Ứng dụng Thin layer Chromatography pot

Nhóm thực hiện:
Tống Thị Huệ
Đồng Thị Viên
Vũ Thị Hằng

Khái niệm.

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành
khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn
hợp các chất cần tách.

Pha tĩnh là chất hấp thụ được chọn phù hợp theo yêu cầu phân
tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên
các phiến kính hoặc phiến kim loại.

Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được
trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận.
Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong
hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng
pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là
một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Cơ chế

Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao
đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của
nhiều cơ chế tuỳ thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh
và dung môi làm pha động.
Mô hình cháy sắc ký lớp mỏng.
Ứng dụng
Định tính
1

Thử tinh khiết
2
Định tính.
Định lượng
3
1. Định tính

Dựa vào trị số Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di
chuyển của chất phân tích, gọi là hệ số di chuyển

Rf=a/b.

Trong đó:

a là :khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết thử
tính bằng cm

b là : khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi
đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.

Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
ví dụ:
1. Định tính

Đôi khi do sắc ký liên tục không xác định được tuyến
dung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối
Rr để đặc trưng cho chất phân tích:

Rr = a/c.


Trong đó:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết thử
tính bằng cm

c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chuẩn
tính bằng cm.

Rr càng gần 1, chất phân tích càng đồng nhất với chất
chuẩn
2. Thử tạp chất.

Nếu có chất chuẩn tạp thì :
so sánh mật độ viết của chất
thử trong mẫu thử với mật
độ vết chất chuẩn tạp đã có.
2. Thử tạp chất.

Nếu không có chất
chuẩn tạp thì : so sánh
mật độ vết của chất
thử trong mẫu thử
với mật độ vết của
chất chuẩn tạp có Rf
tương ứng.
3. Định lượng.
Có hai cách để định lượng các chất trong vết sắc ký:
•
Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng

dung môi thích hợp.
Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân
tích bằng một kỹ thuật thích hợp (phổ hấp phụ, huỳnh
quang, cực phổ…). Phương pháp này hiện nay ít dung
vì có nhiều trở ngại và mất nhiều thời gian.
3. Định lượng
•
Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng:
•
Đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký. Hiện nay
dung 2 kỹ thuật:
- Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ
thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có
độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký.
-
Densitometer : chiếu chùm tia vào
vết sắc ký và đo cường độ
hấp thụ hoặc huỳnh quang.
4. Ví dụ phần thử tạp: trong viên nén ACETAZOLAMID

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

Bản mỏng: Silicagel GF
254

Dung môi khai triển: Propan-2-ol - ethyl acetat - dung dịch ammoniac 13,5
M (50 : 30 : 20)

Dung dịch (1): Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 50
mg acetazolamid, thêm 10 ml hỗn hợp dung môi đồng thể tích ethanol 96%

và ethyl acetat, lắc kỹ trong 20 phút, lọc.

Dung dịch (2): Hút chính xác 1 ml dung dịch (1), pha loãng với hỗn hợp
dung môi trên vừa đủ 100 ml.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 µl mỗi dung dịch trên.
Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 15 cm. Lấy bản sắc ký
ra và để khô ngoài không khí. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
254 nm.

Trên sắc ký đồ, bất kỳ vết phụ nào của dung dịch (1) cũng không được có
màu đậm hơn màu của vết chính của dung dịch (2) (1%).
4. Ví dụ phần thử tạp:VIÊN NÉN BISACODYL

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4).

Bản mỏng: Silica gel GF 254.

Hệ dung môi khai triển: Butan-2-on – xylen (1 : 1).

Dung dịch thử (1): Cân một lượng bột viên tương ứng với 50 mg bisacodyl, thêm 5
ml aceton (TT), lắc 10 phút, ly tâm và sử dụng dịch trong ở trên.

Dung dịch thử (2): Pha loãng 1 thể tích dung dịch thử (1) thành 5 thể tích với aceton
(TT).

Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 3 thể tích dung dịch thử (1) thành 100 thể tích
với aceton (TT).

Dung dịch đối chiếu (2): Dung dịch bisacodyl chuẩn 0,2% trong aceton (TT).


Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai
sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm. Lấy bản sắc ký ra, để khô ngoài không khí.
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.

Bất kỳ vết phụ nào trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử (1), ngoài vết tá dược
viên có thể có với R
f
bằng 1,3 R
f
của vết chính, không được đậm màu hơn vết trên
sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (1).
Ví dụ phần định tính
Định tính ngũ bội tử

Dung môi khai triển: Cloroform – ethyl acetat – acid formic (5 : 5 : 1).

Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu thô, thêm 2 ml methanol
(TT), siêu âm 15 phút. Lấy dịch lọc làm dung dịch thử.

Dung dịch đối chiếu: Hoà tan acid galic trong methanol (TT) (1 mg/ml)
làm dung dịch đối chiếu hoặc dùng 0,5 g Ngũ bội tử (mẫu chuẩn), tiến hành
chiết như mẫu thử

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 2 ml mỗi dung dịch thử và
dung dịch đối chiếu. Sau khi khai triển xong, để khô ở nhiệt độ phòng. Quan
sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Sắc ký đồ của dung dịch
thử phải cho vết có cùng màu sắc và cùng Rf với vết của acid galic trên sắc
ký đồ của dung dịch đối chiếu. Nếu dùng dược liệu chuẩn để chuẩn bị dung
dịch đối chiếu thì trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng giá

trị Rf và màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.