Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời pptx

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời











H
ệ thống nuôi cấy ngập
chìm tạm thời




1. Giới thiệu

Ngày nay, việc nghiên cứu cải
thiện các quy trình nhân giống
thực vật nhất là cây hoa cảnh
trong ống nghiệm rất được quan
tâm bởi nhiều nhà khoa học trên
khắp thế giới. Ðể ứng dụng của
hệ thống vi nhân giống thông
thường trên môi trường thạch vào
quy mô công nghiệp nhằm giảm
tỷ lệ nhiễm bệnh, giảm chi phí
giá thành, tăng hệ số nhân giống.
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng
phương pháp nuôi cấy trong môi
trường lỏng có hay không có lắc.
Kỹ thuật này cho phép đạt được
hệ số nhân chồi, tạo phôi soma,
PLB (protocorm-like body: thể
giống protocorm), … nhiều hơn
so với trên môi trường thạch.

Tuy nhiên khi nuôi cấy trong môi
trường lỏng mẫu cấy bị trương
nước và bị hiện tượng thủy tinh
thể do ngập quá lâu trong môi
trường, ngoài ra mẫu còn bị
những tổn thương do quá trình
lắc. Vì vậy để kết hợp những ưu
điểm của hệ thống nuôi cấy trên
thạch với nuôi cấy lỏng, vào năm
1983, Harris và Mason đã thiết
kế hai hệ thống nuôi cấy ngập
chìm tạm thời là hệ thống nuôi
cấy nghiêng và hệ thống Rocker.
Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat
và Vandercook đã thiết kế một hệ
thống nuôi cấy tự động APCS
đây là hệ thống có thể thay thế
được môi trường và có thể sử
dụng nuôi cấy trong một thời
gian dài mà không cần cấy
chuyền. Ngoài ra còn có một số
hệ thống ngập chìm tạm thời một
phần hay toàn phần được điều
khiển tự động bằng máy tính hay
bán tự động. Hiện nay đáng chú
ý là hệ thống nuôi cấy ngập chìm
tạm thời RITA
®
của hãng Cirad,
Pháp; BIT

®
Twin Flask của Cuba
đã được khảo sát và nghiên cứu
trên nhiều đối tượng khác nhau.

2. Nguyên tắc vận hành và cấu
trúc cơ bản hệ thống

Tất cả các hệ thống này đều tuân
theo những điều kiện được đề ra
bởi Teisson và c
ộng sự năm 1999:
(1) tránh sự ngập liên tục là y
ếu tố
ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh
trưởng và phát sinh hình thái của
mẫu cấy; (2) cung cấp sự trao đổi
oxy một cách đầy đủ; (3) cung
cấp sự hòa trộn đầy đủ; (4) có thể
thay đổi môi trường và đi
ều khiển
t
ự động; (5) hạn chế sự nhiễm; (6)
giá thành hạ.

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngậ
p
chìm tạm thời đều phải tuân theo
một nguyên tắc là phải có khả
năng tạo ra sự ngập chìm không

liên t
ục theo chu kỳ xác định. Các
hệ thống đều có ngăn chứa môi
trường riêng, có thể chung một
bình chứa nh
ưng có hai ngăn khác
nhau hay gồm một hệ thống bình
chứa nối với hệ thống chứa mẫu
cấy bằng hệ thống ống dẫn và
bơm điều khiển. Các mẫu cấy
thường được đặt trên những đĩa
bằng nhựa polypropylene thành
một cụm, điều này giúp tiết kiệm
được thời gian phải đặt mẫu lên
trên giá thể thạch trong nuôi cấy
thông thường.

Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập
chìm tạm thời thông thường có
những bộ phận chủ yếu sau:
- Bơm hay máy nén khí t
ạo áp lực
để hút môi trường từ ngăn chứa
lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược
lại
- Hệ thống cài đặt thời gian dùng
để điều khiển chu kỳ ngập
- Hệ thống ống dẫn và van điều
khiển
- Các màng lọc

- Bình nuôi cấy thư
ờng bằng nhựa
polycarbonate hay thủy tinh

Dựa theo nguyên tắc v
à nguyên lý
để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm
thời, nhiều nhà khoa học đã thiết
kế và tạo ra các hệ thống ngập
khác nhau, tùy vào mục đích nuôi
cấy khác nhau.

Sau đây là ba biến thể khác nhau
đã được phát triển và bán rộng rãi
trên thị trường, đó là hệ thống
RITA
®
, thứ hai là hệ thống bình
đôi BIT
®
, và hệ thống Plantima.

a. Hệ thống RITA
®



Hình 1. Hệ thống RITA
®
, Pha 1

:
mô không ngập trong môi
trường, Pha 2: hiện tượng ngập
được hoạt hóa, các van mở ra cho
khí đi qua các màng lọc đẩy môi
trường lỏng lên ngập mô cấy,
Pha
3: sự trao đổi khí trong hệ thống
RITA
®
, Pha 4: chu kỳ kết thúc,
các van đóng lại và môi trường
lỏng rút xuống ngăn bên dưới.

Hệ thống RITA
®

(Hình 1) là công
trình của Teisson và Alvard vào
năm 1995. Một bình chứa 1 L
gồm có hai phần, phần trên chứa
mẫu cấy và phần dưới chứa môi
trường. Một áp suất vượt mức tác
động vào môi trường lỏng chứa
trong phần dưới và đẩy chúng
dâng lên ngăn ch
ứa mẫu cấy. Mẫu
cấy được ngập chìm trong môi
trường lỏng lâu hay mau tùy theo
thời gian áp suất vượt mức được

duy trì. Trong su
ốt thời gian ngập,
không khí được sục v
ào trong môi
trường lỏng, môi trường được
chuyển động làm cho mẫu cấy
xoay trở được các mặt tiếp xúc
với bề mặt môi trường, áp suất
vượt mức sau đó được thoát ra
bên ngoài nhờ một ngõ ra phía
trên đầu hệ thống.

b. Hệ thống bình sinh đôi BIT
®


Hệ thống bình sinh đôi
BIT
®
(Hình 2) được thiết kế bởi
Escalona và cộng sự (1998) được
dự định nhân giống số lượng lớn
qua con đường phát sinh phôi
soma. Ðối với nhân giống theo
con đường phát sinh cơ quan kích
thước mẫu cấy đòi hỏi một hệ
thống có thể tích lớn hơn và rẻ
hơn. Con đường dễ dàng nhất để
đạt được trạng thái ngập chìm t
ạm

thời theo chu kỳ nhất định là nối
hai bình thủy tinh hay plastic có
kích thước từ 250 ml - 10 L bằng
một hệ thống ống dẫn, và điều
khiển tạo ra áp suất vượt mức để
đưa môi trường vào bình chứa
mẫu và ngược lại. Hệ thống
BIT
®
được thiết kế đáp ứng với
những yêu cầu trên.

Hình 2. Hệ thống bình sinh đôi
BIT
®


c. Hệ thống Plantima
®


Hệ thống này được thiết kế tổng
thể tương tự như hệ thống
RITA
®
tuy nhiên có thay đổi và
cải tiến một số chi tiết như hệ
thống bơm và vị trí các màng lọc.
Hệ thống này được sản xuất và
cung cấp bởi Công ty A-tech

Bioscientific tại đảo Ðài Loan.
Cấu tạo và phương pháp vận h
ành
cơ bản (Hình 3, Hình 4):

Hình 3. Các thành phần của hệ
thống Plantima

Hình 4. Hệ thống Plantima với
hệ thống điều khiển chu kỳ
ngập

3. Ưu và khuyết điểm của hệ
thống nuôi cấy ngập chìm tạm
thời

a. Ưu điểm

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm
thời (Temporary Immersion
System, TIS) có tác đ
ộng tích cực
lên tất cả các giai đoạn từ nhân
nhanh chồi cho tới phát sinh phôi
soma trên nhiều đối tượng cây
trồng khác nhau. Sự sinh trưởng
và hệ số nhân nhanh chồi của cây
được nuôi cấy trong hệ thống
ngập chìm tạm thời luôn cao hơn
so với những cây nuôi cấy trong

hệ thống thông thường trên môi
trường rắn hay trong những hệ
thống bioreactor thông thường.
Cây tái sinh và phôi soma thu
được trong hệ thống này luôn có
chất lượng tốt hơn. Từ đó cây có
nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy
ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống
sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh
trong quá trình thuần hoá ngoài
vườn ươm. Có thể nói hệ thống
nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã
kết hợp thành công những ưu
điểm của hệ thống nuôi cấy rắn
thoáng khí và hệ thống nuôi cấy
lỏng giúp cây tránh được những
hiện tượng bất lợi do sự thiếu
thông thoáng của môi trư
ờng lỏng
ngập liên tục hay trong hệ thống
kín trên môi trường rắn, giúp gia
tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng.

Chu kỳ và tần số ngập chìm là
những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng
đến sự phát triển của mẫu cấy
cũng như toàn bộ quy trình nhân
giống. Khi những chỉ số này đư
ợc
tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia

tăng, quá trình kiểm soát sự phát
sinh hình thái tốt hơn và còn có
khả năng hạn chế tối đa hiện
tượng thủy tinh thể. Ðây là ưu
đi
ểm lớn nhất của hệ thống TIS so
với hệ thống bioreactor thông
thường.

Hệ thống TIS tiết kiệm đư
ợc công
lao động và không gian phòng
nuôi cấy và giảm đư
ợc chi phí sản
xuất. Những quá tr
ình nhân nhanh
phôi soma, tái sinh nhi
ều chồi, tạo
củ bi có khả năng được tối
ưu hoá
trên nhiều đối tượng cây trồng từ
đó giảm được chi phí sản xuất
một cách đáng kể.

b. Khuyết điểm

Mật độ nuôi cấy là một yếu tố
không kém phần quan trọng
nhưng hiện nay vẫn chưa được
khảo sát một cách sâu rộng. Thời

gian ngập tối ưu phải được khảo
sát và xác định chính xác cho
từng giai đoạn nuôi cấy của từng
loại cây cũng như thời gian giữa
các lần cấy chuyền đối với những
hệ thống không thể bổ sung môi
trường mới, cuối cùng là phải
khảo sát tối ưu hóa thành phần
môi trường cho từng giai đoạn
nuôi cấy.

Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu
hơn về ảnh hưởng của hệ thống
nuôi cấy ngập chìm tạm thời về
mặt vật lý là r
ất cần thiết để có thể
tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
trong những hệ thống này.

Một ưu điểm khác của hệ thống
này trong việc giảm được hoạt
tính của các chất độc ngoại bào
hay các chất ức chế sinh trưởng
được tiết ra ngoài môi trường
trong thời gian nuôi cấy của mẫu
cấy vẫn chưa đư
ợc đánh giá chính
xác.

Trong điều kiện Việt Nam hiện

nay, giá thành c
ủa những hệ thống
nuôi cấy TIS tương đối cao do
phải nhập hệ thống này từ nước
ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan
do đó nếu muốn ứng dụng rộng
rãi thì những hệ thống này nhất
thiết phải được nghiên cứu thiết
kế ngay trong nước để giảm giá
thành. Ngoài ra, những thông số
kỹ thuật của hệ thống này cần
được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu
hóa đối với từng giai đoạn nuôi
cấy của từng loại cây, có được
những điều kiện như vậy thì
chúng ta m
ới có khả năng áp dụng
hệ thống TIS rộng rãi trong sản
xuất cây giống.


N.Q. Thiện
Tổng hợp từ các nguồn:
- Teisson C & Alvard D,
(1995). A new concept of plant in
vitro cultivation liquid medium:
temporary immersion.
In: Terzi M
et al. (eds). Current Issues in Plant
Molecular and Cellular Biology

(pp. 105-110). Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht.
- Escalona M, Lorenzo JC,
Gonzalez B, Daquinta M,
Fundora Z, Borrto CG, Espinosa
D, Arias E & Aspiolea ME,
(1998). New system for in vitro
propagation of pineapple (Ananas
comosus (L.) Merr).Pineapple
News. 5. pp: 5-7.
- Etienne H. & Berthouly M.,
(2002). Temporary immersion
systems in plant
micropropagation. Plant Cell,
Tissue and Organ
Culture 69: 215–231. Kluwer
Academic Publishers,
Dordrecht.