Tinh sạch protein (p-3) doc

Tinh sạch
protein (p-3)


Phân tách protein bằng điện di
trên gel

Để đánh giá quá trình tinh sạch
protein có hiệu quả hay không,
ngoài cách xác định hoạt tính đặc
trưng của protein có tăng lên sau
mỗi bước tinh sạch, còn một cách
là làm hiện hình các protein hiện
diện trong mẫu sau mỗi bước; điều
này được thực hiện nhờ kỹ thuật
điện di.

1 Điện di một chiều

Một phân tử có mang điện tích sẽ
di chuyển trong điện trường. Hiện
tượng này, được đặt tên là điện di,
giúp hướng tới một kỹ thuật rất
mạnh để phân tách protein và các
đại phân tử khác như DNA và
RNA. Vận tốc di chuyển (v) của
một protein (hay bất kỳ phân tử
nào) trong điện trường phụ thuộc
vào lực điện trường (E), điện tích

thực của protein (z) và hệ số ma sát
(f)

Lực điện Ez kéo phân tử mang điện
tích tới điện cực trái dấu bị cản trở
bởi lực kéo của độ nhớt fv tăng lên
do sự ma sát giữa phân tử đang
chuyển động với môi trường. Lực
ma sát phụ thuộc vào cả khối
lượng, hình dạng của phân tử đang
di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi
trường. Với một khối cầu có bán
kính là r, ta có

Điện di luôn được thực hiện trên
gel (hay trên vật thể rắn như giấy)
bởi vì gel giống như một cái ray
phân tử sẽ làm tăng sự phân tách.
Những phân tử nhỏ hơn kích thước
lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên
qua gel, trong khi đó những phân tử
lớn hơn lỗ gel thì gần như không di
chuyển. Những phân tử có kích
thước trung bình di chuyển trong
gel với nhiều vận tốc khác nhau.
điện di được thực hiện trên một
bảng polyacrylamide mỏng, thẳng
đứng. Hướng của dòng điện từ trên
xuống.

Gel polyacrylamide, được tạo thành
từ sự polymer hóa acrylamide và sự
liên kết chéo của
methylenebisacrylamide, được
chọn làm môi trường cho điện di vì
nó có tính trơ về mặt hóa học và
được tạo hình nhanh chóng. Điện di
là một cách lọc qua gel mà theo đó
tất cả các phân tử, không xét về
kích thước, sẽ bị tác động một lực
để di chuyển trong cùng một chất
nền. Gel ở đây có thể xem tương
đương với một hạt trong cột lọc
gel.
Các protein có thể được phân tách
dựa trên khối lượng bằng điện di
trên acrylamide dưới điều kiện đã
bị biến tính. Hỗn hợp protein được
hòa tan trong dung dịch sodium
dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy
mang điện tích âm sẽ phá tất cả các
nối không cộng hóa trị của protein
ban đầu. Mercaptoethanol (2-
thioethanol) hay dithiothreitol cũng
có thể được thêm vào để làm giảm
số nối disulfide. Phức hợp SDS với
protein đã bị biến tính có một điện
tích thực âm tỉ lệ thuận với khối
lượng của protein. Điện tích âm có
được do gắn với SDS lớn hơn rất

nhiều điện tích của bản thân protein
ban đầu; vì thế, điện tích ban đầu
của protein không ảnh hưởng đáng
kể đến điện tích của phức hợp.
Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là
mẫu để chạy điện di. Khi điện di
kết thúc, những protein trên gel sẽ
được nhìn thấy là một dãy các băng
bằng cách nhuộm với bạc hay một
chất nhuộm màu như Coomassie
blue. Những đánh dấu phóng xạ có
thể được phát hiện bằng cách đặt
một tấm phim chụp x quang lên
miếng gel, quá trình này gọi là
phóng xạ tự ghi.
Những protein nhỏ di chuyển
nhanh trong gel, trong khi những
protein lớn ở phía đầu, gần vị trí
nạp mẫu. Tính di động của phần
lớn các chuỗi polypeptide dưới
những điều kiện như thế tỉ lệ với
khối lượng của chúng. Tuy nhiên,
cũng có vài protein giàu
carbohydrate và protein màng
không tuân theo mối tương quan
này. SDS-PAGE có độ phân tách
cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy
cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng
0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch
rất rõ khi nhuộm với Coomassie

blue và thậm chí ít hơn (~0.02ug)
vẫn có thể được phát hiện khi
nhuộm bằng bạc. Những protein
chênh lệch về khối lượng khoảng
2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay
khác nhau khoảng 10 acid amin) có
thể phân biệt được bằng SDS-
PAGE.

Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta
đánh giá kết quả của quá trình tinh
sạch. Với những phân đoạn đầu
tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều
protein. Nhưng qua mỗi bước tinh
sạch, số lượng protein sẽ giảm và
sẽ có một băng ngày càng đậm.
Vạch đó tương ứng với protein mục
tiêu.

2 Điện di dựa vào điểm đẳng điện

Các protein còn có thể được phân
tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số
acid amin có tính acid và số acid
amin có tính base của chúng. Điểm
đẳng điện của một protein (pI) là
điểm pH mà ở đó điện tích thực của
nó bằng 0. Tại điểm pH này, tính di
động của protein trong điện trường
cũng bằng 0 bởi vì z trong công

thức (1) bằng 0. Mỗi một protein có
một pI riêng; ví dụ như pI của
cytochrome C, một protein vận
chuyển ion có tính base cao, là
10.6, trong khi pI của albumin
huyết thanh, một protein có tính
acid trong máu, là 4.8. Giả định cho
một hỗn hợp protein chạy trong
điện trường trong một miếng gel
với một khuynh độ pH, không có
sự hiện diện của SDS. Mỗi protein
sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị
trí mà tại đó pH bằng pI của nó.
Dựa vào hiện tượng này, ta có
phương pháp phân tách protein dựa
vào điểm đẳng điện của protein. để
tạo Khuynh độ pH, trước hết là cho
vào gel một hỗn hợp
polyampholyte (những polymer
nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI,
sau đó điện di hỗn hợp này. Điện di
dựa vào điểm đẳng điện phân tách
protein nhanh với khả năng phân
biệt được sự chênh lệch pI khoảng
0.01 hay những protein khác nhau
chỉ một đơn vị điện tích cũng có
thể được phân tách bằng phương
pháp này.

3 Điện di hai chiều

Đây là một phương pháp có khả
năng phân tách cao do sư kết hợp
SDS-PAGE với điện di dựa vào
điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu
tiên sẽ được chạy điện di dựa vào
điểm đẳng điện. sau đó, đặt khoảng
gel có chứa protein vừa được điện
di lên tấm gel SDS-polyacrylamide
theo phương nằm ngang. Protein sẽ
chịu một điện trường theo chiều
dọc. Kết quả là một mô hình các
điểm được phân tách hai chiều,
chiều ngang theo điểm đẳng điện,
chiều dọc theo khối lượng. Khả
năng phân tách của phương pháp
này được chứng minh khi hơn một
ngàn protein của vi khuẩn E. coli
có thể được phân tách trong một
lần chạy điện di.

Những protein được phân tách từ tế
bào ở các điều kiện sinh lý khác
nhau có thể phân tách được bằng
phương pháp này, sau đó cường độ
của tính hiệu sẽ được xác định. Với
cách này, những protein cụ thể sẽ
được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy
vào tình trạng sinh lý. Tuy nhiên,
phương pháp này có một hạn chế là

có rất nhiều protein được phân tách
nhưng lại phân biệt rõ. Để khắc
phục hạn chế này, người ta kết hợp
điện di hai chiều với kỹ thuật khối
phổi.

4 Đánh giá kết quả tinh sạch
protein

Sau mỗi bước tinh sạch, những
thông số sau cần được ghi nhận để
có thể đánh giá quá trình tinh sạch
protein:

- Protein tổng số: lượng protein có
trong một phân đoạn. Thông số này
tính bằng cách nhân nồng độ một
phần của phân đoạn với tổng thể
tích của phân đoạn đó.
- Hoạt tính tổng: hoạt tính của
enzyme trong phân đoạn đó. Thông
số này được tính bằng cách nhân
hoạt tính của enzyme có trong
lượng mẫu được xét nghiệm với
tổng thể tích của phân đoạn đó.
- Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính
tổng chia cho protein tổng số.
- Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi
bước tinh sạch được thể hiện bằng
phần trăm hoạt tính của dịch chiết

thô với hoạt tính trong dịch chiết
khởi đầu là 100%.
- Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh
sạch, được tính bằng cách chia hoạt
tính riêng, được tính sau mỗi bước
tinh sạch, với hoạt tính riêng của
dịch chiết ban đầu.

Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm,
người ta thấy rằng sau mỗi bước
tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên
trong khi yield lại giảm. Thật vậy,
với kỹ thuật SDS-PAGE, nếu ta
nạp một lượng mẫu nhất định vào
mỗi giếng trên bản gel ứng với một
bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng
sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch
trong khi tỉ lệ lượng protein mục
tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ
tăng .

Vì vậy, đánh giá quá trình tinh sạch
phải dựa cả vào 2 thông số mức độ
tinh sạch và yield. Một quá trình
tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch
cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số
yield cao còn mức độ tinh sạch thấp
có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm
trong mẫu (nhiều protein ngoài
protein mục tiêu) và làm phức tạp

việc giải thích thí nghiệm