Báo cáo nghiên cứu khoa học: "THU NHẬN POLY - HYDROXYBUTYRATE, MỘT LOẠI NHỰA SINH HỌC DỄ PHÂN HỦY, TỪ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM" ppt

THU NHẬN POLY -  HYDROXYBUTYRATE,
MỘT LOẠI NHỰA SINH HỌC DỄ PHÂN HỦY,
TỪ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. PHÂN LẬP
TẠI VIỆT NAM
PRODUCTION OF POLY -

-

HYDROXYBUTYRATE, A BIODEGRADABLE
POLYMER, BY METHYLOBACTERIUM SP. ISOLATED IN VIETNAM


LÊ LÝ THÙY TRÂM
Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng
KIỀU PHƯƠNG NAM, BÙI VĂN LỆ
Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh


TÓM TẮT
PHB (poly--hydroxybutyrate), một loại nhựa sinh học chịu nhiệt, dễ phân hủy, đang được
quan tâm như là một nguồn thay thế lý tưởng cho nhựa tổng hợp bởi nó có các tính chất
tương tự nhựa tổng hợp. PHB được tích lũy trong tế bào nhiều loài vi sinh vật với hàm lượng
khác nhau. Chủng Methylobacterium sp. (kí hiệu Mcd), được phân lập từ môi trường nuôi cấy
mô cây chanh dây tạp nhiễm vi khuẩn màu hồng, có thể phát triển trên môi trường khoáng
căn bản với methanol 1% là nguồn C và lượng PHB tạo ra chiếm 31,37 % tổng lượng sinh
khối khô sau 4 ngày nuôi cấy. Sản xuất PHB theo con đường sinh học từ nguồn C rẻ tiền
(methanol) đang mở ra một hướng nghiên cứu và ứng dụng mới đầy triển vọng ở nước ta
hiện nay.
ABSTRACT
PHB (poly--hydroxybutyrate), a biodegradable thermoplastic material, has been considered
as an attractive substitute for petroleum-derived synthetic plastic because it has properties

similar to synthetic plastic. PHB can be accumulated intracellularly in a wide range of
microorganisms at different levels. Methylobacterium sp. (Mcd for short) has been isolated
from the culture medium of water lemon (Passiflora sp.) in vitro contaminated by pink-
pigmented bacteria. Mcd is capable of growing in a basal mineral medium containing 1 % (v/v)
methanol as a sole source of carbon, yielding PHB which accounts for 31.37% of its dry
weight after 4 days of culture. The production of PHB by means of the biological method using
methanol, one of the cheapest substrates, is currently opening a new and promising approach
for research and application in Vietnam.


1. MỞ ĐẦU
Một trong những tác nhân chính gây ô nhiễm môi trường là nguồn chất thải rắn như
bao bì, vật liệu nhựa từ các polymer tổng hợp… Các vật liệu này rất khó bị phân hủy và do đó
tồn tại rất lâu trong đất, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Giải pháp khắc phục hiện nay
là nghiên cứu và tìm ra các nguồn vật liệu mới để thay thế. Trong đó, các loại polymer sinh
học có khả năng bị phân hủy nhanh nhờ các loài vi sinh vật đang rất được quan tâm.
Thuộc trong nhóm PHAs (poly hydroxyalkanoates), các polyester có tính chất tương
tự nhựa tổng hợp, PHB đang được quan tâm đặc biệt do chúng có độ dẻo và tính chịu nhiệt
cao (nhiệt độ nóng chảy xấp xỉ 170
0
C)[3]. Đặc biệt, PHB rất dễ được phân hủy tự nhiên nhờ
các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PHB như là nguồn Carbon và năng lượng cho các
hoạt động sống của nó[1].
PHB là một nguồn Carbon dự trữ trong tế bào ở một số loài vi sinh vật: Alcaligenes
eutropha, Pseudomonas sp., Methylobacterium sp., Bacillus sp., Rhodospirillum
rubrum…[1]. Năm 1982, công ty hóa chất ICI đã thương mại hóa sản phẩm PHB từ Rastonia
eutropha. Tuy nhiên giá thành của sản phẩm vẫn còn khá cao do sử dụng nguồn nguyên liệu
là đường nguyên chất (glucose) và acid propionic. Do vậy, việc ứng dụng sản phẩm đại trà
vẫn còn nhiều hạn chế [1].
Ý tưởng nghiên cứu của nhóm chúng tôi xuất phát từ việc phân lập được chủng vi

khuẩn Methylobacterium sp., là nhóm vi khuẩn sắc tố hồng, có khả năng sử dụng methanol
làm nguồn cung cấp Carbon và tổng hợp PHB theo con đường biến dưỡng serine. Từ nguồn
nguyên liệu rẻ tiền (methanol) có thể sản xuất được PHB, một sản phẩm nhựa có giá trị ứng
dụng, chúng tôi hy vọng sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới để giải quyết vấn đề ô nhiễm
môi trường hiện nay.

2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Chủng vi khuẩn, môi trường nuôi cấy và điều kiện tăng trưởng
Chủng vi khuẩn được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây chanh dây bị tạp nhiễm
vi khuẩn có sắc tố hồng trên môi trường MMS có bổ sung 1% methanol. Chủng thuần được
phân tích các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái, kết hợp với giải trình tự vùng 16S rDNA
nhằm tiến hành định danh. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này thuộc chi Methylobacterium
(kí hiệu là Mcd).
Môi trường nuôi cấy được sử dụng có thành phần như sau: 1% (v/v) methanol, 0,1 g/L
cao nấm men, 1 g/L (NH
4
)
2
SO
4
, 0,45 g/L MgSO
4
.7H
2
O, 1,305 g/L KH
2
PO
4
, 4,02 g/L
Na

2
HPO
4
, 3,3 mg/L CaCl
2
.2H
2
O, 1,3 mg/L FeSO
4
.7H
2
O, 30 g/L H
3
BO
3
, 40g/L,
CoCl
2
.6H
2
O, 40g/L Na
2
MoO
4
.2H
2
O, 40g/L CuSO
4
.5H
2

O, 130 g/L ZnSO
4
.7H
2
O, 100
g/L MnSO
4
.H
2
O, pH =7.[2]
Khuẩn lạc được cấy vào các erlen 250mL chứa 100mL môi trường, nuôi lắc 150v/p ở
nhiệt độ 29 ± 1
0
C. Tiến hành ly tâm thu sinh khối ở 8500v/p trong 20 phút vào các thời điểm
khác nhau (24h, 48h, 72h, 96h và 120h). Sinh khối được sấy khô hoàn toàn ở 65
0
C và cân
trọng lượng.
2.2. Xác định hàm lượng PHB trong sinh khối vi khuẩn
Sau khi ester hóa chuyển PHB về dạng -hydroxybutyric methyl ester, hàm lượng
PHB trong sinh khối vi khuẩn ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau được xác định bằng
phương pháp sắc ký khí (GC - Gas Chromatography) với acid benzoic là chất nội chuẩn [5].
Đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn là PHB (hãng Aldrich,USA)
2.3. Tách chiết PHB
Đồng nhất 0,1g sinh khối khô thành bột mịn, sau đó hòa trong 3mL NaOCl 5% và
vortex mạnh cho đến khi sinh khối trắng hoàn toàn. Sau đó, bổ sung 4mL chloroform, vortex
đều và ủ ở 60
0
C trong 60 phút. Ly tâm 8000v/p trong 15 phút để thu nhận phân lớp
chloroform có hòa tan PHB. Để bay hơi chloroform tự nhiên thu được một dạng bột trắng.

2.4. Xác định cấu trúc và các đặc điểm lý hóa của sản phẩm thu được
Cấu trúc của sản phẩm tách chiết được xác định thông qua phổ hồng ngoại (IR), phổ
cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (
1
H-NMR,
13
C-NMR). Nhiệt độ nóng chảy được xác định
bằng máy DSC (Different Scanning Calori) và phân tử lượng của sản phẩm được xác định
bằng phương pháp sắc ký lọc gel (GPC – Gel permeation chromatography).

3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN
3.1. Sự tăng trưởng và hàm lượng PHB tích lũy trong sinh khối thay đổi theo thời
gian nuôi cấy
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 20 40 60 80 100 120
Thời gian (h)
Sinh khối khô, PHB (g/l môi trườ
ng)
Sinh khối khô
Hàm lượng PHB

Đồ thị 1: Sự thay đổi sinh khối khô và hàm lượng PHB tích lũy trong tế bào
ở các thời điểm khác nhau
Từ đồ thị có thể nhận thấy, sau 5 ngày nuôi cấy, sinh khối vẫn tiếp tục gia tăng, trong

khi, hàm lượng PHB đạt cực đại ở ngày thứ 4 (0,252 g/L môi trường, chiếm 31,37% tổng sinh
khối khô vi khuẩn) và sau đó giảm dần. Như vậy, trong giai đoạn đầu, khi nguồn C còn dồi
dào, vi khuẩn sử dụng chính methanol làm nguồn C để sinh trưởng và tích lũy PHB. Tuy
nhiên, sau ngày thứ 4, có lẽ nguồn C trong môi trường đã cạn kiệt nên vi khuẩn sử dụng chính
PHB tích lũy trong tế bào làm nguồn C dẫn tới sự suy giảm hàm lượng PHB trong nội bào. Từ
kết quả này, chúng tôi cũng đã thử nghiệm tăng hàm lượng methanol bổ sung vào môi trường
lên 2%, tuy nhiên tốc độ tăng trưởng lại giảm so với methanol 1%. Rất có thể, nồng độ
methanol 2% có ức chế đến sự tăng trưởng tế bào. Thử nghiệm bổ sung methanol 1% vào môi
trường sau ngày thứ 4 cho kết quả sinh khối vẫn không tăng đáng kể trong các ngày thứ 6 và
thứ 7. Điều này có thể là do lượng dinh dưỡng tổng cộng trong môi trường đã cạn kiệt. Như
vậy trong điều kiện nuôi cấy đã khảo sát, chủng Mcd tích luỹ PHB cực đại vào ngày thứ 4
nuôi cấy.
3.2. Kết quả tách chiết PHB
Từ kết quả khảo sát hàm lượng PHB trong sinh khối qua các thời điểm khác nhau,
sinh khối sau 4 ngày nuôi cấy được chọn để tách chiết PHB. Sau khi ly tâm, có sự hình thành
3 phân đoạn: lớp trên cùng là NaOCl, lớp giữa là cặn tế bào đã bị cắt bới NaOCl nhưng không
tan trong chloroform và lớp dưới cùng là chloroform có hòa tan PHB. Hàm lượng bột trắng
thu được so với tổng sinh khối khô đem chiết chỉ đạt khoảng 20-25%. So sánh với kết quả xác
định hàm lượng PHB trong sinh khối bằng phương pháp GC (31,37%) cho thấy có sự chênh
lệch. Sai số này có thể giải thích là do sự hao hụt sản phẩm trong quá trình tách chiết do chưa
có các thiết bị chuyên dùng.

Hình 1. Bột trắng thu được sau khi
tách chiết từ 0,1 g sinh khối khô vi khuẩn

3.3. Xác định cấu trúc và đặc điểm lý hóa của sản phẩm thu nhận được

Kết quả phổ hồng ngoại IR (hình 2) cho thấy có đỉnh hấp thu (cm
-1
) 1725,42 tương
ứng với nhóm chức C=O có trong sản phẩm













Hình 2. Phổ IR của sản phẩm PHB thu nhận

Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (
1
H-NMR,
13
C-NMR) cho phép khẳng
định sản phẩm thu được chính là PHB.

Hình 3. Phổ
13
C-NMR với các mũi tương ứng 4 loại C trong cấu trúc của PHB
CDCl
3
1
3
2
4
O
CH
CH
3
CH
2
C
O
1
2
3
4
n
CDCl
3
1
3
2
4

O
CH
CH
3
CH
2
C
O
1
2
3
4
n
O
CH
CH
3
CH
2
C
O
O
CH
CH
3
CH
2
C
O
1

2
3
4
n
1
2
3
4
n





Hình 4. Phổ
1
H-NMR với các mũi tương ứng với 3 loại H trong cấu trúc của PHB

* Các đặc tính lý hóa của sản phẩm

Các thông số
PHB tách chiết PHB chuẩn (Aldrich,USA)
Mw (g/mol) 1.2793 x10
5
7.0464x10
5
D (độ đa phân tán) 3.8034 3.2738

Bảng 1. So sánh các thông số về phân tử lượng bằng phương pháp GPC
của sản phẩm và chất chuẩn

Từ bảng 1 cho thấy sản phẩm có độ đồng nhất về phân tử lượng tương ứng với chất
chuẩn. Tuy nhiên, phân tử lượng của sản phẩm thu được vẫn còn thấp hơn nhiều so với chất
chuẩn (PHB từ Alcaligenes sp.). So sánh với PHB tách chiết từ Methylobacterium sp. B3-Bp
có Mw là 2,5x10
5
[1] cho thấy sản phẩm thu nhận được cũng không có sự chênh lệch phân tử
lượng quá lớn. Điều này cũng phù hợp với kết quả ghi nhận của một số công trình nghiên cứu
cho thấy PHB từ Methylobacterium sp. có phân tử lượng không cao lắm.

Kết quả DSC xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm là 167
0
C so với PHB chuẩn
(hãng Aldrich, USA) là 175
0
C. Sự chênh lệch về phân tử lượng có thể làm giảm nhiệt độ nóng
chảy của sản phẩm, tuy nhiên chênh lệch này là không đáng kể và sản phẩm thu nhận vẫn đáp
ứng được tính chất của một loại nhựa chịu nhiệt.

4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
Các kết quả đạt được cho thấy chúng tôi đã bước đầu thành công trong việc tách chiết
PHB từ vi khuẩn Methylobacterium sp Mcd. Sản phẩm thu được có các tính chất hóa lý tương
tự như PHB chuẩn. Trong hướng nghiên cứu sắp đến chúng tôi sẽ khảo sát thêm ảnh hưởng
của các nguồn dinh dưỡng lên sự tích lũy PHB trong tế bào với hy vọng sẽ tăng cao hiệu suất
thu nhận PHB. Đồng thời sẽ nghiên cứu tạo dạng đồng polymer (PHBV: poly-

hydroxybutyrate co poly- - hydroxyvalerate) nhằm gia tăng phân tử lượng của sản phẩm,
tăng độ đàn hồi để có thể đưa sản phẩm vào ứng dụng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Anderson AJ, Dawes EA, Occurrence, metabolism, metabolic role and industrial uses
of bacterial polyhydroxyalkanoates, Microbiological Rewiews, p.450-472, 1990.
[2] Bourque D., Pomerleau Y., Groleau D., High-cell-density production of poly-

-
hydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium extorquens: production
of high-molecular-mass PHB, Appl Microbiol Biotechnol 44: p367-376, 1995.
[3] Lundgren D.G., Alper R., Schnaitman C., Marchessault R.H., Characterization of
poly-

-hydroxybutyrate extracted from different bacteria, Journal of Bacteriology,
1965.
[4] Kim Pil, Kim Jung-Hoe, Oh Deok-Kun, Improvement in cell yield of
Methylobacterium sp. by reducing the inhibition of medium components for poly-

-
hydroxybutyrate production, Journal of Microbiol and Biotech 19:357-361, 2003.
[5] Riis V, Mai W., Gas chromatographic determination of poly-

-hydroxybutyric acid
in microbiol biomass after hydrochloric acid propanolysis, Journal Chromatogr,
445:285 -289, 1988.