cattleya docx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP- TNTN
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP DH5SH1
Nghiên cứu nhân giống lan Cattleya
bằng phương pháp in vitro

Chương 1: MỞ ĐẦU
Ngày nay Công nghệ sinh học đã có nhiều ứng
dụng hiệu quả trong nhân giống vô tính bằng
phương pháp cấy mô trên cây hoa lan. Đề tài
“Nghiên cứu nhân giống lan Cattleya bằng phương
pháp in vitro” nhằm thực hiện mục tiêu sau:

Tìm ra môi trường gieo hạt thích hợp cho lan.

Nghiên cứu một số môi trường với các chất điều
hòa sinh trưởng ở nhiều nồng độ để tìm môi trường
thích hợp cho việc nuôi cấy mô lan Cattleya.

Nhân được số kượng lớn cây lan Cattleya cung cấp
cho thị trường lan.

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sự phân lọai và phân bố:
Lớp: Monocotyledonas
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Giống: Cattleya
Phân bố rộng do có cấu trúc và hình thái hết

sức phức tạp và đa dạng.

2.2. Đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng của
Cattleya:
2.2.1 Đặc điểm sinh học
Cattleya là loài lan thân bò ngang mang nhiều
giả hành, hoa có nhiều màu sắc cực kỳ phong
phú. Cattleya được chia làm 2 nhóm: nhóm
Cattleya một lá, nhóm Cattleya hai lá
Các tác động ngoại cảnh ảnh hưởng đến
Cattleya: Ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, tưới nước,
nhu cầu phân bón, mùa nghỉ của lan, sâu bệnh
và các vấn đề khác

2.2.2. Giá trị sử dụng
Rễ được làm thuốc giảm đau và chất kích, chữa
bệnh nóng sốt, khô cổ, khát nước, bứt rứt khó chịu,…
Zhao C và ctv (2002) đã tách chiết được
copacamphane, picrotoxane, alloaromadendrane
glucoside và phenolic glycoside từ thân Dendrobium
moniliforme.
Một bộ tộc ở Indonesia dùng lá Dendrobium
sallasense nấu với cơm. Ngoài ra giả hành được làm
trà hay lấy sợi trong thân làm vòng đeo tay.
Hàng năm thành phố nhập hơn một triệu cành lan
với giá khoảng 4000 đồng/ cành, mỗi năm phải chi
hơn 4 tỷ đồng chỉ để nhập lan cắt cành.

2.4 Nuôi cấy mô
2.4.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô: các nhà thực vật

học đã áp dụng phương pháp cấy mô thực vật với
mục đích sau:

Tạo được một quần thể lớn và đồng nhất trong
thời gian ngắn.

Tạo được nhiều cây con từ mộ và cơ quan.

Làm sạch nguồn virus cho câyy bằng cách cấy
mô phân sinh ngọn.

Cải tiến giống cây trồng

2.4.2. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô thực vật:
-1902,Haberlandt đề xướng tính toàn thể của tế
bào và nuôi cấy tế bào nhưng không thành công.
-1934,White đã thành công trong việc phát hiện
sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà
chua
-1951, Skoog va Miller phát hiện ra hợp chất có
thể điều khiển sự nhân chồi.
-1962, Murashige va Skoog cải tiến môi trường
nuôi cấy( môi trường MS)
Ngày nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng
dụng mạnh mẽ vào chọn giống, nhân giống, sản
xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vào
nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao.

2.5. Thành phần môi trường
Tất cả các môi trường cấy đều gồm 5 thành phần:


Khoáng đa lượng

Khoáng vi lượng

Vitamin

Đường

Các chất diều hòa sinh trưởng thức vật
Ngoài ra còn bổ sung thêm một số chất hữu
cơ ( amino acid, EDTA, nước dừa, dịch chiết
nấm men,…)


Khoáng đa lượng: N, S, P, K, Mg, Ca,

Khoáng vi lượng : Mn, Cu, Co, B, Mo,…

Carbon và nguồn năng lượng: Carbon bổ sung
vào môi trường dưới dạng đường.

Vitamin: Thực vật cần vitamin để xúc tác các
quá trình biến dưỡng khác nhau, một vài
vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triến
của chúng. Nhu cầu vitamin trong môi trường
nuôi cấy nói chung không quan trọng và chúng
cũng không làm cản trở sự tăng trưởng của tế
bào


Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định:
nước dừa, dịch chiết mầm lúa mì, dịch chiết
nấm men,

Than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các
hợp chất điều hòa sinh trưởng, làm đen môi
trường và khử độc.

Yếu tố làm đặc môi trừơng: Agar là chất
thường được sử dụng nhất. Agar không phản
ứng với chất trong môi trường nuôi cấy và
không bị phân hủy bởi enzyme thực vật.

2.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật:
Có 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng
trong nuôi cấy mô thực vật. Trong đó tỷ lệ auxin/
cytokinin xác định dạng phân hóa cơ quan của tế bào
thực vật nuôi cấy
Auxin

Kích thích mạnh lên sự dãn tế bào

Cảm ứng sự tăng trưởng của mô sẹo
Cytokinin

Kích thích sự phân chia tế bào

Cytokinin rất có hiệu quả trong kích thích sự
tạo chồi.


Tăng sinh chồi bên, tạo chồi bất định

Gibberellin
Có tác dụng trong sự hình thành tổ chức đỉnh
sinh trưởng chồi và rễ trong nuôi cấy mô sẹo
Acid abscisic (ABA)
Ảnh hưởng trên sự tăng trưởng của mô sẹo:
một hàm lượng acid abscisic từ 5-50 mg/l sẽ
cản được 50% sự tăng trưởng của tế bào.
Điều khiển sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Ethylene: gây ra sự chín trái, sự lão suy và sự
rụng lá và một số chức năng khác

2.7 Các kỹ thuật nhân giống in vitro
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi
hoặc cơ quan từ các mô như: lá, thân, hoa, rễ,
…Các ky thuật nuôi cấy là:
•
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
•
Nuôi cấy mô sẹo
•
Nuôi cấy tế bào đơn.
•
Nuôi cấy protoplast.
•
Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
•
Phương pháp nuôi cấy tế bào lớp mỏng

•
Phương pháp gieo hạt

2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

Lựa chọn mẫu cấy: chọn phần non như chồi
non mô phân sinh ngọn, cánh hoa non,

Môi trường nuôi cấy: môi trường thích hợp cho
phần lớn các mẫu cấy là môi trường MS.

Điều kiện nuôi cấy: ánh sáng( 12-16h/ ngày),
nhiệt độ( 26˚C), môi trường in vitro có ảnh
hưởng đến sinh trưởng và phát triển hình thái
của cây in vitro

2.9 Một số vấn đề trong nhân giống vô tính
in vitro
•
Tính bất định về mặt di truyền: do ảnh hưởng
của một số chất kích thích sinh trưởng, tần số
biến dị khác nhau và không lặp lại
•
Mẫu bị nhiễm: Mẫu cấy thường bị nhiễm nấm
hoặc bị nhiễm khuẩn. Có thể giảm khả năng
nhiễm mẫu bằng cách sử dụng mô phân sinh
đỉnh hay thêm vào môi trường nuôi các loại
kháng sinh.
•
Sự hóa thủy tinh thể.Đây là một dạng bệnh lý

của cây, cây sẽ bị mất nước khi chuyển từ điều
kiện in vitro ra môi trường tự nhiên

•
Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy và
tái sinh từ protoplast
–
Cơ sở di truyền đối với khả năng tiềm tàng
của tế bào.
–
Tương tác các tế bào trong cây.
–
Cơ chế phân hóa trong quá trình phát triển
cá thể.
–
Nguồn gốc cơ quan và cây hoàn chỉnh
–
Trạng thái sing lý của tế bào.
–
Tác động của quá trình phân lập
–
Tác động trạng thái phân lập.

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu

Chai lan mô Cattleya

Trái lan Cattleya


Môi trường nuôi cấy: MS, Knop, White, Knudson
và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ( IAA,
IBA, NAA,…), không sử dụng nước dừa.

Các dụng cụ khác: tủ cấy vô trùng, cân điện tử, tủ
lạnh, máy đo pH, nồi autoclauve,….

Các hóa chất: cồn, NaOH 0,1 N, HCl 0,1 N

3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Khử trùng mẫu:
Thu trái lan chín rửa sạch với nước nhiều
lần, ngâm xà phòng 15-20 phút, rửa nhiều lần
dưới vòi nước cháy. Chuyển mẫu vào tủ cấy vô
trùng và ngâm trong cồn 70˚ trong 2 phút.Rửa
lại bằng nước cất vô trùng 3-5 lần rồi ngâm
trong dung dịch Chloramin B 10% và vài giọt
nước rửa chén trong 5phút, rửa mẫu bằng nước
cất vô trùng 3-5 lần. Dùng kẹp và dao mổ cắt
mẫu vô trùng ra để cấy
Nếu trái non hoặc già nhưng chưa bung hạt
thì không cần tấy trùng hạt.

3.2.2 Bố trí thí nghiệm
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: gieo hạt
•
Mục đích: tìm ra chất điều hòa sinh trưởng thực
vật với nồng độ thích hợp cho sự nảy mầm và
phát triển của hạt lan Cattleya.

•
Vật liệu: trái Cattleya
•
Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần
lặp lại, mỗi lần 1 bình.
•
Chỉ tiêu theo dõi: Ngày hạt phân hóa màu xanh,
phần trăm (%) hạt chuyển màu xanh/ bình, ngày
hạt nảy chồi. Thời gian lấy chí tiêu: 20, 40, 60
ngày sau khi cấy

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Tạo chồi hoàn chỉnh từ hạt
Cattleya
•
Mục đích: thăm dò những ảnh huỏng của BA
và NAA đến khả năng tạo chồi trên hạt.
•
Vật liệu: chai cây cấy mô Cattleya
•
Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 4
lần lặp lại, mỗi lần 1 bình, mỗi bình cấy 4 mẫu.
•
Chỉ tiêu theo dõi: ngày xuất hiện chồi, số chồi,
chiều cao chồi, đặc điểm chồi. Thời gian lấy
chỉ tiêu: 20, 40, 60 ngày sau khi cấy

3.2.2.3 Thí nghiệm 3: Tạo cây hoàn chỉnh
•
Mục đích: thăm dò sự ra rễ của lan với các môi
trường nghèo dinh dưỡng

•
Vật liệu: chai lan mô Cattleya
•
Bố trí thí nghiệm : các mẫu được nuôi trong 4
môi trường : MS, Knop, Knudson C và White
theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp
lại, mỗi lần 1 bình, mỗi bình cấy vào 4 mẫu
•
Chỉ tiêu theo dõi : số lượng rễ, số lá trên cây,
chiều cao cây, màu sắc lá . Thời gian lấy chỉ
tiêu : 20, 40, 60, ngày sau khi cấy

Chương 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1 : Gieo hạt
Nồng độ thích hợp cho hạt lan tạo thành chồi là MS
bổ sung 5mg/l BA và 2 mg/l NAA
4.2. Thí nghiệm 2 : Nhân nhanh chồi
4.2.1 Sự hình thành chồi lan sau khi cấy trên
môi trường tạo chồi
Nghiệm thức MS bổ sung 2mg/l BA là công
thức tốt nhất, điều này chứng tỏ BA ảnh
hưởng đến sự phát sinh chồi của Cattleya

4.2.2 Sự phát triển chồi Cattleya sau khi cấy trên
môi trường tạo chồi
Qua so sánh ta thấy số chồi và chiều cao chồi
phát triển tốt nhất trên môi trường MS có bổ
sung 2mg/l BA. Điều này chứng tỏ BA rất quan
trong trong quá trình tạo chồi, cytokinin có hiệu

quả gây sự mọc chồi với đa số loài và với nhiều
bộ phận của lan.
4.3. Thí nghiệm 3 : Tạo cây hoàn chỉnh
Giai đoạn này có tính chất quyết định khả
năng sống sót của cây.

4.3.1 Sự phát triển của Cattleya trên môi trường
tạo rễ
Khi không có NAA chiều cao chồi thấp
Môi trường MS bổ sung 2mg/l NAA cho chồi
có chiều cao cao nhất
4.3.2 Sự hình thành và phát triển rễ lan Cattleya
trên môi trường tạo rễ
Cây Cattleya tạo rễ tốt ở môi trường MS bổ
sung 1,5-2 mg/l NAA và môi trường Knudson
C bổ sung 1,5-2 mg/l NAA. Nghiệm thức cho
rễ thấp nhất là môi trường Knop không bổ sung
NAA.

Chương 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
•
Gieo hạt : trái lan Cattleya thu từ vườn cấy vào môi
trường MS có bổ sung 5mg/l BA kết hợp với 2mg/l
NAA ( 30 ngày sau khi cấy) cho hạt nảy chồi nhiều,
cây khỏe.
•
Nhân nhanh chồi : môi trường MS có bổ sung
2mg/l BA cho số chồi đạt cao nhất và chiều cao
nhất, chồi nhiều, xanh khỏe. Môi trường MS bổ

sung BA ( 0,2 mg/l) cho số chồi thấp nhất sau 60
ngày sau khi cấy.
•
Tạo cây hoàn chỉnh : chồi được cấy vào môi trường
MS có bổ sung 2mg/l NAA giúp tạo được cây hoàn
chỉnh với rễ nhiều, dài. Môi trường Knop không
chất điều hòa sinh trưởng cho số rễ thấp