Bài giảng thực hành nuôi cấy mô thực vật pptx

MỤC LỤC
Bài 1. Phương pháp pha chế mơi trường ni cấy mơ thực vật
Bài 2. Phương pháp khử trùng mơ thực vật
Bài 3. Khử trùng ni cấy chồi ngủ cúc và hạt cam
Bài 4. Vi nhân giống dứa bằng ni cấy chồi ngủ
Bài 5. Phương pháp ni cấy tạo mơ sẹo ở thực vật
Bài 6. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo
Bài 7. Phương pháp tách và ni cấy đỉnh sinh trưởng
Bài 8. Phương pháp vi ghép ở thực vật
Bài 9. Phương pháp thuần hố cây ra vườn ươm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
42
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 1
BÀI I
PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MƠI TRƯỜNG
NI CẤY MƠ THỰC VẬT
1 - NGUN TẮC
1.1 - Ngun tắc pha chế mơi trường
Mơi trường ni cấy mơ thực vật khác với các loại mơi trường ni cấy vi sinh là
có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hố chất với hàm lượng rất
nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các mơi trường ni cấy (mơi trường làm việc),
người ta khơng cân hố chất mỗi lần pha mơi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều
loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước
vơ khống khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ
được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thơng thường pha các
dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh
trưởng, và các stock cần thiết khác.
1.2 - Phân loại mơi trường ni cấy mơ thực vật
Tùy theo thành phần các chất có trong mơi trường, có thể phân thành 3 loại mơi
trường:
- Mơi trường nghèo chất dinh dưỡng: như mơi trường White, Knop. Mơi trường này

thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình ni cấy mơ thực vật khi chuẩn bị chuyển
cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Mơi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng
trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mơ thực vật.
- Mơi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: mơi trường B5, Gamborg.
Loại mơi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh
dưỡng trong mơi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi ni cấy mơ thực vật dài
ngày.
- Mơi trường giàu chất dinh dường: mơi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là
mơi trường khởi đầu cho mọi q trình ni cấy mơ đối với mọi đối tượng ni cấy. Mơi
trường MS là một mơi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất
dinh dưỡng.
2 - NGUN LIỆU - HỐ CHẤT - DỤNG CỤ
2.1 - Hố chất
- Saccharose (sucrose)
- Agar
- NH
4
NO
3
- KNO
3
- MgSO
4
.7H
2
O
- KH
2
PO
4

- CaCl
2
.5H
2
O
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 2
- KI
- Na
2
MoO
4
.2H
2
O
- CoCl
2
.6H
2
O
- H
3
PO
3
- MnSO
4
.4H
2
O
- ZnSO
4

.7H
2
O
- CuSO
4
.5H
2
O
- Thiamine HCl
- Myo-inositol
- Glycine
- NAA
- BA (6-Benzyl aminopurin)
- Na
2
-Ethylen diamin tetraacetat (Na
2
EDTA
-Fe
2
(SO
4
)
3
2.2 - Dng c Thit b cn cho 1 nhúm (30 sinh viờn) thc hnh
STT Tờn dng c, thit b
n v
tớnh
S
lng

Ghi chỳ
1 - Bỡnh nh mc: 100 ml cỏi 10
2 - Bỡnh nh mc: 500 ml cỏi 3
3 - ng ong: 100 ml cỏi 12
4 - ng ong 500 ml cỏi 3
5 - a khuy cỏi 15
6 - Bỡnh mu 200 ml cỏi 5
7 - Qu búp cao su cỏi 15
8 - B n nhit cỏi 1 Dựng pha Fe-EDTA
9 - Cc 100 ml cỏi 30
10 - Cc 200 ml cỏi 15
11 - Pipett: 1 ml cỏi 15
12 - Pipett: 5 ml cỏi 15
13 - Pipett: 10 ml cỏi 15
14 - Bỡnh nh mc 250 ml cỏi 15
15 - ng nghim ị 25 ng 100
16 - Bụng m g 200
17 - Bỡnh mu: 1000 ml cỏi 2 Bo qun cỏc stock
THệẽC HAỉNH NUOI CAY MO THệẽC VAT Trang 3
3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của mơi trường
MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khống đa lượng (Skoog I), dung dịch
mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khống vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất
điều hồ sinh trưởng
4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MƠI TRƯỜNG MS
(Murashige – Skoog)
4.1. Pha stock khống đa lượng mơi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)
Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khống đa lượng. Dùng ống đong, đong
khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào
theo trình tự nhất định sau:

Tên hố chất
Nồng độ mơi trường
ni cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x20) (mg/lít)
- MgSO
4
.7H
2
O 370 7.400
- KH
2
PO
4
170 3.400
- KNO
3
1.900 38.000
- NH
4
NO
3
1.650 33.000
- CaCl
2
.2H
2
O 440 8.800
Mỗi lần cho một loại khống vào phải khuấy tan hồn tồn và bổ sung thêm
100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khống khác vào (phương pháp pha thể

tích tăng dần). Do CaCl
2
.2H
2
O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO
4
.7H
2
O nên hai chất
này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl
2
.2H
2
O vào sau cùng.
Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000
ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khống đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch
này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10
oC
, dùng 50 ml cho một
1000 ml mơi trường ni cấy.
4.2. Pha stock khống vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)
Do hàm lượng một số loại khống vi lượng trong stock khống vi lượng rất
nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khống vi lượng khác. Vì vậy ở đây,
ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khống này (CuSO
4
.5H
2
O, CoCl
2
.6H

2
O) có
nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”.
Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock
khống vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên. Thành phần các khống như sau:
Tên hố chất
Nồng độ mơi
trường ni cấy
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x1000)
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
“bà ngoại “(x100)
(mg/lít)
H
3
PO
3
6,2 6200
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 22300
ZnSO
4
.4H
2
O 8,6 8600

Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 250
KI 0,83 830
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 4
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 25 2500
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 25 2500
4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200)
Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối
với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường
dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm
Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng
thích ra mơi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau:
Tên hố chất
Nồng độ mơi trường
ni cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch stock
(x200) (mg/lít)

FeSO
4
.7H
2
O 27,8 5560
Na
2
EDTA 37,3 7460
Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất
hai lần. Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80
oC
. Cân chính xác 5,56 g
FeSO
4
.7H
2
O cho vào becher 500 ml có 400 ml nước trên, khuấy tan hồn tồn. Cân chính
xác 7,46 g Na
2
EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khuấy tan hồn tồn.
Cho từ từ dung dịch FeSO
4
.7H
2
O vào dung dịch Na
2
EDTA, vừa đổ vừa
khuấy đều. Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Như vậy, ta có 1000 ml dung dịch
stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt. Dung dịch này được bảo
quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10

oC
, dùng 5ml cho một 1000 ml mơi
trường ni cấy.
4.4. Pha stock hormon
Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung mơi khác nhau. IAA, NAA,
BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm
nước đến thể tích cần). GA
3
,

2,4-D pha trong cồn 50
o
cho đủ thể tích.
Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau:
+ Cách 1: pha theo hệ mol
Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol
(milimol) từ IAA tinh khiết.
176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước →1000 ml dung dịch có nồng độ 1
mol/lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn có
100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M
2,4-D
:
221,04; MBA: 225,2)
+ Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khống.
Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các
chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10
oC
.
4.5. Pha stock vitamin mơi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500)
Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ

sung các vitamin vào theo trình tự sau:
Tên hố chất
Nồng độ mơi trường
ni cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch stock
(x500) (mg/lít)
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 5
Acid nicotinic 0,5 250
Thiamin HCl 0,1 50
Pyridoxin HCl 0,5 250
Myo-inositol 100 50.000
Glycine 2 1.000
Cho tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ sung cho đủ 100 ml.
Như vậy, ta có 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần
trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0
oC
, dùng 2ml cho một 1000 ml mơi trường ni cấy.
4.6. Pha mơi trường làm việc (mơi trường ni cấy)
Pha 1 lít mơi trường MS cơ bản:
- Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher.
- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hồn tồn
- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều.
- Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều.
- Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều.
- Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500.
- Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích ni cấy.
- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ
1000 ml
- Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8.
- Bổ sung 6-8 g agar.

- Đun sơi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp mơi trường vào các bình ni
cấy, cần chia xong trước khi dung dịch mơi trường MS nguội xuống 50
oC
. Hấp khử trùng
(đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vơ trùng và bổ sung vào
mơi trường sau khi hấp). Mơi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25
oC
.
5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III.
2. Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích.
3. Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít.
Biết MBA =225,2.
4. Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 µmol/lít để pha mơi
trường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 µmol/lít.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 6
BÀI 2
PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MƠ THỰC VẬT
1 - NGUN TẮC
Một thí nghiệm ni cấy mơ thực vật khác với một thí nghiệm ni cấy vi sinh
thường tiến hành trong một thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế,
chỉ cần một tế bào vi khuẩn, một bào tử nấm mốc rơi vào mơi trường ni cấy, sau một
thời gian ngắn sẽ sinh sơi làm hỏng mơi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến hành
làm lại từ đầu. Do đó việc vơ trùng tức loại bỏ hết nấm khuẩn trong ni cấy mơ thực vật
vơ cùng quan trọng.
Mơ cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phơi,
nỗn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với mơi trường bên ngồi, các bộ
phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Để chuyển mơ thực vật từ mơi trường tự
nhiên vào mơi trường ni cấy in vitro, mơ thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để
loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên q trình này phải đảm bảo là mơ thực vật còn

sống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt.
Phương pháp vơ trùng mơ cấy thơng dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học
có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào
thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên
bề mặt mơ cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mơ cấy. Để tăng tính linh
động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thơng thường người ta lắc mơ cấy với
cồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.
Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật
Tác nhân vơ trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả
Canxi hypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypoclorid 2 5 – 30 Rất tốt
Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt
HgCl
2
0,1 – 1 2 – 10 Trung bình
Chất kháng sinh 4 – 50 30 – 60 Khá tốt
Trong thời gian xử lý, mơ cấy phải ngập hồn tồn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối
với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng bột và rửa
sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý song, mơ cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vơ
trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mơ cấy bị tác nhân vơ trùng làm cho trắng ra
cần phải cắt bỏ trứơc khi đặt mơ cấy lên mơ trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các
tác nhân vơ trùng lên mơ cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngồi khi ngâm mơ vào dung
dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mơ cấy lên
mơi trường.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 7
Như vậy, để có thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mơ
thực vật có thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố
liên quan chặt chẽ với nhau và liên quan tới mơ thực vật đem khử trùng đó là:
- Chất khử trùng

- Nồng độ chất khử trùng
- Thời gian khử trùng.
Vơ trùng mẫu là một thao tác khó, ít khi thành cơng ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu
kiên trì tìm nồng độ và thời gian vơ trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt
kết quả.
2 - VẬT LIỆU - HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
- Cây Trầu bà
- Hạt thuốc lá
2.2 - Hố chất
- Xà phòng bột
- Cồn 70
o
, 90
o
- Javel
- Ca(OCl)
2
(Caxi hypoclorid)
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 8
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bơng mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Tủ cấy vơ trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi vơ
trùng
3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
Học sinh thực hành khử trùng đốt thân cây Trầu bà, hạt thuốc lá. Sau khi vơ trùng
tiến hành gieo hạt thuốc lá, cấy đốt thân cây Trầu bà lên mơi trường MS.
4 - THỰC HÀNH
4.1 - Khử trùng cây Trầu bà
a. Thực hiện trong phòng thí nghiệm
- Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm. Rửa các đoạn này dưới vòi

nước máy cho sạch bụi đất.
- Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang
một chồi ngủ. Cắt bỏ lá, rễ.
- Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen.
- Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng.
b. Thực hiện trong tủ cấy
- Lắc các đốt thân với cồn 70
o
trong 1 phút
- Chiết bỏ cồn. Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút
(hay dung dịch javel được pha lỗng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút).
- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vơ trùng 5-6 lần
- Gạn bỏ nước.
4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá
- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng.
- Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng
- Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút.
- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vơ trùng 5-6 lần.
- Gạn bỏ nước.
4.3 - Cách cấy mẫu
a. Mẫu cây Trầu bà
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 9
- Trong tủ cấy vơ trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy
vơ trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá.
- Ở mỗi nách lá có mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu có kích
thước khoảng 1x1 cm cấy vào mơi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm.

- Khi cấy mẫu cần chú ý cấy đúng chiều của thân. Các ống nghiệm được đặt trong
phòng lạnh nhiệt độ 25
oC
, cường độ ánh sáng 2500-3000 lux.
b. Mẫu hạt thuốc lá
- Hạt thuốc lá sau khi khử trùng, dùng kẹp đặt đều trên bề mặt mơi trường MS trong
các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1cm.
- Các erlen được đặt ở nơi tối hồn tồn.
5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá.
2. Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid.
3. Ghi nhận kết quả ni cấy.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 10
BÀI 3
KHỬ TRÙNG, NI CẤY CHỒI NGỦ CÚC
HẠT CAM
1 - NGUN TẮC
Trong các phương pháp nhân giống vơ tính in vitro cây trồng, bên cạnh những
phương pháp đòi hỏi người làm việc phải có kỹ thuật cao như tách và ni cấy đỉnh sinh
trưởng, vi ghép…, phương pháp nhân giống bằng ni cấy chồi ngủ (chồi nách) là
phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao nhất.
Ở đa số các lồi thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ. Các chồi ngủ này có
đặc tính hồn tồn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đỉnh sinh trưởng ở trạng thái
tiềm sinh), có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật tồn vẹn. Các
chồi ngủ này đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn). Nếu tách
riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động bởi
những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách
này có thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới hàng trăm chồi).
Với những chồi mới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những mơi trường tạo chồi mới
thì hệ số nhân giống rất đáng kể.

Với những lồi thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thì
việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó thực hiện. Vì vậy, với những loại thực vật này,
phương pháp nhân giống vơ tính hiệu quả nhất là ni cấy chồi nách. Chồi nách đem
ni cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn
rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn
so với phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng
Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh có mang chồi của thực
vật. Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang
chồi nách. Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vơ trùng
trong ống nghiệm được tạo ra do việc ni cấy hạt giống.
Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vơ tính thực vật qua
ni cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp ni cấy chồi nách từ hạt giống.
2- VẬT LIỆU –HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
- Cây hoa cúc
- Hạt cam
2.2 - Hố chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Mơi trường MS bổ sung 2,4 – D
- Xà phòng bột
- Cồn 70
o
, 90
o
- Javel
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 11
- NAA

- BA
2.3 - Dng c Thit b cn cho 1 nhúm (30 sinh viờn) thc hnh
STT Tờn dng c, thit b
n v
tớnh
S
lng
Ghi chỳ
1 - Dao m cỏi 15
2 - Li dao m cỏi 15 Dựng li dao m nhn
3 - ng ong: 100 ml cỏi 12
4 - ng ong 500 ml cỏi 3
5 - a khuy cỏi 15
6 - Cc 500 ml cỏi 15
7 - Qu búp cao su cỏi 15
8 - Cc 1000 ml cỏi 5
9 - Cc 100 ml cỏi 30
10 - Cc 200 ml cỏi 15
11 - Pipett: 1 ml cỏi 5
12 - Pipett: 5 ml cỏi 5
13 - Pipett: 10 ml cỏi 5
14 - Erlen 250ml cỏi 60
15 - Kp di 25 cm Cỏi 15
16 - Bụng m g 200
17 - ng nghim ị25 cỏi 15
18 - Giỏ ng nghim l ln cỏi 15
19 - ốn cn cỏi 15
20 - T cy vụ trựng cỏi 1
T cy cú qut thi khớ vụ
trựng

3 - NI DUNG THC HNH
- Sinh viờn tin hnh ct t thõn cỳc, thc hin xỏc nh cụng thc kh trựng. Nuụi
cy thõn cỳc trờn mụi trng MS b sung.
- Sinh viờn tin hnh kh trựng, tỏch v v nuụi cy ht cam trờn mụi trng MS.
4 - THC HNH
4.1 - Kh trựng v nuụi cy thõn cỳc ct t
a. Kh trựng
THệẽC HAỉNH NUOI CAY MO THệẽC VAT Trang 12
- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một
đoạn cách gốc 10÷15 cm.
- Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy.
- Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn có một chồi ngủ.
- Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 10÷15 phút.
- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1.
- Rửa sạch javel bằng nước cất vơ trùng 5÷6 lần.
b. Ni cấy
- Thân cúc sau khi khử trùng được ni cấy trên mơi trường MS bổ sung BA và
NAA với tỷ lệ NAA/BA <1.
- Cắm thân cúc vào mơi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt mơi trường .
4.2 - Khử trùng và ni cấy hạt cam
a. Khử trùng hạt
- Rửa hạt cam dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước xà phòng 10÷15 phút.
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy.
- Lắc với cồn 70
o

trong 30 giây.
- Rửa sạch cồn bằng nước cất vơ trùng 5÷6 lần.
b. Tách vỏ hạt
- Đặt hạt cam lên trên giấy cấy. Dùng kẹp giữ hạt.
- Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dài hạt. Hai đường này đối diện nhau.
Lưỡi dao chỉ vừa đủ cắt rách lớp vỏ, khơng chạm vào phần thịt hạt.
- Dùng dao và kẹp tách bỏ lớp vỏ cứng (vỏ trấu) và vỏ lụa bên ngồi.
- Hạt cam là hạt đa phơi, khi tách các phơi có thể tách rời nhau. Ta vẫn có thể dùng
những mảnh phơi để ni cấy, mỗi mảnh phơi sẽ phát triển thành một cây cam.
c. Ni cấy
- Đặt ngang hạt cam trên mơi trường MS.
- Dùng kẹp đè nhẹ hạt lên bề mặt mơi trường sao cho ½ hạt nhập vào mơi trường
- Đặt bình ni cấy trong điều kiện ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25
oC
.
5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Phương pháp lựa chọn cơng thức khử trùng.
2. Tại sao phải tách vỏ ngồi (vỏ trấu), vỏ lụa hạt cam trước khi ni cấy?
3. Nếu để bình ni cấy hạt cam trong điều kiện khơng có ánh sáng, phơi có nảy
mầm phát triển được khơng? Giải thích?
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 13
BÀI 4
VI NHÂN GIỐNG DỨA BẰNG NI CẤY CHỒI NGỦ
1 - NGUN TẮC
Đối với một số cây như tre, mía, dứa, phương pháp nhân giống vẫn thường được sử
dụng hiện nay trong nơng nghiệp là nhân giống truyền thống bằng chồi nách, chồi ngầm,
thân ngầm, giâm hom… Tuy nhiên đặc điểm chung của các phương pháp này là hệ số
nhân giống thấp, khơng đáp ứng được nhu cầu về cây giống để mở rộng sản xuất.
Trước nhu cầu của việc mở rộng sản xuất, trong một số năm gần nay để nhân giống
dứa thường tiến hành bằng ni cấy chồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi). Ưu điểm

của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn.
Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa,
sau đó được ni cấy tạo cụm chồi trên mơi trường in vitro. Các chồi có hình dạng giống
như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng. Mỗi chồi được tách
riêng để ni cấy để tạo thành cụm chồi.
2 - VẬT LIỆU – HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu ni cấy.
2.2 - Hố chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Mơi trường MS bổ sung NAA, BA
- Javel
- Xà phòng bột
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15

8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 14
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bơng mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15
19 - Đèn cồn cái 15
20 - Tủ cấy vơ trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi khí vơ
trùng
3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
- Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ.
- Các chồi ngủ được tách rời, ni cấy trên mơi trường MS bổ sung NAA và BA.
4 - THỰC HÀNH
4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ngủ dứa
- Tách bỏ tồn bộ các lá ở phần ngọn dứa. Tách lần lượt các lá từ dưới lên trên, từ
ngồi vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ.
- Tách rời phần cùi (lõi) có mang chồi ngủ.

- Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ.
- Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ.
- Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10
phút.
- Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc các mảnh mơ dứa trong cồn 70
0
trong 2 phút.
- Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút.
- Rửa sạch lại bằng nước cất vơ trùng 5÷6 lần.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 15
Hình 1. Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa
4.2 - Phương pháp ni cấy
- Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy.
- Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mơ dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp.
- Cắm phần đầu hình tháp ngập vào mơi trường ni cấy.
- Đặt các bình ni cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25
oC
.
4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi
Sau thời gian ni cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang mơi trường
ni cấy để tạo cụm chồi. Mơi trường ni cấy có nồng độ chất điều hồ sinh trưởng
NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít. Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi. Số
lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi
(thường là sau 3-4 tháng ni cấy). Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang mơi trường
tái sinh cây hồn chỉnh. Điều kiện ni cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng
4000 lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-27
0
C.
Hình 2. Cách cắt rời chồi ngủ dứa

5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH
1. Trình bày những điểm cần lưu ý khi tách chồi ngủ dứa
2. Trình bày quy trình nhân giống dứa bằng chồi ngủ.
3. Tại sao phải cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mơ dứa có mang chồi ngủ?
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 16
BÀI 5
PHƯƠNG PHÁP NI CẤY TẠO MƠ SẸO THỰC VẬT
1 - NGUN TẮC
Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý
(những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do cơn trùng tấn cơng) thực vật có khả năng
hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó. Những tế bào mới
được hình thành đó là tế bào mơ sẹo.
Mơ sẹo là một khối tế bào nhu mơ phát triển vơ tổ chức, hiện diện trong các giai
đoạn hố lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng
(vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành.
Những tế bào mơ sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt. Khối mơ sẹo có khả
năng tái sinh thành cây hồn chỉnh trong điều kiện mơi trường khơng có chất kích thích
sinh trưởng tạo mơ sẹo.
Ni cấy tạo mơ sẹo được thực hiện đối với các lồi thực vật khơng có khả năng
nhân giống thơng qua ni cấy đỉnh sinh trưởng. Những mơ của thực vật có thể dùng
ni cấy tạo mơ sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phơi nhũ, tế bào diệp nhục,
lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mơ sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm
tế bào mơ sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là ni cấy đỉnh sinh
trưởng.

A B
Hình 3. Sự tái sinh chồi từ mơ sẹo. A: Mơ sẹo, B: Chồi tái sinh.
Mơ sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong q trình tạo cơ quan, nhất là
trong sự tạo rễ. Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mơ
sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành khơng có khả năng tạo mơ sẹo. Sự tạo

mơ sẹo ở thực vật xảy ra khi mơi trường ni cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D)
thích hợp.
Sự tạo mơ sẹo do tác dụng của auxin do 3 q trình:
- Sự phản phân hố của tế bào nhu mơ: xảy ra ở các tế bào nhu mơ mộc và libe, nhu
mơ vỏ hay lõi.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 17
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn
cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin.
- Sự xáo trộn của các mơ phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ).
2 - VẬT LIỆU – HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên mơi trường MS. Sử dụng các cây
con làm vật liệu thí nghiệm.
2.2 - Hố chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Mơi trường MS bổ sung 2,4 - D
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bơng mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15
19 - Đèn cồn cái 15
20 - Tủ cấy vơ trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi khí vơ
trùng
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 18
3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
- Học sinh tiến hành cắt đốt thân, mảnh lá, đoạn rễ cây thuốc lá để ni cấy tạo mơ
sẹo, những đoạn có mang chồi ngủ được ni cấy tái sinh cây.
- Các thành phần này được ni cấy trên mơi trường MS bổ sung 2,4 – D.
4 - THỰC HÀNH
4.1 - Vật liệu ni cấy
a. Mơ cấy từ cây thuốc lá tạo ra qua ni cấy hạt
- Tiến hành khử trùng hạt thuốc lá.
- Ni cấy hạt thuốc lá trong mơi trường MS.
- Bình ni cấy được đặc trong điều kiện tối, nhiệt độ 25
0

C cho nảy mầm.
- Cây con được ni cấy trong điều kiện có ánh sáng.
- Sau 15-20 ngày ni cấy, khi cây có từ 6-8 lá, cao khoảng 10-15cm, có thể sử
dụng là ngun liệu cho ni cấy mơ sẹo
b. Mơ cấy từ cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên
Cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên có sức tăng trưởng mạnh, khả năng hình thành mơ
sẹo rất lớn. Những mơ đặt cấy lấy từ cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên phải trải qua giai
đoạn vơ trùng mẫu để loại bỏ hết nấm, khuẩn tồn tại trong và trên mẫu cấy.
4.2 - Chuẩn bị mẫu cấy
a. Cắt đốt thân
- Dùng kẹp gắp một cây thuốc lá trong bình ni cấy đặt lên giấy cấy.
- Dùng dao mổ cắt rời tất cả lá, rễ ra khỏi thân.
- Cắt thân thuốc lá thành những đoạn nhỏ, mỗi đoạn là một đốt thân. Từ các đốt này,
tiếp tục chia nhỏ thành các đoạn, mỗi đoạn có kích thước khoảng 0,2 – 0,4 cm. Các đoạn
nhỏ này được ni cấy tạo mơ sẹo.
- Điều lưu ý khi cắt các đoạn thân là phải bỏ tất cả các phần mắt của đốt. Các phần
này khơng có khả năng tạo sẹo, chỉ có thể được sử dụng để ni cấy tạo chồi.
b. Cắt mảnh lá
- Từ các lá ở phần trên, sử dụng dao mổ cắt bỏ gân chính và rìa lá.
- Các phần lá này được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 0,2 x 1 cm.
- Các mảnh lá này được ni cấy tạo mơ sẹo.
c. Cắt đoạn rễ
- Sau khi cắt các đoạn thân, lá, phần rễ còn lại được rửa sạch agar trong nước cất vơ
trùng.
- Dùng dao cắt rễ thành các đoạn nhỏ có kích thước 0,2 - 0,4 cm. Các đoạn này được
ni cấy tạo mơ sẹo.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 19
Hỡnh 4. Phng phỏp ct mnh lỏ (A), t thõn (B), on r (C)
4.3 - Nuụi cy to mụ so
a. Nuụi cy thõn, lỏ

- Dựng kp gp cỏc on thõn mnh lỏ cy trờn mụi trng MS b sung 2,4-D.
- Khong cỏch gia cỏc on thõn, mnh lỏ l 1cm. Trỏnh cy quỏ dy.
- S dng mụi trng MS b sung 2,4-D cú nng l 1àmol/lớt mụi trng.
b. Nuụi cy on r
- Cỏc on r c nuụi cy trờn mụi trng MS b sung 2,4-D cú nng 0,1
àmol/lớt mụi trng.
Nhng khi mụ so hỡnh thnh qua quỏ trỡnh nuụi cy cú th c tỏch ra v chuyn
sang nuụi cy cú nng 2,4-D gim (0,05àmol/lớt mụi trng) tip tc phõn chia to
thnh nhng khi mụ so mi. Thi gian cy chuyn gia cỏc ln nuụi cy l 4-6 tun.
Khi mụ so cng cú th c cho tỏi sinh thnh cõy nu mụi trng nuụi cy loi b
2,4-D v b sung BA vo.
5. BI BO CO THC HNH
1. Khỏi nim mụ so? Nguyờn nhõn ca vic hỡnh thnh mụ so thc vt?
2. Vai trũ ca auxin i vi vic hỡnh thnh mụ so thc vt. Nng thớch hp
nht kớch thớch to mụ so t thõn, lỏ, r cõy thuc lỏ.
3. Phng phỏp ct t thõn, on r, mnh lỏ to mụ so cõy thuc lỏ.
THệẽC HAỉNH NUOI CAY MO THệẽC VAT Trang 20
A
B
C
BÀI 6
KỸ THUẬT TẠO ÁO BAO HẠTGIỐNG NHÂN TẠO
1 - Ý NGHĨA
Ở một số loại thực vật như mía, khoai tây, khoai mìm dâu tây đều khơng có khả
năng nhân giống bằng hạt. Bên cạnh đó có nhiều loại thực vật tạo được hạt giống nhưng
hạt giống kém chất lượng hay hạt giống rất đắt. Để giải quyết tất cả các vấn đề trên, một
phương pháp nhân giống mới được nghiên cứu và ứng dụng đó là phương pháp tạo hạt
nhân tạo.
Hạt giống nhân tạo về cơ bản giống như hạt giống tự nhiên. Chỉ có sự khác nhau
là hạt giống nhân tạo có cấu tạo là phơi được bao bọc bởi lớp áo bên ngồi thay cho nội

nhũ, vỏ và phơi ở hạt nhân tạo là phơi vơ tính (phơi soma) (hình 1). Hạt giống nhân tạo
gồm 3 phần (hình 2):
- Phơi vơ tính
- Vỏ bọc polymer như alginat
- Màng ngồi: được cấu tạo từ alginat canxi
Phơi soma ở hạt nhân tạo giống như phơi hợp tử ở hạt tự nhiên là có hai cực (đỉnh
chồi và đỉnh rễ), như thế có thể phát triển thành một cây hồn chỉnh tương tự như hạt nảy
mầm. Cấu trúc phơi soma giống như phơi hợp tử nhưng phơi soma của hạt giống nhân
tạo khơng có vỏ bao hạt cũng như mơ dự trữ.
Hình 5 - So sánh cấu trúc hạt tự nhiên và hạt nhân tạo
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 21
Hình 6 - Cấu tạo hạt nhân tạo
Hạt nhân tạo thườmg có vỏ làm bằng alginat Na và alginat Ca hay B-hydrogel.
Alginat Na là một chất cao phân tử được chiết suất từ rong biển (rong Mơ
Sargassum sp là một loại rong nâu). Trong rong Mơ alginat Na tồn tại dưới dạng alginit
khơng tan là hợp chất của các axid manuronic. Để chiết tách alginat , thường tiến hành
nấu rong với Na
2
CO
3
.
[(C
5
H
7
O
4
COO)
2
Ca]

n
+ nNa
2
CO
3
2[C
5
H
7
O
4
COONa]
n
+ nCaCO
3
Alginat Ca Alginat Na
Alginat Na là dạng tan trong nước. Khi Alginat Na tiếp xúc với dung dịch CaCl
2
,
xảy ra phản ứng trao đổi ion giữa hai dung dịch này theo phản ứng:
2[C
5
H
7
O
4
COONa]
n
+ nCaCl
2

[(C
5
H
7
O
4
COO)
2
Ca]
n
+ 2nNaCl
Alginat Na Alginat Ca
Ở dạng này, alginat Ca kết tủa, trở thành dạng khơng tan, tạo thành màng khơng thấm
nước. Tồn bộ bề mặt của gịot hỗn hợp trên sẽ được bao bọc bằng một lớp áo alginat Ca
khơng thấm nước và tạo thành một hạt. Phần alginat Na bên trong vẫn ở trạng thái tan.
Vỏ hạt nhân tạo được tạo ra theo ngun tắc này.
Hạt nhân tạo có thể bảo quản, tồn trữ và trồng trọt bằng những kỹ thuật canh tác
truyền thống. Và đặc biệt là có thể chủ động trong sản xuất, trồng trọt, canh tác khơng
phụ thuộc vào các điều kiện thời tiết, mùa vụ.
Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tìm hiểu kỹ thuật tạo áo bao cho phơi vơ tính
để cấu thành một hạt giống nhân tạo hồn chỉnh.
2 - NGUN LIỆU - HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Ngun liệu, hố chất
STT Tên hố chất, phụ liệu
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 Alginat Na 4% ml 100

2 Mơi trường MS ml 1000
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 22
Phôi
soma
Nội
nhũ
nhân
tạo
Vỏ
nhân
tạo
STT Tên hố chất, phụ liệu
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
3 CaCl
2
2,5% ml 300
4 Nước cất ml 500
5 Giấy lọc gói 1
6 Phơi vơ tính
2.2 - Dụng cụ, thiết bị cần cho một nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT
Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng

Ghi chú
1 Bình chiết 500ml cái 2 Tạo giọt nhỏ
2 Pipette 10 ml cái 2 Hút và chuyển phơi
3 Kẹp gắp 25cm cái 2 Gắp hạt
4 Phễu lớn cái 2
5 Erlen 500ml cái 2
6 Erlen 250 cái 2
7 Quả bóp cao su cái 2
8 Đồng hồ cá nhân cái 2
9 Đĩa petri cái 2
10 Cốc 1000 ml cái 2
11 Cốc 250ml cái 2
3. NỘI DUNG THỰC HÀNH
- Học sinh tiến hành nhỏ giọt và chuyển phơi tạo hạt
- Học sinh thực hiện ngâm hạt trong dung dịch CaCl
2
và nước để tạo hạt hồn chỉnh
4 – THỰC HÀNH
4.1 – Tạo giọt nhỏ
- Hồ tan 100 ml Alginat Na 4% vào 1 lít mơi trường MS có chứa các mi khống,
đường, vitamin, các chất sinh trưởng. Cho hỗn hợp này vào bình chiết.
- Mở khố nhỏ giọt của bình chiết, nhỏ từng giọt nhẹ nhàng hỗn hợp này vào một
cốc dung dịch CaCl
2
2,5%. Mỗi lần nhỏ, khi giọt dung dịch vừa ló ra ở đầu ống nhỏ giọt
của bình chiết, vặn khố lại để dừng giọt dung dịch ở đầu ống nhỏ giọt
4.2 – Chuyển phơi và tạo hạt
- Dùng pipette hút một phơi trong dung dịch MS chuyển vào trong giọt nhỏ đang
dừng ở đầu bình chiết.
- Mở khố bình chiết để giọt có chứa phơi nhỏ vào trong erlen đựng CaCl

2
.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 23
- Ngâm hạt này trong dung dịch CaCl
2
20 phút, có thể lắc nhẹ erlen.
4.3 – Rửa và làm khơ hạt
- Sau 20 phút, dùng kẹp gắp hạt nhân tạo sang một cốc đựng nước cất. Hạt được
ngâm nước 5 phút để làm cứng và ngăn chận phản ứng.
- Sau 5 phút, dùng kẹp chuyển hạt ra một đĩa petri có lót giấy lọc để làm khơ hạt.
- Hạt sau khi được làm khơ có thể được bảo quản hay sử dụng cho gieo trồng trực
tiếp.
Hình 7. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo
5 - NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
- Tất cả mọi cơng việc tạo áo bao hạt nhân tạo đều phải được thực hiện trong tủ
cấy vơ trùng
- Việc vặn khố của bình cầu nhỏ giọt phải thực hiện cẩn thận để có thể giữ được
giọt dung dịch ở đầu ống.
- Thao tác chun phơi vào giọt nhỏ thực hiện nhẹ nhàng để khơng làm rơi giọt
dung dịch.
- Thời gian ngâm hạt phải chính xác 20 phút.
6. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM
- Làm tường trình thí nghiệm
- Giải thích ngun tắc tạo áo bao hạt giống nhân tạo
- So sánh giữa vỏ hạt giống từ nhiên và hạt giống nhân tạo
- Nêu ý nghĩa và cách bảo quản hạt giống nhân tạo
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 24
Hỗn hợp alginat Na 4 % và môi trường MS
Chuyển phôi vào giọt nhiểu
Tạo màng bao alginat Ca trong 20 phút

Ngâm nước và thu hạt nhân tạo
BÀI 7
PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
1 - NGUN TẮC
Mơ phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng, được bao bọc bởi một lớp
vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất q trình mất nước và lớp cutin này bao bọc
cả chồi đỉnh.
Ở thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu trong các mơ phân sinh đỉnh,
các mơ này phân hố ngay từ những giai đoạn phát triển đầu của phơi và giữ lại trong
suốt đời sống của cây. Điều này xảy ra là do mơ phân sinh có sự phân hố của những tế
bào khởi sinh. Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ các tế bào khởi sinh.
Q trình sinh trưởng của cơ quan diễn ra theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn thứ nhất: thường được gọi là giai đoạn phơi sinh. Trong các
điểm sinh trưởng (trong các mơ phân sinh đỉnh) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự
phân chia đầu tiên của nó thành các mơ riêng biệt.
- Giai đoạn thứ hai: giai đoạn dài ra do sự sinh trưởng nhanh chóng, mầm
cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.
- Giai đoạn thứ ba: giai đoạn kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu sự hố gỗ
các thành tế bào, xuất hiện ở trên đó những chỗ dầy lên có cấu tạo và kết quả là khơng
còn khả năng tiếp tục sinh trưởng.
Ở mỗi nách lá đều có chồi nách. Chồi nách thực chất có cấu tạo khơng khác đỉnh
sinh trưởng của thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi nách khơng phát triển, nhưng khi
được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng, chúng có cấu tạo lá đầy đủ như thân chính.
Q trình sinh tổng hợp DNA của virus thực vật khơng xảy ra trong tế bào đỉnh
sinh trưởng do một cơ chế hiện nay khơng rõ. Vì vậy mơ đỉnh sinh trưởng là mơ duy nhất
sạch virus. Do đó trong kỹ thuật ni cấy mơ tế bào, mơ đỉnh sinh trưởng được sử dụng
là vật liệu ni cấy mơ tế bào nhằm tạo các cây khơng nhiễm virus và các loại vi khuẩn
hay nấm gây bệnh.
Ni cấy đỉnh sinh trưởng là phương pháp nhân giống quan trọng vừa tạo ra
những loại cây trồng sạch vius vừa có hệ số nhân giống rất cao. Phương pháp này đã áp

dụng hiệu quả đối với cây thân thảo như cúc, cẩm chướng, khoai tây, khoai lang, chuối
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 25