Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR ppsx

Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR
The PCR technique was patented by Cetus
Corporation, where Mullis worked when he
invented the technique. The Taq polymerase
enzyme is also covered by patents. There have been
several high-profile lawsuits related to the
technique, including most famously a lawsuit
brought by DuPont. The pharmaceutical
company Hoffmann-La Roche purchased the rights
to the patents in 1992 and currently holds them.
Thực nghiệm PCR


Figure 1: PCR machine
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA
ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một
gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật
sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA
ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair =
kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi
đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi
là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một
mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với
nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ
như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base.
Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều
thành phần. Những thành phần đó là: - DNA mẫu
(template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp
mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc
vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) -
DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên

của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên
liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới.
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho
DNA-polymerase

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt.
Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản
ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để
ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần
nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường
hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho
một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp
phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD.
Đoạn mồi
Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi
chọn lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân
tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì
DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác
định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi
đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù
hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc
của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA
mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà
DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp
của sợi DNA mới.
Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và
nhiệt độ biến tính của nó (Tm-melting) phụ thuộc
vào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm
lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳ
đầu tiên của quá trình PCR được định nghĩa là

nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt
độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ
biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi
quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và
sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài
DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt
độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80°C sẽ gây ra
nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở
nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ
20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ
60 – 75°C.
Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng
được sử dụng. Những đoạn mồi này là hỗn hợp
tương tự nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thể
thuận tiện nếu có cùng gen cần khuếch đại từ
những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó có
thể là tương tự nhưng không giống nhau. Người ta
còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi
được thiết kế dựa trên chuỗi protein. Như nhiều
codon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường
rất khó để suy ra codon nào dùng cho trường hợp
đặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit amin
isoleucine có thể là “ATH”, A có nghĩa là adenine,
T là thymine, và H ứng với adenine, thymine, hay
cytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them về
codons) Sử dụng đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm
giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn
đề có thể được giải quyết bằng phương pháp
touchdown PCR.
Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở

trên cần phụ thuộc vào sản xuất sản lượng: - hàm
lượng GC nên trong khoảng 40-60% - Tính toán
nhiệt biến tính cho cả những đoạn mồi trong phản
ứng không khác quá 50°C và nhiệt biến tính của
sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10°C -
Nhiệt độ bám vào thỉnh thoảng thấp hơn nhiệt nóng
chảy 50°C. Tuy nhiên, nên chọn lựa theo kinh
nghiệm cho từng trường hợp cụ thể. - Tránh … -
Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm – nó có thể không bổ
sung cho bất cứ vùng nào của đoạn mồi trong phản
ứng và phải cung cấp base chính xác phù hợp với
mẫu. Có cả chương trình hỗ trợ việc thiết kế mồi
(xem External links)
Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ
gồm 3 bước (Hình 2)
(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA
ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối
hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA
thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để
đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn
toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ
thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn.
Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này
phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt
độ biến tính 50°C (45-60°C). Sử dụng sai nhiệt độ
trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không
gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy
tiện. Thời gian: 1-2 phút.

(3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi
trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo
sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo
dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của
bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và
chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy
tắc …, 1000bp/ 1 phút.
[[Tập tin:pcr.png|frame|none|Figure 2: Hình 2: Chu
trình PCR dưới dạng sơ đồ. (1) Nóng chảy ở 96°C.
(2)Gắn mồi ở 68°C. (3)Kéo dài ở 72°C
(P=Polymerase). (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành.
Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu
trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao
cho mỗi chu kỳ.
Ví dụ
Thời gian và nhiệt độ trong ví dụ này được lấy từ
chương trình PCR mà đã thành công trên phân
đoạn 250bp của đầu C của insulin-like growth
factor (IGF).
Hỗn hợp phản ứng gồm:
 1.0 µl DNA khuôn (100 ng/µl)
 2.5 µl mồi, 1.25 µl cho mỗi mồi(100 ng/µl)
 1.0 µl Pfu-Polymerase
 1.0 µl nucleotide
 5.0 µl đệm
 89.5 µl H
2
O
100 µl hỗn hợp phản ứng ( sử dụng ống eppendorf
200 μl) được đưa vào máy PCR.

Quy trình PCR bao gồm các bước sau:
Bước 1
Khởi đầu. Đun hỗn hợp ở 96°C trong vòng 5
phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được
làm nóng. DNA-Polymerase có thể có trong
giai đoạn khởi đầu, hoặc nó có thể được thêm
vào ngay sau bước này.
Bước 2
Biến tính (Melting). 96°C trong 30 giây. Đối
với mỗi chu kì thì lượng thời gian này là đủ để
biến tính DNA.
Bước 3
Gắn mồi (Annealing). 68°C trong 30 giây.
Bước 4
Kéo dài (Elongation).72°C trong 45 giây.
Bước 5
Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 25 lần, tuy
nhiên với mồi và polymerase tốt, 15 đến 20
chu kỳ có thể là đủ.
Bước 6
Giữ hỗn hợp ở 7°C. Tại nhiệt độ này DNA sẽ
không bị hư hại trong vòng 1 đêm.


Figure 3: PCR product compared
with DNA ladder in agarose gel.
DNA ladder (lane 1), the PCR
product in low concentration
(lane 2), and high concentration
(lane 3). Image published with

permission of Helmut W. Klein,
Institute of Biochemistry,
University of Cologne, Germany
Sản phẩm PCR có thể được nhận
biết bằng kích thước của chúng
qua việc sử dụng sắc ký gel
agarose. Sắc ký gel agarose là
phương pháp bao gồm việc nhỏ
mẫu sản phẩm PCR của DNA
vào gel agarose và sau đó chạy
điện di trên gel. Kết quả là các
đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển
nhanh hơn các đoạn lớn qua gel
từ cực âm đến cực dương. Kích
thước của sản phẩm PCR có thể
được xác định bằng việc so sánh
vói thang DNA, thang này có
chứa các DNA đã biết trước kích
thước, cũng nằm trong gel (hình
3).
Tối ưu hoá PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh
ô nhiễm các DNA khác có trong
phòng thí nghiệm (vi khuẩn,
virus, DNA, ). Vì vậy các mẫu
DNA, hỗn hợp phản ứng và quy
trình DNA, ngoài ra còn có phản
ứng phân tích sản phẩm, nên
được thực hiện trong một khu
vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn

bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn
bị phòng riêng biệt với đèn UV.
Phải sử dụng găng tay sạch cho
mỗi bước PCR cũng như thay thế
các pipet. Thuốc thử dùng trong
PCR phải được chuẩn bị riêng
biệt và chỉ được dùng cho mục
đích này. Các mẫu phải được giữ
riêng biệt với các mẫu DNA
khác. Phản ứng có kiểm soát
(kiểm soát bên trong), ngoại trừ
DNA khuôn mẫu, phải luôn được
htực hiện, để kiểm tra sự nhiễm
bẩn.
[sửa]Recent developments in
PCR techniques
 A more recent method which
excludes a temperature cycle,
but uses enzymes, ishelicase-
dependent amplification.
 A style of PCR that reduces
nonspecific primer annealing
is Touchdown PCR.
 Real-Time PCR is a quantative
PCR technique.
Những ứng dụng của PCR
PCR can be used for a broad
variety of experiments and
analyzes. Some examples are
discussed below.

Vân tay di truyền
Genetic fingerprinting is a
forensic technique used to
identify a person by comparing
his or her DNA with a given
sample, e.g., blood from a crime
scene can be genetically
compared to blood from a
suspect. The sample may contain
only a tiny amount of DNA,
obtained from a source such as
blood, semen, saliva, hair, etc.
Theoretically, just a single strand
is needed. First, one breaks the
DNA sample into fragments, then
amplifies them using PCR. The
amplified fragments are then
separated using gel
electrophoresis. The overall
layout of the DNA fragments is
called a DNA fingerprint.
]Kiểm tra huyết thống


Figure 4: Electrophoresis of
PCR-amplified DNA fragments.
(1) Father. (2) Child. (3) Mother.
The child has inherited some, but
not all of the fingerprint of each
of its parents, giving it a new,

unique fingerprint.
Although these resulting
'fingerprints' are unique (except
for identical twins), genetic
relationships, for example,
parent-child or siblings, can be
determined from two or more
genetic fingerprints, which can
be used for paternity tests (Fig.
4). A variation of this technique
can also be used to determine
evolutionary relationships
between organisms.
Chẩn đoán bệnh di truyền
The detection of hereditary
diseases in a given genome is a
long and difficult process, which
can be shortened significantly by
using PCR. Each gene in
question can easily be amplified
through PCR by using the
appropriate primers and
then sequenced to detect
mutations.
Viral diseases, too, can be
detected using PCR through
amplification of the viral DNA.
This analysis is possible right
after infection, which can be
from several days to several

months before actual
symptoms occur. Such early
Tách dòng gene
Cloning a gene not to be
confused with cloning a whole
organism describes the process
of isolating a gene from one
organism and then inserting it
into another organism. PCR is
often used to amplify the gene,
which can then be inserted into
a vector (a vector is a means of
inserting a gene into an
organism) such as a plasmid (a
circular DNA molecule) (Fig. 5).
The DNA can then be transferred
into a different organism where
the gene and its product can be
studied more closely. Expressing
a cloned gene (to express a gene
means to produce the protein that
it determines the production of)
can also be a way of mass-
producing usefulproteins for
example, medicines.

Figure 5: Cloning a gene using a
plasmid.
(1) Chromosomal DNA of
organism A. (2) PCR. (3)

Multiple copies of a single gene
from organism A. (4) Insertion of
the gene into a plasmid. (5)
Plasmid with gene from organism
A. (6) Insertion of the plasmid in
organism B. (7) Multiplication or
expression of the gene, originally
from organism A, occurring in
organism B.
Gây đột biến điểm
Mutagenesis is a way of making
changes to the sequence of
nucleotides in the DNA. There
are situations in which one is
interested in mutated (changed)
copies of a given DNA strand,
for example, when trying to
assess the function of a gene or
in in-vitro proteinevolution.
Mutations can be introduced into
copied DNA sequences in two
fundamentally different ways in
the PCR process. Site-directed
mutagenesis allows the
experimenter to introduce a
mutation at a specific location on
the DNA strand. Usually, the
desired mutation is incorporated
in the primers used for the PCR
program. Random

mutagenesis, on the other hand,
is based on the use of error-prone
polymerases in the PCR process.
In the case of random
mutagenesis, the location and
nature of the mutations cannot be
controlled. One application of
random mutagenesis is to analyze
structure-function relationships
of a protein. By randomly
altering a DNA sequence, one
can compare the resulting protein
with the original and determine
the function of each part of the
protein.
Phân tích mẫu DNA cổ
Using PCR, it becomes possible
to analyze DNA that is thousands
of years old. PCR techniques
have been successfully used on
animals, such as a forty-
thousand-year-old mammoth, and
also on human DNA, in
applications ranging from the
analysis of Egyptianmummies to
the identification of a
Russian tsar.
Xác định kiểu gene của các đột
biến
Through the use of allele-specific

PCR, one can easily determine
which allele of a mutation or
polymorphism an individual has.
Here, one of the two primers is
common, and would anneal a
short distance away from the
mutation, while the other anneals
right on the variation. The 3' end
of the allele-specific primer is
modified, to only anneal if it
matches one of the alleles. If the
mutation of interest is a T or
C single nucleotide
polymorphism (T/C SNP), one
would use two reactions, one
containing a primer ending in T,
and the other ending in C. The
common primer would be the
same. Following PCR, these two
sets of reactions would be run out
on an agarose gel, and the band
pattern will tell you if the
individual is homozygous T,
homozygous C, or heterzygous
T/C. This methodology has
several applications, such as
amplifying certain haplotypes
(when certain alleles at 2 or more
SNPs occur together on the same
chromosome [Linkage

Disequilibrium]) or detection of
recombinant chromosomes and
the study of meiotic
recombination.
So sánh mức độ biểu hiện của
gene
Researchers have used traditional
PCR as a way to estimate
changes in the amount of a gene's
expression. Ribonucleic
acid (RNA) is the molecule into
which DNA is transcribed prior
to making a protein, and those
strands of RNA that hold the
instructions for protein sequence
are known as messenger RNA
(mRNA). Once RNA is isolated
it can be reverse transcribed back
into DNA (complementary DNA
to be precise, known as cDNA),
at which point traditional PCR
can be applied to amplify the
gene, this methodology is
called RT-PCR. In most cases if
there is more starting material
(mRNA) of a gene then during
PCR more copies of the gene will
be generated. When the product
of the PCR reaction are run on an
agarose gel (see Figure 3 above)

a band, corresponding to a gene,
will appear larger on the gel (note
that the band remains in the same
location relative to the ladder, it
will just appear fatter or
brighter). By running samples of
amplified cDNA from differently
treated organisms one can get a
general idea of which sample
expressed more of the gene of
interest. A quantative RT-PCR
method has been developed, it is
called Real-Time PCR.