báo cáo nghiên cứu khoa học ''''''''nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô''''''''

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.51 MB, 13 trang )

10

Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006

Nhân nhanh giống hoa đồng tiền
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Mai Văn Chung
(a)
, Phùng Văn Hào
(b)

Tóm tắt. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây đồng tiền bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro, bớc đầu, chúng tôi thu đợc kết quả: Chồi đỉnh ngọn
trớc khi đa vào nuôi cấy in vitro đợc khử trùng kép bằng cồn 70
0
trong 1 phút và
HgCl
2
0,1% trong 10 phút; Môi trờng nhân nhanh chồi đồng tiền: MS + 50g/l
saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% nớc dừa; Môi trờng ra rễ cho chồi
đồng tiền: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l -NAA.

I. Đặt vấn đề
Cây đồng tiền (Gerbera jamesonii B.) là một loài thuộc họ Cúc (Asteraceae)
cho hoa quanh năm. Hoa đồng tiền đợc coi là một trong 10 loại hoa đẹp nhất
trên thế giới (chỉ xếp sau hoa hồng, cúc, cẩm chớng, lay ơn) [2, 4].
ở

Việt Nam, hiện có rất nhiều giống hoa đồng tiền đang đợc trồng với
những u điểm: hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa
đẹp, cho năng suất cao. Tuy nhiên, khó khăn trong sản xuất hoa đồng tiền là
nguồn giống cung cấp cho quá trình trồng trọt chủ yếu là cây tách thân, mặc dù
sinh trởng mạnh trong giai đoạn đầu nhng đến giai đoạn trởng thành và ra
hoa, cây sinh trởng chậm, nhanh già cỗi, chất lợng hoa kém. Bên cạnh đó,
phơng pháp tách thân tạo ra số lợng cây không nhiều trong mỗi lần nhân
giống [2, 4]. Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro khắc phục đợc những hạn chế
trên, cho phép chủ động sản xuất ra một lợng lớn cây giống, có độ đồng đều cao
và chất lợng tốt [1]. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trình nhân giống
vô tính hoa đồng tiền đợc công bố [2, 3, 4]. Tuy nhiên, việc tiếp tục hoàn thiện
cũng nh đề xuất quy trình kỹ thuật mới cho các giống vẫn thực sự cần thiết.
II. vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
1. Vật liệu
Đối tợng nghiên cứu của đề tài là giống đồng tiền kép, hoa đỏ có nguồn gốc
nhập nội. Cây giống đợc trồng trong nhà lới, sạch bệnh.
2. Xử lý mẫu
Chồi đỉnh ngọn đợc rửa trên nớc chảy và khử trùng sơ bộ bằng cồn 70
0
trong 1 phút trớc khi xử lý bằng H
2
O
2
hoặc HgCl
2
. Sau khi khử trùng, chồi đợc
rửa sạch bằng nớc cất vô trùng 4 - 5 lần, cắt lấy mẫu có kích thớc 3 ì 3 ì 3mm rồi

Nhận bài ngày 22/8/2005. Sửa chữa xong 17/11/2005

11
Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006

đa vào môi trờng dinh dỡng nuôi cấy trong 2 tuần. Các mẫu sống, bật chồi
đợc chuyển sang môi trờng nhân nhanh và nuôi. Sau 4 tuần, chồi in vitro đợc
nuôi trong môi trờng tạo rễ 1 tháng trớc khi đa ra vờn ơm.
Mẫu in vitro đợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25
0
2
0
C, cờng độ ánh sáng
2000lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày [5, 6].
3. Nội dung và phơng pháp nghiên cứu
Để xây dựng quy trình nhân giống in vitro, chúng tôi đã tiến hành những nội
dung nghiên cứu sau:
+ Nghiên cứu ảnh hởng của loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng
đến tỷ lệ sống của mẫu với các thí nghiệm đợc bố trí: Khử trùng mẫu bằng H
2
O
2

nồng độ 10, 15 và 20% trong 10 - 15 phút; bằng HgCl
2
0,1% trong 5 - 15 phút.
+ Nghiên cứu ảnh hởng của chất điều tiết sinh trởng BAP (6-benzylamino
purin) tới khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro. Môi trờng nuôi cấy chồi đợc
sử dụng là [MS (Murashige and Skoog, 1962) + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar] bổ
sung BAP với các nồng độ từ 0,1 - 2,0mg/l. Hệ số nhân chồi trong các thí nghiệm
đợc tính theo công thức

Hệ số nhân chồi = số chồi sau thời gian nuôi cấy / số chồi ban đầu.
+ Nghiên cứu ảnh hởng của chất phụ gia là nớc dừa bổ sung cho môi
trờng nuôi cấy với các nồng độ từ 0 - 20% đến sinh trởng, phát triển và hệ số
nhân chồi in vitro.
+ Nghiên cứu ảnh hởng của -NAA (-naphtyl acetic acid) đến khả năng ra
rễ của chồi in vitro. Môi trờng ra rễ đợc sử dụng là (MS + 50g/l saccaroza +
6,5g/l agar) có bổ sung -NAA với các nồng độ từ 0,1 - 1,5mg/l.
Các nghiên cứu đợc thực hiện từ tháng 01 đến tháng 7 năm 2005 tại Phòng
Nuôi cấy mô - tế bào thực vật, khoa Sinh học, trờng Đại học Vinh.
III. Kết quả nghiên cứu và bàn luận
1. ảnh hởng của loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng
Bảng 1. Hiệu quả khử trùng đỉnh ngọn cây đồng tiền.

Hoá
chất
Nồng độ
(%)
Thời gian
(phút)
Số mẫu
đa vào
Số mẫu nhiễm
và chết (%)
Số mẫu
sống (%)
10 10 20 15 (75) 5( 25)
15 10 20 12 (60) 8 (40)
15 15 20 12 (60) 8 (40)

H

2
O
2

20 15 20 14 (70) 6 (30)
0,1 5 20 13 (65) 7 (35)
0,1 10 20 4 (20) 16 (80)

HgCl
2

0,1 15 20 9 (45) 11 (55)

12

Mai Văn Chung - Phùng Văn Hào, Nhân nhanh giống hoa , tr.

10-15

Kết quả bảng 1 cho thấy: sử dụng H
2
O
2
ở các nồng độ 10% và 15% để xử lý
mẫu đồng tiền trong thời gian 10 phút cho tỷ lệ nhiễm khá cao (từ 60 - 75%),
chứng tỏ hiệu quả khử trùng mẫu của các thí nghiệm này thấp. Khi H
2
O
2

đợc
sử dụng với nồng độ cao hơn (20%) và kéo dài thời gian xử lý (15 phút) thì số
lợng mẫu bị nhiễm có giảm nhng tỷ lệ chết lại cao. Có thể nói, H
2
O
2
không phù
hợp cho việc sử dụng để khử trùng đỉnh ngọn đồng tiền.
Đối với HgCl
2
0,1%, thời gian khử
trùng 5 phút cho số mẫu bị nhiễm
nhiều (13 mẫu). Khi tăng thời gian khử
trùng, tỷ lệ mẫu bị nhiễm và chết giảm
nhiều, hiệu quả cao nhất đạt đợc ở
công thức xử lý 10 phút (tỷ lệ sống và
bật chồi đạt 80%). Thời gian xử lý 15
phút cho số mẫu bị nhiễm giảm nhiều
(3 mẫu) nhng lại có tới 6 mẫu bị chết
(do thời gian xử lý dài). Nh vậy, sử
dụng HgCl
2
0,1% với thời gian xử lý 10
phút là phù hợp đối với đỉnh ngọn cây
hoa đồng tiền.

Hình 1. Chồi đồng tiền in vitro
sau 1 tuần nuôi cấy từ đỉnh ngọn.

2. ảnh hởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro
Sau khi lựa chọn đợc loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích
hợp, chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu với số lợng lớn để nhân nhanh và tìm
hiểu ảnh hởng của BAP - một loại chất kích thích sinh trởng thực vật - đến
khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro.
Bảng 2. ảnh hởng của BAP đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro.
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Nồng độ
BAP (mg/l)

Số mẫu

Số chồi Hệ số nhân Số chồi Hệ số nhân
0,0 50 50 1,00 58 1,16
0,1 50 55 1,10 102 2,04
0,5 50 102 2,04 110 2,20
1,0 50 148 2,96 215 4,30
1,5 50 155 3,10 307 6,14
2,0 50 145 2,90 246 4,92
Qua bảng 2, chúng tôi nhận thấy: không có BAP, sinh trởng và phát triển
của chồi đồng tiền in vitro kém, hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,16 sau 1 tháng nuôi
cấy. Khi bổ sung BAP vào môi trờng dinh dỡng (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l
agar), sinh trởng của chồi tăng tỷ lệ thuận với thang nồng độ BAP từ 0,1 - 1,5mg/l,

13
Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006

hệ số nhân chồi cao nhất đạt đợc ở nồng độ BAP 1,5mg/l (sau 2 tuần nuôi cấy là
3,10, sau 4 tuần là 6,14). Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2,0 mg/l thì hiệu quả xử
lý đã giảm xuống.

Hình 2. Chồi đồng tiền in vitro sau 1 tuần cấy chuyển.
3. ảnh hởng của nớc dừa đến khả năng sinh trởng và nhân chồi
in vitro
Bảng 3. ảnh hởng của nớc dừa đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro.
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Nồng độ
nớc dừa (%)
Số
mẫu
Số chồi Hệ số nhân Số chồi

Hệ số nhân
0 50 94 1,88 262 5,24
5 50 110 2,20 289 5,78
10 50 152 3,04 314 6,28
15 50 193 3,86 336 6,72
20 50 141 2,82 295 5,90
Nớc dừa là một loại hỗn hợp dinh dỡng tự nhiên, trong thành phần chứa
nhiều hợp chất quan trọng đối với mô, tế bào in vitro: axit amin, axit hữu cơ,
gluxit, các hợp chất có hoạt tính auxin, các xytokinin dạng glycosit và myo
insitol. Bổ sung vào môi trờng nhân chồi đồng tiền (MS + 50g/l saccaroza +
6,5g/l agar + 1,5mg/l BAP) nớc dừa với nồng độ 15% cho kết quả tốt nhất, chồi
in vitro phát triển mạnh, cây khoẻ, hệ số nhân chồi đạt đợc sau 2 và 4 tuần
nuôi cấy tơng ứng 3,86 và 6,72. Các nồng độ cao hoặc thấp hơn 15% đều cho
hiệu quả kém hơn (bảng 3). Do đó, môi trờng sử dụng để nhân nhanh chồi đồng
tiền cần bổ sung nớc dừa với nồng độ 15%.
4. ảnh hởng của

-NAA đến khả năng phát triển rễ và lá của chồi in

vitro
Các chồi đồng tiền có khả năng tạo rễ và phát triển lá khác nhau trong môi
trờng có nồng độ -NAA khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 4).

14

Mai Văn Chung - Phùng Văn Hào, Nhân nhanh giống hoa , tr.

10-15

Bảng 4. ảnh hởng của NAA đến khả năng phát triển rễ và lá của chồi
đồngtiền in vitro.
Nồng độ -
NAA (mg/l)
Số chồi
% số chồi
ra rễ
Số rễ/ cây

Dài rễ
(mm)
Số lá /cây

0,0 50 40 2,3 12,4 4,6
0,1 50 32 2,6 19,3 4,3
0,5 50 84 3,0 26,1 3,9
1,0 50 90 3,1 30,8 4,6
1,5 50 80 3,4 24,6 3,6

Kết quả thu đợc cho thấy, các nồng
độ -NAA từ 0,5 - 1,5 mg/l có ảnh hởng
tốt đến tỷ lệ ra rễ của chồi đồng tiền in
vitro (80 - 90%), số lợng nhiều (3,0 - 3,4
rễ/cây), chiều dài rễ lớn (24,6 - 30,8mm),
trong đó, nồng độ 1,0mg/l -NAA cho hiệu
quả tốt nhất. ở nồng độ này, mặc dù số
rễ/cây cha phải là nhiều nhất nhng tỷ lệ
cây ra rễ, chiều dài rễ và số lá/cây là cao
hơn cả.
Vì vậy, theo chúng tôi, nồng độ -NAA
bổ sung vào môi trờng (MS + 50g/l
saccaroza + 6,5g/l agar) cho chồi đồng tiền
in vitro ra rễ thích hợp nhất là 1,0mg/l.

Hình 3. Cây đồng tiền sau 4 tuần
nuôi trong môi trờng ra rễ.

IV. kết luận
Từ những kết quả thu đợc, bớc đầu, chúng tôi đề xuất phơng pháp nhân
giống vô tính in vitro giống đồng tiền kép, hoa đỏ nh sau:
+ Chồi đỉnh ngọn trớc khi đa vào nuôi cấy in vitro đợc khử trùng kép:
xử lý mẫu bằng cồn 70
0
(1 phút), sau đó sử dụng HgCl
2
0,1% trong 10 phút.
+ Môi trờng nhân nhanh chồi đồng tiền in vitro
MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% nớc dừa.

+ Môi trờng tạo rễ cho chồi đồng tiền in vitro:
MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l -NAA.

15
Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006

Tài liệu tham khảo

[1] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, Công nghệ sinh học thực vật trong
cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1997.
[2] Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, Hoa đồng tiền, NXB Lao động - Xã hội, Hà
Nội, 2004.
[3] Trần Thị Lệ, Lê Dung, Hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền
bằng công nghệ in vitro, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Số 10
(2005), 80 - 82.
[4] Nguyễn Xuân Linh, Hoa và kỹ thuật trồng hoa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội,
1998.
[5] Đỗ Năng Vịnh, Công nghệ sinh học cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội,
2002.
[6] M. R. Fowler, Plant cell culture, laboratory techniques, In Encyclopedia of
cell, Wiley, New York, 2002.

SUMMARY

Rapid multiplication of Gerbera (Gerbera jamesonii B.)

by tissue culture technique

We have studied to apply the technique of in vitro propagation in order to
produce a large number of disease-free plantlet of Gerbera.
The first results of our research show that: The in vitro shoot tip explants of
Gerbera were sterilized by etanol 70
0
in 1 minute and HgCl
2
0.1% in 10 minutes;
The best medium using for shoot multiplication is [MS (Murashige and Skoog,
1962) + 50g/l saccharose + 6.5 g/l agar + 1.5mg/l BAP (6-benzylaminopurine) +
15% coconut water]; The best medium using for roots formation was (MS + 50g/l
saccharose + 6.5 g/l agar + 1.0 mg/l -NAA (-naphtyl acetic acid)).

(a) (b) Khoa sinh học, Trờng Đại học Vinh

16

§¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006