Thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bò pps

Thụ tinh trong ống nghiệm
trên đối tượng bò

1 Nuôi chín tế bào nang trứng và nuôi cấy in vitro
Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) bò sẽ thành công hơn nếu trứng
được thu hoạch từ buồng trứng hoặc từ các nang trứng chín (tế bào trứng thứ
cấp). Tuy nhiên, các trứng trong nang chưa chín vẫn được sử dụng nhờ áp
dụng quá trình gây siêu bài noãn. Các tế bào trứng thu hoạch được từ các
nang trứng có đường kính 2-5 mm cần được nuôi chín cho đến khi đạt tới
giai đoạn II của quá trình phân chia (Metaphase II) (tương ứng với "tuổi"
của trứng khi trứng rụng tự nhiên). Hiện tượng " nuôi chín in vitro " này đã
được tiến hành rất nhiều kể từ khi Sreenan báo cáo lần đầu tiên (1970). Hiện
nay, tế bào trứng bò được nuôi cấy trong huyết thanh thai bê (10-20%), ví dụ
TCM199, trong 24-28 giờ với tỷ lệ chín của tế bào trứng là 60-80% và đã
thành công trong IVF. Nhưng có một điều hết sức quan trọng là phải thu
thập được tế bào trứng hoàn hảo, nghĩa là không chỉ có nhân chín mà còn
phải có nguyên sinh chất hoàn hảo và vòng trong suốt tròn rõ.
2 Hiện trạng và những vấn đề của IVF
Trong năm 1959, Chang đã tạo một động vật có vú đầu tiên từ quá
trình IVF trên thỏ. ở người, hơn 1000 cháu bé ra đời bằng IVF kể từ sau ca
IVF đầu tiên thành công của Steptoe và Edward (1978). ở Nhật, thành công
đầu tiên đã đến với nhóm nghiên cứu thuộc Bệnh viện Tổng hợp Tohoku
(1983), tiếp đến là rất nhiều thành công của các bệnh viện tổng hợp khác
trong toàn quốc.
Bảng 1. Thành tựu về IVF ở động vật có vú
Tác gia Loài đư
ợc
nghiên cứu
Kết quả đạt được
Chang (1959) Thỏ Đẻ con
Dauzler &

Thibault (1959)
Cừu Tiền nhân
Yanagimachi &
Chang (1964)
Chu
ột đồng
Trung Quốc
Thâm nhập, tiền nhân v
à
phân chia tế bào
Whittingham
(1968)
Chuột Phân chia tế bào và thai
Pickworth &
Chang (1969)
Chu
ột đồng
Trung Quốc
Thâm nhập và tiền nhân

Edwards et al.

(1969)
Người Thâm nhập và tiền nhân

Hamner et al
.
(1970)
Mèo Phân chia tế bào
Yanagimachi

(1972)
Chuột Lang Thâm nhập, tiền nhân v
à
phân chia tế bào
Gould et al.

Khỉ Rhesus Tiền nhân v
à phân chia
(1973) tế bào
Miyamoto
&
Chang (1973)
Chuột Thâm nhập và tiền nhân

Iritani et al.

(1975)
Lợn Thâm nhập, tiền nhân v
à
phân chia tế bào
Mahi &
Yanagimachi (1976)
Chó Thâm nh
ập (mở rộng
đầu)
Iritani & Niwa
(1977)
Bò Thâm nhập và tiền nhân

Hanada & Chang

(1978)
Hươu chuột Thâm nhập và tiền nhân

Hanada &
Tsutsumi
Dê Thâm nhập
Khi IVF ở người, tế bào nang trứng được lấy ra từ người mẹ bằng
phương pháp nội soi ngay trước kỳ trứng rụng, sau đó tế bào trứng này được
cho thụ tinh với tinh trùng của người chồng, nuôi cấy cho phát triển đến giai
đoạn 4-8 tế bào và cấy trở lại vào tử cung người mẹ. Phương pháp này được
gọi là IVF-ET (In vitro Fertilization and Embryo Transfer) vì nó gồm hai kỹ
thuật: thụ tinh trong ống nghiệm và cấy truyền phôi.
Đã có nhiều công trình về IVF ở động vật có vú được công bố. Phần
lớn đề cập đến sự xâm nhập của tinh trùng vào trong tế bào trứng, việc tạo ra
tiền nhân và sự bắt đầu phân chia (Bảng 1).
Quá trình IVF-ET được áp dụng đầu tiên trên người, và thí nghiệm
nhiều trên động vật (như chuột nhắt, chuột cống, thỏ) nhưng có rất nhiều báo
cáo về sự thành công trên đối tượng gia súc ở thập kỷ 80 (bảng 2).
Bảng 2.? Một số? động vật có vú? ra đời lần đầu tiên do IVF
Tác gia Loài
động vật


Tác gia Loài
động vật
Chang (1959) Thỏ

Brackett
et
Bò

al. (1982)
Whittingham
(1968)
Chuột

Hanada
(1985)
Dê
Shiba
Toyoda &
Chang (1974)
Chuột
cống


Hanada
(1985)
Cừu
Steptoe &
Edwards (1978)
Người

Cheng et al
.
(1986)
Lợn
Brackett (1982) là người đầu tiên báo cáo về thành công IVF trên bò.
Ngày nay kỹ thuật này đã được áp dụng trên toàn thế giới trong đó có Nhật
Bản (bảng 3). Nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần được giải quyết, chứ không
giống như làm IVF trên đối tượng chuột nhắt, chuột cống và người.

Bảng 3. Số liệu về các ca chửa đẻ ở bò được IVF
Tác gia Trứng

Tinh
trùng
Phát tri
ển
của tế bào trứng
Kết quả

?lúc đư
ợc
truyền cấy
Brackett
et
al., 1982
IVM Tươi

4 tế bào 1 bê
Brackett
et
al., 1982
IVM Tươi
(?)
4 tế b
ào
(?)
2 bê
(sinh đôi)
Hanada

et
al., 1986
IVM
Đông
lạnh
Phôi dâu-
nang
3 bê
Sirard
et
al.,1986
IVM Tươi

Phô
i nang
8 tế bào
7 bò có
chửa, đẻ 6 bê
Shimohira
et al, 1986
IVM
Đông
lạnh
1 tế bào 1 s
ẩy
thai (210 ngày)

Parrish
et
IVM

Đông
Phôi dâu,
nang đông l
ạnh
3 bê (có
al., 1986 lạnh và giải đông 2 sinh đôi)
Lu et al
.,
1987
IVM
Đông
lạnh
Phôi dâu-
nang
11 bò có
chửa
Fukushima
et al, 1987
IVM
Đông
lạnh
Phôi nang

3 bê
Aoyagi,
1987
IVM
Đông
lạnh
Phôi dâu-

nang
3 bê
- IVM (in vitrro maturation): Nuôi chín trong ống nghiệm
- Các trứng sau khi thụ tinh được nuôi cấy trong tử cung thỏ và tử
cung cừu
Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm bò được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4. Các nội dung hoạt động và kỹ thuật cần thiết cho IVF
Nội dung Tiến hành
Lấy tinh Gi
ải đông tinh (đông lạnh).
Epididymis tinh trùng
Hoạt hoá tinh trùng Trong đư
ờng sinh dục của con cái
động dục
Nuôi cấy trong cơ quan sinh dục
Nuôi cấy trong môi trư
ờng nuôi cấy
tổng hợp
Thu hoạch trứng Trứng rụng tự nhiên. Tr
ứng trong
nang trứng
Nuôi chín tế bào trứng Nuôi chín in vitro. Nuôi c
ấy trong
môi trường tổng hợp
Thụ tinh Môi trường nuôi cấy phù hợp
Nồng độ tinh tr
ùng. Đánh giá tinh
trùng
Nuôi cấy các trứng đ
ã

được thụ tinh
Trong cơ quan sinh sản c
ùng loài
hoặc khác loài
Cấy truyền các trứng đ
ã
được thụ tinh
Phương pháp ph
ẫu thuật hoặc không
phẫu thuật
Sự thành công phụ thuộc chủ yếu vào sự chín của tinh trùng (sự hoạt
hoá) và tế bào trứng. Hơn nữa, để có thể có được một con bê ra đời qua con
đường phôi cấy vào tử cung tử cung bằng phương pháp không phẫu thuật thì
phôi đó phải được nuôi cấy cho đến khi có 8 tế bào hoặc cho tới giai đoạn
phôi nang thì càng tốt. Những ví dụ về IVF bò được ghi trong bảng 5.
Bảng 5. Những thành tựu chủ yếu đối với kỹ thuật IVF trên bò ở Nhật
Bản
Tác gia, Cơ
quan, năm
Điều
ki
ện nuôi
tr
ứng chín
IVM
Điều
ki
ện xử lý
tinh trùng
Điều

ki
ện nuôi cấy
sau IVF
Kết quả
Hanada
et
al. (Viện
Qu
ốc gia,
1985)
Nuôi
chín
in vitro
cùng v
ới
hormone
Caffein
+ Ca
++


Tử
cung thỏ
Đ
ẻ (chết
khi sinh)
Hanada
et
al. (Viện
Qu

ốc gia,
1986)
Nuôi
chín
in vitro
cùng v
ới
hormone
Caffein
+ Ca
++

Tử
cung thỏ
2 bê
Shimohira
et al. (Viện
Qu
ốc gia,
1986)
Nuôi
chín
in vitro
cùng v
ới
hormone
Caffein
+ Ca
++

Tử
cung thỏ
3 bê, bao
gồm 2 b
ê sinh
đôi
Fukushima
et al. (Viện
Nuôi
chín in vitro

không
Caffein
+ Ca
++

Tử
cung thỏ
3 bê

Qu
ốc gia
Hyogo, 1987)
hormone
Kajiwara
et
al. (Trường
ĐH
Kagoshima, 1987)

Nuôi
chín in vitro

cùng v
ới
hormone
Caffein
+ Ca
++

Nuôi
cấy in vitro

cùng T.bào
Cumulus
Phôinang
trương n
ở?
(13%)
Fukuda
et
al. (Trư
ờng
Kitazaro, 1987)
Nuôi
chín in vitro

cùng v
ới
hormone

Caffein
+ Ca
++

Nuôi
cấy in vitro

cùng T.bào
Cumulus
Phát tri
ển
thành phôi nang
(11%)
Aoyagi
et
al. (Trường
ĐH
Kitazato, 1987)
Nuôi
chín in vitro

cùng v
ới
hormone
Caffein
+ Ca
++

Nuôi
cấy in vitro

cùng T.bào
Cumulus
3 bê sinh
ra
Hi
ệp hội
Nuôi
Caffein
ống 40-50
bò
phát triển
gia súc,
1987
chín in vitro

cùng v
ới
hormone
+ Ca
++
dẫn trứng thỏ

chửa
Trong năm 1985, Hanada et al. (Viện Chăn nuôi quốc gia - Bộ Nông
Lâm Ngư nghiệp) thành công trong việc tạo ra một con bê IVF, tuy nó bị
chết sau khi sinh. Trước đó vài năm, đã có nhiều kết quả được báo cáo ở
nhiều viện nghiên cứu của Nhật, đáng chú ý nhất là báo cáo của Shimodaira
et al. (1986), nhân viên Trường Kitazato và Trường Kagoshima. Shimodaira
cấy truyền trứng đã thụ tinh đông lạnh (phôi dâu và phôi nang thu hoạch từ

tử cung thỏ), trong khi tại hai trường đại học trên,? người ta nuôi cấy in vitro
các tế bào trứng đã được IVF thay cho việc nuôi cấy trong tử cung thỏ đến
khi chúng phát triển thành phôi nang, sau đó được cấy truyền và phát triển
đến khi bò mẹ đẻ. Trong tương lai gần, các tế bào trứng sau khi IVF, được
đông lạnh để bảo quản, xác định giới tính và nuôi cấy in vitro cho đến khi
phát triển thành phôi nang.
3. Hoạt hoá tinh trùng
Tinh trùng sau khi khai thác từ bò đực, nếu không được hoạt hoá,
không thể tiến hành IVF. Cần đặt tinh trùng trong một ống khoảng 4-6 giờ
để làm tăng khả năng thụ tinh của chúng. Mặc dù có nhiều điều không thể
làm sáng tỏ được về vấn đề tại sao hoạt hoá lại là nguyên cớ, có thể có một
số yếu tố cản trở chống lại sự thụ tinh đã được loại bỏ sau khi hoạt hoá. Có
một số thay đổi ở đầu tinh trùng (sau khi được hoạt hoá) ngay trước lúc thâm
nhập vào tế bào trứng và được gọi là phản ứng acrosome.
Với chuột nhắt, chuột cống, thỏ và người: có thể dễ dàng tạo con non
từ IVF, vì tinh trùng có thể được hoạt hoá bằng cách rửa vài lần để loại bỏ
tinh thanh (seminal plasma) và nuôi cấy một thời gian trong môi trường nuôi
cấy. Nhưng phương pháp này vẫn chưa có hiệu quả đối với bò. Hiện nay đã
có một phương pháp thu hoạch tinh từ cơ quan sinh dục, sau đó nuôi cấy
chúng trong đường sinh dục đã được lấy ra ngoài của bò cái hoặc từ một số
động vật khác, hoặc nuôi cấy chúng trong môi trường bao gồm dịch nang
trứng hoặc một số hoá chất khác (Ca
++
, heparin, chondroitin, v.v ).
Brackett et al. (1982) là người đầu tiên tạo được bê từ IVF, và một số
tác gia? khác đã tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhau.
1.1. Phương pháp của Brackett? et al. (1982)
Nuôi cấy tinh trùng trong dịch chứa nồng độ ion cao (HIS, khoảng
380 mOsm/kg) trong 5 phút, rửa chúng và nuôi cấy tiếp trong 3/4 đến 5 giờ.
Phương pháp xử lý bằng HIS này được phát triển như là một cách để loại bỏ

tinh thanh bám trên bề mặt tinh trùngđực giống. Một số tác gia cho rằng
phương pháp này có hiệu quả đối với tinh trùng thỏ và bò, trong khi một số
khác lại thất bại. Phương pháp này có thể có ích trong quá trình hoạt hoá.
1.2. Phương pháp của Hanada et al. (1986)
Pha loãng tinh dịch bằng cách thêm môi trường nuôi cấy tổng hợp có
chứa một ít caffein nhưng không có albumin huyết thanh bò (BSA). Xử lý
chúng cùng với ion A trong một thời gian ngắn (0,1mM, 60 giây) và hoạt
hoá trong môi trường nuôi cấy có bổ sung BSA. Ion A được cho là giúp tinh
trùng lấy Ca
++
và có hiệu lực đối với phản ứng acrosome tinh trùng, làm cho
chúng dễ thâm nhập vào trứng.
1.3. Phương pháp của Lu et al. (1987) { kế thừa phương pháp của
Parrish (1986)}
Xử lý tinh trùng đông lạnh bằng cách nhúng ngập tinh trùng ở phần
thấp của môi trường nuôi cấy, giữ chúng ở đấy và sử dụng những tinh trùng
bơi lên phía trên (tinh trùng hoạt động- active sperms). Phương pháp này
thường áp dụng cho người, sau đó xử lý chúng 15 phút trong heparin để hoạt
hoá. Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,4 để hoạt hoá và 7,8 để thụ tinh vì pH
có tác động tới cả hai quá trình này.
4. Nuôi chín tế bào trứng
Tinh trùng đã hoạt hoá vẫn có thể không có khả năng thụ tinh tế bào
trứng, sự thâm nhập của chúng tạo nên sự thụ tinh không bình thường. Khi
sử dụng tế bào trứng gần rụng hoặc đã rụng trong tử cung (giai đoạn phân
chia chín thứ cấp), có thể tạo được sự thụ tinh bình thường. ở người, dễ dàng
nhận biết nang trứng chín trong buồng trứng nhờ đo hàm lượng hormone
hoặc dùng phương pháp đo siêu âm. ở bò, đã có các nghiên cứu đo bằng siêu
âm để xác định thời điểm trứng rụng. Có thể dùng nội soi để thu hoạch tế
bào trứng ngay trước hoặc sau khi rụng.
Có thể sử dụng tế bào trứng chưa chín cho IVF bằng cách nuôi chín

chúng bên ngoài cơ thể. Hiện nay có thể dễ dàng nuôi cấy tế bào trứng đến
giai đoạn phân chia chín thứ cấp. Tuy nhiên tỷ lệ thụ tinh in vitro thành công
vẫn còn thấp (30-60%), có thể là do quá trình thụ tinh không chỉ phụ thuộc
vào sự chín của nhân, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của nhân, tế bào
chất và độ tròn rõ của vòng trong suốt. Đã có nhiều nghiên cứu về toàn bộ
các vấn đề liên quan đến nang trứng, bao gồm cả ảnh hưởng của các loại
hormone và các tế bào lớp màng hạt.
5. Sự phát triển sau khi thụ tinh
Các nghiên cứu gần đây về IVF bò đã thành công 60-90% (tinh trùng
thâm nhập được vào tế bào trứng và tạo tiền nhân). Vấn đề quan trọng hiện
nay là cấy truyền các trứng đã thụ tinh và theo dõi cho tới lúc bê sinh ra. Các
tế bào trứng cần đạt tới giai đoạn 8 tế bào trước khi cấy truyền vào tử cung
bò mẹ (phương pháp không phẫu thuật). Hiện nay thường dùng các tế bào
trứng thụ tinh phát triển tới 2-4 tế bào để? cấy truyền vào tử cung thỏ hoặc
cừu; sau đó 4-6 ngày, cấy chuyển trở lại vào tử cung bò. Khi đó chúng đã
phát triển thành phôi dâu hoặc phôi nang (bảng 3). Trong tương lai gần có
thể phát triển trứng đã thụ tinh trong môi trường nuôi cấy tổng hợp. Các quá
trình nuôi chín, thụ tinh và phát triển (tới phôi nang) sẽ được tiến hành trong
phòng thí nghiệm, nhằm tăng cường khả năng thực hành cấy truyền phôi và
bảo quản lạnh phôi.
6. ứng dụng của kỹ thuật IVF
ở người, IVF dùng chữa chứng vô sinh cho những phụ nữ có buồng
trứng và tử cung bình thường nhưng ống dẫn trứng không bình thường hoặc
cho những đàn ông không có đủ tinh trùng.
ở bò, IVF đang có triển vọng ứng dụng rộng rãi, và nó bao gồm cả
việc cấy truyền phôi (bảng 6).
Bảng 6. ứng dụng IVF cho bò và cấy truyền phôi


Khả năng ứng dụng

1

Lai tạo nhiều giống khác nhau trong cùng thời điểm
2

Sử dụng tế bào nang trứng chưa chín
3

Tạo bê sinh đôi. Bảo quản lạnh các tế bào tr
ứng. Tạo trứng thụ
tinh có 2-4 tế bào, áp d
ụng cho xác định giới tính, cấy chuyển nhân
và gen.
4

Tạo bê từ các bò khó phối giống hoặc bị bệnh nặng
5

Đóng góp cho các nghiên cứu về sinh lý thụ tinh, v.v
Hiện nay mỗi bò chỉ có thể thu được 4-6 tế bào trứng phù hợp với việc
cấy chuyển (kể cả khi gây siêu bài noãn) và số lượng này còn hạn chế hơn
nữa nếu phối cho bò trong cùng một giống. Nếu các phương pháp được thiết
lập để sử dụng số lượng lớn các tế bào trứng thu hoạch được sau khi gây
rụng trứng nhiều và tế bào nang trứng chín in vitro để đem thụ tinh với tinh
trùng thuộc giống bò khác, thì việc thụ tinh của nhiều giống khác nhau có
thể tiến hành cùng một lúc. Tuy nhiên, nếu tìm ra các mối tương quan giữa
tỷ lệ thành công của IVF và tỷ lệ thành công của thụ tinh nhân tạo thì sẽ giúp
đánh giá được khả năng của bò đực lấy tinh.
Một bê cái mới sinh ra có khoảng 500.000 nang trứng thứ cấp trên
buồng trứng. Nếu thu thập các tế bào trứng non từ các nang trứng đó, nuôi

chín in vitro và sử dụng cho IVF, sẽ tạo ra được số lượng lớn tế bào trứng
thụ tinh. Các tế bào trứng thụ tinh này có thể dùng để tạo bê sinh đôi, bảo
quản lạnh, tạo tế bào trứng thụ tinh có 2-4 tế bào, xác định giới tính, cấy
chuyển nhân và gen, v.v Hơn nữa, nếu các tế bào trứng được bảo quản
lạnh trước khi thụ tinh sẽ giúp chữa vô sinh cho các con bò có ống dẫn trứng
không bình thường. Có thể cấy chuyển gen của những con bò có chất lượng
cao nhưng bị bệnh nặng do phối giống lặp lại nhiều lần. Quá trình cấy truyền
phôi bò sẽ đóng một vai trò hết sức quan trọng trong các nghiên cứu cơ bản
đề cập đến các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh, sự phát triển trong
giai đoạn đầu? của tế bào trứng thụ tinh, v.v /.