PCR

Kỹ thuật PCR



!"#
$%&'
(!)*+,

/)0*+,123!
4#567894 :7
;.

<=5>!3'?
"@A6/ )*++
Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng đợc coi là
một bớc ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách
mạng "thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh
học hiện đại .( J. Watson)
B!CD9E(!!
F@!D5G8#H
HI4JC
8:;(!KLADM(
  35J35N3
;3OP3…
Khái niệm
!DBQ
RD7ID9
KLA!C7J!SH
D7T6HEU.
A8VW
A8VW

   O 8  XY 
W&KLA&ZR
6" D 9 KLA N  9
[ 4 02 B
 (I  H -  @  9 B’
W9KLA
8HH;



\ [ ]  O
0$ [ C   \^ả
O20 -_ `/ O2–đầ ự

KLAô

LAKaJ0bc
3 C Z a 
JDI+1?B2

d9OOAb_

'
ee
3dung dịch đệm3/3.
Các giai đoạn trong phản ứng PCR
*. fF XV 0O2g /  W $
XV Q    N J D  0+dc
+1


2.
\. fV02gAJD"
#"X7011ch^

2Z
V(!KLAB#8V
6]W6&BB.
QO!96]KLA0LAKX2g
"#%RiKLAJ
N&KLA&(h1cj12ZQ
O!96]8V6](I
5.
Khuôn ADN được biến đổi
thành 2 sợi đơn (94oC, 5 phút)
Gắn primer vào chân ADN
(55-60 oC, 30 giây)
Tổng hợp chuỗi ADN mới
(65-75oC, 2-5 phút)
Biến đổi để tách thành đơn
(94oC, 30 giây)
Chu trình PCR
k"#
Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bớc đợc lập đi lập lại nhiều
lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu đợc hàng triệu
bản copy của một đoạn ADN nào đó, đủ cho các mục đích
thí nghiệm khác nhau.
Hỗn hợp phản
ứng PCR
GĐ1
GĐ2

GĐ3
Bắt đầu chu kỳ mới (2)
Nhắc đi nhắc lại n chu kỳ
Thời gian (phút)
Nhiệt độ (oC)
PCR-Chu kỳ 1
PCR-Chu kỳ 2
PCR-Chu kỳ 3
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
30 40 chu kỳ của 3 b%ớc
B%ớc 1: biến tính
B%ớc 2: gắn primer
B%ớc 3: polymer hoá
1 phút 94
o
C
45 giây 54
o
C
2 phút 72
o
C
Primer
dNTP
b7D]KLAW"#

ADN khuôn
l9H
R6"
k#

*
k#
\
k#
\
k#
-
k#
d
\
*
m
\6"

\
\
m
d6"

\
-
m
,6"

\
d
m
*h6"
k#
-1

\
-1
m-dJ6"

7RiKLA]
)!7n
f9*gfFXVKLA

b> ụ êg5N≤-^^^60X.*^62

b>Xa6@D?[?J3N!D
$4C"\^40>!O!34
?J!3N≥*h42

AJD"#)8+1

Z!FXV
KLAô9Q0QO!"^31;\Y2

bN9!!O!3J:"FXV!
!"94W&(!CZR6;4
5.

AJDR6;4RiKLA(!
FXVB
Sîi ADN ban ®Çu
2 Sîi ADN sau khi gi·n
xo¾n
95

o
C
'\e

oJ6]'
\e
(!"#
Y!]a7B
pg

4(!KLA5

KLA&(!5
f9\gfV02

AJD"*1 \1–



9[02V(!H1 ’
W\BKLA

q>QO!"^31c\Y

bN!V34V?J
!!"JEW
:>]KLA
ADN ®Ých
primer
Sîi ADN míi

Sîi ADN míi
Việc thiết kế mồi cần phải có thông tin về trình tự ADN
mục tiêu. Các lưu ý khi thiết kế mồi cho PCR :

O Độ à gqV?J.qO!"J
:"
bNr*,c\1

Mồi có trình tự phù hợp với khuôn (template), khoảng cách giữa
các mồi xuôi và ngược không dài quá 1 kb

Tránh hiện tựợng tự bắt cặp giữa các mồi  mồi xuôi và ngược
cần có trình tự không bổ sung với nhau

Có khoảng 45- 60% G/C

Các mồi có kích thước ít khác nhau, có T
m
gần giống nhau 
tăng hiệu quả của PCR
b  ế ế
á    b ế ố ả ưở ủ
g

Chiều dài của primer

Hàm lượng G/C

Đối với các primers có 15 - 26 nucleotides, tính T
m

theo công thức Wallace (1989):

T
m
= [2(A+T) + 4(G+C)] ° C

7 (I [ s \^  -1 6&B –Đ ì J D V [ 4
g

bm\\e*3dht\0fe2e0Keb2u
^

Hình. Sự biến tính bởi nhiệt của ADN
b  gụ ộ
/  0fe2 LAK.à ượ ủ
< EWO5.ả
< E LAK.ả ủ
Hình. Mối quan hệ của Tm với hàm lượng G
+C

Cặp mồi để nhân gen chống bệnh đạo ôn (nằm trên NST 12) ở lúa
nhờ PCR:

CAGCTGTTCAGTCGTTTGCAGCTGTTC 27 NUCLEOTID

ATACCGTTATGGGCATTAAGGAAT 24 NUCLEOTID

Cặp mồi để nhân gen chống bệnh bạc lá ở lúa Xa21 (gen kháng bạc
lá, nằm trên nST 21-pTA-248) nhờ PCR:


AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGAG 24 NUCLEOTID

AGCGCGGTGTAATCGAAAGATGAAA 25 NUCLEOTID
Ví d :ụ
f9-gRiKLA
0LAK&2

bIR3O%LAK0
v.
w2
(!bdZQO!

LAK!C44XOC
94xcOX0y-_ccc
s1_2.

/9;g

AJD!(J4!-j

54
:ì6V?W[0c20
..

V(!ìKLA2.

AJDO%ZFXVKLA$k
6;4& ả 6]X&I
$kDC.