Nghiên cứu khả năng kích thích hệ miễn dịch chống ung thư của các alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây trinh nữ hoàng cung (crinum latifolium l ) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ


CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
VỀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ
GIỮA VIỆT NAM VÀ BUNGARI


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH
CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC ALCALOID VÀ FLAVONOID
ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L.) ĐỂ SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN
XUẤT THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ



Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Công ty CP Dược Liệu TW2
Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS. Nguyễn Thị Ngọc Trâm



7588
08/01/2010

Hà Nội - 2009
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Trong báo cáo này chúng tôi có sử dụng một số từ viết tắt và các ký hiệu như
sau:

HPLC: High Performance Liquid Chromatography – sắc ký lỏng hiệu năng cao
IR Infrared spectroscopy – phổ hồng ngoại.
UV Ultraviolet spectroscopy – phổ tử ngoại
1
H - NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân H
1

13
C - NMR
Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân
các bon 13.
GC/MS Gas Chromatography – Mass Spectroscopy – sắc ký khí / khối phổ
GAP Good Agricultural Practice
TNHC Trinh Nữ Hoàng Cung
TT Thuốc Thử
EIMS Electron Impact Mass Spectroscopy – Phổ điện tử
PBMN Peripherial Blood Mononuclear Cells
FCS Foetal Calf Serum
Con - A Concanavalin A
PHA Phytohemagglutinin
CSF Colony stimulative Facters
DPPH 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl
SC Scaverging Capacity.

FBS Fetal Bovine Serum ( Huyết Thanh Bê)
PBS Psychedelic Benzodiazepin Solution
GTBH
S
Graffi Tumors Bearing Hamster
TLC Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG
1. Bảng 1: Máy móc thiết bị
2. Bảng 2: Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn C
1

bằng GC-MS.
3. Bảng 3: Dữ liệu phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR, HMBC của HCB01.
4. Bảng 4: Suy giảm số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu ở
chuột chiếu tia (nhận dạng bằng hình thái học) và tác dụng phục
hồi của Crila đối với các dòng này.
5. Bảng 5: Các dưới nhóm tế bào lympho máu ngoại vi (xác định
bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp) ở chuột bị chiếu tia và điều
trị bằng Crila.
6. Bảng 6: Tỉ
lệ % của các dưới nhóm tế bào lympho lách (xác định
bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp).
7. Bảng 7: Khả năng chế tiết TNFα và IL-2 của tế bào lách của chuột
chiếu tia được điều trị với Crila.
8. Bảng 8: Hoạt tính chống ôxy hóa của Crila và các phân đoạn.

9. Bảng 9: Sơ đồ pha mẫu theo các thang nồng độ chất thử.
10. Bảng 10: Kết qu
ả - dòng Hep-G2.
11. Bảng 11: % tế bào sống sót.
12. Bảng 12: Kết quả thực nghiệm hoạt tính gây độc tế bào các dòng
ung thư nghiên cứu.
13. Bảng 13: Giá trị IC
50
đối với các dòng ung thư nghiên cứu.


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
1. Ảnh 1: Crila, 24 h.
2. Ảnh 2: Crila, 48h.
3. Ảnh 3: Crila, 48h
4. Ảnh 4: H
1
, 24h.
5. Ảnh 5: C
1
, 24h.
6. Ảnh 6: ConA. 24h.
7. Ảnh 7: Cụm tế bào Tuỷ xương chuột nhắt nuôi cấy trong môi
trường lỏng.
8. Ảnh 8: Cụm tế bào Tuỷ xương chuột nhắt nuôi cấy trong môi
trường thạch.
9. Ảnh 9: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào của thuốc viên
CRILA in vitro
10. Ảnh 10: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào của thuốc viên
CRILA in vitro

11. Ảnh 11: hoạt tính chống kh
ối u, gây độc tế bào của thuốc viên
CRILA in vitro
12. Ảnh 12: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào của thuốc viên
CRILA in vitro
13. Ảnh 13: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum
latifolium L. phân đoạn H
1

14. Ảnh 14: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum
latifolium L. phân đoạn H
1.

15. Ảnh 15: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum
latifolium L. phân đoạn H
1


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
1. Biểu đồ 1: Tỷ số Kyn/trp (% các tế bào đã được kích thích bằng PHA)
2. Biểu đồ 2: Tỷ số Kyn/trp (% các tế bào đã được kích thích bằng PHA)
3. Biểu đồ 3: Sự tạo thành neopterin % các tế bào đã được kích thích.
4. Biểu đồ 4: Sự tạo thành neopterin % các tế bào đã được kích thích.
5. Biểu đồ 5: Đồ thị tính giá trị IC
50
của mẫu.
6. Biểu đồ 6: Mẫu C
3
- Dòng Hep-G2
7. Biểu đồ 7: Mẫu C

2
- Dòng Hep-G2
8. Biểu đồ 8: Hiệu quả in vivo của Crila và các phân đoạn đối với sự tăng
trưởng khối u của chuột cống dùng trong thí nghiệm với
methylcholanthrene.
9. Biểu đồ 9: Thời gian sống trung bình (MST) của chuột cống mang
khối u được chữa trị với Crila và các phân đoạn.
10. Biểu đồ 10: Tỉ lệ chết (%) của chuột cống mang khối u, được ch
ữa trị
với Crila và các phân đoạn.
11. Biểu đồ 11: Kích thước khối u (mm) của chuột Hamster, được chữa
trị với CRILA.
12. Biểu đồ 12: Thời gian sống trung bình của chuột Hamster mang khối
u Graffi được chữa trị với Crila.
13. Biểu đồ 13: Khả năng cấy ghép (%) ở chuột Hamster, được chữa trị
với Crila.
14. Biểu đồ 14: Tỉ lệ chết (%) củ
a chuột Hamster mang khối u Graffi,
được chữa trị với Crila.
15. Biểu đồ 15: Khả năng cấy ghép (%) khối u tế bào tủy Graffi của chuột
Hamster, được chữa với thuốc viên Crila.
16. Biểu đồ 16: Tỉ lệ chết (%) của chuột Hamster mang khối u tế bào tuỷ,
được chữa trị với thuốc viên Crila.
17. Biểu đồ 17: Thời gian sống trung bình của GTBH, được chữa trị với
thuố
c viên Crila.
18. Biểu đồ 18: Kích thước (mm) khối u ở chuột Hamster mang khối u
điều trị với Crila.
MỤC LỤC
Nội dung trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ Crinum
latifolium L…………………………………………… 2
1.1. T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc 2
1.2. T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc 8
1.3. Các thuốc kích thích hệ miễn dịch 11
2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC
QUỐC TẾ 13

3. MỤC TIÊU CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ 13
4. NỘI DUNG CỦA NHIỆM VỤ 13
4.1. Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá cây Trinh nữ
hoàng cung Crinum latifolium L. 13
4.2 Đánh giá tác dụng sinh học in vitro và in vivo của các phân đoạn
alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây TNHC (Crinum
latifolium L.) 14
CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 1
5
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17
3.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá của cây
Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L. 17
3.1.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây TNHC
(Crinum latifolium L.) 17
3.1.2 Chiết xuất các phân đoạn flavonoid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.) 20
3.1.3 Máy móc thiết bị 22
3.1.4 Xác định thành phần hóa học của phân đoạn alcaloid C

1
và
phân đoạn flavonoid H
1
22
3.1.5 Tiêu chuẩn hóa sản phẩm 26

3.2 Đánh giá tác dụng sinh học của các phân đoạn Alcaloid và
Flavonoid chiết xuất từ lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung 38
3.2.1 Chứng minh tác dụng tăng cường miễn dịch in vivo và
in vitro của các phân đoạn alcaloid, flavonoid và viên nang Crila 38
3.2.1.1 Thí nghiệm in vivo 39
3.2.1.2 Tác dụng gây phân bào (mitogenic activity) in vitro của Crila
và các phân đoạn H
1
(Flavonoid), C
1
(Alcaloid) 44
3.2.1.3 Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của viên nang
Crila và các phân đoạn C
1
, C
2
, C
3
(alcaloid), H
1
(flavonoid)
trên bạch cầu đơn nhân người từ máu ngoại vi 47
3.2.1.4 Tác dụng viên nang Crila trên tủy xương chuột nhắt

nuôi cấy in vitro 49
3.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của viên nang Crila
thông qua phản ứng bao vây gốc tự do 1,1 – diphenyl
– 2 – picrylhydrazyl (DPPH) 51
3.2.3 Thử gây độc tế bào với các dòng ung thư nuôi cấy in vitro 53
3.2.3.1 Với các dòng ung thư phổi, gan, màng tim in vitro 53
3.2.3.2 Thử độc tế bào in vitro của viên nang Crila và phân đoạn
H
1
trên tế bào ung thư tuỷ Graffi nuôi cấy 59
3.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vivo được chứng minh trên
chuột Wistar và chuột Hamster 65
3.2.4.1 Nghiên cứu tác dụng của viên nang Crila và phân đoạn
C
1
, H
1
trên chuột Wistar được gây ung thư do hoá chất
20 – methylcholanthrene 65
3.2.4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc in vivo của viên Crila Việt Nam
sử dụng tại chỗ khối u tế bào tuỷ Graffi ở chuột Hamster 70
3.2.4.3 Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch chống khối u của viên
nang Crila trên chuột Hamster được cấy ghép khối u tế bào tủy Graffi 75
CHƯƠNG IV:
BÀN LUẬN 80
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82
Tài liệu tham khảo 86
Phụ lục

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trên thế giới các nhà khoa học đang nỗ lực tìm kiếm thuốc điều
trị ung thư và hỗ trợ điều trị ung thư từ dược thảo bởi vì các sản phẩm
thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp hóa học và bán tổng hợp
còn có nhiều tác dụng không mong muốn. Thuốc sản xuất từ dược thảo có
tính ưu vi
ệt hơn hẳn làm cho người bệnh trên thế giới ngày càng mong
muốn sử dụng thuốc từ nguồn gốc thiên nhiên. Hiện nay có một câu hỏi
được đặt ra trước các nhà khoa học - Có phải chăng có bao nhiêu loại
bệnh trên trái đất này sẽ có bấy nhiêu cây thuốc để chữa trị mà con người
chưa khám phá được hết? Câu hỏi này đã thôi thúc các nhà khoa học tiếp
tục tìm kiếm, nghiên cứu trong thiên nhiên từ dược thảo, từ động vậ
t,
khoáng vật, v.v… để tìm ra những loại thuốc mới cứu con người thoát
khỏi nguy cơ của căn bệnh ung thư.
Thật kinh hoàng khi người bệnh phải trải qua những khoảnh khắc chờ đợi
kết quả xét nghiệm tế bào, sinh thiết để khẳng định mình có bị ung thư
hay không? Nếu các nhà khoa học đã tìm ra được thuốc chữa bệnh ung
thư, chắc hẳn người bệnh sẽ không ph
ải quá lo âu chờ đợi kết quả xét
nghiệm. Cũng vì vậy, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã và đang
không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm và hy vọng sẽ tìm được các loại thuốc
mới điều trị ung thư đi từ nguồn gốc tự nhiên.
Để góp một phần nhỏ trong sự nghiệp nghiên cứu tìm thuốc mới điều trị
ung thư từ dược thảo và tạo điề
u kiện cho các nhà khoa học mở rộng hợp
tác nghiên cứu với các nước, Bộ Khoa Học Công Nghệ và Bộ Y Tế đã
giúp đỡ chúng tôi thực hiện Nghị định thư giữa Việt Nam và Bungari, với
sự cộng tác nghiên cứu khoa học của các chuyên gia Bungari và các cộng

sự trong nước. Chúng tôi đã được thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu khả
năng kích thích hệ miễn dịch chống ung thư c
ủa các alcaloid và
flavonoid được chiết xuất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều
trị ung thư”.



2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ
Crinum latifolium L.
1.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc.

a. T×nh h×nh bƯnh ung th− vµ đ¸p øng miƠn dÞch chèng ung th−:
Bệnh ung thư là căn bệnh hiểm nghèo, cả thế giới chưa tìm được thuốc
đặc trò. Theo thông tin từ tổ chức Y Tế thế giới số lượng bệnh nhân ung
thư hàng năm khoảng 9 triệu người, số người chết vì căn bệnh ung thư
năm 1909 4%, năm 1990 20%. Từ năm 1990 đến nay tỉ lệ người mắc
bệnh bò tử vong tăng lên nhanh [1]. Trước hiểm hoạ đó các nhà khoa học
đã tập trung nghiên cứu tìm kiếm từ thiên nhiên hoặc từ con đường bán
tổng hợp và tổng hợp hoá học hy vọng rằng sẽ tìm được thuốc chữa trò
ung thư có hiệu quả.
Hiện nay các phương pháp chữa trò ung thư được sử dụng nhiều :
phẫu thuật, xạ trò, hoá trò, điều trò miễn dòch. Thuốc cho bệnh ung thư
trên thế giới hiện có khoảng 90 loại [24], trong đó có nguồn gốc thực vật
là 62%. Thực tế đó đã thúc dục các nhà khoa học tiếp tục đi tìm thuốc
chữa trò ung thư từ dược thảo trong đó có các nhà khoa học Việt Nam.
Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (TNHC) có tên khoa học Crinum latifolium

L. họ thủy tiên Amaryllidaceae, là một cây thuốc quý đã được lưu truyền
trong y học dân gian, nhân dân ta đã sử dụng lá TNHC sắc uống trong
vòng 63 ngày để điều trò bệnh u xơ tuyến tiền liệt [6]. Cây TNHC là cây
hoang dại, theo tác giả Võ Văn Chi [3] cây TNHC còn gọi là cây náng
lá rộng, tỏi lơi lá rộng, mọc hoang ở ven suối trong rừng, một số nơi ở

3
Đồng Nai và cội nguồn của cây TNHC là sống ở vùng Bà Ròa Vũng tàu.
Trong những năm qua, Trung tâm Nghiên cứu Phát Triển Sản Xuất
Dược Phẩm CRINA trực thuộc Công ty CP Dược Liệu TW2 đã tập trung
cây TNHC hoang dại về thành vùng trồng dược liệu sạch theo quy trình
GAP (Good Agricultural Practice) tại Huyện Long Thành – Tỉnh Đồng
Nai, để có nguyên liệu ổn đònh hoạt tính sinh học, sản xuất thuốc điều
trò bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung. Theo tác giả Vũ
Ngọc Lộ, và các tác giả viện Dược liệu (cây thuốc và động vật làm
thuốc tập II) đã viết, theo kinh nghiệm dân gian nhân dân ta thường hái lá
cây Trinh nữ hồng cung phơi khơ, sau đó sao khơ hạ thổ để làm thuốc
chữa các bệnh ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư dạ dày, ung thư phổi,
ung thư tuyến tiền liệt, và một số bệnh ung thư khác. Cây TNHC được
biết tới như loài cây chữa bệnh ung thư nhiều năm nay nhưng nước ta
vẫn chưa có một công trình nghiên cứu khoa học đầy đủ về tác dụng
chữa bệnh của nó. Do đó, chúng tôi nhận thấy cần phải hợp tác với các
nước tiên tiến có điều kiện về trang thiết bò máy móc hiện đại với sự
giúp đỡ của các nhà khoa học có trình độ chuyên môn cao, để chứng
minh khả năng hỗ trợ điều trò bệnh ung thư của cây Trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.)
Cây Trinh nữ hồng cung là một cây thuốc q hiếm. Cây thuốc này
có khả năng tự tổng hợp các chất ức chế sự phát tri
ển của tế bào u. Một
trại dược liệu Trinh nữ hồng cung với điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng

Việt Nam có thể thay cho một nhà máy tổng hợp các alcaloid và flavonoid
có tác dụng kháng u. Thiên nhiên đã ban tặng cho Việt Nam một điều may
mắn là có được cây Trinh nữ hồng cung và thực tế từ kinh nghiệm dân
gian chúng tơi muốn nắm bắt và nhận được từ dược thảo Việt Nam một

4
viên thuốc q điều trị ung thư. Trong số các phương pháp điều trị ung
thư, phương pháp điều trị miễn dịch là phương pháp hiện nay đang được
quan tâm vì con người đã phát hiện ra các kháng ngun đặc hiệu của các
khối u của người. Tiếp theo đó người ta cũng nhận thấy các phản ứng hỗn
hợp giữa các lympho T với các kháng ngun của khối u. Trong các
trường hợp ung thư, các lympho T đượ
c sinh sản chủ yếu là dạng lympho
T CD4
+
và một phần là các lympho T CD8
+
đặc hiệu với các tế bào ung
thư tiết ra TNFα, Boon và các cộng sự (1994) đã phát hiện được một họ
các gen của kháng ngun của ung thư melanoma và gọi là MAGE
(melanoma associated genes). Từ máu của bệnh nhân mang bệnh
melanoma MZ2, họ đã tách được các lympho Tc CD8
+
đặc hiệu với khối u
MZ2-E.
b. Các kết quả đã đạt được của Đề tài và Dự án của Cơng ty CP Dược
Liệu TW2 ®· nghiªn cøu vỊ cây Trinh n÷ hoµng cung (Crinum
latifolium L.)
Trong những năm qua được sự giúp đỡ của Bộ Khoa Học Công
nghệ và Bộ Y Tế, TS. Nguyễn Thò Ngọc Trâm cùng các cộng sự của

Công ty và các Viện nghiên cứu trong và ngoài nước đã nghiên cứu
thành công và đưa ra sản phẩm viên nang cứng CRILA chiết xuất từ
Trinh nữ hoàng cung điều trò phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến
tiền liệt). Sản phẩm này dựa trên kết quả nghiên cứu khoa học của hai
đề tài cấp Bộ và một Dự án sản xuất thử nghiệm cấp Nhà nước:
- Đề tài 1: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất
alcaloid toàn phần từ lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium
L.) dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trò u xơ tuyến tiền liệt, u
xơ tử cung”.

5
- Đề tài 2: “Nghiên cứu tác dụng sinh học và bào chế viên nang cứng
từ cao khô alcaloid toàn phần của lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung trong
điều trò u xơ tuyến tiền liệt” Dự án SXTN – KC.10.DA17: “Hoàn thiện
quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) để sản xuất viên nang điều trò phì
đại lành tính tuyến tiền liệt”
Hai đề tài trên đã được nghiệm thu đánh giá đạt loại khá và dự án
SXTN KC.10.DA17 đạt loại xuất sắc.
Dựa trên kết quả nghiên cứu lâm sàng và đánh giá của Hội Đồng Khoa
Học, Bộ Y Tế đã cho phép Viên nang CRILA được lưu hành toàn quốc
với số đăng ký: VNB-3391-05, sản phẩm được người bệânh tin dùng vì
hiệu quả điều trò cao, đạt 89,18% đối với u xơ tuyến tiền liệt và 79,5%
đối với u xơ tử cung.
Để có được một sản phẩm thuốc đặc trị cho bệnh phì đại lành tính
tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt), u xơ tử cung và thuốc hỗ trợ điều trị
ung thư đòi hỏi phải có nguồn ngun liệu ổn
định về hoạt tính sinh học
ức chế khối u, do đó phải có giống và qui trình trồng trên vùng đất ổn
định. Cơng ty CP Dược Liệu TW2 đã phát triển vùng trồng 20 hecta và

nghiên cứu bảo tồn gen cây Trinh nữ hồng cung. Hiện đang tiếp tục phát
triển vùng trồng và chuẩn bị nghiên cứu phương pháp cấy mơ để so sánh
hoạt tính sinh học ức chế khối u của cây cấy mơ với cây nhân giống tự
nhiên.
c. Thành phần hóa học

* Alcaloid
- Cơng ty Dược Liệu TW2 - Nguyễn Thò Ngọc Trâm và cộng sự đã
tìm ra các alcaloid: 9-Octadecenamide
b
,

6
Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine,
Crinane-3α-ol, Buphanidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline,
6-hydroxybuphanidrine, 6-hydroxypowelline, Crinamidine,
6-hydroxyundulatine, 1β,2β - epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine,
Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one .[48]
- Trường Đại học Dược Hà Nội – Nguyễn Văn Bằng, Vũ Đoan Trang,
và các cộng sự, đã xác đònh trong lá Trinh Nữ Hoàng Cung có alcaloid,
saponin, acid hữu cơ, amino acid. [2]
- Trần văn Sung và cộng sự xác đònh thêm 2 hoạt chất: Lycorin và
Pratorin (Hippadin) [11]
- Võ Thò Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, và các cộng sự xác đònh
được 4 alcaloid: Augustamin, ambelin, crinamidin, 6-hydroxycrinamidin
[5]
- Nguyễn Thò Ngọc Trâm và cộng sự đã nghiên cứu và công bố 32
chất bay hơi có trong lá cây Trinh nữ hoàng cung [49]
* Flavonoid
- ViƯc t×m kiÕm thc ch÷a trÞ ung th− tõ thùc vËt lµ h−íng ®i cđa thêi

®¹i, ®−ỵc c¸c nhµ khoa häc ®Ỉc biƯt quan t©m. Trong nh÷ng n¨m qua nhiỊu
lo¹i thc ®· ®−ỵc ra ®êi phơc vơ cho y häc, song viƯc t×m ra c¸c lo¹i
thc cã hiƯu lùc ch÷a trÞ ung th− vÉn cßn lµ c©u hái lín ®èi víi c¸c nhµ
khoa häc. Trong c¸c h−íng nghiªn cøu nh»m t×m ra c¸c ho¹t chÊt cã kh¶
n¨ng chèng ung th− – Flavonoid lµ một nhóm chất cũng được nhiều nhà
khoa học quan t©m do chóng cã t¸c dơng chèng oxy ho¸ cao, t¸c dơng ®Õn
nhiỊu hƯ Enzym vµ Ýt ®éc tè víi c¬ thĨ, Flavonoid cã thĨ t¸c ®éng lªn c¸c
biÕn ®ỉi sinh ho¸ häc.

7
- Nguyễn Hải Nam và Nguyễn Tiến Vững [8] đã chiết xuất và phân
lập xác đònh cấu trúc của 2 chất sau:
* 4’7 – dihydroxy -3- vinyloxyflavan.
* 4’7 – dihydroxyflavan.
Kết quả này hoàn thiện thêm nghiên cứu về thành phần hóa học của cây
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
* Thành phần hóa học khác của lá Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium L.)
- Nguyễn Công Hào và cộng sự [14] đã chiết tách và phân lập từ lá
tươi Trinh nữ hoàng cung 4 hợp chất: p – hydroxycinnamat metyl, 3,4-
dihidroxycinnamat etyl, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosit và
kaempferol-3-4’-di-O-β-D-glucopyranosit.
d. Tác dụng sinh học
- Nguyễn Thò Ngọc Trâm và cộng sự đã chứng minh trong dòch chiết
bằng nước nóng từ lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung có chứa đựng những
yếu tố hoạt hóa tế bào Lympho T làm cho tế bào Lympho T phát triển
và hoạt động.[12]
- Nguyễn Thò Ngọc Trâm, I.Yanchev, E.Zvetkova. Đã tiến hành thử
nghiệm gây ung thư trên chuột đực giống Wistar từ 50 đến 55 ngày tuổi
bằng cách cấy dưới da hoá chất gây ung thư 20-methylcholanthrene, và

tiến hành thí nghiệm cho uống những chất chiết bằng nước nóng của cây
Crinum latifolium L. (cây Trinh Nữ Hoàng Cung –Việt Nam). Kết quả
đã làm chậm sự tăng trưởng khối u của chuột thí nghiệm [50]

8
- Các tác giả còn chứng minh thêm được 4 phân đoạn alcaloid có tác
dụng gây độc tế bào ung thư da, ung thư màng tử cung, ung thư cơ tim có
kết quả dương tính mạnh [13].
- Để có thuốc hỗ trợ cho điều trò u xơ tuyến tiền liệt (phì đại lành tính
tuyến tiền liệt) và tránh nhầm lẫn cây Trinh Nữ Hoàng Cung với các cây
náng khác có ở Việt Nam, Công ty CP Dược Liệu TW2 đã sản xuất trà
túi lọc Trinh Nữ Hoàng Cung từ 1998 cho đến nay, sản phẩm đã và đang
có uy tín trên thò trường.
- Năm 2001 tại BV Hữu Nghò, Bác só Nguyễn Xuân Hướng sử dụng
nước sắc lá Trinh Nữ Hoàng Cung của Công ty Dược Liệu TW2 cung
cấp để điều trò u xơ tuyến tiền liệt cho các bệnh nhân của bệnh viện
Hữu Nghò Hà Nội, đạt hiệu quả cao. [4].
- Tháng 7 năm 2005 theo quyết đònh của Cục Trưởng Cục Quản lý
Dược Việt Nam, viên nang cứng CRILA do Trung tâm NCPTSX Dược
Phẩm CRINA thuộc Công ty CP Dược liệu TW2 sản xuất từ cao khô
Trinh nữ hoàng cung đã được phép lưu hành toàn quốc điều trò bệnh phì
đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) và tháng 10 năm 2007
được bổ sung thêm tác dụng thứ hai điều trị u xơ tử cung.

1.2. T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc.

Từ những năm 1984 cho đến nay các công trình nghiên cứu về thành
phần hoá học và tác dụng dược lực của Crinum latifolium L. cũng đã
được công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước.
a. Thành phần hoá học

9
- Năm 1984, Ghosal (Ấn Độ) đã phân lập và xác đònh từ cán hoa
Crinum latifolium một glucoalcaloid có tên latisolin. Thủy phân bằng
enzym thu được aglycon có tên latisodin (J. Chan. Res 1984) [27]
- Ghosal và Shibnath còn phân lập được từ thân hành lúc cây đang ra
hoa Pratorimin và Pratosin là 2 alcaloid pyrolophenanthrindon mới cùng
với những chất đã được biết như pratorimin, ambelin và lycorin [28]
- Năm 1986, Ghosal còn công bố tách được từ Crinum latifolium L. một
số dẫn xuất alcaloid có tác dụng chống ung thư: Crinafoline và
Crinafolidine. Các chất này đã được thử nghiệm với tế bào và cho kết
quả dương tính [29]
- Năm 1989, Ghosal còn chiết từ dòch ép của cán hoa cây Crinum
latifolium 2 alcaloid mới có nhân pyrrolophennanthaidin là 2-epilycorin
và 2-epipancrassidin [30]
- Một số nhà khoa học Nhật Bản cũng tìm thấy một số ít alcaloid khác từ
cây Crinum latifolium như: crinamin, hamayne [40]
b. Tác dụng sinh học
Song song với các nghiên cứu về mặt hóa học, có nhiều công trình
nghiên cứu về tác dụng dược lý từ cây Trinh nữ hoàng cung đã được
công bố. Các tác giả đã chứng minh được rằng tác dụng dược lý của các
alcaloid trong họ Amaryllidaceae rất rộng, bao gồm các đặc tính chống
ung bướu, chống vi khuẩn và kích thích miễn dòch.
- Tác giả Yui và cộng sự đã chứng minh alcaloid lycorine là họat chất
chính từ Crinum latifolium L. có tác dụng gây kích thích cho tế bào T
trong ống nghiệm và trên sinh vật hoạt động và phát triển. [54]

10
- Các tác giả Nguyễn Thò Ngọc Trâm, E.ZVETKOVA, E.NIKOLOVA,
E.KATZAROVA và G.KOSTOV cũng đã chứng minh được rằng dòch

chiết nước nóng từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và
đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD3 +T và CD4 + T
trong ống nghiệm. [51]
- Nguyễn Thò Ngọc Trâm, I.Yanchev, E.Zvetkova . Đã tiến hành thử
nghiệm gây ung thư trên chuột đực giống Wistar từ 50 đến 55 ngày tuổi
bằng cách cấy dưới da hoá chất gây ung thư 20-methylcholanthrene, và
tiến hành thí nghiệm cho uống những chất chiết bằng nước nóng của cây
Crinum latifolium L. (cây Trinh Nữ Hoàng Cung –Việt Nam). Kết quả
đã làm chậm sự tăng trưởng khối u của chuột thí nghiệm [53]
- Theo tác giả Ghosal , một số alcaloid từ Crinum latifolium như:
Crinafoline, crinafolidine đã được thử nghiệm với tế bào ung thư và cho
kết quả dương tính. [29]
- Theo tác giả E. Zvetkova, N.T.Tram, D.Fuchs dòch chiết nước nóng
của trà túi lọc Trinh nữ hoàng cung có khả năng kích thích tế bào
lympho T hoạt động và phát triển tăng sức đề kháng của cơ thể mạnh
hơn trà xanh. [58]
- Dòch chiết nước của Crinum latifolium L. có khả năng kích thích tế
bào lympho T của người hoạt động và phát triển [52]
- Dòch chiết nước nóng từ Crinum latifolium L. Việt Nam tạo nên một
số tác dụng mạnh trực tiếp mà nguyên nhân do kích thích một số hỗn
hợp những tế bào Lympho CD4
+
/CD8
+
, là sự sản xuất số lượng lớn

11
những tác nhân diệt ung bướu như TNF - α trong các sinh vật và bệnh
nhân ung thư.

- Các alcaloid ngăn chặn sự phát triển của khối u và kích thích hệ
miễn dòch.
• Epoxyambellin [31] ở nồng độ 5 mg/ml kích họat vừa phải tế bào
Lympho trong lách chuột
• Hỗn hợp Epoxyambellin và ambellin [31] theo tỉ lệ (1:1) gây hoạt
hóa tế bào Lympho T giống như concanavalin A. [32]
• Crinamine và 6 – Hydroxycrinamine [33]
• Hoạt động chống lại tế bào u hắc tố chuột BL6
• Lycorin, crinamin và Augustin [34]
Lycorin ở nồng độ 0,1 – 0,5 mg/ml diệt tế bào MM46 và ức chế sự tổng
hợp DNA (Deoxyribonucleic Acid)
- Lycorin ức chế sự tổng hợp protein và DNA của tế bào lách chuột
và ức chế tế bào u báng cấy ở chuột.
- Lycorin làm giảm khả năng sống của tế bào u.
- Lycorine ức chế sự tổng hợp vitamin C trong cây cỏ, làm ngừng sự
phát triển virus gây bệnh bại liệt.
- Ức chế sự tổng hợp các tiền chất cần cho sự sinh trưởng của virus
gây bệnh bại liệt và Enzym polipeptidas và có tác dụng kháng virus.
- Lycorin có độc tính cấp thấp.
- Lycorin - O – Glycosid ở mức liều microgram gây kích thích các tế
bào lympho lách chuột nhắt trắng, có tác dụng tă
ng cường miễn dịch.
Psendolycorin có tác dụng làm ngừng sự phát triển tế bào Hela, ngăn cản
sự tổng hợp protein trong tế bào u báng và làm chậm lại q trình tổng hợp
DNA.

12
- Chống vi khuẩn và chống nấm [36]
1.3. Các thuốc kích thích hệ miễn dòch.

Trên thế giới đã có một số loại thuốc kích thích hệ miễn dòch được sử
dụng như:
a. Các chất miễn dòch nội sinh:
• Interleukin-2; Interferon [9, 43, 45, 15]
b. Các chất kích thích miễn dòch từ các nguồn khác:
• Từ vi khuẩn, virút, ký sinh trùng, nấm như: BCG, MDP,
Bronchovachon, lentinan [20, 16, 17, 18, 19, 39, 47, 25]
• Từ nguồn tổng hợp hóa học: Levanisal, nimuthiol [26, 35, 39, 59,
22]
c. Từ nguồn gốc thực vật lectin của một số loại họ đậu, tầm gửi và
taxol chiết từ cây thông đỏ (Taxus baccata L.) [21, 23,]
Hiện nay bệnh ung thư ngày càng nhiều. Đứng trước thảm họa đó chúng
tôi thấy rằng cần tìm ra loại thuốc mới hỗ trợ điều trò bệnh ung thư từ
những alcaloid và flavonoid chiết xuất từ lá và hoa của cây Trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.).
Việt Nam sẽ có một viên thuốc hỗ trợ điều trị ung thư có hiệu quả cao từ
dược thảo Việt nam – cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.).
Sản phẩm ra đời sẽ chứng minh được ngành Dược Việt Nam, trí tuệ Việt
Nam có thể tạo ra sản phẩm mới có tầm quốc tế nếu các nhà khoa học đem
hết tâm huyết, sức lực tập trung cho nghiên cứu khoa học và thật sự muốn
nâng tầm hiểu biết của mình cần phải hợp tác quốc tế để học hỏi kinh
nghiệm nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học trong nước và quốc tế.
Tính đến tháng 12 năm 2006 trong nước chưa có một dạng thuố
c nào
được bào chế từ ngun liệu chiết xuất của cây Trinh nữ hồng cung hỗ

13
trợ điều trị ung thư. Do đó, nhiệm vụ của đề tài phải khẳng định được và
tạo ra nguyên liệu làm thuốc là các phân đoạn alcaloid và flavonoid có khả
năng hỗ trợ điều trị ung thư, kích thích tế bào lympho T hoạt động và phát

triển, ức chế sự phát triển của tế bào để kéo dài thời gian sống của động
vật bị ung thư.
2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ KH
Ả THI CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC
QUỐC TẾ
- Người mắc bệnh ung thư ngày càng tăng, do vậy nhu cầu thuốc chữa
bệnh ung thư là cần thiết và cấp bách. Kết quả nghiên cứu đánh giá được
tác dụng điều trị ung thư của các phân đoạn alcaloid và flavonoid chiết
xuất từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) có thể sử dụng làm
nguyên liệu để sản xuất thuố
c hỗ trợ điều trị bệnh ung thư. Kết quả này sẽ
tạo công ăn việc làm cho người lao động, có thuốc tốt phục vụ sức khỏe
cộng đồng với giá thành hợp lý phù hợp với thu nhập của người lao động
Việt Nam. Sản phẩm có khả năng sẽ xuất khẩu sang các nước thu ngoại tệ
góp phần làm cho đất nước giàu mạnh. Sản phẩm thu
ốc mới đi từ Trinh nữ
hoàng cung sẽ góp phần bình ổn giá thuốc trong nước và thể hiện trí tuệ
của người Việt Nam có thể tạo ra được những sản phẩm thuốc mới từ
dược thảo hỗ trợ điều trị bệnh ung thư.

3. MỤC TIÊU CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
1. Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá củ
a cây Trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.).
2. Đánh giá được khả năng kích thích miễn dịch chống ung thư của các
phân đoạn alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ lá của cây Trinh
nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản
xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư.
4. NỘI DUNG CỦA NHIỆM VỤ

14
4.1. Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá cây Trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.)
- Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.).
- Chiết xuất các phân đoạn flavonoid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.).
4.2. Đánh giá tác dụng sinh học in vitro và in vivo của các phân đoạn
alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây TNHC (Crinum latifolium
L.) thông qua nghiên cứu in vitro và in vivo:
4.2.1 Chứng minh tác dụng tăng cường miễn d
ịch in vivo và in vitro của
các phân đoạn Alcaloid và Flavonoid và viên nang Crila.
- Thí nghiệm in vivo:
Đánh giá khả năng phục hồi, tăng cường dòng tế bào lympho T và
dòng tủy của viên nang Crila trên chuột nhắt trắng random bị chiếu tia
gamma.
- Tác dụng gây phân bào (mitogenic activity) in vitro của các phân đoạn
H
1
(flavonoid), C
1
(alcaloid) và viên nang Crila.
- Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của viên nang Crila
và các phân đoạn C
1
, C
2
, C
3

(alcaloid), H
1
(flavonoid) trên bạch cầu đơn
nhân người từ máu ngoại vi (peripheral blood mononuclear cells –
PBMN).
- Tác dụng viên nang Crila trên tủy xương chuột nhắt nuôi cấy in vitro
(trong môi trường lỏng và trong thạch).
4.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống ôxy hoá của viên nang Crila thông qua
phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)
4.2.3 Thử gây độc tế bào với các dòng ung thư nuôi cấy in vitro
- Với các dòng ung thư phổi, gan, màng tim in vitro
- Thử độc tế bào in vitro của viên nang Crila và phân đoạn H
1
trên tế bào
ung thư tuỷ Graffi nuôi cấy.

15
4.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vivo được chứng minh trên chuột
Wistar và chuột Hamster.
- Nghiên cứu tác dụng của viên nang Crila và phân đoạn C
1
, H
1
trên chuột
Wistar được gây ung thư do hoá chất 20 – methylcholanthrene.
- Đánh giá hoạt tính gây độc in vivo của viên Crila Việt Nam sử dụng tại
chỗ khối u tế bào tuỷ Graffi ở chuột Hamster.
CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
- Nguyên liệu dùng để chiết xuất:

Lá cây Trinh nữ hoàng cung thu hái vào tháng 4 năm 2007 tại Trại dược
liệu Long Thành – Đồng Nai.
- Nguyên liệu dùng để thử tác dụng sinh học:
+ Các phân đ
oạn chiết xuất alcaloid C
1
, C
2
, C
3
.
+ Phân đoạn chiết xuất Flavonoid
+ Viên nang Crila được sản xuất từ alcaloid tổng C = C
1
+ C
2
+ C
3

viên thuốc Crila đang được lưu hành trên thị trường với SĐK
VNB-3391-05.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp nghiên cứu chiết xuất: phương pháp ngấm kiệt.
- Các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC).
- Phương pháp hoá lý: cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), khối phổ (MS),
sắc ký khí khối phổ (GC-MS), quang phổ hồng ngoại (IR), quang phổ tử
ngo
ại (UV).
- Phương pháp gây độc tế bào – tác giả Skehan (1990) và

Likhiwitayawuid (1993).
- Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của các tác giả
Shela G., Olga, M. B., Elena, K. (2003). Dựa trên nguyên tắc chất 1,1-

16
diphenyl – 2 – picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do
bên trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn
hợp này, nếu chất đem thử có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các
gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hóa thông qua giá trị hấp thụ ánh
sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước
sóng 515 nm.
- Các nghiên cứu in vitro (trong ống nghiệm):
Tác động trong ống nghiệm của Crila và các phân đoạn H
1
, C
1
,C
2
,C
3

lên
sự hoạt hoá và lên sự sinh sôi nảy nở của các tế bào đơn nhân của máu
ngoại vi của người (hPBMCs) (10
6
tế bào/ml ở môi trường nuôi cấy) đã
được nghiên cứu trong các điều kiện nuôi cấy tế bào dễ thay đổi trong thời
gian ngắn. Các liều Crila dùng là 10-25µg/ml ở môi trường nuôi cấy
RPMI 1640 được bổ sung với FBS v.v…, liều của các phân đoạn H
1

, C
1
,
C
2
, C
3

.
Máu ngoại vi và các mạch bạch huyết cũng là 10-25 µg/ml ở môi trường
nuôi cấy (RPMI 1640 đã được bổ xung với FBS v.v…)
Các kiểm tra rõ ràng chắc chắn bằng lectin, convanavaline A (Con A)
cũng đã được thực hiện ở các liều 10 và 25 µg/ml môi trường nuôi cấy.
Các kết quả thí nghiệm thu được đã được ghi chép, (bằng kính hiển vi
quang học) trên Giemza.
Việc tìm hiểu tính gây độc tế bào (cũng là các tác động chống khối u) của
Crila đã được thực hi
ện trong các điều kiện nuôi cấy tế bào u tủy sống
Graffi (10
6
tế bào/ ml môi trường nuôi cấy) với các liều của Crila 10 -
25µg/ml môi trường nuôi cấy (RPMI 1640 được bổ sung với FBS v.v ) và
bổ sung bằng các phương pháp về tế bào học đã được mô tả.
Các khám phá in vivo (ở cơ thể sống)

50 con chuột đực thuộc loại Wistar 50-55 ngày tuổi đã được dùng cho việc
tạo khối u bằng hóa chất gây ung thư. Thực hiện việc tiêm dưới da chất
20- metylcholanthrene và sau khi nổi lên các khối u từ 2-3 mm, các con

17

vật được chia thành 2 nhóm – (một nhóm được điều trị bằng thuốc Crila và
các phân đoạn) và một nhóm để đối chứng (không được điều trị).
Các liều của Crila và các phân đoạn H
1,
C
1,
C
2
,

C
3
bước đầu đưa vào trong
10 ngày/28,35 g) - sau khi xuất hiện các khối u là 500mg/kg thể trọng
chuột/ngày.
Việc xác định các con chuột sống sót, việc ức chế sự tăng trưởng của khối
u, cũng như việc áp dụng các kỹ thuật về mô học và thực hiện thống kê đã
được áp dụng theo các phương pháp P.Zajac.
- Phương pháp nghiên cứu in vitro. Gây suy giảm miễn dịch và suy tế
bào dòng tuỷ: Chuột được chi
ếu tia gamma 100rad/ngày x 06ngày (tại
bệnh viện K Hà Nội) trên máy Picker (Mỹ), trường chiếu 35cm x 35cm,
khoảng cách 80cm, xuất liều 94,38rad/min.

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá của cây trinh
nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.).
3.1.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây trinh nữ hoàng
cung (Crinum latifolium L.).
a. Chiết alcaloid toàn phần

Chiết alcaloid dựa vào tính tan của chúng, các alcaloid dạng muối tan
trong nước, các alcaloid dạng bazơ tan trong dung môi hữu cơ. Để có mẫu
là các phân đoạn alcaloid đưa thử sàng lọc tác dụng sinh học điều trị ung
thư, chúng tôi tiến hành chuẩn bị mẫu thử để chuyển sang nghiên cứu tại
Viện Hàn Lâm Khoa học Bungari và Áo.
Chúng tôi tiế
n hành chiết alcaloid toàn phần theo quy trình sau:
• Chuẩn bị nguyên liệu lá Trinh nữ hoàng cung được thu hái vào tháng
4/2007 tại Trại Dược Liệu, Long Thành, Đồng Nai.

18
- Lá TNHC được rửa sạch, phơi khô, sấy khô ở nhiệt độ 50 đến 60
o
,
xay thành bột.
- Lấy 10 kg bột lá TNHC làm ẩm bằng dung môi chiết xuất.
- Ngâm với ethanol 70
o
/acid acetic 2% (chỉnh pH = 4) các dịch chiết
cồn, acid thu được đem lọc rồi kiềm hóa bằng amoniac đến pH = 9-10,
sau đó lắc với chloroform nhiều lần đến khi chiết kiệt hết alcaloid, (
kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff).
- Tinh chế: dịch chloroform được lọc, sau đó lắc nhiều lần với HCl
0,1N gộp dịch chiết acid rồi kiềm hóa dịch bằng NH
4
OH đến pH= 9-
10. Dịch chiết đã kiềm hoá tiếp tục lắc với CHCl
3
, sau đó cất thu hồi
dung môi CHCl

3
thu được 135g alcaloid toàn phần.
b. Tiến hành tách các phân đoạn alcaloid bằng sắc ký cột nhanh, chất
hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải CHCl
3
:MeOH.
- Tăng dần tỷ lệ MeOH (1, 5, 7%) thu được 9 phân đoạn từ C
1
đến C
9
.
Chúng tôi đã đem tất cả các phân đoạn sàng lọc tác dụng sinh học
nhưng chỉ có 3 phân đoạn từ C
1
đến C
3
có tác dụng kích thích hệ miễn
dịch ngăn ngừa sự phát triển của tế bào u, kết quả này sẽ được chứng
minh ở phần nghiên cứu đánh giá tác dụng của các phân đoạn alcaloid
có hoạt tính sinh học điều trị ung thư ở phần sau.