Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

Tiểu luận: KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
Nhóm 12
MỤC LỤC
A, ĐẶT VẤN ĐỀ
B, NỘI DUNG
I, Protoplast là gì? Thế nào là lai tế bào soma?
II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn thành.
III, Các kỹ thuật cụ thể
1, Kỹ thuật tách tế bào trần
2, Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần
3, Kỹ thuật dung hợp tế bào trần
IV, Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma
1.
Triển vọng của phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần là rất lớn
2.
Một số ứng dụng khác
V, Tồn tại của kỹ thuật protoplast
VI, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần
C, KẾT LUẬN
1
A.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với công nghệ gene, thì công nghệ nuôi cấy mô tế bào ngày càng phát
triển và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp. Công nghệ nuôi
cấy mô có vai trò rất quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng không
bị nhiễm bệnh, tạo ra các nguồn nguyên liệu di truyền phong phú hay các sản
phẩm chuyển gen mang các đặc tính mong muốn, cho phép mở rộng nguồn gen
của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di
truyền ưu việt của cả bố và mẹ. Một trong những kỹ thuật để chứng minh được
điều đó là “kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần”
Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần đã bắt đầu được ứng dụng rộng

rãi để tạo ra các cây trồng mới hoặc có sản lượng và chất lượng cao hơn, hoặc
là có thêm khả năng kháng bệnh. Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều
lình vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất
đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi sinh
vật. Sau đây chúng ta cùng tìm hiểu kỹ hơn về vấn đề này.
2
B.
NỘI DUNG
I, Protoplast là gì? Thế nào là lai tế bào soma?
v
protoplast
Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào, chỉ còn màng
sinh chất bao bọc khối tế bào chất và nhân tế bào.
Tế bào trần được tách ra từ các mô hoặc các cơ quan khác ở cây như lá, rễ, mô sẹo
nuôi cấy in vitro.
Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế
bào mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzyme:
Pectinase phân hủy pectin, celluloase phân hủy cellulose, hemicellulase phân hủy
hemicellulose.
Đặc điểm của tế bào trần là nếu để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5- 10 ngày
sẽ tạo vách tế bào và phân chia.
v
Lai tế bào soma
Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với nhau sẽ tạo thành một tế bào, đó gọi là
hiện tượng dung hợp tế bào trần.
Nếu các tế bào trần có nguồn gốc từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc các
giống, loài hoặc chi khác nhau dung hợp với nhau gọi là hiện tượng dung hợp tế
bào soma hay lai soma.
II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn thành
So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì nuôi cấy tế bào trần

thường yêu cầu 1 số thay đổi, do bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường
3
liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ,
vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để
kích thích sự phân chia tế bào.
Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi cấy các tế bào vẫn còn
thành tế bào:
Ø
Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế bào không có màng
cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một đơn vị thể tích
môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bàon/1ml môi trường).
Ø
Tế bào trần có khả năng tái sinh rất mạnh,ví dụ tế bào mô thịt lá ở thuốc lá,
cải dầu…. Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể tạo ra các tế bào biến
đổi gen. Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào
thành cây hoàn chỉnh. Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào vẫn còn thàh
tế bào.
Ø
Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế
bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản.
Ø
Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung hợp tế bào - gắn hai tế bào trần
lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào, tạo nên
một thể lai vô tính mà không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các
gen, ít tốn kém, nhanh, trực tiếp và áp dụng kĩ thuật chuyển gen ( bơm ADN,
hóa thấm, điện thấm…) giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạp cây lai hữu
thụ. Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện
phức tạp.
Ø
Tế bào lai thu đực từ dung hợp hai tế bào trần, được tái sinh và phát triển

thành một cây lai. Quá trình này được thực hiện trên tế bào nên được gọi là
lai tế bào và thông qua tế bào soma nên còn gọi là lai soma hay lai vô tính tế
4
bào. Từ phương pháp này để phát sinh ra phương pháp lai xa giữa các loài -
điều không thể thực hiện được bằng phương pháp lai hữu tính thông thường.
Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một số trở ngại, đó là:
Ø
Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện.
Ø
Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp.
III, Các kỹ thuật cụ thể
v
Kỹ thuật tách tế bào trần.
v
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần (2 giai đoạn: tế bào trần tái
sinh thành tế bào, hình thành phát sinh cơ quan).
v
Kỹ thuật dung hợp tế bào trần.
1. Kỹ thuật tách tế bào trần: Có mức độ thành công phụ thuộc vào bản chất
nguyên liệu ban đầu. Phương pháp tách ảnh hưởng lớn đến sức sống của tế bào
trần và do đó liên quan đến quá trình nuôi cấy sau này
a- Nguyên tắc: Enzyme xenlulolaza, pectinaza và hemixenluloza để phân
giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần. Sau khi thành tế bào được tách
ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để
tránh nước xâm nhập vào không bào,gây vỡ tế bào chất, bằng việc bổ sung các chất
tạo áp suất thẩm thấu như saccrose, manitol…Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu
và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho thích hợp với từng đối tượng cây trồng.
Enzyme Xenllulolaza Enzyme pectinaza
5
b- Các bước tiến hành:

i.
Chọn nguyên liệu: nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần phải thu từ
những cây có trạng thái sinh lý tốt.
•
Nếu nguyên liệu có nguồn gốc ex vitro thì phải từ những cây không
bị xử lý thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ. Mô lá non thu được cần phải khử trùng.
•
In vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù. Những lá được tạo ra trong
nuôi cấy in vitro là những vật liệu ban đầu lý tưởng cung cấp môt lượng lớn các tế
bào trần khỏe mạnh.
ii.
Xử lý gây co nguyên sinh chất: Trước khi thành tế bào bị loại bỏ, các tế
bào cần được ngâm trong dung dịch với mục đích gây co nguyên sinh
chất.
Các dung dịch thường được sử dụng như: manitol hoặc sorbitol 12 - 14% (W/
v), đường saccarozo 0.2 M, polyvinyl pyrrolydon 2%(W/v).
Không nên dùng các dung dịch có nồng độ quá thấp có thể dẫn đến những tế
bào trân đa nhân do dung hợp tự phát của hai hay nhiều tế bào trần trong quá trình
tách chiết.
Việc xử dụng nguồn mẫu in vitro sẽ thuận lợi hơn khi các tế bào được nuôi trên
môi trường tương tự như nuôi cấy tế bào trầntrước khi xử lý với enzyme, giúp đảm
bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu và môi trường các ion trong quá trình tách
chiết
iii.
Các tế bào trần có thể được tách bằng phương pháp cơ học hoặc bằng
phương pháp enzyme
•
Phương pháp cơ học, mẫu được cắt hoặc nghiền nhỏ và đưa vào
dung dịch gây co nguyên sinh chất, làm cho phần co nguyên sinh chất nhỏ lại. Sự
6

phản co nguyên sinh chất tiếp theo sẽ làm giãn nở và đẩy phần nguyên sinh chất ra
khỏi tế bào qua những khe hở.
Phương pháp cơ học nhìn chung khá phức tạp và số lượng các tế bào trần có
thể tồn tại độc lập là rất ít.
•
Phương pháp dùng enzyme: được thực hiện từ đầu những năm
1960. Bằng xử lý enzyme có thể thu được một số lượng lớn các tế bào trần .
Thường phải dùng cả ba loại enzyme: Xellulolaza, hemixelluloza, pectinaza.
Có hai phương pháp xử lý enzyme:
- Enzyme hỗn hợp dùng cả xellulolaza, hemixelluloza, pectinaza.
- Enzyme kế tiếp mẫu lá thực vật được xử lý với pectinaza để làm nới lỏng
thành tế bào, tiếp theo cắt bằng enzyme xellulolaza, hemixelluloza
Cả hai phương pháp đều có một số ưu điểm và nhược điểm nhưng phương
pháp enzyme hỗn hợp được sử dụng nhiều hơn cả
iv.
Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm
v.
Xác định chất lượng của tế bào trần: khi quan sát dưới kính hiển vi, các
tế bào đều có dạng hình cầu, điều này cho thấy thành tế bào đã bị loại
bỏ bởi sự phân cắt của những enzyme. Tuy nhiên vẫn còn những mảnh
7
thành tế bào còn sót lại làm ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu sau này.
Để phát hiện thành tế bào cách tốt nhất là dùng calcofluor. Calcofluor sẽ
bám vào các phần tử xellulozơ. Cho 1 ml dung dịch calcofluor( dung dihj 1% pha
trong nước cất) vào 20 ml môi trường chứa tế bào trần. Calcoflour sẽ bám vào các
phân tử xellulozơ và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi
soi dưới tia cực tím. Nếu các tế bào trần đã bị loại cellulose thì hiển vi trường có
màu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh
sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể.
Để xác định được khả năng sống sót của tế bào trần có thể quan sát trực tiếp

huyền phù tế bào trần dưới kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x. Tế bào chất của
những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển đông tròn, trông như các hạt
nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống.
Ngoài ra còn một số phương pháp khác để kiểm tra sức sống của tế bào dựa
vào các đặc tính lý học và sinh lý học liên quan đến tế bào sống.
Phần lớn những phương pháp này dựa trên hoạt tính enzyme hoặc tính thấm
của màng sinh chất đối với các hóa chất chỉ thị như chất màu thuốc nhuộm. Một
trong những phương pháp này là sử dụng: fluorescein diacetat (FDA) để kiểm tra
tỷ lệ phần trăm tế bào trần còn sống sau khi tách chiết. FDA được dùng ở thể tích
0.8 ml dung dịch( dung dịch 0.05%) với 20 ml môi trường chứa tế bào trần. Khi
soi dưới ánh sáng tử ngoại, các tế bào trần còn sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang
màu xanh, những tế bào trần có màng sinh chất bị phá hủy sẽ có màu xẫm hoặc
màu tối. Quan sát ít nhất 50 tế bào trần và xác định tỷ lệ % các tế bào trần còn sống
sau khi tách từ mẫu thực vật.
8
Một phương pháp khác là kết hợp kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với
nhuộm xanh Evan để xác định sức sống của tế bào trần. Trộn 2ml dung dịch thuốc
nhuộm 1% với 10ml môi trường tách tế bào trần. Lấy 0.25 ml huyền phù tế bào
trần và đưa vào 1ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút sau đos quan sát
dưới kính hiển vi huỳnh quang. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho
thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, ngược lại những tế bào có màng
sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được
2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần: Thường chia làm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: nuôi cấy để tế bào trần tái sinh thành tế bào và phân chia tạo cụm
nhỏ tế bào: nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện sáng yếu, trong môi trường lỏng
có lắc hay môi trường bán lỏng. Môi trường cần giàu dinh dưỡng và chất phù hợp.
Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ dưỡng
Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi cấy trong
điều kiện chiếu sáng với quang chu kì phù hợp, trên môi trường đặc. Cần chú ý
hàm lượng và tỷ lệ auxin và xytokinin để tái sinh được cây từ callus

3. Kỹ thuật dung hợp tế bào trần
Sơ đồ nguyên tắc dung hợp tế bào trần
9
Có hai loại dung hợp:
•
Dung hợp đối xứng (sysmetric): khi dung hợp 2 tế bào trần cùng có
nhân ở mức bội thể như nhau.
Ví dụ: khoai tây (2X) + khoai tây (2X) khoai tây (4X)
•
Dung hợp không đối xứng (asyametric): tạo ra thể lai tế bào chất hay
còn gọi là Cybrid. Ở đây chủ yếu là trộn tế bào chất để chuyển nạp các vật chất di
truyền tế bào chất( AND của ty thể và lạp thể). Một trong hai tế bào trần sẽ bị diệt
nhân trước khi dung hợp. Kết quả tạo ra các thể heteroplastid
a- Phương pháp dùng hóa chất: có nhiều hóa chất được sử dụng để kích
thích dung hợp tế bào trần thực vật bao gồm: NaCl, KCl, NaNO
3
, dextran sunfat,
polyvinyl alcohol…
10
ü
Xử lý với NaNO
3
: đây là phương pháp ra đời sớm nhất và ngay từ năm
1970, hai tác giả Cummins và Cocking đã dung hợp thành công tế bào trần tách từ
đầu rễ của ngô và yến mạch.
Để cảm ứng dung hợp, các tế bào trần được xử lý với hỗn hợp dung dịch có
5,5% NaNO
3
và 10% saccarozơ, trong 30 phút,ở nhiệt độ 35
0

C. Tần số dung hợp
theo phương pháp này rất thấp, đặc biệt là những tế bào trần đã bị không hóa mạnh

ü
Xử lý với nồng độ Ca
2+
cao và pH cao: Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt
lá được ủ trong môi trường kiềm mạnh có 0,05M CaCl
2
, 0,4M 9%(W/w) manitol,
pH cao(8-10) và ly tâm nhẹ ở 50g trong 3 phút, tiếp theo đem ủ trong nước ở nhiệt
độ 37
0
C trong 45 phút. Bằng phương pháp này, Keller và Melchers(1973) đã dung
hợp thành công tế bào trần tách từ mô dậu của 2 dòng thuốc lá. Tuy nhiên giá trị
pH cao có thể gây độc cho tế bào trần của một số loài thực vật( Kao và Wetter,
1977)
ü
Xử lý với poliethylen glycol (PEG): PEG là một polymer, do đó khối
lượng phân tử phụ thuộc vào các điều kiện phản ứng trùng hợp: PEG 1540 (MW
1300 -1600), PEG 4000 (MW 3000 - 5000), PEG 6000 (MW 6000 - 8000).
Thường dùng dung dịch PEG 6000 có nồng độ 20 - 30% (W/v) để xử lý các tế bào
11
trần trong 10 - 30 phút.
Theo Wallin và cộng sự (1974), PEG được ứng dụng rộng rãi trong dung
hợp tế bào trần thực vật do có đôc tính thấp , đồng thời có tác dụng với hầu hết các
kiểu tế bào.
Kao và Michayuk (1974) là những tác giả đầu tiên dùng PEG để dung hợp
tế bào trần giữa đỗ tương và thuốc lá, đỗ tương và ngô, nhưng tần số dung hợp
thấp. Khi sử dụng PEG với nồng độ ion Ca

2+
cao (0,05M CaCl
2
.2H
2
O) và giá trị
pH cao sẽ cho kết quả tốt hơn dùng PEG riêng rẽ, có thể đạt tới 10-15%. Phương
pháp này là sự kết hợp giữa phương pháp dùng PEG nguyên thủy của Kao và
Michayluk (1974) với phương pháp sử dụng ion Ca
2+
và pH cao của Keller và
Melcher(1973).
Theo nhiêu tác giả, phương pháp kết hợp được cho là khá hiệu quả trong
dung hợp tế bào trần thực vật (Melcher và cộng sự 1978, Hoffman: 1978, 1979)
Dung hợp tế bào bằng PEG
12
b- Phương pháp xung điện:
Zimmerman (1982) là người đầu tiên đề xướng phương pháp dung hợp tế
bào trần nhờ xung điện. Trong phương pháp này sự dung hợp xảy ra khi các tế bào
trần được đưa vào điện trường có điện thế cao (500 - 1000V/cm) trong một thời
gian phát xung cực ngắn (5 - 6/1000giây).
Nguyên tắc: Các protoplast tích điện nên dịch chuyển trong điện trường và
tạo chuỗi giữa hai thanh điện cực, dùng xung điện để làm thủng màng của hai
protoplast sát cạnh nhau khiến chúng hòa trộn vào nhau
Thiết bị: Máy tạo xung điện, kính hiển vi đảo pha, buồng dung hợp
Tạo điện trường: Đặt trong buồng dung hợp các điện cực platin có khoảng
cách 0,2-1mm và nối với nguồn điện có hiệu điện thế 200V/cm
Tạo xung: U 500 - 1000V/cm ,thời gian cực ngắn 1- 200 miligiây
Hiệu quả dung hợp cao tuy nhiên đầu tư thiết bị lớn
13

IV. Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma
1. Triển vọng của phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần là rất
lớn.
ü
Sau khi loại bỏ thành tế bào và được nuôi cấy trên môi trường thích
hợp, những tế bào trần được tái tạo nhanh chóng thành tế bào mới và quá trình phát
triển này đưa ra một hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào
(Willison và Cocking, Grout 1973)
ü
Các tế bào trần có khả năng tiếp nhận các vật liệu từ bên ngoài đưa vào
trong tế bào. Do đó, tế bào trần là đối tượng thích hợp cho các nghiên cứu đưa
nhân lạp thể, ti thể, DNA, Plasmit vào tế bào (Dodds và Bengochea 1985)
ü
Quần thể tế bào trần có thể xem như một hệ thống tế bào đơn. Do vậy
các thao tác tương tự như đối với các vi sinh vật qua đó có thể lựa chọn dòng đột
biến và tách dòng quần thể tế bào thực vật (Evans và Cocking 1977)
14
Sự dung hợp tế bào trần nhờ xung điện cao áp
2. Một số ứng dụng khác:
ü
Sản xuất các dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai.
ü
Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào trong môi
trường lỏng(nuôi lắc, nuôi trong bioreactor).
ü
Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho những cây có giá trị kinh
tế cao, nhưng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường.
ü
Nhờ kỹ thuật dung hợp người ta có thể lai tạo giữa hai loài thực vật
khác nhau, thậm chí cả các loài thuộc những chi khác nhau.

ü
Nuôi 2 dòng tế bào sinh dưỡng khác loài trong cùng một môi trường, có
sự kết dính ngẫu nhiên của hai hay một số tế bào khác loài của tế bào lai chứa bộ
NST của hai tế bào gốc. Phương pháp này có thể tạo ra những cơ thể có nguồn gen
khác xa nhau mà lai hữu tính không thực hiện được.
ü
Kỹ thuật dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen của các loài
thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt
của cả bố và mẹ.
ü
Nhiều cây lai được tạo ra bằng phương pháp dung hợp tế bào đã có được
năng lực chống cỏ dại hoặc chống nấm bệnh.
ü
Tạo điều kiện thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào: tính thấm của
màng, vận chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực vật…
ü
Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy tế bào trần là vi nhân
giống thực vật. Sau khi phân chia protoplast, thành tế bào được tái sinh để tăng sự
phát triển callus và tiếp theo là cây hoàn chỉnh nhờ đó thực vật có thể được nhân
lên nhiều lần.
ü
Nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật
Bằng kỹ thuật tách tế bào trần, trong tương lai, có thể tạo ra những cơ thể
lai có nguồn gen rất khác xa nhau mà bằng lai hữu tính không thể thực hiện được,
15
có thể tạo ra những cơ thể khảm mang đặc tính của những loài rất khác nhau,
thậm chí giữa thực vật với động vật.
V, Tồn tại của kỹ thuật protoplast
Kỹ thuật protoplast đã thu được thành công ở các loài thuộc họ cà
(Solanaceae) và một số họ khác, nhưng thành công ở họ hòa thảo (Poaceae) là họ

của các cây trồng ngũ cốc chính còn rất hạn chế.
Potrykus (1980) đã thảo luận rất kỹ về vấn đề này. Theo Potrykus có những
chỉ tiêu sau liên quan đến kết quả nuôi cấy và tái sinh từ protoplast tiềm lực in
vitro:
1. Phân lập
ü
Cơ sở di truyền của tế bào (khả năng tiềm tàng của tế bào trong nuôi cấy
in vitro).
ü
Tương tác tế bào trong cây.
ü
Cơ chế phân hóa trong quá trình phát triển cơ thể.
ü
Nguồn gốc cơ quan và cây hoàn chỉnh.
ü
Trạng thái sinh lý của tế bào.
ü
Tác động của quá trình phân lập.
ü
Tác động của trạng thái phân lập.
2. Điều kiện nuôi cấy
ü
Nhu cầu dinh dưỡng.
ü
Nhu cầu về phytohormone.
ü
Điều kiện vật lý của nuôi cấy.
ü
Các yếu tố ức chế có thể xuất hiện.
ü

Tác động của mật độ quần thể tế bào
16
3. Sự phân bào
ü
Sinh tổng hợp thành tế bào.
ü
Điều khiển sinh tổng hợp thành tế bào.
ü
Chức năng của thành tế bào đối với phân bào.
ü
Điều khiển sự phản phân bào.
ü
Điều khiển sự phân chia nhân.
ü
Điều khiển phân bào.
4. Sự phân hoá
ü
Điều khiển phân hóa tế bào.
ü
Tương tác tế bào trong nuôi cấy.
ü
Điều khiển và cơ chế tạo kiểu mô.
Điều khiển quá trình tạo cơ quan, phôi
VI, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần
v
quy trình nuôi cấy protolast từ lá cây của cây thuốc lá
Nguyên liệu thực vật: lá cây
Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực
vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất.
Phương pháp cơ bản để tách protoplast từ lá cây:

i.
Khử trùng mẫu lá
ii.
Ngâm mẫu lá trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất.
iii.
Tách lớp mặt dưới lá.
iv.
Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzyme.
v.
Tinh sạch tế bào trần.
vi.
Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp hoặc dung hợp hay chuyển
nạp gene.
vii.
Lá của cây thuốc lá in vitro được sử dụng làm nguyên liệu tách protoplast.
Sử dụng các lá được tách trong ngày.
17
Các bước phân lập protoplast từ lá cây
a, Chuẩn bị môi trường
Dung dịch enzyme tách protoplast:
+ Onozuka cellulose R10 0,5%
+ Onozuka macerozyme R10 0,1%
+ Mannitol 13,0%
+ pH môi trường ̴ 5,8
Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Milipore loại có đường kính lỗ lọc
0,2 – 0,25 µm.
b. Tiến hành
Ngày thứ nhất:
+ Các mẫu lá thuốc lá in vitro được lọai bỏ hết gân lá và đặt trên đĩa petri thủy
tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá.

+ Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml
dung dịch enzyme tách protopast. Bọc cóc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và
đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút).
Ngày thứ hai:
+ Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng ( Ø = 65µm) đặt
trong cốc loại 50ml.
+ Bổ sung thêm 3ml dung dịch rửa (Pl + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh
lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc l. Chuyển hỗn hợp protoplast - enzyme
(tổng cộng 15ml) vào tube ly tâm loại 15ml và ly tâm 50×g trong 10 phút.
+ Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch tách
(Pl + 20% sucrose), them 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và
protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha
(nhỏ từ từ dung dịch rửa lên thành tube tránh bắn tung tóe lên dịch rửa bên dưới),
ly tâm 50×g trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch.
18
+ Dùng micropipette hút lớp protoplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và
chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, them 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại.
Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên.
+ Rửa protoplast them một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa. Loại bỏ phần nổi
trên mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1ml môi trường nuôi cấy
protoplast (PC).
+ Đặt một giọt protoplast lên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast
(số lượng tế bào/số ô đếm × 10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng
50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô
trùng. Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28˚C.
Ngày thứ ba:Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sang yếu ( 10 - 20µmol.sec/m2) hoặc bọc
một lớp vải thưa dưới đèn huỳnh quang ánh sang trắng, với chu kì chiếu sang 16
giờ, nuôi trong hai ngày.
Ngày thứ năm:Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sang cao hơn (50 – 75 µmol/
sec/m2) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra

Ngày thứ bảy: Ta có được kết quả của việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia
từ tổng số tế bào ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu
hiệu của sự nhiễm bản không.
C, KẾT LUẬN
Tóm lại kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có vai trò rất quan trọng và có
triển vọng rất lớn. Đặc biệt kỹ thuật dung hợp có thể lai tạo giữa hai loài thực vật
khác nhau, thậm chí cả những loài thuộc chi khác nhau, tạo ra sự phong phú về
nguồn gen thực vật.
Vì vậy, chúng ta cần phát huy những thế mạnh của kỹ thuật này trong ứng dụng
chọn tạo giống cây trồng và nhiều các lĩnh vực khác
19
20