KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 6 pdf

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR
1. Primer (mồi)
Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2)
Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành
primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại.
2. DNA bản mẫu (template)
Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất
ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ),
heparin, )
3. Nồng độ MgCl
2
Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo
nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản
của enzyme
4. dNTP
Thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng ; hàm lượng thường không đổi
nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế
5. Enzyme
Được chọn tùy mục đích sử dụng :
W
Taq
DNA polymerase (
Thermus aquaticus
) : thông dụng nhất, hoạt tính
polymerase khá mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease
Stoffel DNA polymerase : tính chòu nhiệt cao hơn, không có hoạt tính 5’-3’
exonuclease, hoạt động được ở phổ MgCl2 rộng

multiplex PCR
Taq

và Stoffel DNA polymerase thêm 1 3’dA vào sản phẩm PCR
W
Vent/DeepVent DNA polymerase (
Thermococcus litoralis
) : tính chòu nhiệt
rất cao, nhân bản được những đọan DNA rất dài, có hoạt tính 3’-5’
exonuclease

tính trung thực cao hơn Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu
bằng”
W
Pfu
DNA polymerase (
Pyrococcus furiosus
) : có cả 2 hoạt tính 5’-3’ và
3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao hơn Taq pol 12 lần, thường dùng trong
cycle sequencing
W
Tth
DNA polymerase (
Thermus thermophilus
) : vừa có chức năng
polymerase vừa có chức năng phiên mã ngược (RT)

dùng trong phản ưng
RT-PCR
W
UlTma DNA polymerase (
Thermotoga maritima
) : tính chòu nhiệt rất cao,

có hoạt tính 3’-5’ exonuclease

tính trung thực rất cao
CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)
5. Chương trình PCR :
W
Nhiệt độ : biến tính – 94-95
q
C ; lai < Tm của các primer ~ 5
q
C ; kéo
dài - 72
q
C
W
Thời gian của từng chu kỳ tùy thuộc thiết bò và kích thước sản phẩm
W
Số lượng chu kỳ thường

40
Ví dụ : 1 chu kỳ - 95
q
C – 5‘
35 chu kỳ – 94
q
C – 30”
55
q
C – 30”
72

q
C – 45”
1 chu kỳ – 72
q
C – 10’
6. Thiết bò : Những cải tiến máy luân nhiệt liên quan đến (1) microtiter plate
96 giếng, (2) các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, (3) block dùng cho lam
kính để tiến hành
in situ
PCR.
7. Dụng cụ : Ống Eppendorf “thành mỏng” (thin-wall), đầu tip có phin lọc
CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)
NH
Ư
Õ
NG HA
Ï
N CHE
Á
CỦA KỸ THUA
Ä
T
PCR –
CÁCH KHẮÊC PHỤC
1. Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh
Ỵ
Phân chia khu vực thí nghiệm, sử dụng đầu tip có phin lọc, găng tay
thay thường xuyên, chiếu tia UV khu vực thí nghiệm, sử dụng hệ thống
dUTP-ung,
2. Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp

Ỵ
Lặp lại phản ứng PCR nếu cần thiết, sử dụng loại polymerase có tính
trung thực cao như
Pfu
, DeepVent, UlTma polymerase.
3. Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác
Ỵ Kỹ thuật viên cần được đào tạo tốt, tự động hóa, sử dụng hóa chất pha
sẳn (kit) đã được chuẩn hóa
4. Thiết bò đắt tiền
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR
1. PCR : sử dụng 1 cặp mồi ; sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di
2. Nested / Semi-nested PCR : sử dụng 1 cặp mồi “ngoài” và 1 mồi/1 cặp
mồi “trong” để tăng tính đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng PCR
3. Multiplex PCR : sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR để
phát hiện đồng thời nhiều trình tự DNA của 1 tác nhân (A) hay nhiều tác
nhân (B)
(A)
(B)
MO
Ä
T
SO
Á
PH
Ư
ƠNG PHA
Ù
P PCR (tie
á
p)

4. AP-PCR (Arbitrary Primed)/RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA) : sử dụng tổ hợp các primer “ngẫu nhiên” để xác dònh “dấu ấn di
truyền” của loài
(1)
(2)
5. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) : nhân bản hai đầu mút 5’
và 3’ của 1 trình tự exon với 1 mồi đặc hiệu và 1 mồi “chung”
6.
In situ
PCR : thực hiện phản ứng PCR ngay trên mô/tế bào
7. PCR đònh lượng : đònh lượng sản phẩm PCR theo thời gian thực dựa
trên mẫu dò phát hùynh quang
AAAAAAAA
TTTTTT
AAAAA
TTTTTTT
RT-PCR
Gồm 2 bước :
1. RT (Phiên mã
ngược) : tạo cDNA
2. PCR : nhân bản
cDNA
Dùng để nhân bản
RNA
REAL-TIME PCR
Dùng đònh lượng DNA hoặc RNA (real-time RT-PCR)
Đònh lượng dựa trên số tín hiệu huỳnh quang/phản ứng mà máy đọc được
Tác nhân đánh dấu thuộc hai nhóm :
W
Chất phát huỳnh quang liên kết với DNA mạch đôi (SYBR Green, Ethidium

bromide) sẽ phát huỳnh quang
W
Chất phát hùynh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu
TaqMan probe
KẾT QUẢ PCR REAL-TIME
C
A
B
10
1
bản sao
10
1
bản sao
Dựng đường chuẩn (standard
curve) với một chất chuẩn có
nồng độ đã biết.
Hàm lượng của thành phần cần
phát hiện được tính dựa trên
đường chuẩn này
Ct (Cycle threshold - chu kỳ ngưỡng) :
chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt
khỏi tín hiệu nền
Ghi chú : đường màu đỏ là t1n hiệu nền
T
A
Ï
O DO
Ø
NG SẢN PHA

Å
M PCR
Taq
polymerase thường thêm 1A
vào đầu 3’ Ỉ sử dụng T-vector
để tạo dòng sản phẩm PCR
Còn gọi là T-A cloning
PCR “NG
Ư
Ơ
Ï
C“
Dùng nhân bản vùng nằm
hai bên một vùng đã biết
trình tự
PCR „“TÁI TỔ HP“
Dùng để nối nhiều trình tự
ngắn thành một trình tự dài, Ví
dụ : nối promoter của gene A
với vùng mã hóa của gene B
GIA
Û
I TRÌNH T
Ư
Ï NUCLEOTIDE (SEQUENCING)
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT
(HÓA HỌC)
Nguyên lý : dựa trên sự phân cắt
hóa học DNA
Các bước chính :

1. Thu nhận trình tự DNA cần giải
2. Biến đổi hóa học đặc hiệu các
base
3. Loại bỏ các base biến đổi
4. Cắt mạch DNA ở vò trí bò loại
bỏ base
PHƯƠNG PHÁP SANGER
(ENZYME HỌC) (DIDEOXY
SEQUENCING METHOD)
Nguyên lý : dựa trên sự tổng hợp
DNA kết hợp với từng loại
dideoxynucleotide
Các bước chính :
1. Thu nhận trình tự DNA cần giải
2. Nhân bản trình tự này với
dNTP và từng loại ddNTP
Điện di phân tách các trình tự DNA tạo thành của hai phản ứng
È
Đọc kết quả : tự động hoặc qua phóng xạ tự ghi
PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ MAXAM-GILBERT
Các phản ứng giải trình tự :
C : Hydrazine trong NaCl cắt
base C
G : G được methyl hóa bằng
dimethylsulfate sau đó bò cắt
bằng kiềm
G + A : Formic acid cắt liên kết
giữa base và đường
T + C : Hydrazine cắt vòng
pyrimidine

Bước cuối :
Piperidine cắt các base biến đổi
KE
Á
T
QUẢ GIẢI TRÌNH T
Ư
ÏHO
Ù
A HO
Ï
C
Kết quả của kỹ thuật phóng
xạ tự ghi (autoradiography)
PHÖÔNG PHAÙP
GIAÛI TRÌNH TÖÏ
SANGER
GIAÛI TRÌNH TÖÏ TÖÏ ÑOÄNG
MỘT SỐ BIỆN PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG
The Single-Priming Method
PHệễNG PHAP Sệ
DUẽNG 2 PRIMER
ẹOT BIEN
PHÖÔNG PHAÙP KUNKEL
dut
: dUTPase
ung
: uracil-DNA-glycosylase
(W.P. Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751)
PH

Ư
ƠNG PHA
Ù
P “
T
A
Ù
I SẮP XẾP DNA” (DNA SHUFFLING)
Gồm các bước :
• “Đục lỗ” DNA bằng Dnase I
• Tiến hành PCR không có mồi : - Biến tính
- Tái bắt cặp
- Kéo dài
Ỵ
Tạo ra những trình tự DNA “lai”
CHUYE
Å
N VẬ
T
LIỆU DI TRUYỀN
Ơ
Û
T
H
Ư
ÏC VẬ
T
Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens có mang plasmid Ti
tái tổ hợp để chuyển gene vào tế

bào thực vật
MỘT SỐ BIỆN PHÁP CHUYỂN VẬT LIỆU DI
TRUYỀN
Phương pháp
bắn gene
Phương pháp
biến nạp
Phương pháp
vi tiêm
Phương pháp
dùng vector
virus