PHÂN lập, TUYỂN CHỌN một số CHỦNG VI KHUẨN cố ĐỊNH đạm nội SINH TRONG rễ cây NGÔ tại một số địa điểm của đăk lăk

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ
LÊ XUÂN CƯỜNG
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM NỘI
SINH TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA ĐĂK LĂK
(Báo cáo tóm tắt luận văn tốt nghiệp thạc sỹ)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng
BUÔN MA THUỘT, NĂM 2013


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của
•
Phân bón vi sinh ra đời 1896 tại Đức.
•
Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học.
•
Ở Việt Nam phân vi sinh đã được nghiên cứu từ những năm 1960.
•
Tình hình sản xuất phân vi sinh trong nước chưa đáp ứng đủ nhu cầu
thực tiễn sản xuất của nền nông nhiệp.
•
Do đó việc nghiên cứu hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh
là việc làm hết sức cần thiết… Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn
các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo
ra chế phẩm [7].
•
Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần loài của

vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk
Lăk.
“Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong
rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”.


MỞ ĐẦU
- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định
đạm trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk.
- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩn có
hoạt tính cố định đạm cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.
1. Tính cấp thiết của
Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi
khuẩn sống nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để
sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn
chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần phát triển
một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
2. Mục tiêu của đề tài
3. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
- Xác định được một số chủng vi khuẩn có khả năng cố định
đạm, sống nội sinh trong rễ cây ngô.


PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu
các nội dung sau:
1. Phân lập, mô tả đặc điểm sinh học và định danh bằng sinh

học phân tử một số chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ cây
ngô.
2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định
đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô.
3. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng
vi khuẩn nội sinh được tuyển chọn.


2.2.2.Phương pháp phân lập.
•
Mẫu được thu thập một cách ngâu nhiên trên các nền
đất khác nhau
•
Toàn bộ bộ mẫu rễ được đựng trong túi nilon đã khử
trùng và ghi nhãn:
+ Nơi lấy
+ Ngày lấy
+ Người thu mẫu.
2.2.1.Phương pháp thu mẫu.
Vòng pellicle
Dòng thuần trên môi trường
Nfb+cao nấm men+ amoniClorua
Sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh
vi hiếu khí
Khuẩn lạc trên Nfb vô đạm
2.2.Phương pháp nghiên cứu.
PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quá trình phân lập và làm thuần giống được thực hiện trên Nfb vô đạm.

PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm
sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh.
Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi,
xác định đặc điểm sinh học và định danh theo khoá phân loại của
Bergey 1994.
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ IAA (mg/l) 0 5 10 20 40 80
OD
530nm
2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các
chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây ngô.
Xây dựng phương trình đường chuẩn về mối tương quan
giữa chỉ số OD
530nm
và nồng độ IAA.


PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5 Phương pháp xác định khả năng cố định N của các
chủng VK
* Phương pháp thí nghiệm:
Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi
khuẩn
Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm các chủng vi khuẩn cố
định đạm phân lập được.
Lưu ý: Mỗi chủng vi khuẩn 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có
10 bầu đất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao
cây, số lá trên cây, chiều dài lá, đường kính gốc, chiều dài rễ, khối

lượng tươi, sinh khối khô.
2.2.5.1. Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục
+ Hàm lượng diệp lục và carotenoid được xác định bằng phương
pháp so màu [36].
+ Xác định hàm lượng đạm tổng số trong lá bằng phương pháp
Kjeldah
+ Xác định hàm lượng phosphat tổng số trong lá bằng phương
pháp quang phổ.
2.2.6.Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố
định đạm nội sinh bằng phương pháp PCR xác định
gen nifH.
•
Mồi đặc hiệu cho gen nifH cũng như quy trình cho phản ứng PCR
được cung cấp và thực hiện tại VCNSH &MT, trường Đại học Tây
Nguyên.
Môi xuôi (Pol F) (5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3')
Mồi ngược (Pol R) (5' - ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3')
Sản phẩm sau phản ứng được điện di có kích thước 360bp
ghi nhận thông qua thang chuẩn 100bp để kết luận:
Nếu xuất hiện vạch có kích thước 360bp thì kết luận vi
khuẩn phân lập có mang gen nifH, ngược lại.
2.2.7 Phương pháp định danh 16s các chủng vi khuẩn
được tuyển chọn.
Gửi mẫu định danh tại Công ty TNHH Nam Khoa – TP. HCM
để giải trình tự gen 16S xác định tên loài.


PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.8. Phương pháp nghiên cứu nhân nuôi sinh khối của các
chủng vi khuẩn được tuyển chọn

•
Tối ưu môi trường nuôi cấy.
Nfb, BMS, Fallik.
•
Tối ưu thời gian nuôi cấy
24h, 48h, 72h, 96h.
•
Tối ưu nhu cầu Oxy
0 rpm, 100 rpm, 150 rpm, 200 rpm, 250 rpm.
•
Tối ưu pH môi trường nuôi cấy.
pH = 4,8 ; pH = 5,8; pH = 6,3; pH = 6,8 ; pH = 7,8.
•
Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
27
0
C, 32
0
C, 37
0
C, 42
0
C


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập một số chủng VK cố định N trong
rễ cây ngô ở Đăk Lăk.
Sự hiện diện của VK nội sinh
vi hiếu khí

Cấy truyền tạo dòng thuần
Các dòng thuần
•
Phân lập được 31 dòng vi khuẩn kí hiệu từ C1 đến C31).
•
Trong đó có 9 dòng ở Krông Năng C1 đến C9.
•
10 dòng ở dòng ở thành phố Buôn Ma Thuột C10 đến C19.
•
12 dòng ở huyện Ea Súp C20 đến C31.
Vòng
pellice


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Kết quả mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh
học của các chủng vi khuẩn cố định đạm
Hinh 1: Hình thái một số chủng vi khuẩn trên môi trường vô đạm Nfb
C11
C23
C14 - Trắng sữa C31 - Vàng nhạtC23 - Trắng sáng
C23 – Gram (-)


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.Kết quả nghiên cứu xác định khả năng tạo IAA của
các chủng vi khuẩn cố định đạm
•
31 chủng phân lập được đều có khả năng sinh IAA.
•

Cao nhất C14 13,51mg/l.
•
Thấp nhất C28: 1,77mg/l
Biểu đồ A: Khả năng sản sinh IAA của các chủng vi khuẩn


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến
sinh trưởng của cây ngô trong bầu đất.(BẢNG 3.5)
•
Số lượng lá tăng từ 26,7 - 33,3%.
•
Chiều dài lá tăng từ 9 – 38,5%.
•
Chiều cao cây tăng từ 7,4 - 44%.
•
Đường kính gốc thân tăng 10,9 – 33%.
ĐC
C23
Đo các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trong bầu đất


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chiều dài rễ tăng 4,5 – 26%; Khối lượng rễ 7,0 – 29,2%; Sinh khối
tươi 12,5 -53,5%; Sinh khối khô 9,8 – 58,8% so với ĐC.
Biểu đồ A: Tác động của VK cố định
N đến sinh khối tươi của cây ngô.
Biểu đồ B: Tác động của VK cố định
N đến sinh khối khô của cây ngô.

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
•
Kết quả khi xử lý số liệu và biểu đồ cho thấy có 29/31 NT khi nhiễm các
chủng VK cố định đạm làm cho tích lũy diệp lục tổng số có trong mẫu lá
tăng 1,2 - 2,6 lần (tức tăng 11-84%) so với ĐC.
•
Tuy nhiên C7, C30 có tích lũy diệp lục tổng số cao hơn nhưng khác biết
không có ý nghĩa thông kê ở mức ý nghĩa 0,01.
3.5. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm
đến hàm lượng diệp lục trong lá
Biểu đồ: Tác động của VK cố định N đến hàm lượng cholrophyll tổng số tích luỹ trong
lá
CV= 2,39 ; alpha=0,01


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.6. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm
đến hàm lượng N và phosphat tổng số của cây ngô.
•
Tích luỹ N tổng số trong lá tăng 1,2 - 2,4 lần (tức tăng từ 5 - 45%) và
tăng tích lũy P tổng số 1,1 -1,8 lần (22-38,9%) so với ĐC.
•
C1 tích lũy N thấp hơn so với ĐC.
Biểu đồ C: Tác động của VK cố định
đạm đến hàm lượng N tổng số
Biểu đồ D: Tác động của VK cố định
đạm đến hàm lượng P tổng số
•
Sau khi phân tích các chi tiêu theo dõi chúng tôi tuyển chọn được 13 chủng có

phản ứng tốt khi cộng sinh với hệ rễ cây ngô, đó là các chủng: C31, C14, C23,
C30, C11, C29, C10, C16, , C13, C8, C21, C6, C18.


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.7. Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm bằng
phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn nội sinh mang gen nifH.
500bp
360bp
•
Kết quả điện di sản phẩm PCR có 9/13 chủng tuyển chọn có vị trí đặc hiệu với
band DNA ở vị trí 360bp. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có mang
gen nifH mã hóa cho việc cố định N. Các chủng dương tính với nifH bao gồm:
C6, C10, C13, C14, C18, C23, C29, C30, C31.
•
Các chủng còn lại có band DNA không trùng với vị trí 360bp nên (-) với gen
nifH.
360bp
Ghi chú: M Thang chuẩn 100bp
(-) Chứng âm
C
n
Giếng chứa DNA VK
Kết quả điện di các chủng vi khuẩn cố định N nội
sinh với cặp mồi chuyên biệt cho gen nifH
•
Như vậy qua quá trình sàng lọc chúng tôi tuyển chọn 3 chủng
(C31, C14, C23) có hoạt tính cố định N cao để giải trình tự gen 16S
xác định tên loài và nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nuôi của 3
chủng này.

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Pseudomonas nitroreducens
•
Theo nghiên cứu của Ngô Thanh Phong và cộng
sự trường đại học Cần thơ khi phối hợp giữa 2
chủng Pseudomonas sp KG1 và Pseudomonas sp
KG2 thay thế (50-75% N)
•
Khi giải trình tự 16s thì chủng Pseudomonas
sp.BT2 này có mức tương đồng 99% với chủng
P.nitroreducens [22]. Đây cũng là cơ sơ khoa học
quan trọng để để chúng tôi khẳng định sự cố định
đạm của P. nitoreducens khi sống nội sinh trong hệ
rễ của cây ngô. Và trên thực tế khảo nghiệm các cây
ngô trong bầu đất có nhiễm chủng P. nitroreducens
tích lũy N tổng số trong lá luôn cao hơn so với đối
chứng 1,8 lần.
3.9. Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.
Pseudomonas nitroreducens C14
•
C14: Pseudomonas nitroreducens


Burkholderia sp KG2/Bur vô đạm
(Nguyển Thị Minh Thư, 2010, ĐH Cần Thơ)B.Cenocepacia C23/ Nfb vô đạm
3.9. Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được
tuyển chọn.

•
Chủng C23: Burkholderia cenocepacia (bắp và mía của Reis, 2004)
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


3.9. Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.
C31: Pseudomonas entomophila
•
Theo nghiên cứu (Dobereiner, 1992) thì Pseudomonas trong hệ rễ cây lúa làm
tăng N tổng 20 – 25%. So với kết quả của chúng tôi khi nhiễm P. entomophila
trong hệ rễ cây ngô làm cho tích lũy N tổng trong lá luôn cao hơn gấp 2 lần so
với ĐC, tăng 39% so với ĐC và cao hơn so với kết quả nghiên cứu
(Dobereiner) từ 14 - 19%.
P.entomophila/ Nfb vô đạm
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


3.10. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của chủng
đã tuyển chọn
3.8.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh
khối của các chủng đã tuyển chọn.
•
BMS=(1,3-1,6)Fallik =(5-9)Nfb vô đạm
•
BMS là môi trường thuận lợi nhất cho sự tăng sinh của cả 3 chủng.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.8.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối
của các chủng vi khuẩn.
•
Thời gian tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas
nitroreducens và Burkholderia là sau 48h nuôi cấy
•
Thời gian tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas entomophila
là sau 48h- 72h nuôi cấy.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


3.8.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các
chủng vi khuẩn.
•
Tốc độ lắc tối ưu cho chủng Pseudomonas entomophila và Burkholderia là
150rpm/phút.
•
Tốc độ lắc tối ưu cho chủng Pseudomonas nitroreducens là 150 -200rpm/phút.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


3.8.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến
sinh khối của các chủng vi khuẩn.
•
pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Burkholderia là
cenocpacia 6,3; Pseudomonas nitroreducens là 6,8; Pseudomonas
entomophila 7,8.

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


3.8.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối
của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn
•
Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas
nitroreducens và Pseudomonas entomophila là 32
0
C, Burkholderia
cenocepacia là 37
0
C.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập và mô tả đặc điểm hình thái của 31 chủng vi khuẩn cố
định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên môi trường vô đạm Nfb. Cả 31 chủng
đều có khả năng sinh IAA.
2. Tuyển chọn được 9 chủng có phản ứng tốt với sự sinh trưởng,
tích luỹ chlorophyll, N, P…và dương tính với gen nifH (C6, C10, C13, C14,
C18, C23, C29, C30, C31).
Trong số đó đã giải trình tự gen 16S được 3 chủng C14, C23, C31 là
những chủng cho hoạt tính cố định đạm, khả năng sinh IAA cao là các chủng
Pseudomonas nitroreducens C14, Burkholderia cenocepacia C23,
Pseudomonas entomophila C31.

Khi nhiễm các chủng này vào hệ rễ cây làm tăng số lá 23 – 33%;
chiều dài lá; 18,8 – 38,5%, chiều cao cây 29,5 – 44,2%; đường kính gốc thân
24,3 – 31,5%; chiều dài rễ 24,2 – 25,9%; khối lượng rễ 21,9– 27%; sinh khối
tươi 41,8 - 53,5%, sinh khối khô 48,8 – 58,8% ; tích luỹ diệp lục tổng số
tăng 69,4 -84,9%; tích lũy N trong lá tăng 35,4 – 54,2%; tích luỹ P tăng
30,5 – 36% so với ĐC.