TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT: Biến dị dòng vô tính (biến dị soma) trong nuôi cấy in vitro

TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Chủ đề: “Biến dị dịng vơ tính (biến dị soma) trong ni
cấy in vitro”
A- ĐẶT VẤN ĐỀ
Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp
nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các
giống ưu tú. Tuy nhiên, với thời gian các cơng trình nghiên cứu ở nhiều lồi cây trồng có giá
trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường
xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại
trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh.
Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình ni cấy được gọi là biến dị dịng soma
(somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi
lồi cây, kiểu gene trong lồi và mơ cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính
ổn định của genome.
Như vậy bản thân ni cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới
mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây
trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus,
bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng
bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng sương mai ở khoai tây (Shepard và
cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996).

B- NỘI DUNG
I.

Khái niệm

1. Biến dị
Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động của các yếu tố môi
trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền
Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân cơ bản của

tiến hóa và là nguồn nguyên liệu cho chọn giống.
2. Biến dị dòng soma (biến dị dòng vô tính)
Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể
hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981).
Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà chua, mía,
họ cải… bao gồm đầy đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh
trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác
Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dịng vơ tính.


Biến dị soma là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do những tác động của
các yếu tố mơi trường và do q trình tái tổ hợp di truyền.Biến dị soma tạo ra nguồn đa dạng to
lớn ở các cá thể sinh vật là nguyên nhân cơ bản của tiến hóa và nguồn nguyên liệu cho chọn
giống.
Biến dị kiểu gen + thường biến = biến dị dòng tế bào soma
II.
Ưu và nhược điểm của biến dị soma
1. Ưu điểm
- Cùng lúc khảo sát được 1 khối lượng lớn hàng triệu tế bào trong 1 không gian môi
trường hẹp chẳng hạn trong đĩa petri, đồng nhất và cùng chịu 1 áp lực chọn lọc chủ
định thích hợp , dễ dàng tiến hành theo qui trình cơng nghiệp
- Các biến dị sinh ra trong nuôi cấy mô không gặp phải những cản trở về mặt xã hội,
đạo đức như các cây trồng chuyển gen.
- Có tiềm năng nhất định trong công tác cải tiến giống cây trồng, đặc biệt là các cây lâu
năm vốn bị cản trở bởi nền di truyền hẹp và chu kì tái sinh dài
- Xác định các biến dị trong nuôi cấy mô:
+ Xác định bằng biotest
+ Phân tích AND qua các chỉ thị phân tử
+ Xác định qua kiểu hình

-

Tạo ra một số kiểu hình mới khơng thể tạo ra bằng phương pháp truyền thống


2. Nhược điểm
- Một số biến dị dòng soma kết hợp với 1 hay 1 số tính trạng khơng mong muốn như
lệch bội , bất dục. Hoặc 1 số biến dị soma khác lại có thể xảy ra ở các tính trạng nơng
học có ích, làm mất đi những tính trạng tốt cần lưu giữ.
- Nhiều đặc điểm biến đổi khơng theo ý muốn
- Nếu sử dụng dịng tế bào để ni cấy lặp lại nhiều lần thì tỉ lệ tái sinh thành cây giảm
- Một số dòng biến dị dịng soma khơng ổn định và khơng được truyền cho đời sau
III.

Phân loại biến dị dòng soma

Biến dị kiểu gen (genetic hay heritable variation)
Biến dị kiểu hình (epigenetic hay phenotypic)
1. Biến dị kiểu gen
Là các biến dị có khả năng di truyền xảy ra với tỷ lệ rất thấp và không có tính thuận
nghịch.
Bản chất: Chưa được làm sáng tỏ.
Bao gồm 3 loại: Đột biến hệ gen, đột biến NST và đợt biến gen.
•

Đợt biến hệ gen
Là các biến đởi về số lượng NST. Loại phổ biến là sự sai khác về số lượng NST như đa bội,
dị bội hay thể khảm. Các loài có độ bội thể cao và nhiều số lượng NST cao dễ bị biến đổi hơn
các loài có mức độ bội thể thấp và ít NST. Biến đổi này xảy ra thường xuyên trong nuôi cấy tế
bào, đặc biệt trong nuôi cấy tế bào trần.

Những biến đổi này có thể xảy ra ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, do sự phân
tách NST không bình thường ở những chu kỳ tế bào đầu tiên.

Hình 1: Thể đa bội ở dưa hấu
•

Đợt biến NST


Là các biến đổi về cấu trúc NST, các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng như: Mất
đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo ra các NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổi
trong quá trình giảm phân.
Những biến đổi này có thể ảnh hưởng tới kiểu hình ở Ro và các thế hệ tiếp theo.
•

Đợt biến gen (đợt biến điểm)
Là các biến đởi ở mức độ phân tử: sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản
sao của một trình tự đặc thù, sự thay đổi trong thể hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của
các gen nhảy (transposable elements). Sự xuất hiện các đột biến này về cơ bản mang tính ngẫu
nhiên.
Những tính trạng đột biến thu được ở những cây tái sinh Ro và cũng được di truyền cho các
đời sau.
•

Biến dị kiểu hình
Các biến dị kiểu hình thường liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của một
gen nhất định. Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gen. Các biến dị kiểu hình
thường xuyên xuất hiện ở các cây tái sinh sau nuôi cấy như là kết quả của các phản hồi về mặt
sinh lý.
Các thay đổi về kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi

trạng thái ban đầu. Tuy nhiên, chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của các cây tái sinh.
Nguyên nhân: Chưa được tìm hiểu rõ nhưng chắc chắn có liên quan đến một vài thay đổi
trong quá trình biểu hiện gen.
Hiện tượng khuếch đại gen cũng làm thay đổi hệ gen. Ví dụ như ở cỏ linh lăng đã thu được
dòng tế bào có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ photphinotrixin Tăng 20 lần so với bình thường.
Thuốc này có tác động ức chế enzym glutaminsythetase. Phân tích cho thấy, gen kiểm tra
enzyme này được khuếch đại 4-11 bản, làm tăng hoạt tính phiên mã lên 8 lần.
Hiện tượng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trưởng của các cây tái sinh khi trồng trên đất.
Biểu hiện này có thể liên quan đến việc trở lại của trạng thái trẻ hóa hoặc quá trình loại bỏ virus
khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu. Các ví dụ khác thuộc nhóm này gồm hiện tượng ra hoa sớm, bạch
tạng, các thay đổi về hình dạng, màu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây…


Hình 2: cây ngơ bị bạch tạng

IV.

Hình 3: cây chuối lùn

Nguyên nhân gây biến dị dòng soma

Bất kỳ một yếu tố có khả năng có thể dẫn đến các thay đổi di truyền đều được xem như là
một nguyên nhân gây ra các biến dị này.Các yếu tố này chia làm ba nhóm: sinh lý, di truyền, hóa
sinh.
Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma là:
-

Tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu

-

Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy in vitro.

1. Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy
Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đơn tính, từ hạt hay cây con được xem như là đồng
nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình giống nhau. Tuy nhiên, các mẫu cấy này
thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau như là ploem, xylem, nhu mô, mô vỏ… Những
tế bào này có mức độ bội thể khác nhau. Nói cách khác, có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bào
trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng này được gọi là đa bội vô tính (polysomatic).
Ngoài ra, nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô
có cấu trúc di truyền khác nhau được phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột
biến. Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở cây thân gỗ.
Sự sắp xếp các mô khác nhau về mặt di truyền trong meristem của thực vật ảnh hưởng
đến tính ổn định của các thể khảm. Các cây ở dạng thể khảm có mức độ biến dị di truyền cao khi
nuôi cấy in vitro.


2. Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy
 Phương thức nhân giống in vitro:
Các phương thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau.
Nhìn chung, nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào thì cơ hội để xuất hiện các biến dị
soma thường là lớn hơn rất nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào. Các quá trình nuôi
cấy callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều biến dị soma.

 Loại mẫu cấy:
Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau. Các mẫu cấy có
nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độ biến dị
thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay
protoplast.
Khả năng xảy ra các biến dị soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ. Các

dòng già hơn thường ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn dòng trẻ hơn.
Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều thì có tính biến dị càng cao.
 Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng sử dụng
Cho các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4 D hoặc 2,4,5
T thường gây ra các sai khác trong cây tái sinh.
Ví dụ như: các cây dầu dừa tái sinh từ callus nuôi cấy dài ngày trên môi trường có chứa 2,4
D có tỷ lệ rất lớn các biến dị khi trồng trên đồng ruộng


Sau 6 tuần nuôi cấy trong môi trường bổ sung
1.65 mg/l TDZ and 0.2 mg/l 2,4D.

Sau 6 tuần nuôi cấy trong môi trường bổ sung
3.0 mg/l BAP và 0.2 mg/l IBA.

 Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển
Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitro cũng như tăng số lần cấy chuyển cũng sẽ
làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma.
Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự thay đổi của các kiểu methyl hóa bình thường
của ADN genome
V.

Cơ chế tạo biến soma

 Sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của ADN genome.
Quá trình methyl hóa là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là Adenine hay
Cytosin – có một nhóm methyl gắn liền với nó. Khi quá trình methyl hóa xảy ra như vậy trong
một vùng mã hóa ADN cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và gen bị bất hoạt. Việc
bất hoạt gen do quá trình methyl hóa có thể không được nhận biết về mặt hiện tượng mặc dù quá
trình này đã được tìm thấy trong nuôi cấy mô ở một số loài như ngô, khoai tây và nho.

 Sự sắp xếp lại của NST
Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của biến dị di truyền thể hiện ở
các dòng soma. Ví dụ: Khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong NST, một số ý kiến
cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị nhiễm sắc là nguyên nhân chính dẫn đến các biến dị dòng
vô tính ở ngô và đậu.
 Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị

Sự tách ra hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc các gen cấu
trúc ở gần nó. Hơn thế, sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự sắp
xếp của các trình tự nucleotide. Chúng là nguyên nhân của các biến đổi trong biểu hiện gen cấu
trúc NST. Các nhân tố chuyển vị như Tnt2 trong thuốc lá được hoạt hóa trong nuôi cấy mô.


Nhân tố chuyển vị Ac-Ds ở ngô

 Đột biến điểm
Chúng có thể là đột biến lặn hay trội. Các đột biến gen đã được tìm thấy ở cây cà chua (13
đột biến gen đơn khác nhau ở 230 cây tái sinh), lúa mỳ, thuốc lá.

VI.

Chọn lọc dòng tế bào soma
1. Nguyên tắc chọn lọc tế bào

a. Chọn trực tiếp
Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc có thể chọn được
từ quần thể tế bào.Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc khối
callus.

Điều kiện chọn lọc là các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh
trưởng của tế bào. Thông thường, người ta trộn tế bào và môi trường thạch chứa dược tố và chọn
những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo hoặc cây trực tiếp lên mơi trường chọn
lọc chứa đợc tớ.
Ví dụ: các dịng kháng kháng sinh, chống chịu muối có thể tiến hành theo cách này

b. Chọn gián tiếp:
Trong trường hợp này, đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế
bào.
Ví dụ: enzym nitrate reductase (NR), trên mơi trường chứa ClO3- những tế bào có NR sử
dụng ClO3- như NO3-, và khử thành ClO2-, ClO2- tác dụng như một độc tố cho nên chỉ những tế
bào khơng có NR mới sống sót trên mơi trường chọn lọc.

c. Chọn tổng thể
Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức xử lý động biến và nuôi
trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến.


Ví dụ: đột biến lặn chịu được S-2-aminoethyl cysteine xuất hiện sau khi sử lý phôi nuôi
cấy.

2. Cách chọn dòng tế bào
a. Không có tác nhân chọn lọc
Các tế bào và callus không xử lý sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro ở các thời kỳ khác
nhau trên môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế), được cảm ứng
để phân hóa các cây hoàn chỉnh. Các cây tái sinh sẽ được trồng trên đồng ruộng để chọn lọc các
biến dị. Bằng phương thức này, người ta đã thu được các biến dị dòng soma của các cây trồng
khác nhau.
Các ví dụ:
+ Với cây mía đường (Saccharum officinarum): người ta đã chọn được các cây kháng bệnh

mốc sương (downey mildew), bệnh Fiji (do virus apid – transmitted) trên giống mía Pindar, hoặc
cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q10 kháng bệnh đốm mắt . (Do
Helminthosporium sacchari).

+ Với cây khoai tây:Shepard và cộng sự (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ protoplast tế
bào thịt lá của giống “Russet Burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể
protoclones. Một trong số chúng kháng được bệnh thối sớm (early bright do Alternaria solani)
hoặc thối muộn (late bright do phytophthora infestans).
+ Với cây cà chua: Evan và cộng sự đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị
hình thái là các đột biến lặn của tính bất dục kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt cuống lá,
khả năng lục hóa của lá, màu sắc của quả và hoa.
b. Có các nhân tớ chọn lọc:
Theo phương pháp này, các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào khả
năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trường dinh dưỡng, hoặc
dưới các điều kiện stress của môi trường. Các biến dị có thể thu được bằng cách chọn lọc trực
tiếp, gián tiếp. Sự phân lập được tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền phù hoặc bằng cách dàn
trải tế bào đơn/protoplast.
Các hướng chọn lọc
- Kháng amino acid và các đồng đẳng của amino acid.
- Kháng bệnh.
- Kháng thuốc diệt cỏ.
- Chống chịu với các stress của môi trường.
- Kháng kháng sinh.
- Kháng các đồng đẳng base của ADN.

Tác nhân sử dụng chọn

Tính trạng

Cây trồng

Biểu hiện tính trạng


lọc
TB

Cây

nuôi

tái

Truyền lại
cho thế

cấy

sinh

hệ sau

Methionine sulfximine
(pseudomonas syringe)

Kháng lại độc tố bệnh

Thuốc lá

+

+

+

Tabtoxin tinh khiết
(pseudomonas syringe
pv tabaci)

Kháng lại độc tố bệnh

Thuốc lá

+

+

+

Dịch độc lọc nuôi
(Alternatia alternate)

Kháng lại độc tố bệnh

Thuốc lá

+

+

+

Độc tố HmT của chủng
Helminthosporium
sacchari

Kháng lại độc tố bệnh

Ngô

+

+

+ (di
truyền
theo dòng
mẹ

Độc tố Hs tinh khiết
của Helminthosporium

Kháng lại độc tố bệnh

Mía

+

+

+ (thông
qua nhân
vô tính)

Dịch lọc nuôi cấy nấm
Helmithosporium
oryzae

Kháng lại độc tố bệnh

Lúa

+

+

+

5 – Methyl trytophan

Cải thiện chất lượng
protein

Lúa

+

+

+

S (2 – amino ethyl) –
cysteine (AEC)

Cải thiện chất lượng
protein

Lúa

+

+

+

NaCl

Tăng khả năng chống
mặn

Ngô

+

+

+

VII.

Ứng dụng của biến dị soma trong chọn giống cây trồng

- Trong cải tiến giống cây trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng một số lượng
lớn các cây trong nhà kính hay trên đồng nếu như muốn chọn lọc một đặc tính cụ thể nào đó.
Nếu làm như vậy, số nguyên liệu sử dụng sẽ bị giới hạn bởi diện tích có sẵn và thời gian.
Ngoài ra, các yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn lọc.
- Các hệ thống nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường được xác định
rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn các tế bào đơn và có khả năng tái
sinh thành cây hoàn chỉnh. Như vậy, có thể chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu di truyền
đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong một vài đĩa petri hay
bình nuôi cấy.


- Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi trường
đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu.
- Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất
cao.
- Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý.
+ Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh, chống chịu stress tốt hơn
+ Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song cịn thiếu một số tính trạng mong
muốn
 VD: Giống lúa DR2 (có nguồn gốc từ Viện cơng nghệ sinh học) được tạo ra từ dịng tế
bào soma biến dị của giống lúa CR203 được tách và tái sinh thành cây, có khả năng
chịu hạn, chịu lạnh tốt, năng suất cao,đồng đều.

 Có thể nghiên cứu 1 lồi nhiệt đới ở vùng ơn đới và ngược lại vì điều kiện mơi trường
đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu
 Tạo các biến dị di truyền khơng qua lai hữu tính ở những dịng ưu tú

nấm mỡ chịu nhiệt

 Đột phá công nghệ trồng lan cấy mô (10/10/2007)
Một phát hiện mới trong ứng dụng công nghệ sinh học (CNSH) nhân giống lan bằng
phương pháp cấy mô của Công ty TNHH Long Đỉnh là cho hoa nở sớm được từ trong
ống nghiệm


 Các dịng tế bào mang các đặc tính mong muốn sau khi được chọn lọc sẽ được tái sinh
thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh để phát triển nguồn cây giống mới, thích hợp các điều
kiện sản xuất nơng nghiệp cụ thể
Giống lúa CR203 có nhiều gen quý như tính
chống chịu rầy nâu, tính thích ứng ổn
định,năng suất gạo khá.

Hiện nay các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu
tạo ra hoa đồng tiền bằng phương pháp biến dị
soma.
VIII.

Tạo giống cà chua chịu hạn

Cơng trình nghiên cứu

Ảnh hưởng của xử lý ETHYLMETHANESULPHONATE (EMS)
invitro đối với cây cẩm chướng
Thực hiện bởi:Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà, Vũ Hoàng Hiệp


1. Tóm tắt
Nghiên cứu này nhằm bước đầu làm rõ tác động gây đột biến của xử lý ethylmethane
sulphonate (EMS) in vitro cho cây cẩm chướng. Trong thí nghiệm, các đoạn thân mang mắt ngủ

của cây in vitro được ngâm trong dung dịch EMS với nồng độ khác nhau (từ 0 - 1,0%) với thời
gian 1 - 3 giờ sau đó được đặt trên máy lắc với tốc độ100 vịng/phút. Mẫu được nuôi cấy trên
môi trường tạo chồi MS + 1ppm Kinetine và sau đó được chuyển sang ni cấy trên môi trường
tạo rễ MS + 0,5 ppm α- NAA.
Kết quả cho thấy, nồng độ EMS càng cao, thời gian xử lý mẫu càng dài thì tỷ lệ mẫu sống
và phát sinh chồi càng giảm. Xử lý EMS đã làm tăng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm chướng nuôi cấy
in vitro từ 5,1 đến 22,7 lần so với đối chứng. Nồng độ và thời gian xử lý thích hợp là 0,4% EMS
trong thời gian 2 giờ. Sau xử lý, thu được năm dạng chồi biến dị(A, B, C, D, E). Mức độ tăng
trưởng chiều cao, số lá và khả năng ra rễ của các dạng chồi giảm dần theo thứ tự: A > B > D > E
> C. Trên cơ sở số liệu thực nghiệm đã xây dựng được mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ
giữa khả năng sống của mẫu cấy, tỷ lệ biến dị của chồi với nồng độ EMS và thời gian xử lý mẫu.
Các kết quả trên tạo cơ sở cho việc ứng dụng công nghệ xử lý đột biến in vitro trong tạo giống
hoa cẩm chướng mới ởViệt Nam.
Ethyl methanesulfonate (EMS) là một hợp chất hữu cơ gây đột biến, gây qi thai, và có
thể gây ung thư với cơng thức CH3SO3C2H5. Nó tạo ra đột biến ngẫu nhiên trong vật liệu di
truyền bằng cách thay thế nucleotide, đặc biệt là guanine. Làm xảy ra các đột biến điểm.

Ethyl methanesulfonate
2. Vật liệu nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu
a) Vật liệu nghiên cứu
Đoạn thân mang mắt ngủ của chồi invitro cây hoa cẩm chướng thơm (Dianthus
caryophillus L.) giống Quận chúa.
b) Phương pháp nghiên cứu


 Phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật
•

Mơi trường MS(6,2 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l innositol).

•

pH:6

•

nhiệt độ: 22 – 25 độ C

•

Cường độ chiếu sáng:2000 lux

•

Thời gian: 16h/ ngày

•

Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên

•

Mỗi cơng thức thí nghiệm tiến hành 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại bố trí 30 bình, mỗi
bình 3 mẫu

 Phương pháp xử lý đột biến in vitro
Các đoạn thân mang mắt ngủ của cây cẩm chướng invitro (khoảng 1,0 cm) được ngâm
trong dung dịch EMS có nồng độ khác nhau (0-1,0%) và được lắc với tốc độ 100 vòng/phút,
được xử lý ở 3 mức thời gian: 1h, 2h và 3h tùy từng thí nghiệm. Các mẫu sau khi xử lý được rửa
bằng nước cất vô trùng 5 lần và nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh chồi (MS + 1,5 ppm

Kinetin). Sau 4 tuần nuôi cấy, các chồi in vitro được chuyển sang môi trường ra rễ (MS +0,5
ppm NAA). Mỗi công thức xử lý 100 mẫu in vitro cho một lần nhắc lại, tiến hành 3 lần nhắc lại
công thức.
 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mềm Excel và Irristat
4.0S.
Sử dụng thuật toán nội suy Lagrange để xây dựng mơ hình tốn học (Nguyễn Đình Trí và
cs.,2002)
3.Kết quả nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS tới sự phát sinh và sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro
EMS là chất gây độc biến hóa tác động trực tiếp vào hệ gen của tế bào qua phương thức
thẩm thấu qua bề mặt mô. Với 3 mức thời gian khác nhau, thí nghiệm đã cho thấy EMS có ảnh
hưởng rất rõ đến khả năng sống và khả năng phát sinh chồi của các mẫu xử lý(Bảng 1).
Khi tăng nồng độ và thời gian xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống, tỉ lệ phát sinh chồi giảm dần.
Ở cả 3 mức thời gian xử lý khác nhau thì tỉ lệ phát sinh chồi đều đạt cao nhất tại nồng độ 0,4%.

Bảng 1: Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và sự phát sinh chồi in vitro (sau 4 tuần
nuôi cấy)
Nồng độ
EMS (%)

Xử lý 1h
Tỉ lệ mẫu
sống (%)

Tỉ lệ phát
sinh chồi

Xử lý 2h
Tỉ lệ mẫu

sống (%)

Tỉ lệ phát
sinh chồi

Xử lý 3h
Tỉ lệ mẫu
sống (%)

Tỉ lệ phát
sinh chồi


(%)

(%)

(%)

0,0

100,00

100,00

98,83

98,58

97,78

97,67

0,2

91,11

91,66

88,89

88,26

83,33

82,68

0,4

86,67

93,93

82,22

91,11

78,89

84,15

0,6

81,97

88,90

70,00

86,50

62,44

82,19

0,8

48,89

80,40

45,55

77,38

39,97

74,66

1,0

32,22

73,83

26,67

71,86

18,99

69,74

CV%

4,00

1,20

1,90

1,50

1,30

0,80

LSD0.05

4,26

1,93

1,30

2,30

1,51

1,15

Mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ mẫu chết
với thời gian sử lý
STT

Thời gian
sử lý

Mơ hình tốn học

R

1

1h

Y = -62,16X +1157,07X2 - 4145,10X3 + 5626,30X4 - 2508,33X5

0,94

2

2h

Y = 1,17 + 52,91X - 57,06X2+ 563,85X3- 1107,81X4+ 581,77X5

0.97

3

3h

Y = 2,22 + 195,48X - 997,26X2+ 2299,84X3- 2109,11X4+689,48X5

0.98

Từ kết quả thu được, bằng thuật toán nội suy Lagrange, một mơ hình tốn học được xây
dựng biểu diễn mối quan hệ và hệ số tương quan giữa nồng độ, thời gian xử lý EMS với tỉ lệ
mẫu chết. Hệ số tương quan R>= 0,9 cho thấy, tỉ lệ mẫu chết và nồng độ EMS xử lý có mối
tương quan thuận và rất chặt chẽ. Dựa vào mơ hình tốn học này, có thể dự báo được tỉ lệ mẫu
chết với từng nồng độ EMS xử lý, từ đó xác định được khoảng nồng độ xử lý đem lại hiệu quả di
truyền cao mà ít gây chết cho mẫu xử lý.
2.2 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro
EMS khơng chỉ ảnh hưởng đến khả năng sống và tái sinh chồi của mẫu cấy mà cịn có khả
năng gây biến dị hình thái các chồi in vitro. Các chồi mọc từ các mẫu được xử lý EMS có các
hình dạng khác nhau và không giống như các chồi từ mẫu không xử lý EMS (đối chứng). Đây là
các chồi bị biến dị hình thái. Tỉ lệ xuất hiện các chồi biến dị hình thái ở các cơng thức là khác
nhau(Bảng 2). Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính của tỉ lệ các chồi biến dị
hình thái vào nồng độ, thời gian xử lý EMS: nồng độ càng cao và thời gian xử lý càng dài thì tỉ lệ
chồi biên dị càng lớn.

Bảng 2: Tỷ lệ (%) chồi biến dị hình thái khi xử lý EMS (sau 4 tuần nuôi cấy)

Nồng độ EMS

Thời gian sử lý EMS (giờ)
1h

2h

3h

0,0

2,24

4,19

5,87

0,2

13,2

18,52

29,93

0,4

15,6

28,25

33,33

0,6

34,75

38,53

46.01

0,8

45,72

49,53

56,33

1,0

52,5

57,88

64,49

CV%

3,04

6,7

4,3

LSD0,05

1,75

3,91

3,04

Mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ biến dị của chồi với
thời gian sử lý

STT

Thời
gian sử
lý

Mô hình tốn học

R

1

1h

Y = 2,24 + 266,34X - 1823,63X2+ 4983,33X3 - 5431,25X4+2061,46X5

0,985

2

2h

Y = 4,19 + 99,15X - 192,33X2 + 311,72X3-201,04X4+ 36,20X4

0,977

3

3h

Y = 5,87 + 327,25X - 1665,40X2+ 3870,73X3- 3865,10X+ 1391,15X5

0,980

Các dạng chồi mọc từ các mẫu được xử lý EMS được phân lập thành các dạng sau


Dạng A: Chồi phát sinh bình thường
Dạng B: Chồi có biến đổi về hình thái lá như lá hình quạt, đốt thân mạng 1 lá, lá dính vào nhau
tạo hình lao, đốt thân mang 3 lá, các lá bao chặt thân có dạng vịi

Dạng C: Chồi thấp, các đốt thân rất ngắn và xếp xít lại với nhau, các là dày, cứng màu xanh đậm
Dạng D: Chồi đa thân, thân được tạo bởi nhiều thân ghép lại với nhau
Dạng E: Chồi có khả năng sinh sản mạnh, các chồi có khả năng đẻ chồi rất mạnh, tạo thành cụm
chồi
Bảng 3: Ảnh hưởng của EMS đến tỷ lệ (%) các dang chồi in vitro với thời gian xử lý 1h
(sau 4 tuần nuôi cấy)

Nồng độ
EMS (%)

Dạng A

Dạng B

Dạng C

Dạng D

Dạng E

0,0

97,76

2,24

0,00

0,00

0,00

0,2

86,75

8,10

2,16

3,00

0,00

0,4

74,40

17,32

2,54

4,19

1,55

0,6

64,91

22,32

4,78

4,28

3,70

0,8

54,62

33,25

6,12

3,82

2,19

1,0

47,50

34,72

15,45

2,33

0,00

CV%

1,40

5,70

8,80

8,40

5,20

LSD

1.75

2,00

0,81

0,11

0,11

Bảng 4: Ảnh hưởng của EMS đến tỷ lệ (%) các dang chồi in vitro với thời gian xử lý 2h
(sau 4 tuần nuôi cấy)
Nồng độ

Dạng A

Dạng B

Dạng C

Dạng D

Dạng E


EMS (%)
0,0

95,81

4,19

0,00

0,00

0,00

0,2

81,82

10,08

3,13

3,29

0,00

0,4

70,24

17,55

3,75

4,64

1,69

0,6

61,36

27,11

5,42

3,69

2,41

0,8

51,15

32,51

10,63

3,47

2,25

1,0

42,12

36,42

21,46

0,00

0,00

CV%

2,80

8,10

7,40

6,80

6,10

LSD

3,35

3,07

0,97

0,30

0,19

Bảng 5: Ảnh hưởng của EMS đến tỷ lệ (%) các dang chồi in vitro với thời gian xử lý 3h
(sau 4 tuần nuôi cấy)
Nồng độ
EMS (%)

Dạng A

Dạng B

Dạng C

Dạng D

Dạng E

0,0

94,13

5,87

0,00

0,00

0,00

0,2

69,71

19,71

4,69

3,50

2,39

0,4

66,33

21,73

5,39

4,36

2,20

0,6

53,59

31,46

9,31

3,57

2,08

0,8

44,71

38,06

14,33

2,90

0,00

1,0

34,76

35,44

29,80

0,00

0,00

CV%

2,30

4,60

5,00

9,30

4,70

LSD

2,49

2,06

0,95

0,39

0,09

Khi xử lý EMS ở nồng độ cao trong thời gian dài không những không tăng được mà cịn
làm chúng giảm đi. Vì vậy, nồng độ thích hợp cho xử lý mẫu EMS là 0,4% trong thời gian ngâm
mẫu 2h. Ở nồng độ và thời gian xử lý này có tỉ lệ mẫu sống, tỉ lệ phát sinh chồi cao, số lượng
chồi và dạng chồi biến dị thu được nhiều.
3.3. Khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro

Bảng 6: sự sinh trưởng và khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro


Dạng chồi

Tỷ lệ chồi
tạo rễ (%)

Thời gian ra
rễ (ngày)

Chiều cao
TB (cm/cây)

Số cặp lá

(lá/cây)

Số rễ TB
(rễ/cây)

Chiều dài
rễ (cm)

Dạng A

100

7

4,96

4,11

9,23

3,13

Dạng B

88,89

9

4,72

3,92

6,44

1,87

Dạng C

37,78

15

1,52

2,21

0,78

0,58

Dạng D

83,33

11

3,76

3,56

6,21

1,41

Dạng E

76,67

12

3,45

3,37

5,76

1,36

CV%

1,80

2,40

2,10

5,00

LSD0,05

0,12

0,15

0,21

0,15

Các dạng chồi thu được sau xử lý EMS được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường ra
rễ (MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l NAA). Sau 4 tuần nuôi cấy, sự sinh trưởng
của các loại chồi biến dị đều kém hơn rất nhiều so với chồi bình thường, mức độ tăng trưởng
chiều cao, số lá và khả năng ra rễ(tỉ lệ chồi ra rễ, thời gian xuất hiện rễ, số rễ/cây) của các dạng
chồi giảm dần theo thứ tự chồi dạng A> chồi dạng B> chồi dạng D> chồi dạng E> chồi dạng C.
Như vậy, sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi biến dị trong nuôi cấy in vitro sẽ cung cấp
dữ liệu giúp định hướng sàng lọc tiếp các dạng biến dị có lợi trong điều kiện tự nhiên.
3.4 Sự thích ứng của các dạng chồi in vitro trong điều kiện vườn ươm

Bảng 7: sự sinh trưởng, phát triển của các dạng cây in vitro

Dạng chồi

Tỷ lệ cây sống (%)

Chiều cao TB (cm)

Số cặp lá/cây

Dạng A

96,16

5,42

5,18

Dạng B

93,33

4,55

4,32

Dạng C

3,33

2,63

2,34

Dạng D

82,22

4,32

3,98

Dạng E

76,67

4,03

3,67

CV%

2,20

2,80

LSD0,05

0,17

0,20

Ở giai đoạn vườn ươm , các dạng chồi biến dị có khả năng sống và sinh trưởng thân lá
thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi bình thường. Tỉ lệ sống của các chồi dang A cao nhất
(93,33%) tiếp đến lần lượt là chồi dạng B,D,E,C. Chồi dạng C có khả năng sống thấp nhất
(3,33%). Một trong những nguyên nhân chính là do số lượng rễ được tạo ra trong giai đoạn tạo
cây hoàn chỉnh của chồi dạng C rất thấp.
Sau giai đoạn vườn ươm, các dạng cây nêu trên đã được trồng ra vườn sản xuất để tiếp
tục theo dõi, đánh giá về các đặc điểm sinh trưởng, phát triển khác nhằm xác định biến dị có lợi
làm nguồn nguyên liệu cho chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.


4. Kết luận

Xử lý EMS đã làm tăng biến dị cho cây cẩm chướng nuôi cấy invitro từ 5,1 đến 22,7 lần
so với đối chứng.
Theo tính tốn thì nồng độ và thời gian xử lý thích hợp là 0,4% EMS trong thời gian 2h
EMS làm giảm khả năng sống, khả năng phát sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ của
cây cẩm chướng invitro.
Nồng độ EMS càng cao thời gian xử lý mẫu càng dài thì tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi
càng giảm.

C- KẾT LUẬN
Người ta có thể tiến hành xử lý và chọn lọc tế bào thực vật ở ba mức độ cấu trúc chính:
callus, tế bào đơn (single cell) và tế bào trần. Trong phạm vi công nghệ (nuôi cấy) tế bào thực
vật, người ta thường tập trung các nghiên cứu cho mục đích chọn dịng tế bào sản xuất dư thừa
(over production) các loại sản phẩm chủ yếu là các amino acid và các hợp chất tự nhiên.
Trong cơng tác giống cây trồng, chọn dịng tế bào biến dị soma có thể khái quát ở một số
ứng dụng sau:
- Chọn dòng tế bào chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, ví dụ: chống chịu
nóng, lạnh, phèn, mặn, khơ-hạn...
- Chọn dịng tế bào kháng các độc tố: độc tố do nấm bệnh tiết ra, các loại kháng sinh...
Các dòng tế bào mang các đặc tính mong muốn sau khi chọn lọc được sẽ được tái sinh
thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh để phát triển nguồn cây giống mới, thích hợp cho các
điều kiện sản xuất nơng nghiệp cụ thể.
Nhìn chung, hiện tượng biến dị di truyền xuất hiện ở các tế bào khơng phân hóa
(undifferentiation), các protoplast phân lập, các callus và các mô nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy tế
bào thực vật có khả năng tạo biến dị di truyền tương đối nhanh và không cần phải ứng dụng

các kỹ thuật.
Như vậy biến dị soma là hiện tượng thường gặp trong q trình ni cấy mơ tế bào thực
vật. Biến dị soma có nhiều ưu điểm,đóng vai trị quan trọng trong công tác chọn tạo giống cây
trồng. Việc hiểu rõ hiện tượng này là vô cùng quan trọng để tạo giống tốt như mong muốn.
-

Nguồn trích dẫn tài liệu
+ />+ bài giảng của cô Nguyễn Thị Lý Anh
+ di truyền tế bào lai soma- Nguyễn Như Hiền