Tinh sạch protein (p-1) doc

Tinh sạch
protein (p-1)


Sự tinh sạch của protein rất
quan trọng vì từ protein tinh
sạch chúng ta có thể xác định
được trình tự acid amin, mối
liên hệ về tiến hóa giữa các
protein trong những cá thể khác
nhau và khảo sát các chức năng
sinh hóa của các protein đó.
Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa
protein chỉ có thể thực hiện với
những protein tinh sạch và từ
những tinh thể đó chúng ta sẽ
biết được cấu trúc bậc 4 cũng
như các đơn vị chức năng của
protein thông qua dữ liệu chiếu
xạ tia X.

I. Giới thiệu chung

Vì vậy, quá trình tinh sạch protein
không ngừng được cải tiến để đạt
được độ tinh sạch cao nhất nhưng
nhìn chung một quá trình tinh
sạch protein cũng cần đi qua các

bước căn bản sau:
1. Nhận biết protein mục tiêu
2. Ly trích protein từ tế bào
3. Thu nhận protein mục tiêu dựa
trên độ hoà tan, kích thước, điện
tích, và liên kết ái lực
4. Phân tách protein bằng điện di
trên gel
5. Xác định trọng lượng và khối
lượng của protein

II. Nhận biết protein mục tiêu

Kết quả của sự tinh sạch là một
mẫu protein chỉ chứa đúng một
loại phân tử, ở đây là một loại
protein mà nhà sinh hóa quan
tâm. Mẫu protein này chỉ là một
phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban
đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế
bào hay một cơ quan riêng biệt
lấy của thực vật hay động vật. Để
xác định được protein mục tiêu từ
hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần
thực hiện một thử nghiệm dựa vào
đặc tính của protein đó. Nếu
protein mục tiêu là một enzyme
thì thử nghiệm sẽ được thực hiện
dựa trên hoạt tính của enzyme đó.
Cụ thể như với enzyme lactate

dehydrogenase, một enzyme có
vai trò trong việc sản xuất năng
lượng từ glucose cũng như tổng
hợp glucose từ lactate, để xác
định enzyme này thì dựa trên
phản ứng của nó trong tế bào. Sau
đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh
sáng mạnh ở bước sóng 340nm
của Nicotinamide adenine
dinucleotide (NADH), ta có thể
đo được lượng ánh sáng được hấp
thụ ở bước sóng 340nm trong một
đơn vị thời gian để xác định hoạt
tính của enzyme lactate
dehydrogenase. Trên thực tế việc
tìm ra một thử nghiệm hiệu quả
thường rất khó, nhưng nếu có
được một cách thử nghiệm càng
đặc hiệu thì quá trình tinh sạch
càng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắc
chắn quá trình tinh sạch hoạt động
tốt, chúng ta còn cần một thông số
là lượng protein có trong hỗn hợp
được thử nghiệm.

Hiện nay có rất nhiều phương
pháp phát hiện nhanh và chính
xác nồng độ protein. Dựa vào 2
thông số thực nghiệm là hoạt tính
enzyme và nồng độ protein, ta có

thể xác định hoạt tính riêng của
enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính
enzyme với hàm lượng protein có
trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính
riêng càng cao thì quá trình tinh
sạch càng hiệu quả hay nói cách
khác, mục tiêu của việc tinh sạch
là làm tăng tối đa hoạt tính riêng.

III. Ly trích protein từ tế bào

Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp
và chọn được nguồn protein,
chúng ta cần phân đoạn dịch tế
bào thành nhiều phần và xác định
xem phần nào chứa nhiều protein
mục tiêu. Quá trình tìm phân đoạn
mục tiêu được phát triển bằng sự
mày mò qua từng thí nghiệm.
Bước đầu tiên là phá vỡ màng tế
bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất.
Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng
ly tâm, dịch nổi chứa phân tử có
trọng lượng thấp, những phân tử
có trọng lượng cao hơn lắng
xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi
lại được ly tâm lần nữa với lực
mạnh hơn để tạo cặn và dịch nổi
mới. Tiến trình này, được gọi là ly
tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiều

phân đoạn khác nhau với tỉ trọng
giảm dần, mỗi phân đoạn này
chứa hàng trăm phân tử protein
khác nhau, sẽ được tinh sạch sau
khi đã qua thử nghiệm hoạt tính.
Thông thường, một phân đoạn có
hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu
cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu
quả.

lực

Hình 1: minh h
ọa sắc ký trao đổi
ion



Hì
nh 2: minh họa cơ chế giữa
protein trong h
ệ sắc ký trao đổi
ion
(a) Những hạt mang điện tích
dương sẽ trao đổi ion âm với dung
dịch đệm. Protein tích điện âm
cũng ion dương tương tác với nó
(b) Khi protein gắn với hạt,
protein thay thế những ion âm
tương tác với hạt cũng như hạt

thay thế những ion dương tương
tác với protein


.

Xác định khối lượng của
protein

Phép ghi phổ khối lượng là một
kỹ thuật dùng để phân tích trong
hóa học hữu cơ trong nhiều năm.
Tuy nhiên, cho đến gần đây, khả
năng bay hơi quá thấp của protein
đã làm mất tác dụng của phép ghi
phổ khối lượng trong việc nghiên
cứu các phân tử này. Khó khăn
này đã được khắc phục khi có
những kỹ thuật chuyển protein và
những đại phân tử khác thành
dạng khí được đưa vào ứng dụng
là matrix-assisted laser
desorption-ionization (MALDI)
và electrospray spectrometry. Ở
đây tập trung vào kỹ thuật
MALDI. Trong kỹ thuật này,
những ion protein được phóng ra
và sau đó được tăng tốc qua một
điện trường. Những ion này sẽ di
chuyển qua một đường ống dài

được hút chân không (flight tube),
ion nhỏ nhất sẽ di chuyển nhanh
nhất và đến đầu đọc trước nhất.
Vì vậy, dựa vào thời gian bay
(time of flight - TOF) trong điện
trường ta có thể biết khối lượng
của protein (hay chính xác hơn là
tỉ lệ giữa khối lượng với điện
tích). Với một lượng nhỏ phân tử
sinh học, dù nhỏ đến khoảng vài
picomole đến vài femtomole, vẫn
có thể phân tích được với cách
này. Một máy phổ ghi khối lượng
dạng MALDI-TOF dược dùng
phân tích hỗn hợp insulin và β-
lactoglobulin. kết quả khối lượng
của 2 protein này lần lượt là
5733.9 và 18,364, so với kết quả
tính toán la 5733.5 và 18,388. Thí
nghiệm này cho thấy MALDI-
TOF thật sự là một kỹ thuật chính
xác để xác định khối lượng
protein. Kỹ thuật này còn được
ứng dụng trong việc xác định dựa
vào khối lượng của peptide
(peptide mass fingerprinting). kỹ
thuật này đã mở rộng khả năng
ứng dụng của điện di hai chiều.
Mẫu cần nghiên cứu được chiết
và phân ra một cách riêng biệt

bằng các phương pháp hóa học
hay enzyme học. Khối lượng của
các phân đoạn protein được xác
định bằng phương pháp khối phổ.
Cuối cùng, khối lượng của
peptide được so với những số liệu
đã có được tính trên máy vi tính.
Kỹ thuật này cho kết quả khá tốt.
Ví dụ, trong số 150 protein của
nấm men được phân tách bằng
điện di 2 chiều, kỹ thuật này đã
giúp xác định được 80% protein.

Siêu ly tâm

Siêu ly tâm không chỉ là một
phương pháp có thể phân tách
một hỗn hợp thô các thành phần
của tế bào mà còn rất hiệu quả
trong việc phân tách và phân tích
những phân tử sinh học. Với
phương pháp này, chúng ta không
chỉ xác định được khối lượng và tỉ
trọng mà còn biết được cả hình
dạng của một phân tử cũng như
phân tích những tương tác giữa
các phân tử. Để có được những
điểm này, chúng ta cần một diễn
tả một cách toán học là một phân
tử bị tác động bởi lực ly tâm như

thế nào. Dưới tác động của lực ly
tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua
một môi trường lỏng. Để biết
được tốc độ di chuyển của phân
tử ta cần phải tính hệ số lắng (s)
theo công thức
với m là khối lượng phân tử, v là
thể tích từng phần (nghịch đảo
của tỉ trọng phân tử), p là tỉ trọng
của môi trường và f là hằng số
lắng thường được biểu hiện là đơn
vị Svedberg (S) bằng 10-3 s. Giá
trị S càng nhỏ, phân tử di chuyển
càng chậm.

Vận tốc lắng của một phân tử phụ
thuộc vào khối lượng của nó. Một
phân tử có cùng hình dạng cũng
như tỉ trọng với các phân tử khác
nhưng nặng hơn sẽ lắng nhanh
hơn
Hình dạng cũng ảnh hưởng đến
vận tốc lắng vì nó tác động đến độ
nhớt. Hệ số ma sát của một phân
tử cuộn lại thì nhỏ hơn những
phân tử cồng kềnh dù chúng có
cùng khối lượng. Vì vậy, một
phần tử dạng thẳng lắng chậm
hơn những phân tử hình cầu dù
chúng có cùng khối lượng.

Một phân tử đặc di chuyển mau
hơn một phân tử ít đặc hơn bởi vì
nghịch đảo của lực đẩy đối với
phân tử đặc nhỏ hơn.

Vận tốc lắng còn phụ thuộc vào tỉ
trọng của dung dịch (p). các phân
tử lằng khi p < 1, nổi khi p > 1 và
không di chuyển khi p = 1.

Một kỹ thuật tách protein dựa vào
hệ số lắng khác nhau của các
protein là kỹ thuật ly tâm phân
đoạn. đầu tiên là tạo khuynh độ tỉ
trọng trong một ống ly tâm bằng
cách trộn 2 dung dịch có tỉ trọng
khác nhau, một có tỉ trọng cao,
một có tỉ trọng thấp. Ví dụ, hỗn
hợp sucrose 20% và sucrose 5%
có khuynh độ tỉ trọng từ 5% ở
phía trên đến 20% ở đáy tube.
một lượng nhỏ dung dịch hổn hợp
protein được nạp vào phía trên
của khuynh độ về tỉ trọng. khi
máy quay, protein sẽ di chuyển
theo khuynh độ và tách ra dựa
trên hệ số lắng của chúng. thời
gian và tốc độ ly tâm có được qua
thực nghiệm. Ta tạo một lỗ ở đáy

ống ly tâm để thu nhận các phân
đoạn của protein.

Khối lượng protein được xác định
trực tiếp bằng trạng thái lắng cân
bằng có nghĩa là mẫu được ly tâm
ở vận tốc thấp đủ để sự lắng cân
bằng với sự khuếch tán. kỹ thuật
này xác định khối lượng protein
rất chính xác và có thể sử dụng
cho protein không qua biến tính vì
vậy cấu trúc bậc bốn của protein
vẫn được bảo tồn. Đây là điểm lợi
thế của phương pháp này so với
SDS-PAGE, chỉ định được khối
lượng của protein khi đã bị biến
tính. Với hai phương pháp này,
SDS-PAGE cho ta biết khối
lượng từng đơn phân, siêu ly tâm
phân đoạn cho ta biết khối lượng
của dạng đa phân, ta có thể kết
hợp để biết có bao nhiêu đơn
phân trong một protein đa phân.