Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli) ppt

Lựa chọn hệ biểu hiện để
sản xuất protein ở vi khuẩn
(Các chủng E. coli )




Nhà máy E. coli


Nhà máy E. coli.
E. coli là loài vật chủ vi khuẩn
Gram âm được ưa chuộng nhất
trong sản xuất protein tái tổ hợp.
Một trong những lý do là vì những
thao tác kỹ thuật với E. coli khá dễ
dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí
nghiệm. Thông thường, tất cả các
chủng E. coli dùng trong biểu hiện
đều xuất phát từ chủng E. coli K-12
hay B. Sự khác nhau giữa các
chủng biểu hiện được phát triển và
thương mại hiện nay là nhằm để
giảm thiểu những vấn đề biểu hiện
nhất định (xem chi tiết ở bảng phía
dưới). Rất nhiều hệ thống promoter
đã được thiết kế cho việc biểu hiện
protein tuy nhiên chỉ có một số ít

trở nên phổ biến và thương mại.
Một promoter hữu ích phải có khả
năng biểu hiện mạnh, có một mức
độ biểu hiện nền thấp và dễ dàng
chuyển nạp giữa các chủng E.
coli khác nhau. Ngoài ra quá trình
cảm ứng cũng cần đơn giản và rẻ
tiền.
Một trong những bất lợi trong việc
sản xuất protein ở E. coli nhằm
mục đích liệu pháp y học là thường
lẫn với lipopolysaccharide, một loại
nội độc tố ở người. Vì lý do như
vậy mà một số loài vật chủ vi
khuẩn khác như Caulobacter,
Staphylococcus và Streptomyces
được lựa chọn để biểu hiện protein.
Các chủng vi khuẩn Bacillus Gram
dương cũng là vật chủ được ưa
thích, trong đó phải kể đến B.
megaterium, B. subtilis và B.
brevis. Những điểm nổi bật của các
vật chủ này là: hoạt tính protease
thấp, các plasmid tương đối bền về
cả cấu trúc lẫn phân ly trong phân
bào, khả năng sinh trưởng trên
nhiều loại cơ chất khác nhau và
hiệu suất biểu hiện cực cao. Trong
đó, B. subtilis được nghiên cứu sâu
và ứng dụng rộng rãi hơn 2 loài còn

lại. Mức độ biểu hiện cao nhất là
đạt được ở chủng đột biến sacUh.
Chủng WB800 bị bất hoạt tất cả
các protease ngoại bào và đã được
tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và lên
men quy mô lớn, tuy nhiên hiện giờ
chưa được thương mại hóa. Các
plasmid với promoter của operon
xylose được sử dụng rộng rãi và
cho mức độ biểu hiện gene cao
nhất. Những gene này có thể được
cảm ứng từ 130 đến 350 lần với
0.5% xylose.
Các sản phẩm protein được tạo ra
thường hay kém tan hoặc nằm
trong các thể không tan (inclusion
bodies). Để khắc phục điều này,
bạn có thể hạ thấp nhiệt độ nuôi
cấy khi cảm ứng xuống tới 16°C,
thay thế các amino acid, biểu hiện
đồng thời với các chaperone, sử
dụng đoạn amino acid kèm có tính
ưa nước cao, bổ sung thêm vào môi
trường nuôi cấy sorbitol, glycyl
betain, sucrose, hoặc raffinose, thay
đổi pH của môi trường nuôi cấy và
sau cùng có thể đổi chủng vi khuẩn
khác. Tuy nhiên, bạn có thể chọn
cách khác là hòa tan trở lại và tái
tạo cấu trúc của protein trong thể

không tan để thu được protein có
hoạt tính. Việc giảm nồng độ chất
cảm ứng thi thoảng cũng có hiệu
quả.
Để tăng cường khả năng biểu hiện
các protein eukaryote hoặc protein
có chứa codon hiếm ở E. coli, bạn
có thể lựa chọn những chủng E.
coli đã được cải biến di truyền phù
hợp với mục đích này. Ngoài vấn
đề vật chủ, promoter, thì số lượng
bản sao plasmid cao, thấp hay trung
bình cũng liên quan đến mức độ
biểu hiện. Khi gắn protein tái tổ
hợp với một đoạn cài (tag) lớn có
thể làm tăng tính tan của tổng thể
protein. Các đoạn cài liên kết
maltose hoặc đoạn cài Sumo
(Sumo-tags) có khả năng làm
protein tan cực tốt, tuy nhiên lại kết
vón sau khi loại bỏ đoạn cài khỏi
protein tái tổ hợp. Protein với các
cầu disulfide thường được tiết ra
vùng ngoại vi bào chất (periplasm)
thay vì trong tế bào chất
(cytoplasm). Để định hướng tiết
protein biểu hiện ra vùng ngoại vi
bào chất, protein tái tổ hợp cần
được gắn một đoạn peptide dẫn
đường (leader peptide) ở phía đầu

N. Thông thường các chủng E.
coli K-12 hoặc B thường sử dụng
cơ chế tiết protein kiểu I và kiểu II
với các signal peptide sau: Lpp,
LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC,
OmpF, OmpT, PelB, PhoA, PhoE,
SpA và Tat.
Đọc đến đây có thể nhiều bạn
muốn đặt câu hỏi: Vậy hệ thống
biểu hiện nào tốt nhất?. Câu trả lời
có lẽ làm bạn không hài lòng
là Không có hệ thống nào là tốt
nhất cho mọi trường hợp. Xin
đừng thất vọng! Tuy nhiên, nếu
không thì việc thiết kế biểu hiện
protein sẽ trở nên một công việc tẻ
nhạt chứ không nâng tầm thành
một "nghệ thuật biểu hiện gene"
như hiện nay. Vậy xin nhớ kỹ quy
tắc ngón tay cái: kiểm tra trình tự
protein trước tiên và sau đó lựa
chọn một hệ biểu hiện phù hợp.