Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (tis) trong vi nhân giống

Trang 1


1
Công nghệ tế bào
HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TIS)
TRONG VI NHÂN GIỐNG
Mục lục
1. Nguyên nhân & lịch sử ra đời
2. Các hệ thống nuôi cấy chính
3. Ưu điểm và hạn chế
4. Giới thiệu nghiên cứu ứng dụng TIS ở Việt Nam
5. Tài liệu tham khảo

Trang 2


2
Công nghệ tế bào
1. Nguyên nhân & Lịch sử ra đời:
a. Nguyên nhân:
Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ nhân giống cây in vitro với nhiều
đối tượng cây trồng đã giúp thu được một lượng lớn cây giống với độ ổn định
cao, chất lượng cây giống tốt, đồng điều. Có rất nhiều nghiên cứu về việc áp

dụng kỹ thuật vi nhân giống trên nhiều đối tượng cây trồng đã được tiến
hành và thu được các kết quả rất khả quan.
Ngay từ khi công nghệ nhân giống cây in vitro ra đời người ta tiến
hành nuôi cấy mẫu trên môi trường thạch. Nhưng khi ứng dụng của hệ thống
vi nhân giống thông thường trên môi trường thạch vào quy mô công nghiệp
thì gặp phải những khó khăn lớn về tỉ lệ nhiễm bệnh, tồn nhiều chi phí nhân
công, hiệu quả sử dụng môi trường không cao, hệ số nhân giống còn thấp
dẫn đến giá thành còn cao. Để khắc phục các nhược điểm trên người ta đã
tiến hành vi nhân giống cây trên môi trường lỏng trong các thiết bị
bioreactor. Phương pháp nhân giống trên môi trường lỏng tuy khắc phục
được các nhược điểm khi nhân giống trên môi trường thạch, cho hê số nhân
giống cao và có thể tiến hành nhân giống với một số lượng lớn nhưng các
mẫu cấy khi nuôi trong môi trường lỏng ngập chìm trong nước quá lâu dẫn
đến bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể, mẫu còn bị những tổn
thương do quá trình lắc, và trong quá trình nuôi phải sụt khí vào môi trường
lỏng để tránh hiện tượng mẫu bị thiếu oxi do ngập liên tục trong môi trường
lỏng.
Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên người ta đã
cho ra đời hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời - Temporary Immersion
System (TIS). Giống như tên của hệ thống, hệ thống này là bước cải tiến từ
việc nuôi cấy mẫu trên môi trường lỏng nhưng ở hệ thống này mẫu chỉ được
ngập trong môi trường lỏng một thời gian nhất định rồi cứ theo một chu kỳ
chúng lại tiếp tục được cho ngập một khoảng thời gian.
b. Lịch sử:
Năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập
chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống Rocker.
Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat và Vandercook đã thiết kế một hệ
thống nuôi cấy tự động APCS đây là hệ thống có thể thay thế được môi
trường và có thể sử dụng nuôi cấy trong một thời gian dài mà không cần cấy
chuyền.

Trang 3


3
Công nghệ tế bào
Hiện nay có các hệ thống ngập chìm tạm thời một phần hay toàn phần
được điều khiển tự động bằng máy tính hay bán tự động. Đáng chú ý là hệ
thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA
®
của hãng Cirad, Pháp; BIT
®
Twin
Flask của Cuba; Hệ thống Plantima, của Đài Loan đã được khảo sát và
nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau.
Trên thế các nghiên cứu về hệ thống này từ năm 1983 đến nay rất
nhiều nhưng ở nước ta các nghiên cứu về hệ thống này còn rất khiêm tốn.
2. Các hệ thống nuôi cấy chính:
Nguyên tắc vận hành hệ thống:
Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi
Teisson và cộng sự năm 1999.
Gồm 6 nguyên tắc cơ bản:
 Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh
trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy;
 Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ;
 Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ;
 Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động;
 Hạn chế sự nhiễm;

 Gía thành hạ.
Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo
một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo
chu kỳ xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể
chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống
bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm
điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa
polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải
đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường.
a. Hệ thống RITA:
Năm 1995, Teisson và Alvard cùng nhau cho ra đời hệ thống nuôi cấy
ngập chìm tạm thời RITA.
Hệ thống này gồm:
 Một bình chứa khoảng 1 lít gồm có hai phần, phần trên chứa
mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường.



Trang 4


4
Công nghệ tế bào
 Một máy bơm tạo áp suất vượt mức tác động vào môi trường
lỏng chứa trong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa
mẫu cấy.
 Các van, ống dẫn khí và các màng lọc khí vô trùng.
 Một timer điều khiển hoạt động của hệ thống bằng khoảng thời
gian ngập chìm và chu kỳ giữa các lần ngập chìm.
Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo

thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong suốt thời gian ngập, không
khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm
cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất
vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ
thống.

Hình 1: Sơ đồ hoạt động hệ thống RITA
Qui trình hoạt động của hệ thống:
1) Hệ thống ở trạng thái không ngập chìm mẫu cấy;
2) Đến thời gian cho mẫu ngập chìm, timer kích hoạt bơm hoạt
động thổi không khí vào hệ thống qua đường ống dẫn khí tạo áp



Trang 5


5
Công nghệ tế bào
suất vượt mức ở ngăn dưới đẩy chất lỏng dâng lên ngâp chứa
mẫu phía trên theo khe thông với hai phần chủa bình;
3) Bơm tiếp tục hoạt động, khi chất lỏng bên dưới đã được đưa lên
trên hết thì không khí phần dưới được sụt vào môi trương lỏng
lên trên làm cho mẫu cấy xoay chuyển;
4) Hết thời gian ngập chìm, timer điều khiển tắt hoạt động của
bơm. Áp lực bên phần bên dưới giảm dần đến cân bằng với môi
trường bên ngoài và đồng thời môi trường lỏng bên trên bị trọng
lực nên di chuyển xuống phần dưới.
Trong quá trình hoạt động của hệ thống van thông khí ở phần ngăn
trên luôn được mở.

Hình 2: Hệ thống RITA ngoài thực tế
b. Hệ thống bình đôi BIT:
Được thiết kế bởi Escalona và cộng sự vào năm 1998. Được dự định
nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma.



Trang 6


6
Công nghệ tế bào
Hệ thống này gồm:
 Hai bình chứa thể tích nằm trong khoảng 250ml-10l được nối với
thông nhau qua một ống dẫn.
 Máy tạo áp suất, ống dẫn, van và các màng lọc như trong hệ
thống RITA.

Hình 3: Sơ đồ hoạt động của hệ thống BIT
Qui trình hoạt động của hệ thống:
1) Hệ thống khi chưa cho mẫu cấy ngập chìm;
2) Đến thời điểm cho mẫu ngập chìm timer kích hoạt bơm thổi
không khí qua bộ lọc khí vào trong bình chứa môi trường dinh
dưỡng dạng lỏng. Áp suất bên bình chứa môi trường tăng cao
hơn áp suất bên bình chứa mẫu cấy làm môi trường di chuyển
qua bên bình chứa mẫu và ngập chìm mẫu;
3) Khi hết thời gian ngập chìm, timer điều khiển tắt bơm bên bình
chứa môi trường và mở bơm bên bình chứa mẫu cấy. Không khí
được thổi vào bình chứa mẫu cấy làm áp suất tăng cao hơn áp

suất trong bình chứa môi trường dinh dưỡng và chất lỏng di
chuyển về bình chứa môi trường. Sau đó đến một thời điểm chất
lỏng đã di chuyên gần như hoàn toàn thì bơm sẽ tự động tắt.
Đối với hệ thống BIT ta thấy do môi trường dinh dưỡng được chứa ở
một ngăn riêng nên tao có thể đễ dàng thay thôi môi trường nuôi cấy so với
hệ thống một bình hai ngăn.