Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong việc sàng lọc bệnh nhược cơ Duchenne Becker ở cộng đồng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.02 MB, 142 trang )
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN GÂY BỆNH,
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC
BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ở CỘNG ĐỒNG
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. TRẦN VÂN KHÁNH
CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ
THỜI GIAN THỰC HIỆN: Từ tháng 11/2007 đến tháng 11/2009
(Quyết định phê duyệt số 4066 /QĐ-BYT ngày 25 tháng 10 năm2007)
8520
HÀ NỘI, NĂM 2009
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN GÂY BỆNH,
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC
BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ở CỘNG ĐỒNG
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. TRẦN VÂN KHÁNH
CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ
THỜI GIAN THỰC HIỆN: Từ tháng 11/2007 đến tháng 11/2009
(Quyết định phê duyệt số 4066 /QĐ-BYT ngày 25 tháng 10 năm2007)
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 470.000.000 đ
Trong đó kinh phí SNKH: 470.000.000 đ
HÀ NỘI, NĂM 2009
DANH SÁCH CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ THAM GIA
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
1- Tên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước
sinh ứng dụng trong sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng
đồng”.
2- Thời gian thực hiện: Tháng 11/2007 – tháng 11/2009.
3- Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Hà Nội.
4- Bộ chủ quản: Bộ Y Tế
5- Danh sách những người tham gia:
STT Họ Tên, Học hàm, Học vị Cơ quan công tác
1 TS. Trần Vân Khánh Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, ĐHYHN
2 PGS.TS. Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN
3 PGS.TS. Nguyễn Thị Hà Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN
4 PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàn Bệnh viện Nhi Trung ương
5 ThS. Nguyễn Thị Băng Sương Bộ môn Hóa sinh, ĐHY Huế
6 BS. Đỗ Ngọc Hải Khoa Hóa sinh, bv Việt-Tiệp, Hải Phòng
7 BS.Nguyễn Thị Thanh Hải BSNT Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN
8 CN Nguyễn Thị Phương Thúy Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN
8 CN. Nguyễn Hoàng Việt Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, ĐHYHN
TL HIỆU TRƯỞNG
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hùng
MỤC LỤC
Trang
PHẦN A- TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1. Kết quả nổi bật của đề tài 1
1.1. Đóng góp mới của đề tài 1
1.2. Kết quả cụ thể .2
2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 3
3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu
đ
ã được phê duyệt 4
3.1. Tiến độ 4
3.2. Thực hiện mục tiêu nghiên cúu .4
3.3. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của Bản đề cương 4
3.4. Đánh giá việc sử dụng kinh phí 5
PHẦN B . NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI
Đặt vấn đề 6
Chương 1. Tổng quan tài liệu 9
1.1. Lịch sử nghiên cứ
u bệnh DMD 9
1.2. Đặc điểm của bệnh DMD 16
1.3. Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen dystrophin 20
1.4. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin 30
1.5. Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 38
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 40
2.1. Đối tượng nghiên cứu 40
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất 40
2.3. Phương pháp nghiên cứu 42
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 49
Chương 3: Kết quả nghiên cứu 50
3.1. Kết quả tách chiết DNA 50
3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 51
3.3. Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ RNA 52
3.4. Kết quả xác định người lành mang gen bệnh 58
3.5. Kết quả chẩn đoán trước sinh b
ệnh DMD 68
Chương 4. Bàn luận 73
4.1. Qui trình tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA 73
4.2. Xác định đột biến gen dystrophin 76
4.3. Xác định người lành mang gen bệnh 86
4.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 95
Kết luận 101
Kiến nghị 102
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
PHẦN A
TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1. KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1.1. Đóng góp mới của đề tài
- Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy - DMD) là bệnh lý cơ
di truyền có tần suất mắc bệnh khá cao (1/3500 trẻ trai), biểu hiện lâm sàng với yếu cơ
nặng dần theo thời gian và thường tử vong ở độ tuổi 20. DMD là bệnh di truyền lặn liên
kết nhiễm sắc thể X. Dạng đột biến mất đo
ạn gen là phổ biến nhất, chiếm 60-65%. Các
nghiên cứu cho thấy đột biến mất đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm
(hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5
’
(exon 1-19). Tại
Việt Nam, các nghiên cứu đã công bố đều xác định đột biến mất đoạn gen ở mức độ
DNA và ưu tiên sử dụng 19-25 cặp mồi khuyếch đại 19-25 exon trong hai vùng trọng
điểm, trong khi đó đột biến có thể rải rác khắp 79 exon của chiều dài gen dystrophin; bởi
vậy, các nghiên cứu này sẽ bỏ sót tổn thương. Trên phân tử DNA, các exon nằm xen kẽ
với các intron có kích thước quá lớn; để khuyếch
đại 79 exon ở mức độ DNA, người ta
phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon. Ngược lại, trong cấu trúc
mRNA của gen dystrophin, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau.
Do đó, để khuyếch đại toàn bộ chiều dài của mRNA chứa 79 exon, người ta chỉ cần dùng
15 cặp mồi đặc hiệu.
Nghiên cứu này đã thành công trong việc xác định
đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở
mức độ mRNA tại tất cả các vị trí của gen (79 exon), không chỉ tại hai vùng hotspot
như các nghiên cứu trước (gồm 19-25 exon). Song song, với việc chỉ cần sử dụng 15
cặp mồi đặc hiệu các tác giả đã tiết kiệm được rất nhiều thời gian, công sức và tiền
của.
- Hiện nay, bệnh DMD chưa có phương pháp điều trị đặc hi
ệu. Các nhà khoa học trên thế
giới cho rằng việc nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị và em gái,
dì) trong gia đình bệnh nhân, hoặc chẩn đoán trước sinh cho những người mẹ có nguy cơ
cao để tư vấn di truyền vẫn là biện pháp cơ bản nhằm phòng ngừa bệnh DMD và hạn chế
tỷ lệ sinh con bị bệnh trong cộng đồng.
Từ kết quả xác định đột biến ở bệnh nhân và sử dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng,
nghiên cứu của đề tài đã phát hiện được những người nữ lành mang gen bệnh trong
các gia đình bệnh nhân. Trên cơ sở đó, các tác giả đã bước đầu thực hiện chẩn đoán
trước sinh cho những thai phụ có mang gen bệnh để phát hiện thai nhi có đột biến mất
đoạn gen dystrophin và đưa ra lời khuyên di truyền: các thai phụ có thể giữ thai hay nên
hủy thai.
Kết quả của đề tài nghiên cứu không chỉ mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, mà
còn có tính nhân văn rõ nét.
1.2. Tóm tắt kết quả cụ thể của đề tài
- Các tác giả đ
ã chuẩn hóa tốt các qui trình kỹ thuật xác định đột biến mất đoạn gen
dystrophin ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen (quy trình tách chiết
DNA và RNA tổng số từ máu ngoại vi, qui trình RT-PCR tổng hợp cDNA, nested-PCR
xác định đột biến, nhân dòng gen và giải trình tự gen, phản ứng multiplex PCR và kết
hợp phân tích phả hệ); qui trình chẩn đoán trước sinh bệnh DMD (chọc hút dịch ối, nuôi
cấy tế bào dịch ối, kỹ thuật tách DNA của tế
bào ối và xác định giới tính thai nhi).
- Phát hiện được 20/40 bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn; trong đó 13 bệnh nhân có
đột biến mất đoạn ở vùng trung tâm (exon 43-60) chiếm 65%; 03 bệnh nhân có đột biến
mất đoạn ở vùng tận 5
’
, chiếm 15%; 02 bệnh nhân có đột biến kéo dài từ vùng tận 5
’
đến
vùng trung tâm, chiếm 10% và 02 bệnh nhân có đột biến mất đoạn ở ngoài vùng hotspot,
chiếm 10%. Như vậy, nghiên cứu này đã thành công trong việc xác định đột biến xóa
đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA tại tất cả các vị trí của gen (79 exon), không chỉ
tại hai vùng hotspot như các nghiên cứu trước (gồm 19-25 exon). Song song, với việc
chỉ cần sử dụng 15 cặp mồi đặc hiệu các tác giả đã tiết kiệm
được rất nhiều thời gian,
công sức và tiền của.
- Từ kết quả xác định đột biến mất đoạn gen ở bệnh nhân, nghiên cứu tiếp tục được thực
hiện để xác định người mang gen (thể dị hợp tử) đối với những người nữ có quan hệ
huyết thống với bệnh nhân. Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng, phân tích gen
dystrophin của 48 thành viên nữ trong 30 gia đình bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạ
n
đã phát hiện: 21/48 thành viên nữ là người lành mang gen bệnh, chiếm 43,8%; trong
đó số người mẹ dị hợp tử là 15/30, chiếm 50% và như vậy, 50% bệnh nhân DMD có
đột biến mới phát sinh mà không phải do nhận gen bệnh từ người mẹ.
- Các tác giả đã tiến hành chẩn đoán trước sinh cho 02 người mẹ đang mang thai
trong số 15 người mẹ có kiểu gen dị hợp tử: 01 thai nhi là nam và 01 thai nhi là nữ, 02
thai nhi này không có đột biến mất đo
ạn gen dystrophin. Hai người mẹ được khuyên có
thể giữ thai.
2. ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI
- Trên cơ sở những kết quả của đề tài, nghiên cứu sẽ được áp dụng trong chẩn đoán xác
định đột biến mất đoạn gen cho những bệnh nhân DMD với giá thành, thời gian và công
sức được tiết kiệm rất nhiều; mặt khác, những kết quả thu được s
ẽ là tiền đề cho những
nghiên cứu tiếp theo nhằm phát hiện các đột biến khác của gen dystrophin gây bệnh
DMD như đột biến điểm, đột biến lặp đoạn. Từ đó, chẩn đoán bệnh DMD sẽ được chính
xác và đầy đủ.
- Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc phát hiện người lành mang gen, người mẹ dị hợp tử
và chẩn đoán trước sinh
để tư vấn di truyền nhằm hạn chế việc sinh con bị bệnh. Những
công việc này có ý nghĩa khoa học và nhân văn lớn, giảm gánh nặng về tinh thần và vật
chất cho gia đình người bệnh, cho xã hội và góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho
người dân.
- Đây là nghiên cứu được tiến hành đầu tiện ở Việt Nam. Bởi vậy, sau khi nghiệm thu kết
quả của đề tài có thể
được chuyển giao kỹ thuật cho các phòng nghiên cứu Sinh học phân
tử của các bệnh viện Sản và Nhi để có thể áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh DMD
và chẩn đoán trước sinh, tư vấn di truyền bệnh DMD.
3. ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIEN
CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT
3.1. Tiến độ:
Thực hiện đề tài và nghiệm thu đúng thời gian qui định.
3.2. Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:
Thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu của Bản đề cương đã được Bộ phê duyệt
3.3. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến củ
a Bản đề cương:
- Các qui trình để thu được RNA tinh khiết từ máu ngoại vi, DNA từ tế bào nước ối; các
kỹ thuật RT-PCR, nested PCR, nhân dòng và giải trình tự gen, multiplex PCR đã được
chuẩn hóa, có tính ổn định cao với mức độ tin cậy tốt.
- Đào tạo 01 cao học, 01 Bác sỹ Nội trú bệnh viện và 01 nghiên cứu sinh:
+ Đỗ Ngọc Hải, Luận văn Thạc sỹ 2007, “Nghiên cứu đột biến mất đoạn gen
dystrophin ở mức độ mRNA trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne” . Đạt loại xuất
sắc.
+ Nguyễn Thị Băng Sương, Luận án Tiến sỹ Y học 2007-2010, “Xác định đột biến
mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát
hiện người lành mang gen bệnh”. Đã bảo vệ luận án cấp cơ sở và đang chờ quyết định
c
ủa Bộ GD-ĐT cho bảo vệ luận án cấp nhà nước.
+ Nguyễn Thị Thanh Hải, Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Nội trú Khóa 31 (2007-
2010),“Nghiên cứu qui trình chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne“. Đang
triển khai.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài đã được công bố trong 05 bài báo của các tạp chí khoa
học ngành Y và dự kiến đăng 01 bài báo ở tạp chí quốc tế (đang hoàn thiện)
+ Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Hà, Tạ
Thành Văn, (2008), Phát hiện người lành mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng
PCR định lượng, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 59 (6), 1-10.
+ Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, (2008), Phát hiện đột biến làm thay đổi quá trình
hoàn thiện mRNA của gen dystrophin, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 54 (2), 19-23.
+ Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2009),
Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA, Tạp chí Y học thành phố
Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, 98-104.
+ Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Băng Sương, Lê Thị Hương Lan, Nguyễn Thị Hà, Tạ
Thành Văn, (2009), Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và phát hiện
người lành mang gen b
ệnh loạn dưỡng cơ Duchenne, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí
Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, 66-72.
+ Đỗ Ngọc Hải, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Băng Sương, Nguyễn Hoàng Việt,
Nguyễn Thị Phương Thúy, Tạ Thành Văn, (2009), Nghiên cứu đột biến mất đoạn gen
dystrophin ở mức độ mRNA trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, Tạp chí Nghiên
cứu Y học, 61 (2), 16-23.
3.4. Đánh giá việc sử d
ụng kinh phí:
- Tổng kinh phí của đề tài: 470.000.000 đ
- Kinh phí đã chi và hoàn ứng: 450.000.000 đ
- Kinh phí còn lại: 20.000.000 đ (để nghiệm thu các cấp).
6
PHẦN B
NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)
là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các
chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai.
Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ,
biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầ
u
thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại
vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối
loạn hô hấp [62], [146].
DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen
dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều
dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là một gen
lớn nhất của người được phát hiệ
n cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA
14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là protein dystrophin. Protein
này có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc
duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình
co cơ. Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả
là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96],
[109].
Hiện nay, bản
đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định.
Dạng đột biến xóa đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%. Đột biến điểm
7
đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn,
khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy đột biến xóa
đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung
tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì
vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến xóa
đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hi
ệu cho
19-25 exon trong vùng hay xảy ra xóa đoạn [7], [20], [69].
Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử,
nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu
và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Tuy nhiên
ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến xóa
đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biế
n trong 2
vùng trọng điểm [1], [7], [10]. Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải
rác khắp 79 exon. Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở
những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền
mRNA.
Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng
phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải
khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩ
a phải khuếch đại toàn bộ 79
exon để xác định đột biến. Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với
các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA
người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon. Ngược
lại, ở cấu trúc của mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên
tục nhau; do vậ
y, để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon
này, người ta chỉ cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả
chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129]. Như vậy, việc xác định đột
8
biến ở mức độ RNA giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa
chất.
Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử
vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ
Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng
của gia đ
ình cũng như của cộng đồng. Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân
DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến
mới phát sinh [66]. Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán
trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh là
sự lựa chọn được nhiều người
đồng thuận [93], [107].
Ở Việt Nam, năm 2005, Nguyễn Thị Trang và cs nghiên cứu về lâm
sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán
người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu
có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ
mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức
thuyết phục để thự
c hiện tư vấn di truyền.
Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện
người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong sàng lọc
bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng đồng” được tiến hành với
các mục tiêu sau:
1. Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne/Becker ở mức độ mRNA.
2. Phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong gia đ
ình
của bệnh nhân đã được xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin.
3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những thai phụ dị hợp tử
mang gen dystrophin đột biến xóa đoạn.
9
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH DMD
1.1.1. Biểu hiện lâm sàng của bệnh DMD
Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp ngã
nhưng chưa có biểu hiện teo cơ.
- Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu Gowers
rõ. Khi trẻ đ
ang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn ngồi
dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống nạng đỡ
lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên
cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các động
tác nh
ư vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.
- Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi. Sau đó
dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được. Cuối cùng trẻ thường tử
vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96].
1.1.2. Xét nghiệm cận lâm sàng của bệ
nh DMD
1.1.2.1. Định lượng hoạt độ CK toàn phần
CK được Lohman phát hiện vào năm 1934. CK là enzym xúc tác sự tạo
năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong
tế bào cơ. Năm 1959, Ebashi và CS là những người đầu tiên áp dụng việc
định lượng hoạt độ CK huyết thanh trong chẩn đoán bệnh lý tổn thương cơ.
Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần ở bệnh nhân
loạn d
ưỡng cơ tiến triển. Manhoney (1977), Edward (1984) phát hiện CK tăng
trong máu của các thai nhi bị bệnh DMD [48], [104].
10
Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thanh thường tăng rất cao trước
khi có dấu hiệu lâm sàng, thậm chí tăng từ thời kỳ sơ sinh. Hoạt độ CK huyết
thanh ở bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường dưới
160 UI/L). Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết thanh bình thường có thể
loại trừ chẩn đoán DMD. Tuy nhiên, trong giai đoạn muộn của quá trình
bệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp. Lý do của hiện tượng trên là vào giai
đoạn cuối, khối cơ còn lại quá ít, mặt khác bệnh nhân giảm vận động nên
lượng cơ thoái hóa cũng bị giảm [4], [91], [102].
1.1.2.2. Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ
Ghi điện cơ là phương pháp nghiên cứu hoạt động điện của cơ bằng
cách ghi lại điện thế hoạt động của các sợi cơ ở những trạng thái khác nhau.
Nhờ nghiên cứu của Kugelberg (1947), Buchtbal (1953), ph
ương pháp ghi
điện cơ được ứng dụng để chẩn đoán sớm các bệnh loạn dưỡng cơ tiến triển
trước khi có biểu hiện lâm sàng. Năm 1979, Stalberg và Trontelj mô tả chi tiết
hình ảnh tổn thương trên điện cơ đồ ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ [103]. Trên
bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, điện cơ đồ cho thấy những biến đổi đặc
trư
ng của bệnh lý cơ nhưng không đặc hiệu cho bệnh DMD, không có bằng
chứng của hiện tượng suy giảm phân bố thần kinh trong cơ, tốc độ dẫn truyền
thần kinh cảm giác và vận động bình thường [34].
1.1.2.3. Sinh thiết cơ
Vào thế kỷ 19, Meryon (1852) và Duchenne (1868) đã áp dụng phương
pháp sinh thiết cơ để chẩn đoán bệnh DMD [34]. Trong nhiều năm sau đó,
phương pháp này được xem là công cụ đắc lực để
chẩn đoán xác định bệnh
DMD và chẩn đoán phân biệt với các bệnh lý khác.
Sinh thiết cơ có tác dụng chẩn đoán xác định dựa vào những thay đổi
đặc trưng trên tiêu bản sinh thiết. Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồm
tăng sinh tổ chức liên kết của mô bọc sợi cơ, các sợi cơ bị thoái hóa và tái
11
sinh rải rác. Mô bệnh học cũng cho thấy các ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơn
nhân, đây là hậu quả của phản ứng viêm được khởi động bởi quá trình hoại tử
sợi cơ; song song các sợi cơ có chức năng bình thường cũng biểu hiện những
thay đổi nhẹ về mặt cấu trúc. [34].
Vị trí sinh thiết thường sử dụng nhất trong lâm sàng ở cơ rộng ngoài
của cơ
tứ đầu đùi hoặc cơ sinh đôi ngoài [62].
1.1.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang
Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ. Bởi vậy với phương pháp
miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bình
thường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trong
khi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắt
màu, không thấy rõ ranh giới màng t
ế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt của
protein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89].
Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker
(BMD). Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với
ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm
hơn. Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể
trên màng tế
bào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD [28].
Người bình thường Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD
Hình 1.1. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein dystrophin
(Nguồn: Matsuo, 2002)
12
1.1.2.5. Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến
Sự thành công của Kunkel và CS (1985) trong việc phát hiện sự xóa
đoạn lớn của NST X ở 1 bệnh nhân nam DMD đã khởi đầu cho một loạt
những nghiên cứu xác định gen ở bệnh nhân DMD. Hiện nay, có rất nhiều kỹ
thuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin như kỹ thuật
PCR,
Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization
(FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA) [90], [91], [107]. Các kỹ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4.
1.1.3. Tần số của bệnh DMD
DMD là một bệnh di truyền phổ biến, có tần suất cao trong nhóm bệnh
loạn dưỡng cơ tuần tiến với tỉ lệ 1/3500 trẻ trai [34].
Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu rõ ràng về tần suất mắc bệnh DMD.
Theo Nguyễn Thu Nhạn và CS những năm 1981-1990 có 131 bệnh nhân vào
điều trị tạ
i Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh Viện Nhi Trung Ương,
chiếm 0,6% trong tổng số bệnh nhân vào điều trị [13]. Theo Nguyễn Thị
Phượng, Vũ Chí Dũng giai đoạn 1991-1996 có 88 bệnh nhân DMD vào điều
trị tại viện Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 19,4% trong các bệnh di
truyền của Khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và chiếm khoảng 0,11% tổng
số bệnh nhân vào điều trị tại bệ
nh viện [14].
1.1.4. Di truyền học bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền đơn gen, tuân theo quy luật di truyền lặn liên
kết NST X không có alen tương ứng trên NST Y. Bệnh thường gặp ở trẻ trai
và rất hiếm gặp ở trẻ gái. Trẻ trai chỉ cần nhận một gen bệnh trên NST X của
người mẹ mang gen (X
D
X
d
) là có biểu hiện bệnh, trong khi đó trẻ gái đòi hỏi
phải nhận 2 gen X mang bệnh, một gen bệnh từ mẹ và một gen bệnh từ bố
mới có khả năng biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, trẻ trai bị bệnh DMD thường chết
sớm ở tuổi từ 20 đến 25 nên không có khả năng lập gia đình. Do vậy, trong
13
sáu trường hợp ở bảng 1.1, khả năng thứ hai là hay gặp nhất, những người mẹ
mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen
bệnh cho 50% số con gái của họ [96].
Trong một vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu hiện bệnh khi
NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen
bệnh sẽ biểu hiện bệnh [54], [56].
Bảng 1.1. Kiểu gen bố mẹ
và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con
Tần số con với các genotyp khác nhau
Genotyp và phenotyp
của cha mẹ
Trai Gái
Cha Mẹ X
D
Y
lành
X
d
Y
bệnh
X
D
X
D
lành
X
D
X
d
lành mang
gen bệnh
X
d
X
d
bệnh
X
D
Y
lành
X
D
X
D
lành
1 0 1 0 0
X
D
Y
lành
X
D
X
d
lành mang
gen bệnh
1/2 1/2 1/2 1/2 0
X
D
Y
lành
X
d
X
d
bệnh
0 1 0 1 0
X
d
Y
bệnh
X
D
X
D
lành
1 0 0 1 0
X
d
Y
bệnh
X
D
X
d
lành mang
gen bệnh
1/2 1/2 0 1/2 1/2
X
d
Y
bệnh
X
d
X
d
bệnh
0 1 0 0 1
Theo nghiên cứu của White (2002), Hung (2006), khoảng 30% bệnh
nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình
đột biến mới phát sinh trong giai đoạn tạo giao tử ở bố hoặc mẹ. Khoảng 70%
bệnh nhân DMD là do nhận gen bệnh từ người mẹ [66], [137]. Phụ nữ mang
gen bệnh thường không có triệu chứng yếu cơ hoặc bất kỳ một dấu hiệu lâm
14
sàng nào của bệnh [16]. Norman (1989) cho rằng khoảng 2/3 người lành
mang gen bệnh có hoạt độ CK huyết thanh tăng [99].
1.1.5. Điều trị bệnh DMD
Điều trị bệnh DMD vẫn còn là vấn đề khó khăn đối với nền y học. Hiện
tại, chưa có những biện pháp điều trị đặc hiệu cũng như ngăn cản sự tiến triển
của bệnh. Tuy nhiên, chúng ta vẫn có thể đ
iều trị các triệu chứng, các biến
chứng của bệnh và nâng cao chất lượng sống cho đứa trẻ.
1.1.5.1. Điều trị nội khoa
Điều trị bệnh DMD chủ yếu phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi
chức năng nhằm trì hoãn sự tiến triển của bệnh. Các thuốc điều trị nội khoa
cho bệnh nhân DMD như prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm
steroid) ho
ặc aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy
tế bào cơ. Vật lý trị liệu có tác dụng làm chậm lại các biến chứng thoái hóa,
co rút cơ [92].
1.1.5.2. Liệu pháp thay thế gen
Mục đích của liệu pháp là đưa vào trong tế bào gen có khả năng tổng
hợp protein dystrophin để protein này biểu hiện được ở màng tế bào cơ. Hai
phương pháp đã được thực nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ những
plasmid chứa đo
ạn gen dystrophin hoặc sử dụng vật truyền trung gian. Tuy
nhiên các phương pháp này gặp khó khăn: (1) trở ngại khi tiến hành đưa một
gen lớn vào vật truyền trung gian, (2) đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế
bào cơ sau phân bào, (3) sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của
hệ thống miễn dịch. Vì những trở ngại đó nên hiện nay các phương pháp này
vẫn chưa được áp dụng để
điều trị bệnh DMD ở người [53], [96].
Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị gen mới đã thu được
nhiều thành quả, đó là việc chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ
BMD. Ở bệnh nhân DMD, đột biến gen dystrophin đã tạo ra mã kết thúc sớm
hoặc làm thay đổi toàn bộ khung dịch mã, kết quả là protein dystrophin không
được sản xuất. Sau khi xác định
được dạng đột biến của bệnh nhân, các nhà
15
khoa học đã chọn lọc xóa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột
biến nhằm tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được
khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần. Phương pháp này đã
được áp dụng để điều trị trên người và thu được những kết quả ban đầu đáng
khích lệ [93], [144].
1.1.5.3. Liệu pháp điều tr
ị tế bào
- Chuyển ghép nguyên bào cơ: kỹ thuật này được thực hiện bằng cách nuôi
cấy in vitro các nguyên bào cơ lấy từ cơ trưởng thành của một người thân
không mắc bệnh DMD, thường là người bố. Các tế bào hình sao hiện diện
trong cơ được xem là những nguyên bào cơ có nguồn gốc phôi thai nhưng ở
trạng thái ngủ. Trong quá trình sửa chữa cơ bị tổn thương, dưới các tác động
khác nhau, t
ế bào hình sao sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào cơ.
Nguyên bào cơ nuôi cấy được tiêm vào cơ loạn dưỡng của người bệnh. Các tế
bào cơ không thiếu protein dystrophin sẽ thay thế các tế bào cơ bệnh lý, nhờ
đó chức năng của cơ được tái lập. Trước khi thực hiện chuyển ghép nguyên
bào cơ, bệnh nhân phải được điều trị ức chế miễn dịch để ngăn cản ph
ản ứng
thải ghép tương tự như trong điều trị ghép tạng và vì vậy, liệu pháp này có thể
có nhiều tác dụng phụ như nhiễm khuẩn, ung thư, [34]. Hiện nay, phương
pháp này chưa được áp dụng điều trị bệnh DMD một cách rộng rãi.
- Phương pháp sử dụng tế bào gốc: những năm gần đây, tế bào gốc từ tủy
xương được nghiên cứ
u nhiều do không bị sự cản trở về vấn đề đạo đức và
nguồn cung cấp dễ dàng. Trong tủy xương, ngoài dòng tế bào tạo máu còn có
nhiều dòng tế bào khác và các tế bào đó có khả năng biệt hóa thành nhiều
dòng tế bào khác nhau như tế bào cơ hệ vận động, tế bào cơ tim, tế bào nội
mạc, tế bào thần kinh, Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, khi tiêm trực tiếp
tế bào tủ
y xương vào cơ sẽ có một lượng nhỏ sợi cơ được tạo ra [143], [138].
1.1.6. Phòng bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền có tiên lượng nặng, làm hạn chế và mất khả
năng đi lại, dẫn đến tàn phế và chết trước tuổi trưởng thành. Hiện nay, chưa
16
có phương pháp điều trị bệnh hiệu quả. Những nhà khoa học quan tâm đến
bệnh DMD đều nhận định rằng, cho tới khi chưa tìm được phương pháp điều
trị có hiệu quả cho bệnh DMD thì việc nghiên cứu nhằm phát hiện những
người lành mang gen bệnh (mẹ và chị, em gái) trong gia đình bệnh nhân, hoặc
chẩn đoán trước sinh trên những người mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di
truyền vẫ
n là biện pháp cơ bản để phòng ngừa bệnh DMD [93], [107].
1.2.
CƠ CHẾ BỆNH SINH VÀ CÁC DẠNG ĐỘT BIẾN GEN DYSTROPHIN
1.2.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophin
1.2.1.1. Vị trí của gen dystrophin
Hình 1.2. Sơ đồ NST X và vị trí của gen dystrophin
(Nguồn: www.ghr.nlm.nih.gov/gene
)
Gen dystrophin nằm trên NST X, nhánh ngắn vùng 2, băng 1, băng phụ 2.
1.2.1.2. Cấu trúc của gen dystrophin
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc của gen dystrophin (Nguồn: Yaffe, 2002)
17
Gen dystrophin là một phức hợp gồm:
- Bộ phận khởi động (promotor): cho phép gen hoạt động, khi đóng, khi mở
và sản xuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu mô tương ứng. Có bảy promotor
đặc hiệu là: promotor não, promotor cơ, promotor tiểu não, promotor Dp260,
Dp140, Dp116, Dp71 [139].
- Các exon: gen dystrophin chứa 79 exon, đây là các vùng của gen được phiên
mã có mặt trong mRNA trưởng thành, chứa đựng thông tin di truyền để tổng
hợp ra protein tương ứng.
- Các intron: là những đoạn DNA c
ủa gen xen kẽ giữa những exon, được sao
mã thành mRNA tiền thân, nhưng bị loại bỏ trong quá trình tạo mRNA trưởng
thành [136], [139].
1.2.1.3. Chức năng của gen dystrophin
Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb, gen sao mã ra mRNA
trưởng thành có chiều dài 14 kb. Phân tử mRNA này tổng hợp nên protein
tương ứng là protein dystrophin [136].
1.2.2. Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin
1.2.2.1. Cấu trúc của protein dystrophin
Là protein được mã hóa bởi gen dystrophin có trọng lượng phân tử 427
kD với khoảng 3685 acid amin. Protein dystrophin nằm ở màng bào tương
của tế bào cơ và đượ
c chia làm 4 vùng:
1. Vùng N-tận gồm 240 acid amin, là vùng gắn với actin.
2. Vùng trung tâm rod có 2700 acid amin.
3. Vùng giàu cystein gồm 280 acid amin
4. Vùng C-tận chứa 420 acid amin, có chức năng liên kết với màng tế bào.
Vùng 5’-tận, vùng giàu base cystein và vùng C-tận là những vùng
tương đối quan trọng đối với chức năng của dystrophin. Những vùng này là vị
18
trí bám của actin và phức hợp dystrophin-glycoprotein (Dystrophin-
Glycoprotein Complex-DGC). Trong khi đó vùng rod được coi là vùng ít
chức năng nhất [65], [107].
Hình 1.4. Cấu trúc mô phỏng của protein dystrophin và một số protein
tương tác với nó (Nguồn: www.jennyndesign.com)
1.2.2.2. Chức năng của protein dystrophin
Protein dystrophin có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ xương, đóng
vai trò quan trọng trong cấu trúc của cơ. Nhiều protein màng tế bào liên kết
với protein dystrophin tạo thành phức hợp DGC (Dystrophin-Glycoprotein
Complex). Phức hợp này cho phép nối nh
ững sợi actin với khung xương
ngoài tế bào xuyên qua màng sợi cơ [109]. Đầu amin tận của protein
dystrophin gắn với F-actin và đầu carboxyl tận gắn với phức hợp DGC tại
màng sợi cơ (hình 1.4). Các thành phần quan trọng của phức hợp DGC bao
gồm dystroglycan, sarcoglycan, dystrobrevin, syntrophin và NOS. Sự đột biến
xảy ra ở bất cứ vị trí nào trong các thành phần này đều gây ra bệnh loạn
dưỡng cơ di truyền. Phức hợp DGC sẽ bị mất
ổn định khi protein dystrophin
vắng mặt. Sự mất ổn định này dẫn đến hoại tử dần dần các sợi cơ và tổn
thương màng. Phức hợp DGC còn có vai trò như một tín hiệu hóa học. Sự mất
tín hiệu này cũng góp phần gây bệnh [65], [109].
Khung xương ngoài tế bào
Vùng N tận
Vùng giàu Cystein
Vùng C- tận
Cấutrúcxoắn
giống spectrin
Vùng nối
Phứchợp
Dystroglycan
Phứchợp
Sarcoglycan
Khung xương ngoài tế bào
Vùng N tận
Vùng giàu Cystein
Vùng C- tận
Cấutrúcxoắn
giống spectrin
Vùng nối
Phứchợp
Dystroglycan
Phứchợp
Sarcoglycan
19
1.2.3. Cơ chế bệnh sinh của bệnh DMD
Sự thiếu hụt protein dystrophin làm mất tính ổn định của phức hợp
DGC, từ đó sẽ gây ra bất thường ở màng tế bào với rách màng tế bào khu trú,
tạo điều kiện cho ion Ca
2+
đi vào tế bào. Ion Ca
2+
vào tế bào sẽ hoạt hóa các
enzym protease, gây phân hủy các protein của sợi cơ và bộ khung tế bào. Do
vậy, màng tế bào bị tổn thương rộng hơn và ion Ca
2+
lại ồ ạt đi vào tế bào tạo
ra một vòng luẩn quẩn và dẫn đến rối loạn cân bằng nội mô canxi. Hậu quả
cuối cùng là sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và hoại tử tế bào [109].
Hình 1.5. Cơ chế bệnh sinh của DMD
(Nguồn: Rando, 2004)
1.2.4. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin
1.2.4.1. Đột biến xóa đoạn gen dystrophin
Đột biến xóa đoạn gen là dạ
ng thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD,
chiếm khoảng 60-65% các dạng đột biến gây bệnh DMD. Những đột biến xóa
đoạn làm lệch khung dịch mã của mRNA, tạo ra protein dystrophin không có
chức năng và gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD. Những mất đoạn gen
không gây lệch khung dịch mã có thể tạo ra protein dystrophin bị cắt ngắn ở
giữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn là
BMD. Khả
năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% các trường hợp
có đột biến xóa đoạn [90], [106].
20
Đột biến xóa đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợp
DMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm và
đầu tận 5’ của gen dystrophin [106]. Các đột biến xóa đoạn gen được phát
hiện bằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi
phương pháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot”
[63], [75].
1.2.4.2. Đột biến điểm
Đột biến điểm đứng thứ hai về
mức độ thường gặp, chiếm 25-30%. Hầu
hết đột biến điểm trong DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnh nặng.
Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trong việc
xác định đột biến. Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen
dystrophin đã được xác định [106], [112].
1.2.4.3. Đột biến lặp đoạn, thêm
đoạn
Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên bệnh DMD trong
hầu hết các trường hợp còn lại. Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn
xảy ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107]. Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ
bệnh nhân DMD có đột biến nhỏ rải rác khó phát hiện [107].
1.3.
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN DYSTROPHIN
Có nhiều phương pháp sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để phát
hiện bất thường của gen dystrophin.
1.3.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis
phát minh vào năm 1985 [121].
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản
ứng bao gồm các thành ph
ần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được
