báo cáo tốt nghiệp phương pháp nuôi cấy mô cây hoa hồng

TRƯỜNG ………………….
KHOA……………………….

Báo cáo tốt nghiệp
Đề tài:

Phương pháp nuôi cấy mô cây hoa hồng

Trang 1
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 3
Chương 1 4
TỔNG QUAN 4
ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY HOA HỒNG 4
Nguồn gốc và sự phân bố 4
Chương 2 14
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14
Vật liệu 14
Chương 3 18
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
HIỆU QUẢ CỦA BA TRÊN SỰ TẠO CHỒI CỦA CÂY HỒNG TỶ MUỘI 18
Tỷ lệ sống 18
Chương 4 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34
4.1. KẾT LUẬN 34
Trang 2
MỞ ĐẦU
Hoa hồng là một loài hoa đẹp được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới. Nó
được trồng với nhều mục đích khác nhau như: trang trí làm đẹp cho không gian sống,
làm nước hoa, mỹ phẩm và thuốc chữa bệnh. Và còn một mục đích nữa là để làm quà

tặng để chinh phục phái đẹp. Riêng hoa hồng tỷ muội lại có vẻ đẹp thanh tú, màu sắc tươi
sáng và nở hoa quanh năm. Công dụng của nó là để lảm cảnh trong sân vườn, lối đi,
trang trí nội thức trong nhà. Trong phong thủy, thì hoa hồng tỷ muội đổi vận “ khai vận
mạng phú quý”, gia đình êm ấm và thăng quan tiến chức. Về kinh tế, hoa hồng là một
loài hoa mang lại lợi nhuận cao. Mặc dù đã có nhiều phương pháp nhân giống cổ truyền
nhưng vẫn không làm cây sạch bệnh, năng suất cao. Đồng thời, nó còn tốn nhiều thời
gian và công chăm sóc.
Và thế là một phương pháp nhân giống mới được ra đời, đó là phương pháp nuôi
cấy mô. Nó làm cho hoa hồng tăng thêm về số lượng lẫn chất lượng ( cây sạch bệnh).
Điểm quan trọng, phương pháp này là sản xuất ra một số lượng trong thời gian ngắn, cây
sạch bệnh và trồng được quanh năm. Đó cũng chính là lý do chúng em chọn đề tài này.
Cây hoa hồng được Nobecourt và Kofler nuôi cấy mô thành công khi tạo ra mô
sẹo và rễ từ chồi vào năm 1945. Sau đó, đã có nhiều công trình nghiên cứu trong và
ngoài nước về loài hoa này. Phương pháp nuôi cấy mô được thực hiện nhằm tìm ra môi
trường thích hợp cho sự nhân chồi và tạo rễ, làm cơ sở cho việc nghiên cứu, ứng dụng
các kỹ thuật công nghệ sinh học, đáp ứng nhu cầu về chất lượng giống ngày càng cao của
người tiêu dùng.
Trang 3
Chương 1
TỔNG QUAN
ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY HOA HỒNG
Nguồn gốc và sự phân bố
Cây hoa hồng có tên khoa học là Rosa sp, thuộc lớp song tử diệp, Bộ Rosales, Họ
Rosaceae có nguồn gốc ôn đới và nhiệt đới vùng Bắc bán cầu. Cách đây khoảng 5000
năm, Trung Quốc là nơi đầu tiên thuần hóa hoa hồng nhưng mãi đến thế kỷ VIII thì
những giống hồng từ Trung Quốc mới giới thiệu ở Châu Âu và hầu hết những giống
hồng ngày nay đều có nguồn gốc từ nó.
Họ hoa hồng có khoảng có 115 chi và trên 3000 loài phân bố chủ yếu ở vùng ôn
đới và cận nhiệt đới bắc bán cầu. Các nước sản xuất hoa hồng chính: Hà Lan, Mỹ,
Nhật…Trong đó, Hà Lan là nước trồng và xuất khẩu hoa hồng lớn nhất thế giới. Hiện

nay, các giống trồng ở Việt Nam hầu hết là giống nhập từ Hà Lan, Mỹ, Pháp, Trung
Quốc và trồng phổ biến ở Đà Lạt rồi đổ xuống vùng Tiền Giang, Hậu Giang, nhất là tại
Cái Mơn, Sa Đéc… hoa hồng được trồng đại trà với nhiều giống quí và mới lạ.
1.1.1 Đặc tính thực vật
Rễ: rễ hồng thuộc loại rễ chum, chiều ngang tương đối rộng, khi bộ rễ lớn phát
triển nhiều rễ phụ.
Thân: hồng thuộc nhóm cây thân gỗ cây bụi thấp, thẳng có nhiều cành và gai
cong.
Lá: lá hoa hồng là lá kép lông chim mọc cách, ở cuống có lá kèm nhẵn, mỗi lá có
3-5 hay 7-9 lá chét, xung quanh lá chét có nhiều cưa nhỏ. Tùy giống mà lá có màu xanh
đậm hay xanh nhạt, răng cưa nông hay sâu hoặc có hình dạng lá khác.
Trang 4
Hoa: có nhiều màu sắc và kích thước khác nhau. Cụm hoa chủ yếu có một hoa
hoặc tập hợp một ít hoa trên cuống dài, cứng, có gai. Hoa lớn có cánh dài hợp thành chén
ở gốc, xếp thành một hay nhiều vòng, siết chặt hay lỏng tùy theo giống. Hoa hồng thuộc
loài hoa lưỡng tính. Nhị đực và nhụy cái trên cùng một hoa, các nhị đực dính vào nhau
bao quanh vòi nhụy. Khi phấn chín rơi trên đầu nhụy nên có thể tự thụ phấn. Đài hoa
màu xanh.
Quả: quả hình trái xoan có cánh đài còn lại.
Hạt: hạt hồng nhỏ có lông, khả năng nảy mầm của hạt rất kém do có lớp vỏ dày.
1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Nuôi cấy mô là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh
trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây. Sự thành công của vi nhân giống phụ thuộc
vào nhiều yếu tố: môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
giống, nhiệt độ, ánh sáng, chọn mẫu vật và tất cả các giống nuôi cấy.
Chọn nguyên liệu ban đầu cho nuôi cấy mô rất quan trọng, nó không những quyết
định sự thành công ban đầu cho cả quá trình nhân tiếp theo. Việc chọn vật liệu phụ thuộc
vào phương pháp nuôi cấy nhưng phổ biến là chọn đoạn than có mang chồi nhũ, vì chọn
vật liệu này sẽ có nhiều vật liệu để tiến hành nuôi cấy hơn chồi ngọn.
1.2.1 Các giai đoạn của nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô thực vật được chia thành 4 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có
môt chức năng riêng. Giai đoạn 0 là giữ cây trong nhà lưới; giai đoạn 1 là khử trùng mẫu
cấy; giai đoạn 2 là nhân chồi nhanh; giai đoạn 3 là kéo dài, kích thích tạo rễ và tiền thuần
dưỡng; giai đoạn 4 là thuần dưỡng.Trong đó, giai đoạn 2 là giai đoạn quyết định số lượng
cây có thể tạo ra. Sự thành công của giai đoạn này tùy thuộc vào sự kích thích chồi bất
định hay là sự phát triển của chồi bên và còn tùy thuộc vào số lần cấy truyền, hệ số nhân
giống, môi trường chung quanh.
Trang 5
1.2.2 Tầm quan trong của phương pháp nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô là một kỹ thuật nhân giống mang nhiều ưu điểm nổi bật như tạo cây sạch
bệnh, hệ số nhân giống cao và thời gian sản xuất được rút ngắn. Vì vậy, công nghệ nuôi
cấy mô có ý nghĩa kinh tế cao, nhất là đối với những cây sinh sản chậm hoặc là đối với
những cây cần cung cấp số lượng giống lớn.
Nuôi cấy mô là phương pháp làm giảm giá thành. Đồng thời, tạo số lượng cây con
lớn và đồng đều đáp ứng nhu cầu thị trường. Phương pháp này có thể nhân được một số
lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1m
2
nền có thể để được 18.000 cây. Thuận
tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (1 thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15 kg). Ngoài
ra, việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô người ta có thể nhân giống rất nhiều loại cây từ
các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà nhân giống vô tính in vitro không thể thực
hiện được. Đồng thời, có thể duy trì được các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho các
phương pháp lai tạo giống.
Bên cạnh đó, nuôi cấy mô còn bao gồm những ưu điểm nổi bật: có thể tạo được
một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vitro do nhân giống in vitro có thể cảm
ứng được sự trẻ hóa của mô; Sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro
thường mạnh hơn những cây nhân giống in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa và
sạch bệnh; việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn lọc
các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của

các cây mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy; Trong nuôi cấy in vitro
chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ
dàng; Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống in
vivo; Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp nên có thể sản
xuất cây con quanh năm.
Trang 6
1.2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình thái
của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần
môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận
nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại
môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng
vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng.
Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino
acid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích
nấm men…
1.2.3.1Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong nuôi
cấy thường là nước cất 1 lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất 2
lần hoặc nước khử khoáng.
1.2.3.2Các nguyên tố đa lượng
Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu các mô cấy
và không gây độc. Nhu cầu khoáng đa lượng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều
so với cây trồng tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: Nitrogen (N),
Photpho (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), và Calcium (Ca).
1.2.3.3Các nguyên tố vi lượng
Đây là những nguyên tố mà cây trồng chỉ cần ít nhưng không thể thiếu cho sinh
trưởng và phát triển bình thường. Hầu hết các nguyên tố khóang vi lượng cần thiết cho
cây đối với mô cấy đều được cung cấp vào trong môi trường nhân tạo. Các vi lượng
thường thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), kẽm (Zn), Đồng (Cu),

Molybden (Mo), Cobalt (Co), sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường thấp
Trang 7
hơn 30 mg/l. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các
enzyme. Nhiều nghiên cứu cho thấy sắt kết hợp với các chất chelat (EDTA-
ethylendiamin-tetra acetic acid) làm tăng khả năng trao đổi chất của sắt.
1.2.3.4Nguồn cacbohydrate
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp rất
thấp do thiếu clorophin, nồng độ CO
2
và nhiều điều kiện khác. Vì vậy phải đưa thêm hợp
chất carbonhydrate vào thành phần môi trường nuôi cấy và hợp chất carbonhydrate được
sử dụng phổ biến là đường sucrose. Lý do nó được sử dụng phổ biến là nó ổn định trong
hấp khử trùng và được cây sử dụng.
Đường sucrose vừa là nguồn carbon cung cấp cho mẫu cấy, đồng thời còn tham
gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường cao mô nuôi
cấy khó hút được nước. Hàm lượng đường quá thấp là một trong những nguyên nhân gây
hiện tượng mọng nước ở mẫu cấy. Đường còn có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất
định.
1.2.3.5Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào
và mô được nuôi cấy thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn của chúng. Các
vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vit B1),
nicotinic acid, pyridoxine (vit B6) và myo- inositol. Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh
trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn carbon
của môi trường nuôi cấy.
1.2.3.6Agra
Việc làm đông đặc môi trường thường dựa vào các hợp chất polysaccharide cao
phân tử, chúng giữ nước và môi trường khoáng cung cấp cho cây, có thể dùng là
phytagell (gelrite) hay agar.
Trang 8

Agar thương được sử dụng hơn cả vì nó trơ không chịu tác dụng nhiều bởi các
phản ứng hóa học, tính ổn định cao và giá cũng tương đối rẻ.
Agar được trích từ tảo và được dùng để chuẩn bị môi trường đặc hay môi trường
bán lỏng để nuôi cấy mô thực vật. Agar tan ở 100
o
C và đông đặc ở 45
o
C. Độ cứng của
agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và độ pH của môi trường nuôi cấy. Nồng độ
agar thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là 6-8 g. Nồng độ agar được
sử dụng sẽ ảnh hưởng đến thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi
trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước và
hoạt động của cytokinin trong môi trường có agar.
Độ tinh khiết cua agar trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng. Người ta đã
chứng minh được rằng trong agar có chứa Ca, Mg, K, Na và sự tha agar trong môi trường
nuôi cấy rất quan trọng.
1.2.3.7Nước dừa
Trong nuôi cấy mô thực vật thường sử dụng nước dưa từ trái dừa bánh tẻ và trái
dừa già. Thành phần của nước dừa khá phong phú nhưng có chứa myo-inositol, các chất
thuộc nhóm cytokinin và một số amino acid khác Diphenylurea (DPU) có hoạt tính giống
như cytokinin là thành phần chính trong nước dừa. Các thành phần này có hàm lượng
thay đổi khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả cùng độ
tuổi.
1.2.3.8Chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình
thái thực vật nuôi cấy mô. Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng,
mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó.
Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập
tạo chồi và rễ. thành lập tạo chồi và rễ. Một tỷ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp
cho sự tạo rễ, còn ở mức độ trung gian thích hợp cho tạo mô sẹo.

Trang 9
Auxin:
Auxin được chia thành 2 loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp. Auxin tự nhiên
được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-
butylric acid (IBA), 2,4-dichlorphenolxyacetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid
(NAA).IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA
không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô. NAA và 2,4- D không bị biến tính trong
quá trình hấp tiệt trùng.
Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm
thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và
trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính.
Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin
là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo
(callus). Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2,0 mg/l
vì chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp.
Cytokinin:
Zeatin là cytokinin tự nhiên được trích từ hạt bắp nảy mầm. Kinetin và 6-Benzyl
adenine được tổng hợp đầu tiên nhưng gần đây người ta đã chứng minh là được tạo ra ở
một vài loại cây. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng
của chồi nuôi cấy mô. Đồng thời, nó ức chế sự tạo rễ và hình thành mô sẹo. Nồng độ sử
dụng là 0,1-2 mg/l. Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình
thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.
Tuy nhiên trong trường hợp không bổ sung cytokinin thì sau 10-12 ngày cũng cho
ra chồi nhưng tỷ lệ rất thấp.
1.2.3.9Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Than hoạt
tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong trường
hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay
Trang 10
đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự

hình thành và sinh trưởng của rễ. Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy
hóa tốt. Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều
hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường.
1.2.3.10 pH
pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi trường là yếu
tố duy trì trao đổi chất trong tế bào Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ một loạt các chất
phụ thuộc vào pH môi trường. Đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibebrellin và các
vitamin. Sự hấp thu các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH. Để chỉnh pH của môi
trường có thể dùng dung dịch 10% hoặc 1N NaOH và 1N HCl. pH của đa số môi trường
được điều chỉnh giữa 5,5- 6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển
sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng.
1.3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NUÔI CẤY MÔ CÂY HOA HỒNG ĐÃ ĐƯỢC
CÔNG BỐ
1.3.1 Các công trình trong nước
Nguyễn Thị Kim Thanh(2005), đã công bố kết quả nhân giống cây hoa hồng đỏ và
cây hoa hồng trắng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, sử dụng môi trường cơ bản MS+20
g/l sucrose+ 5,6 g/l agar, với các kết quả cho từng công đoạn:
Tạo vật liệu khởi đầu: khử trùng mắt ngủ bằng HgCl2 0,5% trong 5 phút, hoặc
dùng Haiter 10% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch trên 60%. Mẫu này được cấy vào môi
trường bổ sung BA hoặc Kinetin 1mg/l, mẫu sẽ bật chồi 100% sau 14 ngày nuôi cấy.
Nhân chồi (sau 4 tuần nuôi cấy): sử dụng 2 mg/l BA đối với giống hồng đỏ cho hệ
số nhân cao nhất là 3,47 và 1,5 mg/l đối với giống hồng trắng cho hệ số nhân cao nhất là
5,94; sử dụng được cả môi trường đặc và lỏng cho nhân chồi hoa hồng đỏ, riêng hoa
hồng trắng thì chỉ nên sử dụng môi trường lỏng; pH=6 là thích hợp cho cả hai loại hoa
hồng.
Trang 11
Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh: môi trường bổ sung 2 mg/l NAA hoặc 2 mg/l IBA cho
hiệu quả tạo rễ trên 60%.
Theo Nguyễn Kim Hằng (2005), trên cây hoa hồng (Rosa chinensis) sử dụng 1,5
mg/l BA cho hệ số nhân chồi cao nhất; sử dụng NAA riêng lẽ (1mg/l) hoặc NAA (2mg/l)

kết hợp với than hoạt tính (2g/l) để tạo cây hoàn chỉnh là tốt nhất.
Hồ Tân (2006), giai đoạn khởi đầu: môi trường bổ sung 3 mg/l BA cho tỷ lệ tạo
chồi từ mầm ngủ cao nhất; giai đoạn nhân chồi: môi trường bổ sung 1 mg/l BA cho số
chồi tăng cao nhất; giai đoạn tạo rễ: môi trường bổ sung 2 mg/l NAA tạo rễ là tốt nhất.
Theo Lê Minh Lý (2007), trong giai đoạn nhân chồi của giống hoa hồng Rosa hybrid bổ
sung thêm 1-2 mg/l BA là thích hợp để nhân chồi.
Nguyễn Hữu Tính (2008), đối với cây hoa hồng nhung ( Rosa chinensis L): sử
dụng 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,15 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất; sử dụng 0,5
mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l than hoạt tính để tạo cây hoàn chỉnh là tốt nhất.
1.3.2 Các nghiên cứu ở ngoài nước
Theo kết quả nghiên cứu của Roy và cộng tác viên (2004), khi sử dụng 1mg/l và
0.5 mg/l IAA để tạo rễ cho cây Rosa sp thì sau 4 tuần đã cho kết quả cao (85% rễ của cây
Rosa sp thành lập).
Kết quả nghiên cứu của Arif và cộng tác viên (1991), giai đoạn nhân chồi bổ sung
thêm 3 mg/l BA và 0,05 mg/l NAA có tác dụng làm chồi cây hoa hồng mini tăng cao
nhất. Al-Khalifah và cộng tác viên (2005), khi sử dụng 3,0 mg/l BA kết hợp với 0,2 mg/l
kinetin thì cây thì cây Rosa hybrid L có tỷ lệ chồi tăng 71,1%.
Theo Soomro và cộng tác viên (2003), để tạo rễ của cây Rosa indica đã sử dụng
0,6 mg/l IBA và 0,1 mg/l NAA sau khoảng thời gian 12 tuần thì rễ sẽ tăng 50%; để tạo
chồi của cây Rosa indica đã sử dụng 2,0 mg/l IBA và 2,0 mg/l IAA sau khoảng 12 tuần
tỷ lệ chồi tăng 70%.
Hamed và cộng tác viên (2006), để tạo chồi của cây Rosa indica L đã được sử
dụng 1,5 mg/l BAP sau 7 ngày đã cho kết quả cao (100% chòi hình thành). Còn khi sử
Trang 12
dung,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l kinetin thì sau 10 ngày có 98% chồi hình thành. Theo kết
quả nghiên cứu của Khosravi và cộng tác viên (2007), trên cây Rosa hybrid sử dụng 4
µM BAP kết hợp với 0,5 µM NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.
Trang 13
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Thí nghiêm được tiến hành trên giống hoa hồng tỷ muội đỏ. Thí nghiệm sử dụng
nguồn mẫu từ cây mẹ khỏe mạnh, mập mạp, không sâu bệnh.
Khi những chồi non được 3 tuần tuổi thì tiến hành lấy mẫu. chọn những đoạn chồi
than không quá non cũng không quá già để tiến hành khử trùng mẫu và nuôi cấy.
Những đoạn chồi thân sau khi cắt ra và khử trùng được sử dụng để bố trí thí
nghiệm 1. Sau 2 tuần chồi mới phát triển, vươn cao và được nhân lên để bố trí các thí
nghiệm còn lại.
2.1.1 Thiết bị và hoá chất
Trang thiết bị thí nghiệm: tủ cấy vô trùng, cân điện tử, nồi thanh trùng(autoclave),
máy đo pH, bếp khử trùng dụng cụ cấy, tủ sấy giấy, các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí
nghiệm: ống đong, keo, ống nghiệm…
Hóa chất gồm có: Môi trường khoáng đa lượng – vi lượng MS( Murashige và
Skoog). Vitamin như thiamin, pyridoxine, nicotinic acid, myo – inositol. Các chất điều
hòa sinh trưởngthực vật: 6 - Benzyl adenine (BA), 1 – naphthaleneacetic (NAA). Hóa
chất khử trùng mẫu vật: cồn 70
o
, xà phòng Sunligh, bột giặt, nước Javel và các chất khác
như: đường sucrose, agar, nước dừa tươi, than hoạt tính.
2.1.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Trang 14
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô, bộ phận sinh lý – Sinh hóa,
khoa Nông nghiệp và SHUD, Trường Đại học Cần Thơ, đường 3/2 Tp Cần Thơ. Thời
gian thực hiện : từ tháng 12/2008 đến tháng 5/2009.
2.1.3 Điều kiện thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng cấy mô (nhiệt độ 26 +2
o
C,
cường độ chiếu sang 1500 lux, thời gian chiếu sang 16 giờ/ngày)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trường cơ bản theo MS có bổ sung them 30g/l đường sucrose, 7g/l
agar, 10% nước dừa tươi, vitamin theo Morel (1951) và 0,1g/l , myo – inositol. Ngoài ra,
tùy theo thí nghiệm có bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy 2g/l than hoạt tính và các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: 6-Benzyl adenine (BA), 1 – naphthaleneacetic
(NAA).
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8. Tùy theo thí nghiệm mà sử dụng
hay ống nghiệm(keo rót 40ml môi trường, ống nghiệm rót 12ml môi trường) và chuyển
vào nồi hấp khử trùng có nhiệt độ 121
o
C, áp suất 1atm, trong thời gian 20 phút.
2.2.2 Khử trùng mẫu cấy
Các chồi thân không quá non cũng không quá già cắt từ cây mẹ trồng trong nhà
lưới được đem vào phòng thí nghiệm để khử trùng và làm mẫu cấy.
Mẫu cấy được bỏ hết lá, cắt thành từng đoạn rồi cho vào keo và lắc nhanh với 4
giọt xà phòng Sunligh. Sau đó, mẫu cầy được ngâm trong bột giặt khoảng 10 phút và rửa
sạch lại dưới vòi nước chảy.Các thao tác tiếp theo được thực hiện trong tủ cấy vô trùng:
rửa bằng cồn 70
o
khoảng 30 giây và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Sau đó, mẫu
cấy được lắc đều với dung dịch khử trùng Javel cộng thêm 2 giọt nước xà phòng Sunligh
17 phút, rồi rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Tiếp đến, mẫu cấy lại được lắc đều với
Trang 15
dung dịch khử trùng Javel 15 phút nhưng không có thêm nước xà phòng Sunligh và rửa
lại 4 lần bằng nước cất vô trùng.
2.2.3 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Hiệu quả của BA trên sự tạo chồi cây hồng tỷ muội
Mục đích: Tìm ra nồng độ BA thích hợp cho giai đoạn tạo chồi từ mầm ngủ.
Mẫu cấy: Chọn những chồi thân với một mắt lá vừa được khử trùng để bố trí

thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 4 nghiệm
thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 3 ống nghiệm đựng môi trường, mỗi ống nghiệm có
1 mẫu.
Ký hiệu các nhiệm thức:
NT1: Đối chứng
NT2: 0,1mg/l BA
NT3: 1,5mg/l BA
NT4: 2 mg/l BA
Các chỉ tiêu theo dõi:
• Tỷ lệ sống: mẫu cấy có mầm ngủ vẫn còn xanh.
• Số lá, chiều cao chồi
• Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2 tuần sau khi cấy.
Thí nghiệm 2: Hiệu quả của BAvà BAA trên sự nhân chồi cây hồng tỷ muội
Mục đích: Tìm ra nồng độ BA và NAA thích hợp kết hợp cho giai đoạn nhân
chồi thích hợp cho giai đoạn tạo chồi từ mầm ngủ.
Mẫu cấy: Chọn những chồi thân với một mắt lá ở vị trí thứ tư từ ngọn xuống
để bố trí thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 6 nghiệm
thức, 6 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo đựng môi trường, mỗi keo có 3 mẫu.
Ký hiệu các nhiệm thức:
NT1: Đối chứng
NT2: 0,2mg/l BA
Trang 16
NT3: 1,5mg/l BA
NT4: 3 mg/l BA
NT5: 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
NT6: 3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
Các chỉ tiêu theo dõi:
• Số chồi

• Số lá, chiều cao chồi
• Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, 4, 5 tuần sau khi cấy.
Thí nghiệm 3: Hiệu quả của NAA và than hoạt tính trên sự tạo rể cây hồng tỷ
muội
Mục đích: Tìm ra nồng độ NAA thích hợp cho giai đoạn tạo rể .
Mẫu cấy: Chọn những chồi cao từ 1- 2 cm để bố trí thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 7 nghiệm
thức, 8 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo đựng môi trường, mỗi keo có 3 mẫu.
Ký hiệu các nhiệm thức:
NT1: Đối chứng
NT2: 0,5 mg/l NAA
NT3: 1 mg/l NAA
NT4: 2 mg/l NAA
NT5: 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l than hoạt tính
NT6: 1 mg/l NAA + 2 mg/l than hoạt tính
NT5: 2 mg/l NAA + 2 mg/l than hoạt tính
Các chỉ tiêu theo dõi:
• Số rễ, chiều cao rễ
• Chiều cao cây, số lá gia tăng
• Trọng lượng tươi gia tăng
• Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, 4, tuần sau khi cấy.
2.2.4 Phân tích số liệu
Trang 17
Xử lý số liệu bằng chương trình Microsoft Excel và chạy thống kê thí
nghiệm bằng chương trình Statgraphichc.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
HIỆU QUẢ CỦA BA TRÊN SỰ TẠO CHỒI CỦA CÂY HỒNG TỶ
MUỘI
Tỷ lệ sống

Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.1 vào thời điểm 1 tuần sau khi cấy thì nghiệm thức
BA 0,1 mg/l và nghiệm thức BA 2 mg/l cho số tỷ lệ sống (%) của mẫu cây hoa hồng tỷ
muội cao nhất (100%) khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với các thí nghiệm thức đối
chứng (66,7%) nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 1,5 mg/l
BA (88,9%).
Bảng 3.1: tỷ lệ sống (%) của mẫu cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có
BA khác nhau 1 tuần sau khi cấy.
Nghiệm thức
Tỷ lệ sống (%)
1 tuần sau khi cấy
Đối chứng
0,1 mg/l BA
1,5 mg/l BA
2 mg/l BA
66,7 b
100,0 a
88,9 a
100,0 a
F
CV (%)
LSD
**
10,81
18,10

Trang 18
3.1.1 Số lá
Kết quả trình bày ở Bảng 3.2 cho thấy vào thời điểm 1 tuần sau khi cấy số lá gia
tăng cao nhất ở các nghiệm thức BA 0,1 mg/l là 2,6 lá khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
mức 5 % so với các nghiệm thức còn lại. Số lá thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng là 0,9

lá. Nghiệm thức 1,5 mg/l BA (1,6 lá) và nghiệm thức 2 mg/l BA (1,7 lá) khác biệt không
có ý nghĩa thống kê nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với đối chứng (0,9
lá).
Bảng 3.2: số lá của cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có BA khác nhau
2 tuần sau khi cấy.
Nghiệm thức
Số lá
1 tuần sau khi cấy 2 tuần sau khi cấy
Đối chứng
0,1 mg/l BA
1,5 mg/l BA
2 mg/l BA
0,9 c
2,6 a
1,6 b
1,7 b
2,6 d
5,6 d
3,6 c
4,7 b
F
CV (%)
LSD
0,05
**
10,09
0,3151
**
10,02
0,7717

Kết quả tuần 2 sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,1 mg/l vẫn cho số lá gia tăng cao
nhất (5,6 lá) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Tại
thời điểm này số lá gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức đồi chứng (2,6 lá).
3.1.2 Chiều cao chồi
Kết quả trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy nghiệm thức BA 0,1 mg/l cho chiều cao
chồi gia tăng cao và ổn định qua 2 tuần nuôi cấy. Tuần đầu sau khi cấy, nghiệm thức BA
0,1 mg/l cho chiều cao chồi gia tăng cao nhất (1 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức
5% so với các nghiệm thức còn lại. Chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức đối
Trang 19
chứng (0,5 cm), tuy nhiên nó khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức 1,5 mg/l BA
(0,6 cm) và nghiệm thức 2 mg/l BA (0,6 cm).
Kết quả tuần 2 sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,1 mg/l vẫn cho chiều cao chồi gia
tăng cao nhất (1,8 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức
còn lại (Hình 3.1). Tại thời điểm này chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức đối
chứng (0,9 cm). Nghiệm thức 1,5 mg/l BA (1,1 cm) và nghiệm thức 2 mg/l BA (1,7 lá)
khác biệt không có ý nghĩa thống kê nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so
với đối chứng (0,9 cm).
Bảng 3.3: Chiều cao chồi (cm) của cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có
BA khác nhau 2 tuần sau khi cấy
Nghiệm thức
Chiều cao chồi (cm)
1 tuần sau khi cấy 2 tuần sau khi cấy
Đối chứng
0,1 mg/l BA
1,5 mg/l BA
2 mg/l BA
0,5 b
1,0 a
0,6 b
0,6 b

0,9 c
1,8 a
1,1 b
1,1 b
F
CV (%)
LSD
0,05
**
9,13
0,1191
**
4,72
0,1031
Trang 20
Hình 3.1: chồi của cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có BA khác nhau 2
tuần sau khi cấy. A) Đối chứng, B) 0,1 mg/l BA, C) 1,5 mg/l BA, D) 2 mg/l BA.
Tóm lại, môi trường MS kết hợp với 0,1 mg/l BA cho hiệu quả tạo chồi cao nhất
với chiều cao chồi là 1,8 cm và số lá đạt được 5,6 lá sau 2 tuần nuôi cấy.
3.2 HIỆU QUẢ CỦA BA VÀ NAA TRÊN SỰ NHÂN CHỒI CÂY HỒNG TỶ
MUỘI
3.2.1 Số chồi
Kết quả trình bày từ bảng 3.4 cho thấy nghiệm thức sử dụng BA 1,5 mg/l cho hiệu
quả tạo số chồi cao và ổn định qua các tuần nuôi cấy. Tại thời điểm 4 tuần sau khi cấy,
nghiệm thức BA 1,5 mg/l cho số chồi tăng cao nhất (1,8 chồi) khác biệt có ý nghĩa thống
kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại, số chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức
đối chứng (1,0 chồi) và nghiệm thức 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (0,1 chồi).
Trang 21
Bảng 3.4 số chồi của cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có BA và NAA
khác nhau 5 tuần sau khi cấy.

Nghiệm thức
Tuần sau khi cấy
4 5
Đối chứng
0,2 mg/l
1,5 mg/l BA
3 mg/l BA
1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
1,0 c
1,3 b
1,8 a
1,1 bc
1,0 c
1,3 c
1,0 d
1,4 b
2,2 a
1,3 bc
1,1 cd
1,3 bcd
F
CV (%)
LSD
0,05
**
17,24
0,2529
**
17,80

0,2864
Kết quả tuần sau khi cấy cho thấy nghiệm thức BA 1,5 mg/l cho số chồi tăng cao
nhất (2,2 chồi) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với nghiệm thức còn lại. Số
chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng (1,0 chồi) tuy nhiên khác biệt không có
ý nghĩa so với nghiệm thức 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA và 3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
(Hình 3.2)
Trang 22
Hình 3.2: số chồi của cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có BA và NAA khác
nhau 5 tuần sau khi cấy. A) đối chứng, B) 0,2 mg/l BA, C) 1,5 mg/l BA, D) 3 mg/l BA,
E) 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA, F) 3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA.
3.2.2 Chiều cao chồi
Kết quả trình bày ở Bảng 3.5 cho nghiệm thức sử dụng 0,2 mg/l BA cho chiều cao
chồi gia tăng cao và ổn định qua các tuần nuôi cấy. Tuần đầu sau khi cấy, nghiêm thức
BA 0,2 mg/l cho chiều cao chồi gia tăng cao nhất (0,4 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê
Trang 23
ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại, chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm
thức 3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (0,1 cm) và nghiệm thức 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
(0,1 cm).
Bảng 3.5: chiều cao chồi (cm) của cay hoa hồng tỷ muội trong môi trường có
BA và NAA khác nhau 5 tuần sau khi cấy
Nghiệm thức
Tuần sau khi cấy
1 2 3 4 5
Đối chứng
0,2 mg/l BA
1,5 mg/l BA
3 mg/l BA
1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
0,3 b

0,4 a
0,2 c
0,2 cd
0,1 de
0,1 e
0,4 c
0,7 a
0,6 b
0,4 cd
0,3 de
0,2 e
0,8 b
1,1 a
0,8 b
0,7 bc
0,5 c
0,4 c
0,9 bc
1,3 a
1,1 b
0,8 c
0,6 d
0,4 d
1,0 c
1,6 a
1,2 b
0,9 c
0,7 d
0,5 e
F

CV (%)
LSD
0,05
**
28,19
0,06458
**
20,92
0,1055
**
28,86
0,2473
**
17,82
0,1749
**
15,72
0,1827
Tại thời điểm 2 tuần sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,2 mg/l cho chiều cao chồi gia
tăng cao nhất (0,7 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức
còn lại. Ở thời điểm này chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức 3 mg/l BA +
0,2 mg/l NAA (0,2 cm) tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức 1,5
mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (0,3 cm).
Kết quả tuần 3 sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,2 mg/l cũng cho chiều cao chồi gia
tăng cao nhất (1,1 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức
còn lại. Ở thời điểm này chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức 3 mg/l BA +
0,2 mg/l NAA (0,4 cm) tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức 1,5
mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (0,5 cm) và nghiệm thức 3 mg/l BA (0,7).
Kết quả tuần 4 sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,2 mg/l vẫn cho chiều cao chồi gia
tăng cao nhất (1,4 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức

còn lại. Ở thời điểm này chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức 3 mg/l BA +
Trang 24
0,2 mg/l NAA (0,4 cm) tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức 1,5
mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (0,6 cm).
Tuần 5 sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,2 mg/l vẫn cho chiều cai chồi gia tăng cao
nhất (1,6 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Ở
thời điểm này chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức 3 mg/l BA + 0,2 mg/l
NAA (0,5 cm).
3.2.3 Số lá
Kế quả trình bày ở bảng 3.6 cho thấy ở tuần đầu sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,2
mg/l cho số lá gia tăng cao nhất (1,9 lá) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với
các nghiệm thức còn lại. Số lá gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức 3 mg/l BA + 0,2 mg/l
NAA (0,3 lá) tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức 1,5 mg/l BA + 0,2
mg/l NAA (0,5 lá) .
Bảng 3.6 Số lá của cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có BA và NAA
khác nhau 5 tuần sau khi cấy.
Nghiệm thức
Tuần sau khi cấy
1 2 3 4 5
Đối chứng
0,2 mg/l
1,5 mg/l BA
3 mg/l BA
1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
1,0 c
1,9 a
1,4 b
0,8 cd
0,5 de

0,3 e
2,0 c
3,1 a
2,4 b
1,4 d
1,3 d
0,8 e
2,6 b
4,3 a
3,9 a
2,3 b
1,6 c
1,2 c
3,0 c
5,1 b
6,6 a
3,5 c
1,9 c
1,4 d
3,1 d
6,2 b
7,8 a
4,8 c
2,2 d
2,1 d
F
CV (%)
LSD
0,05
**

25,62
0,2960
**
17,66
0,3839
**
19,71
0,6115
**
21,14
0,8933
**
26,14
1,336
Tại thời điểm 2 tuần sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,2 mg/l cho số lá gia tăng cao
nhất (3,1 lá) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Ở
thời điểm này số lá gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức 3 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (0,8 lá).
Trang 25