THỰC HÀNH SINH HÓA pdf

THỰC HÀNH SINH HÓA
THỰC HÀNH SINH HÓA
TS. ĐỖ HIẾU LIÊM
TS. ĐỖ HIẾU LIÊM
THỰC HÀNH SINH HÓA ĐỘNG VẬT
•
Bài 1: Thực nghiệm các hợp chất glucid
•
Bài 2: Thực nghiệm các hợp chất lipid và enzyme
•
Bài 3: Thực nghiệm các hợp chất amno acid và protein
•
Bài 4: Thực nghiệm các hợp chất vitamin và khoáng chất
•
Nhóm thực hành 4 tiểu nhóm
•
Mỗi tiểu nhóm thực hành 1 bài
Sinh viên mặc áo blouse và tuân theo nội qui
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP
CHẤT GLUCID
CHẤT GLUCID
1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
1.1. Phản ứng Molisch
1.2. Phản ứng Seliwanoff
1.3. Phản ứng Benedict
1.4. Phản ứng định tính amidon
- Phản ứng màu amidon với iod
- Phản ứng phân giải amidon bằng acid vô cơ đậm đặc
2. PHẦN ĐỊNH LƯỢNG
Định hàm lượng glucose trong máu

BÀI 1
BÀI 1
1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
1.1. Phản ứng Molisch
Polysaccharide
Monosaccharide
Glucose
Ribose
Fructose
Hexose
Pentose
H
2
SO
4
đđ
H
2
SO
4
đđ
α.1, 4
α.1, 6
Glucose
FructoseRibose
O
CHO
Furfural
Thuốc thử Màu
đặc

trưng
Hydroxymethyl
furfural
O
CHOHOH
2
C
Dihydroxymethyl
furfural
CH
2
OH
HOH
2
C
O
GLUCOS
E
H
2
SO
4
đđ
α.Napthol
Hydroxymethyl
furfural
Vòng nhẫn màu tím
GLUCOSE
OH
α Napthol

H
2
SO
4
đđ
Vòng nhẫn
màu tím
giữa 2 lớp
dung dịch
Xác định sự hiện diện hợp chất glucid
1.2. Phản ứng Seliwanoff
FRUCTOS
E
HCl

đđ
Resorcinol
Dihydroxymethyl furfural
Dung dịch màu
đỏ
Dung dịch màu
đỏ
Fructose
Resorcinol
+
HCl đđ
1.3. Phản ứng Benedict
GLUCOSE
TT Benedict
Nhiệt độ

Kết tủa vàng cam
Kết tủa vàng cam
Kết tủa đỏ
Kết tủa đỏ
Kết tủa đen
Kết tủa đen
Nhiệt độ
Nhiệt độ
Glucose
Sodium Citrate
+ CuSO
4
CuOCu
2
O
Xác định sự hiện diện ketose
Xác định tính khử
1.4. Phản ứng định tính amidon
1.4.1. Phản ứng màu amidon + iod
1.4.2. Phản ứng phân giải amidon bằng
acid vô cơ đậm đặc
AMIDON
AMILOPECTIN
AMILOSE
AMILOSE
Iod
(Lugol)
Na
2
S

2
O
3
Na
2
S
2
O
3
AMIDON
H
2
SO
4
20%PhenolphtaleinNaOH

Benedict
Seliwanoff
Làm lạnh Làm lạnh
2. ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSE TRONG MÁU
(Phương pháp Somogyi-Nelson)
1.Máu + Ba(OH)
2
+ ZnSO
4
2.Ly tâm + lấy nước trong
3.DD Somogyi
DD Somogyi
(Cu
2

SO
4
)
4.DD Nelson
DD Nelson
(Arsenomolybdate)
H
2
O
1
1
Nước cất
2
2
Glucose máu
3
3
Glucose chuẩn

 
5.QUANG PHỔ KẾ
λ = 520 nm
Cách thủy
70
0
C
0.000
A
2

A
3

A
2
: Độ hấp thu của glucose máu xét nghiệm
A
3
: Độ hấp thu của glucose chuẩn
Công thức tính:
0.05x A
100x A x 0.05
(mg%)máu Glucose
3
2
=
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT
LIPID VÀ ENZYME
LIPID VÀ ENZYME
1.THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT LIPID
1.1. Độ hòa tan và nhũ hóa triacylglycerol
1.2. Khảo sát sắc tố mật
1.3. Khảo sát thể ketone
2.THỰC NGHIỆM CÁC ENZYME
2.1.Khảo sát enzyme catalase trong hồng cầu
2.2.Khảo sát hoạt lực enzyme amylase trong huyết thanh
BÀI 2
1.THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT LIPID
1.THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT LIPID

Độ hòa tan
Dầu + Alcohol
Dầu + Alcohol
Dầu + Acetone
Dầu + Acetone
Độ nhũ hóa
Dầu + Xà phòng
Dầu + Xà phòng
Dầu + Mật
Dầu + Mật
Dầu + Muối kiềm
Dầu + Muối kiềm
1.1.Độ hòa tan và nhũ hóa triacylglycerol
1.2. Khảo sát sắc tố mật (Bilirubine và biliverdine)
Mật
Mật
Mật
Mật
HNO
3
đđ
HNO
3
đđ I
2
1.3. Khảo sát thể ketone
•
Acetone
•
Acetoacetic acid

•
β.Hydroxy butyric acid
•
Acetone
•
Acetoacetic acid
•
β.Hydroxy butyric acid
Ketone
Ketone
Ketone
Ketone
Sodium nitroprusside
Sodium nitroprusside
Sodium nitroprusside
Sodium nitroprusside
NaOH
NaOH
(NH
4
)
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4

NH
4
OH
NH
4
OH
Phản ứng Gmelin Phản ứng Smith
Phản ứng Legal
Phản ứng Rothera
2. THỰC NGHIỆM CÁC ENZYME
2. THỰC NGHIỆM CÁC ENZYME
2.1. Khảo sát enzyme catalase trong hồng cầu
1
1
Hồng cầu
Catalase
2
2
Hồng cầu
NaCN
Catalase
3
3
Hồng cầu
(đ)
Catalase
MÁU MÁU MÁUH
2
O
2

H
2
O
2
NaCN
NaCN
H
2
O
2
2.2. Khảo sát hoạt lực enzyme catalase trong huyết thanh
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
Huyết thanh

Huyết thanh
NaCl 0.9%
NaCl 0.9%
Amidon
Amidon
Iod
Iod
37
0
C
37
0
C
37
0
C
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT
PROTEIN VÀ AMINO ACID
PROTEIN VÀ AMINO ACID
1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
1.1. Phản ứng Ninhydrin
1.2. Phản ứng Xanthoproteic
1.3. Phản ứng Hopkins Cole
1.4. Phản ứng Biurrette
1.5. Phản ứng sa lắng và biến tính của protein
2. PHẦN ĐỊNH LƯỢNG
2.1. Định lượng nitrogen amin
2.2. Định lượng albumin và globulin trong huyết thanh
2.3. Định lượng protein tổng số trong huyết thanh

BÀI 3
Lòng trắng trứng
1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
1.1.Phản ứng Ninhydrin
1.2.Phản ứng Xanthoproteic
Xác định Nitrogen
(Amino acid, protein…)
Xác định amino acid có vòng
TT NinhydrinDD Nitrogen
HNO
3
NH
4
OH
Lòng trắng trứng
1.3.Phản ứng Hopkins Cole
1.4.Phản ứng Biurette
Xác định amino acid có vòng
Xác định liên kết peptide
Lòng trắng trứng
Paradimethylamino
benzaldehyde
TT Biurette
H
2
SO
4
đđ
1.5.Phản ứng sa lắng và biến tính protein
Lòng trắng trứngAmmonium sulfate Acetone Acetate chì Trichloroacetic acid

2. PHẦN ĐỊNH LƯỢNG
2. PHẦN ĐỊNH LƯỢNG
2.1. Định lượng nitrogen amin (PP Sorenxen)
DD glycine
Formadehyde
Phenolphthalein
A
B
Nước cất
NaOH
Công thức tính:
X = (A-B) x 2.8 mg/10ml
X: Số mg nitrogen trong 10 ml dung dịch glycine
A: Số ml NaOH định phân bình A
B: Số ml NaOH định phân bình B
Na
2
SO
4
2.2. Định lượng albumin và globulin huyết thanh (PP Reinhold)
2.3. Định lượng protein tổng số huyết thanh (PP khúc xạ)
Serum
NaCl 0.9%
1
2
Nước lọc 1
1
2
Nước lọc 2
2

Nước cất
3
Nước cất+NaSO
4
TT Biurette
  
Cân bằng 0.000Độ hấp thu A
1
Độ hấp thu A
2
Hàm lượng albumin
và globulin trong
huyết thanh được xác
định dựa vào hàm
lượng protein tổng số
ở nội dung 2.3
Hàm lượng albumin
và globulin trong
huyết thanh được xác
định dựa vào hàm
lượng protein tổng số
ở nội dung 2.3
Huyết thanh
Protein tổng
số trong huyết
thanh(g%)
Chỉ số
khúc xạ
Ánh sáng
Hàm lượng protein tổng số

trong huyết thanh (g%)
Protein tổng số: Độ hấp thu A
2
X (g%)
Albumin : Độ hấp thu A
1
? Y (g%)
Globulin = Protein tổng số (g%) - Albumin (g%)
= X (g%) - Y (g%)
Protein tổng số: Độ hấp thu A
2
X (g%)
Albumin : Độ hấp thu A
1
? Y (g%)
Globulin = Protein tổng số (g%) - Albumin (g%)
= X (g%) - Y (g%)
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT
THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT
VITAMIN VÀ KHÓANG CHẤT
VITAMIN VÀ KHÓANG CHẤT
1.Định lượng vitamin C trong huyết thanh
2.Định lượng calcium trong huyết thanh
3.Định lượng phospho vô cơ trong huyết thanh
BÀI 4
2,6 dichlorophenol indophenol
1. ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C TRONG HUYẾT THANH
(Phương pháp định phân 2,6 dichlorophenol indophenol)
Huyết thanh Nước cấtHPO
3

A: Số ml thuốc thử định chuẩn mẫu huyết thanh
A: Số ml thuốc thử định chuẩn mẫu huyết thanh
Màu hồng
nhạt bền
1 phút
Màu hồng
nhạt bền
1 phút
B: Số ml thuốc thử định chuẩn nước cất
B: Số ml thuốc thử định chuẩn nước cất
X: Số mg vitamin C trong 100 ml huyết thanh
X: Số mg vitamin C trong 100 ml huyết thanh
3
100 x 5 x 0.088 x B)-(A
X =
O
C
C-OH
C-OH
H-C
HO- C-H
CH
2
OH
O
C
C-OH
C-OH
H-C
HO- C-H

CH
2
OH
O
Cl
O=
=N-
Cl
-OH
O
C
C=O
C=O
H-C
HO- C-H
CH
2
OH
O
C
C=O
C=O
H-C
HO- C-H
CH
2
OH
O
Cl
HO- -NH-

Cl
-OH
KMnO
4
Nước nóng 70
0
C
Ammonium oxalate
Huyết thanh
Nước cất
2. ĐỊNH LƯỢNG CALCIUM TRONG HUYẾT THANH
(Phương pháp Clark Colip)
NH
4
OH
H
2
SO
4
Rữa cặn 3 lần
Màu hồng
nhạt bền
1 phút
Màu hồng
nhạt bền
1 phút
A: Số ml KMnO
4
định chuẩn mẫu huyết thanh
A: Số ml KMnO

4
định chuẩn mẫu huyết thanh
B: Số ml KMnO
4
định chuẩn mẫu nước cất
B: Số ml KMnO
4
định chuẩn mẫu nước cất
X: Số mg Ca trong 100 ml huyết thanh
X: Số mg Ca trong 100 ml huyết thanh
50 x 0.02 x B)-(A X =
3. ĐỊNH LƯỢNG PHOSPHO VÔ CƠ TRONG HUYẾT
THANH
(Phương pháp Urbach và Raabe)
Huyết thanh
Phospho chuẩn
1.Sodium sulfite2.Ammonium molybdate3.Hydroquinone4.Sodium carbonate+Sodium sulfite
1 2
Nước cất
  
A
1
: Độ hấp thu phospho trong huyết thanh
A
1
: Độ hấp thu phospho trong huyết thanh
A
2
: Độ hấp thu phospho chuẩn
A

2
: Độ hấp thu phospho chuẩn
X: Lượng phospho vô cơ trong huyết thanh (mg%)
X: Lượng phospho vô cơ trong huyết thanh (mg%)
0.000
2
1
A
500 x 0.001x A
X =