoba et al. 2007). Mẫu bệnh nuôi cấy qua đêm của vi sinh vật chỉ
thị (0.1ml, khoảng 106 cfu/ml) được cấy chuyền trên môi trường thạch MRS 20ml trong
một đĩa Petri vuông. CFS (100μl) đã được bổ sung vào cốc Oxford (một xi lanh không gỉ,
bên ngoài có đường kính 7,8 ± 0,1 mm, bên trong có đường kính 6,0 ± 0,1 mm và chiều
cao 10,0 ± 0,1 mm) được đặt trên bề mặt của thạch này. Các kích thước của vùng khuếch
tán khắp nơi trên cốc (bao gồm cả các 'Oxford ly' 7,8 mm) được đo và kết quả được báo
trong milimet (mm). Thí nghiệm được thực hiện trong các bản sao.
Phân tích thống kê
Phân tích thống kê các dữ liệu thu được được thực hiện bằng cách sử dụng 2002 SAS
9.0 (SAS Institute Inc, Cary, Hoa Kỳ). Việc so sánh sự khác biệt giữa các phương tiện của
phương pháp điều trị đã được thử nghiệm bởi ANOVA ở mức ý nghĩa của P <0,05.
Phần 3: Kết quả và thảo luận

I. Sự cô lập và nhận diện của vi khuẩn Bacillus bằng kết quả phân tích
trình tự gen 16S rDNA:
Việc cô lập của 33 giống vi khuẩn được áp dụng từ 16 thí nghiệm giống nhau trên
NA ở 37
o
C và được thực hiện 1 cách chính xác. Kết quả phân tích phát sinh loài của trình
tự 16S rDNA được đưa ra. Kết quả tóm tắt ở bảng 1. Trong số 33 giống Bacillus subtilis
và Bacillus cereus có phạm vi giống nhau cao nhất (20.59%) theo thứ tự.
Vị trí phát sinh loài của tất cả các cá thể được xác định bởi trình tự 16S rDNA. Áp
dụng trình tự được lưu trữ trên kho dữ liệu của NCBI dưới số thứ tự (tài khoản tham gia)
từ FJ641004 đến FFJ641037. Trình tự 16S rDNA trong bài giảng này và cá thể điển hình
trên NCBI được đồng chỉnh với phần mềm DNAMAN và sau đó được xây dựng thành cây
phát sinh loài các chỉ số chưa biết được đưa ra kết quả phân tích. Bằng việc so sánh trình
tự gen 16S rDNA của các cá thể cô lập và cá thể điển hình. Những cá thể cô lập được
quan tâm như là 1 loài khi điểm tương đồng của chúng hơn 99%.
Bảng 2: Nhận dạng và phân loại 33 chủng Bacillus phân lập từ cháo lên men tự nhiên ở
Inner Mongilia dựa trên trình tự 16S rDNA
Loài Số lượng phân lập
Bacillus licheniformis 4
Bacillus firmus 1
Bacillus cereus 7
Bacillus subtilis 7
Bacillus fusiformis 5
Bacillus pumilus 3
Bacillus amyloliquefaciens 1
Bacillus flexus 4
Bacillus megaterium 1
Từ kết quả cuối cùng và BLAST tìm trực tuyến, nó cho biết rằng 33 tình trạng trên
chính xác thuộc về việc chịu đựng được giá trị PH thấp của tình trạng 33 trong số những
tình trạng khác.

Lựa chọn sơ bộ các chủng
Tỷ lệ sống sót của Bacillus trong mức độ phát triển bình thường ở PH = 2.5 và trong
dịch vị PH = 2 được đưa ra trong bảng 2. Điều đó cho biết 11 cá thể Bacillus đều có acid
chống chịu được PH = 2.5 và tỷ lệ sống sót hơn 90%. 11 cá thể này có thể chịu đựng được
dịch vị 90% được thử nghiệm sâu hơn ở PH = 2, trong dịch vị và 6 (trong 11 cá thể chọn)
đã sống sót với tỷ lệ 90% và được chọn để tiến hành thử nghiệm xa hơn nữa.
Sức chịu đựng acid là thuộc tính mà bất kỳ chủng nào đều mong đợi để có thể phát
triển được trong đường tiêu hóa (Salminen et al. 1996). 11 chủng (33.33%) của Bacillus từ
việc lên men cháo tự nhiên của người Mông Cổ có thể phát triển, tăng trưởng trung bình
tại PH 2.5 và tỷ lệ sống là hơn 90%. Hơn nữa 6 chủng sống sót tốt trong dịch vị với PH
2.0 sau 3 giờ ủ. (Hyronimus et al. 2000) đã báo cáo chỉ có Bacillus laevolacticus
DSM6475 có thể sống tại PH 2.5 sau 3 giờ ủ với thỷ lệ là 86%, và những chủng Bacillus
coagulans, Bacillus racemilacticus, Sporolactobacillus inulinus racemicus có thể sống
trong môi trường thô. So sánh với báo cáo được miêu tả ở trên, những chủng của chúng ta
có khả năng chịu đựng tốt hơn. Thông qua việc phân tích, nguồn gốc những chủng của
chúng ta (lên men cháo) và những loài đặc biệt có thể xem như là nhân tố chính để so sánh
sức chịu đựng acid nào cao hơn.
II. Hiệu quả của việc mô tả khả năng vận chuyển của tế bào thực vật của
Bacillus
Hiệu quả của việc mô phỏng dịch vị và ruột nhỏ trên khả năng sống của 6 chủng đã chọn
thì được miêu tả ở hình 2. 6 chủng này cho thấy tỷ lệ sống tương đối cao, mà hầu hết
không đổi sau khi ủ trong dịch vị tại PH 2.0 với 3 giờ. Sau đó ủ trong dịch ruột 24 giờ, ta
thấy chúng vẫn sống sót, đặc biệt là 4 chủng Bacillus licheniformis IMAUB1002, Bacillus
subtilis IMAUB1011, Bacillus licheniformis IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens
IMAUB1034 có sức chịu đựng cao trong đường tiêu hóa tại PH 8.0 trong 24 giờ với tỷ lệ
sống 92,6 ± 0,3%, 92,3 ± 0,6%, 91,0 ± 0,6% và 91,4 ± 0,3%, được xem là có khả năng
chịu được khi đi qua dịch dạ dày.
Bàng 3: Tỷ lệ sống sót của các chủng Bacillus phân lập được lựa chọn từ cháo lên men tự
nhiên ở Inner Mongolia trong môi trường nuôi cấy ở pH 2.5 và dịch dạ dày nhân tạo ở pH
2.0

Chủng Môi trường nuôi cấy
Tỷ lệ sống (%)
Dịch dạ dày nhân tạo
Tỷ lệ sống (%)
Bacillus licheniformis IMAUB1002 98.72 ± 2.65
ab
94.41 ± 1.41
ab
Bacillus licheniformis IMAUB1009 93.75 ± 1.93
cd
91.14 ± 0.92
c
Bacillus subtilis IMAUB1011 93.48 ± 0.73
cd
92.57 ± 0.84
bc
Bacillus cereus IMAUB1022 92.84 ± 0.32
d
85.64 ± 0.41
de
Bacillus licheniformis IMAUB1014 97.95 ± 1.96
ab
93.15 ± 0.78
b
Bacillus pumilus IMAUB1015 91.91 ± 0.68
d
83.02 ± 0.37
f
Bacillus cereus IMAUB1020 95.90 ± 0.47
bc

82.11 ± 0.26
f
Bacillus licheniformis IMAUB1012 91.93 ± 0.71
d
83.77 ± 0.28
ef
Bacillus amyloliquefaciens
IMAUB1034
98.94 ± 2.25
a
96.17 ± 1.52
a
Bacillus subtilis IMAUB1031 93.65 ± 0.81
cd
86.67 ± 0.52
d
Bacillus subtilis IMAUB1036 97.52 ± 1.23
ab
92.81 ± 2.36
bc
Những thí nghiệm trong ống nghiệm đã chỉ ra rằng nhiều điều kiện có thể quyết định
đến sự sống sót của probiotic thông qua sự tăng lên trong dạ dày, acid dạ dày, thời gian
tiếp xúc lâu với acid, sự thiếu nước và điều kiện tiếp xúc lâu với muối mật, mức độ thủy
phân của muối mật và những thứ khác cũng chưa nói rõ bản chất của những probiotic
(Carteris et al. 1998; Bezkorovainy et al. 2001).
Ít nguyên cứu chỉ ra rằng khả năng vượt qua những tác động được mô phỏng lên tế
bào sinh dưỡng của Bacillus. Mặc dù tất cả những bào tử của Bacillus được kiểm tra cấy
phân lập là giống nhau về sự đề kháng với tác động của dịch mô phỏng dịch dạ dày,
những tế bào sinh dưỡng của Bacillus thì rất dễ tiếp xúc với tác động của dịch mô phỏng
dịch da dày với một sự giảm xuống những tế bào sống sót hơn 98% trong vòng 5 phút.

Như vậy kết quả của chúng tạo ra tiềm năng probiotic có lợi từ những giống đã cấy phân
lập trong thời gian hiện tại sự nguyên cứu chắc chắn thừa hưởng những giống tự nhiên
được lên men đông lạnh.
III. Sự đề kháng muối mật
Bốn giống được chọn với sự phát triển với sự hiện diện của 0,3% mật bò, kết quả
trên được ghi nhận trên bảng 3, chúng chỉ ra rằng tác động của muối mật len sự phát triển
của mẻ cấy và khả năng chống chịu của chúng đối với muối mật.
(Chateau et al. 1994), ngưòi đã phân biệt được 4 nhóm khi theo dõi thời gian ủ với sự xuất
hiện của mật bò: những giống đề kháng (thời gian ủ phát triển d ≤ 15 phút), những giống
chịu mặn (15< d ≤ 40 phút), những giống chống chịu yếu (40 < d ≤ 60 phút) và những
giống nhạy (d > 60 phút). Bốn chủng Bacillus thử nghiệm được xem là nhạy cảm (d > 60
phút) (bảng 3).Những kết quả đó giống với những điều kiện được theo dõi những thứ khác
không phải SFLAB như là B.subtilis và B.toyoi (Cosson and Deschamps 1994). Trong
nguyên cứu hiện nay, những giống B. coagulans được tiềm thấy trong cả 2 nhóm ‘chống
chịu yếu’ và ‘dễ dàng’. Điều này không đúng cho sự theo dõi với Lactobacillus
acidophilus và đặc biệt là Enterococcus faecium (Gilliland et al. 1984; Taranto et al.
1997).
Bảng 4: Khả năng chịu mật của 4 chủng Bacillus được chọn
Chủng Thời gian cần thiết để tăng A
600
bằng 0.3 đơn
vị (h)
MRS-THIO MRS-THIO +
muối mật
Pha lag (LT)
Bacillus licheniformis IMAUB1002 8.90 ± 0.11
a
21.50 ± 0.47
a
12.60 ± 0.36

b
Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 4.23 ± 0.09
c
20.07 ± 0.82
b
15.84 ± 0.73
a
Bacillus subtilis IMAUB1011 5.64 ± 0.16
b
14.21 ± 0.12
c
8.57 ± 0.04
c
Bacillus licheniformis IMAUB1014 5.68 ± 0.31
b
14.77 ± 0.60
c
9.09 ± 0.31
c
Khi đi qua ống dạ dày, vi khuẩn hệ tiêu hóa phải đối mặt với sự thay đổi các hợp chất
độc như muối mật. Sự cô đặc của muối mật trong phạm vi ruột non từ khoảng 0,2 đến 2%
(w/v), tùy thuộc vào cá thể, loại và số lượng tiêu thụ thức ăn (Dawson 1998). Một nghiên
cứu với 40 chủng Bacillus cereus cho thấy Bacillus cereus rất nhạy cảm bởi muối mật
(Kristoffersen et al. 2007). Một nghiên cứu khác của Hyronimus vào năm (2000) cho thấy
giảm tối thiểu nồng độ của Bacillus coagulans, Bacillus racemilacticus và Bacillus
laevolacticus theo thứ tự >1,0.7,0.1 và chỉ có chủng Bacillus coagulans BCI4 LMAB có
sức chịu đựng yếu và những chủng khác thì nhạy cảm bởi muối mật. Trong các nghiên
cứu này, Bacillus licheniformis IMAUB1002 cho thấy khả năn chịu đựng muối mật cao
nhất (0.6%) so với nghiên cứu trước đây, nghiên cứu của chúng ta có thể cho thấy rằng
Bacillus licheniformis được sử dụng ở mức trung bình trong loài Bacillus.

Bảng 5: Khả năng chịu mật của Bacillus licheniformis IMAUB1002 ở mức độ mật khác
nhau
Mật (%) Bacillus licheniformis IMAUB1002
A
600
MRS agar
0.3 0.718 ± 0.014
a
+
0.4 0.599 ± 0.011
b
+
0.6 0.257 ± 0.010
c
+
0.8 0.032 ± 0.008
d
+
1.0 0.034 ± 0.006
d
+
1.2 0.032 ± 0.005
d
+
1.4 0.028 ± 0.003
d
+
1.6 0.030 ± 0.001
d
+

1.8 0.023 ± 0.001
d
-
Từ kết quả ở bảng 4, cho thấy sự khác biệt đáng kể sức chịu đựng muối mật khi nồng
độ thấp hơn 0.6%. Tuy nhiên khi nồng độ vượt quá 0.6% thì kết quả sẽ không có sự khác
biệt đáng kể. Do đó 0.6% có thể được xem như là 1 điểm giới hạn để kiểm tra sức chịu
đựng với muối mật. Đây là cơ sở để tìm kiếm Bacillus licheniformis IMAUB1002 có sức
chịu đựng muối mật tốt hơn.
IV. Hoạt tính kháng sinh
Các ức chế trong 5 yếu tố gây hỏng thức ăn và vi khuẩn gây bệnh. Được lựa chọn bởi
4 chủng Bacillus bao gồm B. licheniformis IMAUB1002, B. subtilis IMAU1011, B.
licheniformis IMAUB1014 và B. amyloliquefaciens IMAUB1034, cho thấy ở bảng 5.
Bảng 6: Vùng ức chế (mm) của 4 chủng Bacillus được chọn
Chủng Staphyloco
ccus
aureus
ACI.2465
Listeria
monocytoge
ns C533
Shigella
flexneri
CMCC (B)
51592
Salmonella
typhimurium
S50333
Escherichi
a coli O157
882364

Bacillus
licheniformis
IMAUB1002
10.87 ±
0.68
a
13.54 ±
0.59
a
8.35 ± 0.71
b
9.65 ± 0.39
a
10.38 ±
0.17
a
Bacillus
amyloliquefacie
ns IMAUB1034
8.27 ±
0.58
c
9.36 ± 0.51
c
- 9.19 ± 0.26
a
9.35 ±
0.75
b
Bacillus subtilis

IMAUB1011
9.65 ±
0.40
b
9.88 ±
0.48
bc
8.25 ± 0.44
b
- 10.21 ±
0.45
ab
Bacillus
licheniformis
IMAUB1014
9.82 ±
0.69
ab
10.35 ±
0.34
b
11.25 ±
0.52
a
- 7.58 ±
0.55
c
Lên men nổi không bào của MRS của B. licheniformis IMAUB1002 thì ức chế đáng
kể bởi Gram dương (Listeria monocytogenes C53-3, Staphylococcus aureus AC1.2465) và
vi khuẩn gram âm (Escherichia coli O157 882364, Shigella flexneri CMCC (B) 51592,

Salmonella typhimurium S50333). Đồng thời nó cũng cho thấy những chủng khác của
Bacillus có hoạt tính kháng kháng sinh cao mặc dù chúng có sức chịu đựng acid cao. Từ
bảng 5 chúng ta cũng thấy 3 chủng khác của Bacillus licheniformis IMAUB1011, Bacillus
licheniformis IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 một phần sinh
sống ở 5 chủng chỉ định. Nó có ý nghĩa quan trọng bởi vì chất kháng sinh đươc sản xuất
bỏi 3 chủng có phạm vi hẹp.
Một cơ chế quan trọng là đưa đặc tính probiotic vào sử dụng, nhiều nghiên cứu trọng
điểm trong việc sản xuất chất kháng sinh (Servin 2004). Nghiên cứu trước đây cho thấy B.
licheniformis AnBa9 hiển thị dòng quang phổ hẹp của hoạt tính kháng sinh và ức chế 1
vài vi khuẩn Gram dương khác như chủng Listeria và vi khuẩn Gram âm (Anthony năm
2009). Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của cerein 8A được sản xuất từ Bacillus cereus
có thể ức chế vi khuẩn Gram âm như là E.coli, S. enteritidis và L. monocytogenes (Bizani
et al. 2005). Một chất kháng khuẩn từ một loài vi khuẩn Bacillus mới phân lập từ lưu vực
sông Amazon đã ức chế một loạt các chủng chỉ số, bao gồm cả vi khuẩn gây bệnh và hư
hỏng thực phẩm (Motta et al. 2007). Bacillus licheniformis IMAUB1002 cũng cho thấy
một tác động ức chế nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm của cả gram
dương và âm, hoạt động kháng khuẩn của 3 chủng vi khuẩn Bacillus hiển thị khác nhau
trong quang phổ thu hẹp.
Đây sẽ là điều kiện thích hợp để thực hiện nghiên cứu sâu hơn về hoạt động kháng
khuẩn của Bacillus licheniformis IMAUB1002 bị cô lập để cô lập, đặc điểm và xác định
các hợp chất kháng khuẩn sản xuất chống lại các mầm bệnh. Kể từ khi một số các chủng
vi khuẩn Bacillus cho thấy tính chất thú vị kháng khuẩn, đó cũng là hữu ích để nghiên cứu
tính probiotic của chúng.
V. Kết luận
33 chủng Bacillus được phân lập từ 16 mẫu cháo lên men truyền thống ở Inner
Mongolia của Trung Quốc và được xác định bằng cách phân tích trình tự 16S rDNA.
Bacillus cereus và Bacillus subtilis là chủng chiếm ưu thế. Trong số tất cả các vi khuẩn
Bacillus, Bacillus licheniformis IMAUB1002, Bacillus subtilis IMAUB1011, Bacillus
amyloliquefaciens IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 có khả năng
chống chịu với dịch vị mô phỏng ở pH 2.0 trong 3 giờ và có khả năng chống chịu để

chuyển hóa với tỷ lệ sống cao (tất cả trên 90%). Hơn nữa, Bacillus licheniformis
IMAUB1002 có khả năng chống chịu với muối mật (0,6%) và cho thấy hiệu ứng tương
phản cao nhất so với 5 tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm. Nghiên cứu này cho thấy
truyền thống lên men cháo, mà chế biến đa dạng sinh học của Bacillus có thể được sử
dụng như một nguồn tiềm năng cho sự cô lập của probiotic Bacillus.
TRÍCH DẪN TÀI LIỆU
[1] Total Def Probio,trang 5
[2] Seppo Salminen, Atte von Wright, Arthur Ouwehand; Lactic Acid Bacteria
Microbiological and Functional Aspects Third Edition, Revised and Expanded
(phần I chương 19, phần X chương 19, phần XI chương 19, phần XII chương 19 :
safety of novel probiotic bacteria ; trang 23 đến 33; chương 11:Antimicrobial
Components from Lactic Acid Bacteria, trang 389-401; chương 22 trang 624,
chapter 11, p401)
[3] NGUYỄN VĂN THANH- TRẦN CÁT ĐÔNG Công nghệ sinh học dược
Internet
[ 4] />