Kĩ thuật nhân giống vô tính invitro

Chủ đề: Kĩ thuật nhân giống vô tính invitro
Nhóm 9
1.Trần Tuấn Đạt 560787

5.Nguyễn Thị Quý 560856

2.Nguyễn Văn Hùng 560810

6.Nguyễn Thị Thảo 560864

3.Trương Đình Huynh 550463

7.Nguyễn T.Hồng Trang 575682

4.Đoàn Thị My 560830

8. Đỗ Thị Hải Yến 560897
1.Thế nào là nhân giống vô tính cây trồng bằng nuôi cấy mô?
Nhân giống vô tính là phương pháp nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới dựa theo sinh
sản vô tính, nghĩa là phương pháp tạo nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới từ tế bào,
mô, cơ quan của cơ thể bố hoặc mẹ.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù chung cho tất cả các loại nguyên liệu nuôi
cấy thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện
vô trùng.
ð
Nhân giống vô tính cây trồng bằng nuôi cấy mô là quá trình sản xuất một
lượng lơn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận cơ quan của cây trồng như: chồi,
mắt ngủ, vảy củ, thân lá… của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy
in vitro.
2.Ưu nhược điểm của nhân giống invitro
2.1. Ưu điểm của vi nhân giống

- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra
một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất
thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
Page 2
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công
nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm
có thể tạo thành hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân
dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp
hay đồng hợp.
- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí
nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ.
Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên
đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
- Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu
để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch
bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc.
- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm
khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống
nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay
là thân củ.
- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi
xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác
nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực
vật quốc tế.
- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời
gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.
2.2. Hạn chế của vi nhân giống :
_ Đòi hỏi có đầu tư về trang thiết bị , công nghệ, kĩ thuật chuyên môn.
_ Chi phí còn cao nên chưa phổ biến.

3.ĐỐI TƯỢNG CỦA NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH INVITRO
Page 3
Hiện nay kĩ thuật nhân giống vô tính invitro đã được áp dụng để nhân nhanh rất
nhiều loài thực vật phục vụ các mục đích khách nhau của con người và nhân giống
vô tính invitro đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự.
Trong sản xuất các loại cây có nhu cầu thương mại lớn, giá trị kinh tế cao đã được
ứng dụng kĩ thuật nhân giống vô tính invitro để nhân nhanh các giống tốt, sạch
bệnh đáp ứng nhu cầu về giống. Ví dụ: các cây lương thực,thực phẩm (khoai tây,
súp lơ, măng tây, cà chua, cà phê, mía) các cây ăn quả (chuối, dứa, cam, dâu tây),
các cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai), các giống hoa (đồng tiền, cúc, cẩm chướng,
hoa ly….).

Nhân giống invitro trên cây chuối
Đặc biệt là các loại cây khó nhân giống nhanh bằng phương pháp thông thường
mà lại có giá trị kinh tế lớn như hoa lan thì kĩ thuật nhân giống vô tinh invitro là
lựa chọn tối ưu. Ở Việt Nam và trên thế giới một số loại lan quý như lan hồ điệp,
lan hài đỏ (hồng hài), hài hằng cũng đã được áp dụng thành công kĩ thuật này để
nhân giống một cách nhanh chóng. Phân viện sinh học tại Đà Lạt đã rất thành công
trong việc nhân giống và trồng lan hài đỏ bằng phương pháp gây vết thương trong
trong gieo hạt invitro nhằm kích thích sự hình thành chồi.
Page 4

Lan hài đỏ - loài lan quý hiếm ở Việt Nam
Các cây có kiểu gen quý hiếm, có ý nghĩa di truyền được nhân nhanh và duy trì
bằng nhân giống vô tính invitro để làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống.
Các loài thực vật quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng cao cũng là đối tượng cần áp
dụng phương pháp nhân giống vô tính invitro để cải thiện số lượng cá thể, tránh
nguy cơ bị biến mất hoàn toàn. Ví dụ như cây sưa đỏ, gỗ nghiến ở Việt Nam.

Cây sưa con

Page 5
Công tác nghiên cứu các quá trình sinh lý, sinh hóa hay di truyền thực vật hay các
vấn đề sinh học khác cũng đòi hỏi một số lượng cây lớn và nhân giống vô tính
invitro giúp giải quyết hiệu quả vấn đề này.
Trong lĩnh vực y học các dược liệu quý như nhân sâm cũng được sản xuất nhanh
nhờ thu sinh khối callus hoặc thể huyền phù. Ví dụ như cây sâm Ngọc Linh đã
được nhân vô tính và trồng thành công ở Lâm Đồng.
a b
a: Phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh b: Rễ của sâm Ngọc Linh

Nhiều nơi đã ứng dụng hệ thống bioreactor nhân giống thành công nhiều loại
phôi vô tính và các thể chồi, cụm chồi hoặc củ nhỏ. Ở Brasil trên các bioriactor
dung tích từ 2-4 lít. Nồi vận hành theo các nguyên tắc của một nồi lên men (có
thể không dùng cánh khuấy mà chỉ dùng bọt khí để thực hiện việc truyền khí và
truyền nhiệt). Mỗi mẻ có thể thu được 4-5 triệu phôi vô tính cà phê. Củ siêu bi
(microtuber) được thị trường quốc tế công nhận là dạng khoai tây giống của thế kỷ
21. Củ khoai tây siêu bi có kích thước bằng hoặc nhỏ hơn hạt ngô, hoàn toàn sạch
bệnh virus được công ty Microtuber Inc. (Mỹ) sản xuất trong các bioreactor là các
đoạn thân khoai tây nhân giống bằng cấy mô.
Page 8


Bioreactor
Ngoài ra kĩ thuật nhân giống vô tính invitro con giúp tạo ra khối lượng lớn sinh
khối tảo nhằm cung cấp các sản phẩm cho con người và gia súc cũng với đó là
phục vụ nghiên cứu khoa học về tảo. Vì tảo có khả năng sử dụng ánh sáng mặt
trời để tổng hợp nên các chất dinh dưỡng năng lượng sinh học cho quá trình sống.
Ngày nay thì càng có nhiều sản phẩm ứng dụng từ việc sản xuất sinh khối tảo thu
được. Ví dụ như các thực phẩm (mỳ sợi vi tảo, bánh mỳ vi tảo, đồ uống vi tảo),
dược phẩm tăng cường thể lực, giúp giảm cân, tránh tiểu đường, chống ung thư,

các bệnh dạ dày, tim mạch hay mỹ phẩm (mặt nạ, kem dưỡng da).

Page 8
Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo.
4.Các bước trong nhân giống in vitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho
nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai
đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích
hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm
giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các
yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào
mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần
chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi
ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro
Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)
Khoai tây: mầm (Morel, 1952)
Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)
Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng
để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt
được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-
10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung
dịch Br

Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA ), Xytokinin (BA, Kin, 2P ), Gibberelin (GA3)
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số
Page 8
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các
con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả
cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ
ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân
hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế
độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân
phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng
chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi
trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào
môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi
khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau
khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa
chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi
trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin
nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi
với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều
kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi
5. Phương thức trong nhân giống in vitro:
5.1. Hoạt hóa chồi nách:
Page 9
Hoạt hóa chồi nách bằng cách hủy đỉnh sinh trưởng. Bản chất của phương
pháp là á dụng kỹ thuật hủy đỉnh sinh trưởng cưỡng bức, gây ức chế nội tại, kích
thích các chồi ngủ tiềm ẩn ở nách lá, đầu rễ, phân hóa thành chồi mới.
hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh
chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa của
chồi nách diễn ra theo 2 cách:
Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hay chồi nách: xảy ra khi nuôi cấy cây
hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây, hoa cúc
Cách 2.Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách: xảy ra khi nuôi cấy cây một lá
mầm như mía, lúa,
5.2 Tạo chồi bất định:
Chồi bất định là chồi mọc ra rừ các cơ quan các bộ phận khác của cây không
phải là phôi. Ví dụ: chồi hình thành từ mô sẹo.
Tạo chồi bất định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá,
giẻ hành…trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình
phân hóa để tế bào hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát
triển mô sẹo
Tạo cụm chồi là để tái sinh một cách định hướng các tế bào mô nuôi cấy thành các
cụm chồi. Mẫu được khử trùng và tách bỏ chồi nách và đỉnh sinh trưởng sau đó

được cấy vào trong bình tam giác có môi trường nuôi dưỡng phù hợp . Môi trường
thường được sử dụng là môi trường MS có bổ sung saccarose , arga, chất kích
thích sinh trưởng. Sau một thời gian các đỉnh dinh trưởng sẽ phát triển và tạo được
nhiều cụm chồi với kích thước khác nhau
Nhân nhanh cụm chồi sau khi đã phát triển thành nhiều cụm chồi rồi thì các cụm
chồi sẽ được tách ra ngoài để nhân nhanh. Các cụm chồi nhỏ 5-10 sẽ được tách ra
Page
10
và cấy trên môi trường MS có bổ sung sacharose 3%, arga 9g/lit, chất kích thích
sinh trưởng BA 0,5mg/lit và GA3 0,1 mg/lit ở độ PH=5,8 và được cấy trong các
bình tam giác. Cụm chồi phát triển tốt thì sau 2 tháng sẽ có 4-5 cụm trên 1 chồi.
Các chồi cụm phát triển mạnh mẽ sẽ cho các cây có màu xanh
Khi cảm ứng rễ trụ phôi cây tùng trong hệ gene cảm ứng sớm auxin có 5 gen lpea
được biểu hiện từ 1-5. Sau khi xử lý naa trong 10 p lepa2 và 3 được biểu hiện
nhanh chóng, 1 và 4 biểu hiện sau 1h và 5 thì xử lý sau 5h mới biểu hiện sau 24h
thì đạt đến đỉnh cao và biểu hiện trong 5 ngày
Nghiên cứu thể đột biến của cây thuốc lá cho thấy gen hrgpnt3 biểu hiện tính đặc
thù trong thời kỳ cảm ứng rễ bất định. Promoter của hrgpt3 ở thể đột biến không bị
hoạt hóa bởi auxin nên ở nồng độ bất kỳ nào xử lý auxin cũng không gây cảm ứng
phát sinh rễ
ð
Gen đặc hiệu phát sinh chồi bất định
Phát sinh chồi bất định trước tiên là cảm ứng mô sẹo hình thành mô phân
sinh đỉnh chồi=> lá nguyên thủy và chồi nách. Sự hình thành mô phân sinh
đỉnh chồi được điều khiển bởi gen nhất định
5.3. Tạo phôi soma.
Trong quá trình nghiên cứu in vitro phôi có thể hình thàh từ các tế bào soma gọi là
phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể phát sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể sử
dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tương tự như tạo chồi bất
định để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện 2 quá trình phản phân hóa và quá trình

phân hóa để tách các tế bào soma hình thành phôi.
Bước 1: sự phân hóa các tế bào có khả năng hình thành phôi. Trong quá trình này
cần môi trường giàu auxin, vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi,
Page
11
đồng thời nó còn kích thích quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên
tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh là các tế bào nhỏ, nhân lớn,
nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đạm đặc, giàu protein và ARN
thông tin.
Bước 2: sự phát triển của phôi mới hình thành trong môi trường ngiên cứu của giai
đoạn này phải nghèo hoặc không có auxin, với nồng độ auxin cao kích thích sự
tạo phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình phát triển tiếp theo của phôi
này. Như vậy với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có
các phản hồi thích hợp. Nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng
độ cao sẽ gây ức chế hoặc gây độc.
Hình thức phát sinh trực tiếp: thể phôi phát triển từ mẫu nghiên cứu. Mẫu nghiên
cứu có thể là biểu bì, chu bì, tiền phôi hợp tử, tế bào nuôi cấy huyền phù và tế
bào… nói chung sự phát sinh trực tiếp phôi soma là do tế bào trong mẫu nghiên
cứu tồn tại tế bào tiền phôi trong nuôi cấy thì tế bào này trực tiếp bước vào giai
đoạn phát sinh phôi, hình thành thể soma
Hình thức phát sinh gián tiếp: thể phôi phát triển từ mô sẹo hoặc huyền phù tế bào
thông qua phản phân hóa đồng thời do cảm ứng định hướng phát triển tạo tế bào
quyết định cảm ứng phát sinh phôi và chúng phát triển thành phôi soma
Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính
Tất cả các phôi vô tính đều có cấu trúc lưỡng cực, gồm có mô phân sinh của cả
chồi và rễ do đó có thể hình thành một cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Sự
phát sinh hình thái ở phôi vô tính rất giống với phôi hữu tính, những phôi phát triển
bình thường sẽ trải qua những giai đoạn phát triển riêng biệt như: hình cầu, hình
tim, hình ngư lôi và hình lá mầm.
Page

12
Cơ chế phát sinh phôi soma
Những quan sát cụ thể phát sinh phôi phát hiện có 4 pha 0,1,2 và 3 được nhận thấy
trong giai đoạn đầu của quá trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy.
Ở giai đoạn 0, những tế bào đơn hình thành những cụm tế bào có khả năng phát
sinh phôi( giai đoạn 1) trên môi trường có auxin.trong suốt giai đoạn này những tế
bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường nuôi cấy
khong có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1.
Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1qua môi
trường không có auxin. Trong suốt pha 1 các cụm tế bào tăng sinh chậm và
dường như không biệt hóa.
Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn
đến việc hình thành phôi hình cầu. Pha nyaf được gọi là pha 2.
Pha tiếp sau là pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua phôi
hình tim và phôi hình thủy lôi.
+ các kiểu phát sinh phôi soma
Sự phát sinh phôi soma bất định: các phôi vô tnhs có thể phát triển từ các tế bào
hay các mô sẹo có liên quan của mọt số loài thực vật nhiệt đới, các phôi bất định
này có thể được tạo trực tiếp từ tế bào đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp
từ bề mặt của phôi non này.phương pháp này được sử dụng trong chương trình di
truyền cải tạo giống, chẳng hạn như cứu các phôi bị chết non do lai tạo.
Sự phát sinh đa phôi vô tính: hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non
của thực vật hạt trần. Các khối mô có khả năng tạo phôi cao khi cấy truyền sang
môi trường mới sẽ phát triển và tăng trưởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển
Page
13
thành phôi có thể được phân biệt với mô không phát triển thành phôi do màu trắng
của phôi và hóa đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine.
Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng: hiện tượng này do sư nuôi cấy lỏng các tế bào
và mô sẹo sau khi các mô này chịu sự xử lý đặc biệt đem lại khả năng cảm ứng tạo

phôi. Người ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều
kiện nuôi cấy khác nhau để qun sát khả năng tạo thành mô sẹo.
6.Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô
+ Hạn chế của vi nhân giống.
+ Hạn chế về chủng loại sản phẩm : trong điều kiện hiện nay không phải tất
cả cây trồng thương phẩm đều được nhân giống bằng nuôi cấy mô.
+ nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhaanh
bằng phương pháp này để đáp ứng nhu cầu thương mại hay bảo quản nguồn gen
quý
+ Chi phí sản xuất cao: đòi hỏi lao động và có 1 trình độ nhất định sử dụng
thành thạo máy móc và thao tác kĩ thuật. đòi hỏi có trang thiết bị chuyên dụng.
+ giá thành sản phẩm còn cao so với phương pháp truyền thống như nhân
giống bằng hạt.
+ Hiện tượng biến dị soma làm mất hoặc thay đổi những đặc tính tốt của cây
mẹ và không được thể hiện ở đời con.
+ tỉ lệ biến di thấp ở giai đoạn đầu nhưng sau đó có dấu hiệu tăng do sử
dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng làm cho cây không đồng nhất về mặt
nguồn gen.
+ xảy ra hiện tượng nhiễm mẫu do thao tác sai quy trình.
7.Nhân giống vô tính hoa đồng tiền
Đồng tiền là một trong những loài hoa có màu sắc đẹp, tươi sáng, đa dạng về
chủng loại với đầy đủ các loại màu từ đỏ, cam, vàng, trắng, phấn hồng, tím và có
giá trị kinh tế lớn. Trên bông hoa có thể có một màu đơn hoặc nhiều màu xen kẽ.
Page
14
Hoa lớn và đai nên thích hợp để tạo thành bó hoặc tạo thành hoa lẵng hoặc cắm
hoa nghệ thuật. Ngoài ra, hoa đồng tiền cũng thường được trồng trong chậu để
trong phòng làm việc hoặc phòng khách. Một trong những ưu điểm của hoa đồng
tiền là khá lâu tàn, nếu trồng trong chậu có thể nở trong thời gian 20 ngày – 30
ngày. Đồng tiền là một loại hoa có sản lượng và giá trị cao, ở điều kiện thích hợp

có thể ra hoa quanh năm, tỷ lệ hoa cắt và tỷ lệ hoa thương phẩm thu được khá cao,
hình dáng hoa cân đối, hài hòa, có giá trị thẩm mỹ, tươi lâu. Đây là một trong 10
loại hoa được ưa chuộng và tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới. Đồng tiền hiện nay
được trồng ở nhiều nước trên thế giới. Ở Trung Quốc, hoa đồng tiền còn có tên là
Phu lang và thường được dùng trang trí cho xe hoa và phòng cưới. Việt Nam là
nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại hoa,
trong đó có hoa đồng tiền.
Kỹ thuật nhân, nuôi hoa đồng tiền thông thường bằng cách tách chiết cây con và
gieo hạt, tuy nhiên phương pháp này có hệ số nhân thấp, cây không đồng đều, hoa
không đảm bảo chất lượng. Hiện nay công nghệ nhân giống hiện đại bằng phương
pháp in vitro sẽ khắc phục được các nhược điểm đó, từ một cá thể có thể nhân nuôi
thành vài ngàn đến vài triệu cây con.
A. Qui trình nhân giống hoa đồng tiền bằng phương pháp invitro

B. Mô tả các bước trong qui trình
1. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu
Việc tạo nguồn vật liệu ban đầu tốt sẽ là bước quyết định tới sự thành công của các
bước thực hiện tiếp theo. Vì vậy, để có nguồn mẫu cho quá trình nuôi cấy mô thì
cần phải lựa chọn các cá thể sinh trưởng phát triển tốt từ quần thể đã được lựa chọn
từ trước, trồng vào trong chậu với nền giá thể là trấu hun để hạn chế tỷ lệ nhiễm
bệnh khi đưa vào nuôi cấy. Sau khi cây ổn định, phát triển bình thường (khoảng
từ 2-3 tuần) thì có thể tiến hành lấy mẫu để nuôi cấy. Phần mẫu dùng để thực hiện
phương pháp nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng của cây. Thời gian lấy mẫu từ 9-10h của
những ngày những nắng ráo, độ ẩm trong không khí không quá cao hoặc quá thấp.
2. Khử trùng tạo mẫu sạch
Mẫu lấy về cần bóc các lá ngoài, lấy đỉnh sinh trưởng khỏe mạnh, rửa sạch bằng
xà phòng dưới vòi nước chảy, rửa lại bằng nước cất và đặt vào trong bình để khử
Page
15
trùng. Dùng cồn 70% ngâm mẫu trong 1 phút để khử trùng sơ bộ, rửa lại mẫu bằng

nước cất 3 lần, sau đó dùng Canxihypocholorid 15% để khử trùng sạch trong thời
gian15 phút, tiếp tục rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng chúng
ta được mẫu đỉnh sinh trưởng của hoa đồng tiền sạch.
3. Tái sinh cụm chồi
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng của các tế bào mô nuôi
cấy thành các cụm chồi. Mẫu đã được khử trùng sạch đưa vào đĩa petri có giấy
thấm vô trùng để thấm khô bề mặt các mẫu. Dùng dao để tách đỉnh sinh trưởng và
chồi nách có đường kính khoảng 5mm ra và sau đó cấy vào các bình tam giác có
môi trường dinh dưỡng phù hợp. Môi trường thường được sử dụng là môi trường
MS có bổ sung saccharose 3%, agar 9 g/lít, chất kích thích sinh trưởng BA 0,7 mg/
lít ở độ pH= 5,8. Sau 3 tháng thì các đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển và tạo được
nhiều cụm chồi với các kích thước khác nhau.
4. Nhân nhanh cụm chồi
Sau khi đã phát triển thành nhiều cụm chồi thì các chồi này cần phải được tách ra
để nhân nhanh. Các cụm chồi nhỏ có kích thước 5-10mm được tách ra và cấy lên
môi trường MS có bổ sung saccharose 3%, agar 9 g/lít, chất kích thích sinh trưởng
BA 0,5 mg/lít và GA3 0,1mg/lit ở độ pH= 5,8 được đặt trong các bình tam giác.
Cụm chồi phát triển tốt thì sau 2 tháng sẽ đạt được từ 4 - 5 chồi/cụm. Các chồi,
cụm chồi phát triển mạnh sẽ cho thấy các cây con có màu xanh non, lá thẳng dài,
kích thước cây từ 30-40mm.
5. Duy trì cây
Cây sau khi được cấy lên môi trường nhân giống và đạt kích thước 30-40mm thì
được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung saccharose 3%, agar 9 g/lít, chất
kích thích sinh trưởng BA 0,1 mg/lít và GA3 0,3 mg/lit ở độ pH= 5,8 để duy trì
sự phát triển của cây. Sau 1 tháng cây con phát triển mạnh, lá có màu xanh non,
thẳng và có kích thước từ 40-60mm là đạt yêu cầu.
6. Tạo cây hoàn chỉnh
Cây đưa ra vườn ươm cần phải kích thước phù hợp, có đầy đủ rễ để có thể phát
triển bình thường. Do đó khi cây đạt kích thước từ 40-60mm sẽ được cấy chuyền
tiếp sang môi trường duy trì sự phát triển của cây và tạo rễ MS có bổ sung

saccharose 3%, agar 9 g/lít, NAA 0,3 mg/lít, than hoạt tính 2g/lít ở độ pH= 5,8.
Sau 2 tháng trên môi trường này cây hoa đồng tiền sẽ có kích thước 7-10cm, có
đầy đủ bộ rễ và đảm bảo tiêu chuẩn để đưa ra vườn ương.
7. Đưa cây ra ngoài vườn ương
Sau khi cây con đạt chiều cao 7-10cm, có đầy đủ bộ rễ để có thể phát triển ngoài
đất thì tiến hành tách ra khỏi bình tam giác, rửa sạch môi trường bám ở rễ, để ráo
nước. Dùng khay xốp 80 lỗ, xơ dừa sàng mịn, đổ đầy xơ dừa vào các lỗ trên khay,
Page
16
sau đó tiến hành cấy cây con vào các lỗ trên khay. Khi trồng cây vào khay chú ý
không để cổ rễ của cây non ngập quá sâu để tránh hiện tượng thối cổ rễ. Giữ ẩm và
thoáng khí khi chăm sóc cây con.
Ẩm độ, nhiệt độ trong thời gian đầu đối với cây đồng tiền con mới trồng phải được
suy trì gần tương tự như trong phòng nuôi cấy mô. Trồng trong nhà kính có lưới
che 30% ánh sáng vì đồng tiền không chịu được cường độ ánh sáng trực xạ cao
và sương muối, mưa nhiều nên phải làm giàn che để hạn chế các điều kiện bất lợi
trên.
Chế độ tưới nước cho cây con giai đoạn đầu là 2 ngày tưới một lần, có thể sáng
tưới trước 9h, hoặc chiều tưới sau 4h. Tưới bằng bình phun sương, trong thời gian
này không nên tưới phân. Sau khi cây ổn định bám được rễ vào xơ dừa thì mới bón
phân. Bón phân NPK 0,5% ( 20-20-15), hai tuần phun một lần, khi phun nên phun
vào buổi sáng hoặc chiều mát.
Sau 2 tháng thì cây con có thể đưa ra trồng ngoài vườn để kinh doanh
Page
16