Chương 5: PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) potx

Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
1. Nguyên tắc của phương pháp PCR:
DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn
cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt.
Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn.
Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi
bị tách mạch thành mạch đơn). T
m
= 4(G + C) + 2(A + T) °C
Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ
sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác
tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi.
2. Phản ứng PCR:

Thành phần phản ứng:
- DNA bản mẫu
- Mồi xuôi và mồi ngược
- dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
- MgCl
2
- Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…)
- Dung dịch đệm.
- Nước cất 2 lần (đã khử trùng)

Các bước của phản ứng:
Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1: Biến tính (denaturation)
DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 95
0

C, trong
thời gian 30s – 1 phút.
Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization)
Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với DNA mạch khuôn là T
a
(T
a
thấp hơn Tm khoảng 5
0
C).
Bước 3: Kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72
0
C, để DNA polymerase hoạt
động kéo dài mạch.
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

DNA mẫu:
- DNA sạch, lượng DNA sử dụng cho PCR có khuynh hướng giảm
(khoảng 100 ng)
- Giảm lượng mẫu

hạn chế sản phẩm “kí sinh”.
- PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt.
 Enzyme :
-
Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ
Thermus aquaticus là Taq polymerase.
-

Enzyme Pfu DNA polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus
furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’
exonuclease.
-
Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng
phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có DNA và Mg2+ thì
enzyme này thực hiện khuếch đại DNA.

Mồi và nhiệt độ lai T
a
- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản
ứng.
-
Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ
sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp
tóc”.
-
Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa.
-
Mồi đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và không bắt cặp
với trình tự khác trên gen.

Các thành phần khác của phản ứng:
-
dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại.
-
Mg
2+
: quá ít


hiệu quả nhân bản giảm
quá nhiều

tạo sản phẩm không đặc hiệu
 Số lượng chu kỳ: không vượt quá 40
4. Ứng dụng của phương pháp PCR
-
Tạo số lượng lớn bản sao DNA

dòng hóa gene, giải trình tự, lập
bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò…
-
Biến đổi một trình tự DNA: thêm vị trí của enzyme cắt hạn chế,
gây tạo đột biến trên DNA, thêm trình tự promoter, trình tự gắn
của ribosome…
5. Hạn chế của phương pháp PCR
-
Ngoại nhiễm:
Xử lí: Khử trùng khu vực thao tác .
Việc thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm được tiến
hành ở các khu vực khác nhau.
-
Nhân bản không đặc hiệu:
-
Các sai sót do Taq polymerase
5. Các dạng khác của PCR:
-
RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA  cDNA  DNA.
-
RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng

sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm.
Nguyên tắc: xác định hàm lượng sản phẩm dựa trên tín hiệu huỳnh
quang.
-
PCR nested: sử dụng nhiều hơn một cặp mồi

thu nhận sản phẩm đặc hiệu hơn.