Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học các hợp chất trong lá cà phê chè ở huyện krông păk, tỉnh đăk lăk

- 1 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA
  



Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hoá học các
hợp chất trong lá cà phê chè (Coffea Arabica L.) tại huyện
Krông Păk, tỉnh Đăk Lăk.



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC


Ngƣời thực hiện: Nguyễn Thị Lê Phƣơng
Lớp: 08CHD
Khoa: Hoá học
Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân





- 2 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây cà phê chè có nguồn gốc từ Ethiopia, được trồng đầu tiên ở vùng châu Phi
và Ả Rập. Sau đó cà phê chè được người Hà Lan đem trồng trên các miền đất thuộc
địa của họ. Năm 1718, người Hà Lan mang cà phê chè tới Surinam, năm 1725 người
Pháp mang tới Cayenne Cuối thế kỷ 18 cà phê chè được trồng ở khắp các xứ sở nhiệt
đới, chủ yếu do sự bành trướng thuộc địa của các đế quốc châu Âu.
Cà phê chè sinh trưởng tốt nhất ở nơi có độ cao từ 500 – 2000m trên mực nước
biển, nhiệt độ trung bình năm là 22
0
C, lượng mưa khoảng trên 1000mm.
Cà phê chè thuộc giới Plantae, bộ Gentianales, họ Rubiaceae, chi Coffea, loài C.
arabica.
Ở Việt Nam cà phê chè được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như
Tuyên Quang, Hà Giang, vùng Phủ Quỳ, Nghệ An và một phần nhỏ ở Đà Lạt, Lâm
Đồng, Đăk Lăk. Hiện nay, nước ta đang khuyến khích phát triển cà phê chè ở Tây
Nguyên và Đông Nam Bộ.
- 3 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Nghiên cứu cho thấy lá cà phê chè có chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh học
như 3ß-hydroxilup-12(13)-en-28-oic, axit ursolic, cafein Các chất này có tác dụng

điều trị sỏi thận rất tốt đồng thời đây cũng là những hoạt chất có khả năng chống lại
hai căn bệnh thế kỷ là ung thư và HIV. Ngoài ra, các thành phần trong lá cà phê chè
còn được sử dụng để điều trị hen xuyễn, nhiễm độc atropin, cúm, đau đầu, nhiễm độc
thuốc phiện.
Tại Việt Nam cũng đã có công trình nghiên cứu như “Nghiên cứu về thành
phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cà phê chè” (Nguyễn Quyết Tiến, Phạm
Thị Hồng Minh, Nguyễn Quốc Nam Hải), Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh
học toàn quốc 2009, Thái Nguyên 11/2009; “ Nghiên cứu thành phần hoá học lá cà
phê chè” (Nguyễn Quốc Nam Hải, 11/2009).
Nhận thấy tính ứng dụng cao của một số thành phần hoá học trong lá cà phê chè
nên tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học các
hợp chất trong lá cà phê chè (Coffea arabica L.) ở huyện Krông Păk, tỉnh Đăk Lăk”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng qui trình chiết tách các hợp chất hóa học trong lá cà phê chè
- Xác định thành phần hoá học, cấu trúc hợp chất hóa học trong lá cà phê chè
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu
Lá của cây cà phê chè ở huyện Krông Păk, tỉnh Đăk Lăk
* Phạm vi nghiên cứu
- Lá cà phê chè
- Chiết tách, xác định thành phần hoá học, cấu trúc hợp chất hoá học trong lá cà
phê chè
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
- 4 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
- Nghiên cứu lý thuyết: phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng
quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của cây
cà phê chè.
- Phương pháp thực nghiệm:
+ Phương pháp lấy mẫu: lá được thu hái, rửa thật sạch bằng nước sau đó phơi

khô, xay thành bột mịn.
+ Phương pháp trọng lượng để xác định độ ẩm, hàm lượng tro của lá cà phê chè.
+ Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS để xác định hàm lượng kim
loại nặng trong lá cà phê chè.
+ Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS để xác định mật độ quang của các
dịch chiết.
+ Phương pháp chiết soxhlet để chiết các hợp chất có trong thành phần của lá cà
phê chè.
+ Định tính một số nhóm chất (sterol, ankaloid, flavonoid, saponin).
+ Phương pháp GC – MS để định danh, xác định hàm lượng các hợp chất hoá
học trong lá cà phê chè.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa thực tiễn: Giải thích một cách khoa học các kinh nghiệm dân gian,
thuận tiện cho việc ứng dụng.
- Ý nghĩa khoa học: Cung cấp thêm thông tin về lá cà phê chè như một số chỉ
tiêu hóa lý, khảo sát thành phần hóa học và cấu tạo của một số hợp chất có trong lá cà
phê chè.
6. Bố cục đề tài
Đề tài gồm 38 trang trong đó có 10 bảng và 15 hình. Phần mở đầu (3 trang), kết
luận và kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (1 trang) và phần phụ lục. Nội dung của
đề tài chia làm 3 chương:
- 5 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Chương 1- Tổng quan (10 trang)
Chương 2- Những nghiên cứu thực nghiệm (10 trang)
Chương 3- Kết quả và bàn luận (12 trang)

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Cây cà phê chè [7],[8]
Cà phê là tên một chi thuộc họ Thiên thảo (Rubiaceae). Họ này bao gồm
khoảng 500 chi khác nhau với trên 6000 loài cây nhiệt đới.
Cây cà phê chè thuộc họ Rubiaceae, bộ Gentianales, loài C. Arabica.
Cà phê arabica còn được gọi là Brazilian Milds nếu nó đến từ Brazil, gọi là
Colombian Milds nếu nó đến từ Colombia, và gọi là Other Milds nếu đến từ các nước
khác.
Hiện nay, Brazil và Colombia là hai nước xuất khẩu chính loại cà phê này.
Bên cạnh đó còn một số quốc gia khác cũng xuất khẩu như Ethiopia, Mexico,
Guatemala, Hondurus, Peru, Ấn Độ,
1.1.1. Nguồn gốc
Cà phê chè có nguồn gốc từ cao nguyên nhiệt đới Ethiopia đông châu Phi. Sau
đó cà phê chè được người Hà Lan đem trồng trên các miền đất thuộc địa của họ. Năm
1718, người Hà Lan mang cà phê chè tới Surinam, năm 1725 người Pháp mang tới
- 6 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Cayenne Cuối thế kỷ 18 cà phê chè được trồng ở khắp các xứ sở nhiệt đới, chủ yếu
do sự bành trướng thuộc địa của các đế quốc châu Âu.
Cà phê lần đầu tiên được đưa vào Việt Nam vào năm 1875, giống Arabica
được người Pháp mang từ đảo Bourton sang trồng ở phía Bắc sau đó lan ra các tỉnh
miền Trung như Quảng Trị, Quảng Bình, … Sau thu hoạch chế biến dưới thương hiệu
“Arabica du Tonkin”, cà phê được nhập khẩu về Pháp. Sau khi chiếm nước ta thực dân
Pháp thành lập các đồn điền cà phê như Chinê, Xuân Mai, Sơn Tây. Chúng canh tác
theo phương thức du canh du cư nên năng suất thấp, những năm đầu giảm từ 400 –
500 kg/ha, những năm sau giảm xuống còn 100 – 150 kg/ha. Để cải thiện tình hình,
Pháp du nhập vào nước ta hai giống mới là cà phê vối (C. robusta) và cà phê mít (C.

mitcharichia) vào năm 1908 để thay thế, các đồn điền mới lại mọc lên ở phía Bắc như
ở Hà Tĩnh (1910), Yên Mỹ (1911, Thanh Hoá), Nghĩa Đàn (1915, Nghệ An). Thời
điểm lớn nhất (1946 – 1966) đạt 13.000 ha. Năm 1925, lần đầu tiên được trồng ở Tây
Nguyên, sau giải phóng diện tích cà phê cả nước khoảng 20.000 ha, nhờ sự hỗ trợ vốn
từ quốc tế, cây cà phê dần được chú trọng, đến năm 1980 diện tích đạt 23.000 ha, xuất
khẩu trên 6.000 tấn. Bản kế hoạch ban đầu được xây dựng năm 1980 đặt mục tiêu cho
ngành cà phê Việt Nam có khoảng 180.000 ha với sản lượng 200.000 tấn. Sau đó, bản
kế hoạch này đã nhiều lần sửa đổi. Các con số cao nhất dừng lại ở mức 350.000 ha với
sản lượng 450.000 tấn (Theo hiệp hội cà phê – ca cao Việt Nam, 2002).
1.1.2. Sự phân bố và đặc điểm sinh thái
Cà phê là cây nhiệt đới nên đòi hỏi nhiệt độ, ánh sáng, lượng mưa khá cao. Cà
phê chè ưa mát, nhiệt độ tối ưu 20
0
C – 22
0
C, ánh sáng tán xạ nên được trồng ở vùng
núi cao từ 600 – 2500m, lượng mưa cần thiết từ 1300 – 1600 mm/năm, có khả năng
chịu được biên độ nhiệt độ lớn. Tuy nhiên, ở nhiệt 0
o
C trở xuống thì lá cây bị rụng,
chồi bị chết, cành bị khô, nhiệt độ trên 30
o
C kéo dài thì cũng dẫn đến hiện tượng lá
héo rồi cháy khô và rụng. Do đó cây cà phê chè thích hợp trồng ở khu vực khí hậu á
nhiệt đới và vùng cao nguyên ở các nước nhiệt đới. Ở Việt Nam, cà phê chè được
trồng chủ yếu ở Tuyên Quang, Hà Giang, Gia Lai, Kon Tum ngoài ra còn được trồng
rải rác ở khu vực miền Trung như Quảng Trị,Thanh Hoá
- 7 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Cà phê chè sau khi trồng khoảng 3 – 4 năm thì có thể bắt đầu thu hoạch. Thường

cà phê 25 tuổi được coi là già mặc dù nó có thể sống đến 70 năm. Hiện nay, cà phê chè
đang được Nhà nước khuyến khích phát triển ở Đông Nam Bộ, song do cà phê chè
chín sớm, giai đoạn chín lại rơi vào mùa mưa nên rất khó khăn cho việc thu hoạch,
phơi sấy và bảo quản. Thời gian mang quả trên cây từ lúc bắt đầu đến khi chín là 7 – 8
tháng.
1.1.3. Đặc điểm hình dáng
Cây cà phê chè có dạng bụi lớn, thẳng đứng, cao khoảng 2 – 3m. Cây mọc dại
có thể cao đến 15m (hình 1.1).








Hình 1.1. Cây cà phê chè
+ Cành thon, dài, đối xứng.
+ Lá mọc đối xứng, cuống lá ngắn từ 0.4 – 1.2cm. Lá có hình oval, nhọn ở hai
đầu, rìa lá quăn, mềm và rủ xuống. Chiều dài của lá từ 7 – 20cm, rộng 4 – 6cm. Mặt lá
nhẵn, mặt trên lá có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt hơn.
+ Vỏ cây mỏng, có màu xám nhạt và trở nên sần sùi, nứt nẻ khi già.
+ Gỗ cây có màu nhạt, cứng, nặng và chắc.
- 8 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
+ Hoa có năm cánh, màu trắng, có hương thơm. Hoa mọc thành từng cụm hoa
gồm 2 – 9 cái (hình 1.2).

Hình 1.2. Hoa cà phê chè
+ Trái hình oval, trái xanh khi chín có màu đỏ tươi sau đó chuyển dần sang màu
xanh đen. Trái dài 1.0 – 1.8cm và rộng 0.8 – 1.2cm. Trái chứa hai hạt hơi dẹt và thon,
có màu xanh lá (hình 1.3).







Hình 1.3. Quả cà phê chè
1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hoá học của cây cà phê chè [11]
1.2.1. Thành phần dinh dưỡng
Thành phần dinh dưỡng trong 100g nhân cà phê được thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của quả cà phê chè
- 9 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Thành phần
Hàm lượng (%)
Nước
8 -12
Caffein
0.8 - 2
Chất béo
4 - 8
Protein

9 - 16
Đạm
1.8 – 2.5
Tanin
2
Axit caffeic
8 - 9
Pantoxan
5
Tinh bột
5 - 23
Dextrin
0.85
Đường
5 - 10
Cellulose
10 - 20
Hemicellulose
20
Lignin
4

1.2.2. Thành phần hoá học
Thành phần hoá học thay đổi tuỳ theo từng bộ phận:
- Vỏ quả: có màu đỏ do có chất antoxian và các vết ankaloid, trong vỏ chứa
21,5 – 30% chất khô (tanin, caffein, ).
- 10 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
- Vỏ trấu: chứa chủ yếu là cellulose và khoảng 0,4% caffein.
- Nhân: nước chiếm 10 – 12%, protein chiếm 9 – 11%, lipid chiếm 10 –

13%, các loại đường chiếm 5 – 10%, tinh bột chiếm 3 – 5%
- Lá: có chứa 1-hexatriacontanol, ß–sitosterol, stigmast–5(6),22(23)–dien-
3ß–yl 1-O–ß –D-glucopyranosid và caffein, 3ß-hydroxilup-12(13)-en-28-oic, axit
ursolic.
1.3. Giá trị sử dụng của lá cà phê chè
1.3.1. Dược tính của lá cà phê chè
Một số kết quả nghiên cứu cho thấy lá cà phê chè có tác dụng chữa bệnh sỏi
thận rất tốt. Bằng chứng là một số bệnh nhân tình nguyện chữa bệnh bằng phương
pháp Đông y, sau đó được kiểm tra bằng phương pháp siêu âm thì ghi nhận được chỉ
số của bệnh nhân có sỏi thận kích cỡ nhỏ hơn 10mm đều hết sỏi, số bệnh nhân có sỏi
lớn hơn 10mm thì kích cỡ sỏi giảm hơn một nửa so với kích thước ban đầu.
Ngoài ra, thành phần lá cà phê chè còn được dùng để chống lại 2 căn bệnh thế kỷ
là ung thư và HIV. Tuy nhiên, nó còn đang được nghiên cứu và tìm hiểu chưa đưa vào
ứng dụng thực tiễn.
1.3.2. Một số bài thuốc chữa bệnh sỏi thận trong Y học cổ truyền
Cho đến nay, Y học dân gian Việt Nam đã sử dụng khá nhiều bài thuốc, dược
liệu để điều trị bệnh sỏi thận. Dưới đây là một số bài thuốc và dược liệu để điều trị sỏi
thận.
* Giáng Thạch Thang: Cam thảo tiêu 30g, Đông quỳ tử 10g, Giáng hương 3g,
Hải kim sa 10g, Hoạt thạch 10g, Kê nội kim 10g, Kim tiền thảo 30g, Ngư não thạch
10g, Xuyên ngư đằng 10g. Sắc uống.
Tác dụng: thanh nhiệt, sỏi đường tiết niệu.
- 11 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
* Tang Căn Tang Kim Nhị Thạch Thang: Hải kim sa 30g, Hoạt thạch 30g, Kê
nội kim (rang với cát) 10g, Kim tiền thảo 30g, Ngư đằng 10g, Tang phụ căn 30g,
Thạch vi 16g, Tỳ giải 10g, Vương bất lưu hành 10g. Sắc uống.
Tác dụng: thanh nhiệt, thông lâm, chỉ thống, trị thận hư, sỏi đường tiểu.
* Thông Phao Thang: Bại tương thảo 16g, Biển súc 6g, Cát cánh 4g, Cù mạch
6g, Lậu lô 10g, Mông hoa 16g, Thanh bì 10g, Vương bất lưu hành 15g. Sắc uống.

Tác dụng: Hành ứ, thông lâm. Trị thấp nhiệt ở bàng quang, ứ trệ hạ tiêu, sỏi
đường tiểu.
* Trân Kim Thang Gia Giảm: Hải kim sa 16g, Kê nội kim 12g, Lộ lô thông 16g,
Mạch môn 10g, Tiểu hồi 10g, Trạch tả 12g, Trân châu 60g, Ty qua lạc 12g, Vương bất
lưu hành 12g. Sắc uống.
Tác dụng: thanh nhiệt, lợi thấp, thông lâm, bài thạch. Trih thấp nhiệt hạ chú, uất
kết lâu ngày làm tạp chất của nước tiểu đọng lại thành sỏi, đường tiểu có sỏi.
* Niệu Lộ Bài Thạch Thang: Biển súc 24g, Chi tử 20g, Chỉ xác 10g, Chích thảo
10g, Cù mạch 15g, Đại hoàng 12g, Hoạt thạch 15g, Kim tiền thảo 30g, Mộc thông
10g, Ngư tất 15g, Thạch vi 30g, Xa tiền sử 24g. Sắc uống.
Tác dụng: Tiêu sỏi, thông lâm, hành khí, hoá ứ, thanh lợi, thấp nhiệt. Trị sỏi ở
đường tiểu.
* Liệu Lộ Kết Thạch Thang: Bạch vân linh 10g, Hải kim sa 15g, Hoạt thạch 12g,
Hổ phách 3g, Kim tiền thảo 15g, Mộc thông 6g, Thanh bì 10g, Xa tiền tử 10g. Sắc
uống.
Tác dụng: lợi thấp, hoá ứ, trị sỏi ở bàng quang.
* Thược Dược Cam Thảo Thang Gia Vị: Bạch thược, Trân châu mẫu 30g, Cam
thảo, Đàn hương, Nga truật, Nguyên hồ, Hồi hương đều 10g, Điền sâm, Mạch môn,
Bạch vân linh 12g. Sắc uống.
- 12 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Tác dụng: hoãn cấp, chỉ thống. Trị thận hư, lưng đau, khí âm đều suy, khí
nghịch, sỏi niệu quản.
* Phụ Kim Thang: Kim tiền thảo 30g, Phụ tử 12g, Thục địa 20g, Trạch tả 10g.
Sắc uống.
Tác dụng: Ôn thận, hành thuỷ. Trị thận khí hư tổn, sỏi đường tiểu.
Hầu hết các bài thuốc trị sỏi thận ở trên gồm nhiều vị thuốc phổ biến, điều trị
kéo dài. Riêng bài thuốc cổ truyền của dân tộc Dao, thuộc loại độc vị, đó là bài thuốc
cổ truyền khá độc đáo chỉ sử dụng một loại thảo dược là lá cây cà phê chè, tác dụng
bài sỏi thận với kích thước nhỏ hơn 10mm là rất tốt trong thời gian ngắn 20-30 ngày.

Bài thuốc này đã được đồng bào dân tộc Dao sử dụng rất có hiệu quả như sau:
+ Thu hái thuốc: Thu hái quanh năm, thời gian thu hái thích hợp nhất trong ngày
từ 9-12 giờ sáng, lá thu hái là là các lá bánh tẻ hoặc già hơn.
+ Sơ chế và bảo quản thuốc: Sau khi thu hái, lá cà phê được hong khô hoắc sấy ở
nhiệt độ 60
0
C, tránh ánh nắng càng tốt. Khi lá đủ khô được đem đi thái hoặc nghiền
nhỏ (giống như chè cám) và bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát.
+ Cách sử dụng: lấy 10-20g lá cà phê chè đã sấy khô nghiền nhỏ cho vào 750ml
nước sôi chiết được khoảng 700ml dịch và dùng uống hết trong ngày (uống 4-5 lần
sáng, trưa, chiều, tối). Khoảng thời gian điều trị từ 20-30 ngày tuỳ thuộc kích cỡ viên
sỏi.
Tác dụng: có tác dụng bài sỏi thận với kích cỡ nhỏ hơn 10mm rất tốt chỉ trong
thời gian ngắn 20-30 ngày.
Hiện nay, người ta cũng biết nhiều về hạt cà phê nhưng thành phần hoá học và
tác dụng của lá cà phê chè (Coffea arabica) chưa thấy có tài liệu, báo cáo nào đề cập.
1.4. Một số ankaloid sử dụng trong y học
1.4.1. Giới thiệu chung về ankaloid
- 13 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Ngày nay, khái niệm ankaloid được hiểu là các hợp chất tồn tại trong giới thực
vật (thường là các hợp chất vòng) chứa nitơ, có tính kiềm yếu và phần lớn trong số
chúng có hoạt tính sinh học mạnh, ở liều cao là những chất độc, còn với liều thấp hơn
chúng lại là những dược phẩm vô cùng hữu ích và tên “ankaloid” nghĩa là có tính kiềm
yếu.
Các hợp chất ankaloid là một trong những nhóm dược phẩm dị vòng chứa nitơ
quan trọng nhất, cho dù trong những năm gần đây có rất nhiều dược phẩm dị vòng
chứa nitơ đã được tổng hợp và đưa ra chữa bệnh.
Trong cùng một thực vật, các ankaloid thường có cấu trúc hoá học gần giống
nhau. Ankaloid trong tự nhiên phần lớn thường ở dạng liên kết (dạng muối) với các

axit hữu cơ đơn giản (axit axetic, axit oxalic, axit táo, axit chanh, ), đôi khi trong một
vài thực vật (đặc biệt trong các thực vật giàu ankaloid) các ankaloid chỉ liên kết với
các axit hữu cơ đặc trưng với chúng như: axit fumaric, axit cevadinic, axit meconic,
Phần lớn các ankaloid là các hợp chất tinh thể rắn, một vài hợp chất trong số
chúng dạng lỏng có thể làm sạch bằng phương pháp chưng cất mà không bị phân huỷ
(nicotin, arecolin, coniin, ) ở nhiệt độ phòng. Các ankaloid rắn thường có vị đắng
còn các ankaloid lỏng thường có vị cay.
Các hợp chất ankaloid ở dạng bazơ tự do hầu hết không tan trong nước, tuy
nhiên tan tốt trong chloroform. Trong các ankaloid thường chứa các cacbon bất đối,
hoạt động quang học (
)
D

và thường chỉ tồn tại trong thực vật ở một dạng nhất định.
1.4.2. Phân tích định tính
Người ta đã sử dụng khá nhiều thuốc thử để xác nhận sự có mặt của ankaloid
trong thực vật. Do cơ sở các phản ứng hoá học của ankaloid phần lớn không rõ ràng,
nên người ta chỉ phân biệt các phản ứng này là các phản ứng màu hoặc phản ứng tạo
tủa.
1.4.2.1. Các phản ứng tạo tủa
- 14 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
* Thuốc thử Mayer: K
2
HgI
4
[kali-thuỷ ngân (II) iodua-kaliumiodomercurat]: Là
thuốc thử ankaloid thông thường cho tủa màu trắng (vàng trắng) không tan kể cả dung
dịch axit loãng.
* Thuốc thử Bouchardat hay Wagner: KI

3
[dung dịch kali-iodua 0,1N + I
2
]: cho
tủa kết tinh màu nâu đỏ sẫm với ankaloid.
* Thuốc thử Dragendorff hay Kraut: KBiI
4
[kali-bizmut-iodua]: cho tủa kết tinh
màu vàng cam với ankaloid.
* Natri-tetraphenyl-borat Na[B(C
6
H
5
)
4
]: cho tủa màu trắng trong axit axetic.
1.4.2.2. Các phản ứng tạo màu
Trong số các phản ứng ankaloid, phản ứng của ankaloid với các axit khoáng đặc
đôi khi cho chúng ta khả năng phân biệt. Các phản ứng chỉ cho kết quả tốt đối với
ankaloid có độ sạch nhất định. Đặc biệt lá các phản ứng tạo màu với axit H
2
SO
4
đậm
đặc dựa trên cơ sở khả năng hút nước và ôxy hoá của nó.
* Tác nhân Erdmann: 20ml axit H
2
SO
4
đậm đặc + 10 giọt (dung dịch 100ml

chứa 10 giọt axit HNO
3
).
Phản ứng không màu với các ankaloid: atropin, coniin, nicotin, caffein, quinin,
cocain, strychnin.
Đỏ, vàng: Brucin
Vàng cam, đỏ máu: Veratrin
Nâu đỏ, nâu sẫm: Papaverin
Đỏ máu, vàng: Tebain
* Tác nhân Thalleiochin: nước clo (brôm) + amoniac.
Xanh lá cây: quinin, quinidin
* Tác nhân Arnold-Vitali: lượng nhỏ KNO
2
+ axit H
2
SO
4
đậm đặc.
Màu tím: Atropin, hyoscyamin, scopolamin
- 15 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Đỏ tím: Strychnin

CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Thu gom nguyên liệu
Lá cà phê chè được thu hái ở huyện Krông Păk, tỉnh Đăk Lăk.
Tên khoa học: Coffea arabica L., thuộc họ Rubiaceae.
2.1.2. Xử lý nguyên liệu
Lá cà phê chè sau khi được thu hái về thì đem xử lý sơ bộ như sau:
- Loại những lá úa
- Rửa thật sạch bề mặt bên ngoài (hình 2.1)
- Phơi khô (hình 2.2)
- Xay thành bột (hình 2.3)
- 16 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân







Hình 2.1. Lá cà phê chè tươi

Hình 2.2. Lá cà phê chè phơi khô




- 17 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân




Hình 2.3. Bột lá cà phê chè
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
2.2.1. Thiết bị - Dụng cụ
Bộ chiết soxhlet, máy cô quay chân không, máy quang phổ UV – VIS (Trung
tâm khí tượng thuỷ văn quốc gia – Đài khí tượng thuỷ văn khu vực Trung Trung bộ,
660 Trưng Nữ Vương, Đà Nẵng), máy hấp thụ nguyên tử AAS (Trung tâm khí tượng
thuỷ văn quốc gia – Đài khí tượng thuỷ văn khu vực Trung Trung bộ, 660 Trưng Nữ
Vương, Đà Nẵng), máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS (Trung tâm kỹ thuật đo
lường chất lượng II, số 2, Ngô Quyền, Đà Nẵng).
Cân phân tích (độ chính xác tới 0.001g), phễu chiết, giấy lọc, bình cầu, bình
định mức, đũa khuấy, buret, pipet, bếp cách thuỷ, tủ sấy, lò nung, cốc sứ, bình hút ẩm
và các dụng cụ khác.
2.2.2. Hoá chất
Dung môi: n-hexan
Hoá chất vô cơ: FeCl

3
, HNO
3
, nước cất, H
2
SO
4
, HCl, NaOH, Mg
Hoá chất hữu cơ: Anhydrid axetic, chloroform
2.3. Sơ đồ nghiên cứu
- 18 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân

2.4. Các phƣơng pháp xác định một số chỉ tiêu hoá lý
2.4.1. Xác định độ ẩm
- Chuẩn bị 5 chén sứ có kí hiệu sẵn, rửa sạch và tráng bằng nước cất, sấy cho
khô sau đó cân lấy khối lượng m
1
(g).
- Cân 5g bột lá cà phê chè trên cân phân tích, cho vào chén sứ đã sấy ở 100
0
C
chuẩn bị sẵn ta có m
2
(g).
- Cứ sau 2h lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội rồi cân, làm như vậy cho
đến khi khối lượng mẫu và cốc chênh nhau giữa mỗi lần không quá 0.005g ta lấy kết
quả m
3
(g).

- Công thức:
* Độ ẩm của mỗi mẫu
W(%) =
%100
)(
2
321


m
mmm
( 2.1)
Lá cà phê chè
Phơi khô, xay nhuyễn
Bột lá cà phê chè
Xác định hàm lượng kim
loại nặng
Xác định: độ ẩm, hàm
lượng tro
Chiết bằng phương
pháp chiết soxhlet
Khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng
Khảo sát thời gian
chiết
Dịch chiết

Định tính một số nhóm
chất

Khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng (nhiệt độ, pH)
Nghiên cứu xác định thành phần
hoá học các hợp chất trong dịch
chiết (Đo GC – MS)

- 19 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
* Độ ẩm trung bình
W
TB
(%)=
n
W
n

1
(%)
(2.2)
Trong đó:
m
1
: Khối lượng chén sứ (g)
m
2
: Khối lượng bột lá cà phê chè (g)
m
3
: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)
n: Số lần xác định W(%)
2.4.2. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật, thực
vật người ta dùng các phương pháp tro hóa mẫu.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương
pháp khô. Các mẫu lá cà phê chè (khối lượng m
3
) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục
được sử dụng để tro hóa. Các mẫu được cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở
500-600
0
C trong thời gian từ 4 – 6h, cho đến khi thu được tro trắng.
Khối lượng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến
khối lượng không đổi, có khối lượng m
4
.
Công thức tính:
% tro =
%100
2
14


m
mm
( 2.3)
% tro trung bình =
n
tro
n


1
%
( 2.4)
Trong đó:
- 20 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
m
1
: Khối lượng chén sứ (g)
m
2
: Khối lượng lá cà phê chè ban đầu (g)
m
4
: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)
n: Số lần xác định % tro
2.4.3. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong lá cà phê chè bằng phương
pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS [4]
Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO
3
loãng, định mức
bằng nước cất và xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ
nguyên tử.
Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) là một kỹ thuật phân tích tương đối mới
đã và đang được phát triển mạnh mẽ được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa
học, kỹ thuật ở các nước phát triển. Đối tượng của phương pháp phân tích theo phổ
hấp thụ nguyên tử là lượng nhỏ các kim loại và một số á kim trong rất nhiều đối tượng
mẫu: quặng, đất, nước khoáng, các mẫu sinh học, y học, các sản phẩm nông nghiệp,
thực phẩm, nước uống, phân bón, vật liệu Với trang bị kỹ thuật hiện nay người ta có
thể định lượng được hầu hết các kim loại và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppb

(nanogam) với sai số không lớn hơn 15%.
Cơ sở lý thuyết của phép đo là sự hấp thụ năng lượng ánh sáng (bức xạ đơn sắc)
của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của
nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ theo định luật hấp thụ ánh sáng Lambert –
Beer.
Mẫu được nguyên tử hóa bằng phương pháp ngọn lửa, với hỗn hợp khí đốt là
C
2
H
2
– không khí. Định lượng bằng phương pháp lập đường chuẩn. Các dung dịch
chuẩn được pha chế từ các dung dịch chuẩn gốc chứa các kim loại với nồng độ
1000ppm.
2.5. Phƣơng pháp chiết và khảo sát các điều kiện chiết từ lá cà phê chè
2.5.1. Phương pháp chiết
- 21 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Phương pháp chiết là phương pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách
biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Có thể chiết
từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn.
Phương pháp soxhlet
Thiết bị chiết soxhlet là thiết bị cho phép chiết tuần hoàn các chất rắn (hình
2.4). Nguyên tắc của phương pháp chiết này là đun nóng dung môi trong bình cầu cho
hơi dung môi đi lên bình chiết chứa chất cần chiết (đã được gói kỹ bằng giấy lọc hoặc
vải), dung môi sau khi bay hơi lên gặp sinh hàn rồi ngưng tụ và lại chảy vào bình
chiết. Khi mực chất lỏng của chất cần chiết ngang bằng với ống nhánh bên ngoài thì
theo nguyên tắc bình thông nhau dịch này sẽ đổ xuống lại bình cầu. Nếu dung môi hoà
tan chất hấp phụ thì chất hữu cơ rắn còn lại trên bình chiết lấy ra làm khô. Nếu dung
môi hoà tan chất hữu cơ thì thu được dung dịch chất hữu cơ trong bình cầu và ta có thể
tiến hành tinh chế theo phương pháp bình thường như cô thu kết tủa hoặc kết tinh lại

bằng dung môi thứ 2.








Hình 2.4. Bộ dụng cụ soxhlet
2.5.2. Khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng
Cho khoảng 10g bột lá cà phê chè vào tờ giấy lọc, gói cẩn thận, cuộn lại bằng
chỉ, cho vào bộ phận tách của dụng cụ soxhlet.
- 22 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Cho lần lượt khoảng 150ml, 200ml, 250ml, 300ml, 350ml dung môi n-hexan
cho vào bình cầu.
Tiến hành chiết soxhlet trong khoảng thời gian 4h ở nhiệt độ sôi của dung môi
là 80
0
C. Lấy dịch chiết tiến hành đo UV – VIS để lấy giá trị bước sóng và độ hấp thụ ở
các bước sóng tương ứng.
2.5.3. Khảo sát thời gian chiết
Cho khoảng 10g bột lá cà phê chè vào tờ giấy lọc, gói cẩn thận, cuộn lại bằng
chỉ, cho vào bộ phận tách của dụng cụ soxhlet.
Cho khoảng 250ml dung môi n-hexan vào bình cầu.
Tiến hành chiết soxhlet trong khoảng thời gian 4h, 6h, 8h, 10h, 12h ở nhiệt độ
sôi của dung môi là 80
0
C. Lấy dịch chiết tiến hành đo UV – VIS để lấy giá trị bước

sóng và độ hấp thụ ở các bước sóng tương ứng.

2.6. Chƣng cất dung môi bằng phƣơng pháp cất quay chân không
Chưng cất là phương pháp thường dùng để tinh chế và tách biệt các chất có
nhiệt độ sôi khác nhau bằng cách đun sôi chất lỏng thành hơi rồi cho ngưng tụ hơi lại
thành chất lỏng tinh khiết.






Hình 2.5. Bộ cất quay chân không
- 23 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Phương pháp chưng cất chân không thường dùng để chưng cất những chất có
nhiệt độ sôi cao hay dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ sôi.
Dụng cụ chưng cất chân không gồm bình claizen có lắp nhiệt kế và mao quản, ống
sinh hàn, bình hứng, áp kế thuỷ ngân, bình bảo hiểm và bơm hút chân không (hình 2.5).
2.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến dịch chiết từ lá cà phê chè
Lấy các mẫu dịch chiết bằng dung môi n-hexan bảo quản trong các điều kiện
khác nhau là để ở nhiệt độ phòng, để ở nhiệt độ 80
0
C, để trong tủ lạnh, sau 4h lấy ra
quan sát.
Lấy các mẫu dịch chiết bằng dung môi n-hexan cho vào 3 ống nghiệm: 1 ống để
đối chứng, 1 ống cho HCl, 1 ống cho NaOH vào và quan sát.
2.8. Khảo sát định tính các dịch chiết
2.8.1. Phát hiện các hợp chất sterol
Lấy 5ml dịch chiết thu được, thêm 2ml NaOH 10% thu được dịch rồi lấy dịch đó

thử định tính sterol bằng thuốc thử Lieberman – Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml
anhydrid axetic + 1ml chloroform để lạnh ở 0
0
C, sau đó cho thêm 1 giọt H
2
SO
4
đậm
đặc). Lấy 1ml dịch trên rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh là
phản ứng dương tính.
2.8.2. Phát hiện các ankaloid
Lấy 5ml dịch chiết thu được, thêm 2ml HCl thu được dịch. Lấy 1ml dịch này
nhỏ thêm 3 – 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
2.8.3. Phát hiện flavonoid
Lấy 5ml dịch chiết, thêm 1 ít bột Mg, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun
trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là phản ứng
dương tính.
2.8.4. Định tính các saponin
- 24 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân
Lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống cho vào 2ml dịch chiết. Ống 1 cho 1ml dung dịch
HCl loãng, ống 2 cho 1 ml dung dịch NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong
vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu
bọt cao quá 3 – 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính.
2.9. Xác định thành phần hoá học các hợp chất từ lá cà phê chè bằng phƣơng
pháp GC-MS [4]
Dịch chiết từ lá cà phê chè thu được tiến hành cất quay chân không thu được cặn
chiết. Gửi mẫu chất rắn này tới trung tâm kỹ thuật đo lường chất lượng II, số 2 Ngô
Quyền, Đà Nẵng để đo phổ GC-MS.
Phương pháp sắc kí khí – khối phổ (GC – MS) dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc

kí khí với máy phổ khối lượng.
Sắc kí khí phân giải cao là một phương pháp hữu hiệu để phân tách các hỗn hợp
phức tạp, đặc biệt là khi nhiều hợp phần trong hỗn hợp có độ phân cực lớn.
Khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét nghiệm được ion hoá
và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân không cao (10
-6
mmHg). Sau quá trình
ion hoá, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một điện trường, được tách trong
một từ trường theo tương quan giữa khối lượng và điện tích của chúng, cuối cùng được
ghi nhận theo cường độ của các hạt đó.
Ở hệ thống GC – MS người ta phải áp dụng những kỹ thuật đặc biệt để loại những
dung môi phân cực dùng cho sắc kí khí trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng.
Toàn bộ quá trình vận hành và ghi kết quả đều được tự động điều khiển bởi computer.





- 25 -
SVTH: Nguyễn Thị Lê Phương GVHD: ThS. Đỗ Thị Thuý Vân

CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá cà phê chè
3.1.1. Độ ẩm
Lá cà phê chè sau khi phơi khô đem tiến hành xác định độ ẩm. Số lượng mẫu
được lấy để xác định độ ẩm là 5 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm
STT
m
1
(g)
m
2
(g)
m
3
(g)
W(%)
W
tb
(%)
1
104.087
4.987
108.257
16.380

2
105.300
4.981
109.475
16.180