Đặc tính sinh học của virus rota gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em năm 2009 tại bệnh viện nhi thụy điển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
VIỆN ðẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  


KHO¸ LUËN TèT NGHIÖP
KHO¸ LUËN TèT NGHIÖPKHO¸ LUËN TèT NGHIÖP
KHO¸ LUËN TèT NGHIÖP






ðề tài:
ðặc tính sinh học của virus rota gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em
năm 2009 tại Bệnh Viện Nhi Thụy ðiển

Người hướng dẫn :PGS.TS Lê Thị Luân
Sinh viên thực hiện :Vũ Văn Chính
Lớp :06 - 05






Hà Nội - 05/2010

Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS. Lê Thị Luân – Phó Giám ñốc Trung tâm Khoa học sản xuất vắc
xin và sinh phẩm y tế, ñã nhiệt tình hướng dẫn em thực hiện ñề tài và hoàn
thành khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Mai Hương, cùng toàn
thể các cán bộ công tác tại Phòng Kiểm ðịnh thuộc Trung tâm Nghiên cứu
và sản xuất Vắc xin và sinh phẩm y tế, các thầy cô giáo trong khoa Công
nghệ sinh học, Viện ðại học Mở Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi và
nhiệt tình giúp ñỡ, dạy bảo trong suốt quá trình học tập và thực hiện ñề tài.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia ñình và cảm ơn bạn bè ñã ñộng viên,
khuyến khích, giúp ñỡ em trong những năm học qua.

Hà Nội, tháng 5 năm 2010
Vũ Văn Chính

Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp

CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADRV Animal Derived Rotavirus
AVE Viral Elution Buffer – Dung dịch dùng ñể tách chiết RNA từ
mẫu phân.
AVL Viral lysis Buffer – Dunng dịch dung ñể tách chiết RNA từ
mẫu phân.
Bp Base pair
Dal Dalton
DNA Axid Deoxyribonucleic
RNA Acid Ribonucleic
cDNA Sản phẩm PCR1
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
EIA ELISA Immunize Assay – Thử nghiệm miễn dịch enzyme
EDTA Ethylendiamintetracetic
IgA Globulin miễn dịch
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
MMU 18006 Chủng Rota virus nguồn gốc từ khỉ Rhesus
RIT 4237 Chủng Rota virus 4237 gây bệnh ở bò
RT Enzyme sao chép ngược
RT – PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction – Phản ứng
chuỗi khuếch ñại sao chép ngược
RV Rota virus
TBE 0,5X Dung dịch ñệm dùng cho chạy ñiện di
TCC Tiêu chảy cấp
TMB 3,3’ – 5,5’ – Tetramethylbenzidine, cơ chất dùng trong
phương pháp ELISA

WC3 Chủng Rota virus gây bệnh ở bò
AW1, AW2 Wash buffer1, Wash buffer2 – Dung dịch nước rửa dùng ñể
tách chiết RNA từ mẫu phân
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

_Toc262481555

ðẶT VẤN ðỀ 5
Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8
1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN RV 8
1.1.1 Tình hình thế giới 8
1.1.2 Tình hình tại Việt Nam 8
1.2. PHÂN LOẠI 9
1.3. HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÚC 9
1.3.1. Hình thái 9
1.3.2. Cấu trúc 10
1.4. PHÂN NHÓM VÀ CÁC TYP HUYẾT THANH 17
1.4.1. Phân nhóm 17
1.4.2. Các typ huyết thanh 17
1.5. TÍNH CHẤT LÝ HÓA [4] 18
1.5.1. Sức ñề kháng với nhiệt ñộ 18
1.5.2. Tính bền vững với pH 18
1.5.3. Các tính chất khác 18
1.6. SỰ NHÂN LÊN CỦA RV TRONG TẾ BÀO 19
1.7. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH 22
1.7.1. Khả năng gây bệnh thực nghiệm 22
1.7.2. Khả năng gây bệnh cho người 23
1.8. CƠ CHẾ GÂY BỆNH 23

1.9. ðẶC ðIỂM LÂM SÀNG 24
1.10. DỊCH TỄ HỌC CĂN BỆNH TIÊU CHẢY CẤP 24
1.10.1. ðường lây truyền 24
1.10.2. Mùa bệnh 24
1.10.3. Lứa tuối mắc bệnh 25
1.10.4. Miễn dịch 25
1.11. SỰ PHÂN BỐ TOÀN CẦU CÁC CHỦNG RV 26
1.11.1. Trên thế giới 26
1.11.2. Tại Việt Nam 29
1.12. CHẨN ðOÁN RV 29
1.12.1. Chẩn ñoán trực tiếp 29
1.12.2. Chẩn ñoán gián tiếp 30
1.13. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN VACXIN PHÒNG
BỆNH TCC 31
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 33
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu 33
2.1.2. Mẫu bệnh phẩm 33
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp

2.1.3. Hoá chất, dụng cụ, máy móc dùng cho chẩn ñoán mẫu phân bằng
phương pháp ELISA 33
2.1.4. Nguyên vật liệu sử dụng cho tách chiết RNA từ mẫu phân 34
2.1.5 Nguyên vật liệu và hóa chất sử dụng cho quá trình chạy PCR 34
2.1.6. Nguyên vật liệu và máy móc sử dụng cho chạy ñiện di 37
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.2.1. Phương pháp miễn dịch - enzyme (ELISA) 38
2.2.2. Tách RNA từ mẫu phân theo Kit Qiagen 40
2.2.3. Các bước phản ứng chuỗi khuếch ñại sao chép ngược xác ñịnh
kiểu gen P và G 41

2.2.4. Chạy ñiện di và ñọc kết quả 44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46
3.1. XÁC ðỊNH TỶ LỆ TCC DO RV VÀO BỆNH VIỆN NHI THỤY
ðIỂN NĂM 2009 46
3.2. TỶ LỆ TRẺ MẮC TCC DO RV PHÂN BỐ THEO MÙA, GIỚI
TÍNH, THEO NHÓM TUỔI TẠI BỆNH VIỆN NHI THUỴ ðIỂN NĂM
2009 48
3.2.1. Phân bố theo mùa 48
3.2.2. Phân bố theo giới tính 49
3.2.3. Phân bố theo nhóm tuổi 51
3.3. NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT PHÂN VÀ CÁC TRIỆU CHỨNG
CỦA TRẺ BỊ TIÊU CHẢY CẤP TẠI BỆNH VIỆN NHI THỤY ðIỂN
NĂM 2009 52
3.3.1. Tính chất phân 52
3.3.2. Các triệu chứng mắc phải 53
3.4. ðẶC TÍNH CÁC CHỦNG RV GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN NHI
THỤY ðIỂN NĂM 2009 54

KẾT LUẬN 61
KIẾN NGHỊ 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63





Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
3

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH ẢNH

Danh mục bảng biểu
Trang

Bảng 1. ðộ lớn của các ñoạn gen của rota virus [6] 12
Bảng 2. Các gen và protein của RV [6] 15
Bảng 3. Thang ño type P và type G hiện hành tại Việt Nam 45
Bảng 4: Tỷ lệ TCC do nhiễm RV năm 2009 tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển46
Bảng 5: Tỷ lệ TCC do RV tại một số bệnh viện ở Việt Nam [13] 47
Bảng 6: Sự phân bố theo tháng của trẻ em mắc TCC tại Bệnh Viện Nhi
Thụy ðiển năm 2009 48
Bảng 7: Tỷ lệ trẻ em mắc bệnh tiêu chảy cấp do RV theo giới tính 50
Bảng 8. Sự phân bố theo tuổi tại viện Nhi Thụy ðiển năm 2009 51
Bảng 9: Tính chất phân trẻ bị tiêu chảy cấp tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển
năm 2009 53
Bảng 10: Triệu chứng lâm sàng của trẻ mắc tiêu chảy cấp 53
Bảng 11: Sự phân bố của các chủng RV gây bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ dưới 5
tuổi tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm 2009 54
Bảng 12 . Tỷ lệ kiểu hình của các chủng RV phân bố tại bệnh viện Nhi
Thụy ðiển năm 2009 56
Bảng 13. Chủng RV lưu hành tại Việt Nam Từ 1998 – 2004 (typ G) [4] 57
Bảng 14. Chủng RV lưu hành tại Việt Nam từ năm 1998 – 2004 (typ P) [4]
58

Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
4


Danh mục hình ảnh


Hình 1:Rotavirus ñược chụp dưới kính hiển vi ñiện tử [15] Error!
Bookmark not defined.
Hình 2 : Cấu trúc chung của RV[11] Error! Bookmark not defined.
Hình 3. Ba lớp capsid của RV Error! Bookmark not defined.
Hình 4. Capsid kép của virus (bên trái) và lớp capsid trong (bên phải)
Error! Bookmark not defined.
Hình 5. Lớp capsid trong của hạt virus Error! Bookmark not defined.
Hình 6. Lớp capsid ngoài Error! Bookmark not defined.
Hình 7. Genome và protein của RV Error! Bookmark not defined.
Hình 8: giám sát sự phân bố của các chủng virusError! Bookmark not
defined.
Hình 9. Sự nhân lên của RV trong tế bào Error! Bookmark not defined.
Hình 10. Tỷ lệ mắc TTC do RV tại Bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm 2009
Error! Bookmark not defined.
Hình 11: Tỷ lệ trẻ em mắc bệnh TCC theo tháng tại Bệnh Viện Nhi Thụy
ðiển năm 2009 Error! Bookmark not defined.

Hình 12: Tỷ lệ mắc TTC do RV phân bố theo giới tính tại Bệnh Viện Nhi
Thụy ðiển năm 2009 Error! Bookmark not defined.
Hình 13. Tỷ lệ trẻ mắc TTC do RV ở các nhóm tuổiError! Bookmark not
defined.
Hình 14: Tỷ lệ các kiểu gen P lưu hành tại Bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm
2009 Error! Bookmark not defined.
Kiểu gen G : G3 chiếm tỷ lệ nhiều nhất 77,04%. Ngoài G4 không thấy xuất
hiện thì các kiểu gen G tương ứng lần lượt tiếp theo là G1 chiếm 10,88%,
G0 chiếm 7,55%, Gmix chiếm 2,42%, G9 chiếm 1,51% và cuối cùng là G2
chiếm 0,61%. Error! Bookmark not defined.
Hình 15: Tỷ lệ các kiểu gen G lưu hành tại Bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm
2009 Error! Bookmark not defined.
Hình 16:Tỷ lệ các chủng RV lưu hành tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm
2009 Error! Bookmark not defined.
Hình 17. Kết quả các kiểu gen P lưu hành tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển
năm 2009 Error! Bookmark not defined.
Hình 18. Kết quả các kiểu gen G lưu hành tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển
năm 2009 Error! Bookmark not defined.


Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
5


ðẶT VẤN ðỀ

Rota virus (RV) ñược phát hiện lần ñầu tiên vào năm 1973, là một
virus RNA sợi ñơn, thuộc họ Reoviridae. Tiêu chảy cấp do Rotavirus là
bệnh nhiễm khuẩn dạ dày ruột cấp do virus Rota gây nên. Bệnh rất thường

gặp ở trẻ em và trẻ nhỏ, ñặc biệt là lứa tuổi từ 3 tháng ñến 2 tuổi. Trong 5
năm ñầu ñời, hầu như không trẻ nào thoát khỏi tiêu chảy cấp do virus rota.
Bệnh cũng có thể xảy ra ở người lớn và thường nhẹ hơn.Trên thế giới hàng
năm có khoảng trên 600 nghìn trẻ chết vì tiêu chảy do virus rota, chiếm 5%
số ca chết vì mọi nguyên nhân ở trẻ em dưới 5 tuổi [19].
Trong vòng 5 năm (1973-1978) RV ñã ñược công nhận là nguyên
nhân phổ biến nhất thường gây bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên
khắp thế giới, nhất là trẻ em dưới 5 tuổi. Có khoảng 1/3 trường hợp tiêu
chảy nặng do RV ở trẻ em phải nằm viện. Theo ước tính của Tổ chức Y Tế
Thế Giới, năm 1991 có 3,5 triệu trẻ em bị chết vì tiêu chảy [5].
Ở Mỹ, RV là nguyên nhân của 2,7 triệu ca viêm dạ dày ruột ở trẻ em
hàng năm, trong số khoảng gần 60.000 ca vào bệnh viện có khoảng 37 ca
tử vong. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng ở các nước ôn ñới có tới 50%
trường hợp tiêu chảy do RV [5].
Tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do RV chiếm trên 50%
trong tổng số trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy vào ñiều trị tại một số Bệnh
Viện Nhi lớn của Việt Nam. Và là bệnh phổ biến ñứng thứ 2 sau nhiễm
trùng hô hấp. RV nhóm A gây ra hơn 90% tổng số ca nhiễm viêm dạ dày
ruột do RV của người, nhóm B chủ yếu gây ra bệnh ở người lớn, nhóm C ít
gặp hơn.
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
6

Từ năm 1998-2003 các nhà khoa học ñã tiến hành nghiên cứu về RV
tại 6 bệnh viện ở 4 thành phố của Việt Nam. Hơn 10.000 trẻ em dưới 5 tuổi
nhập viện do RV, 55% số mẫu có kết quả dương tính và tỷ lệ phát hiện RV
thay ñổi từ 44% ñến 62% [18].
Tiêu chảy do RV ở trẻ em là một gánh nặng ñối với tất cả các nước
trên Thế Giới. Do tính chất nguy hiểm của bệnh nên hiện nay nhiều nước

trên Thế Giới cũng như ở Việt Nam ñang ñặc biệt quan tâm và mở rộng các
nghiên cứu nhằm tìm ra các biện pháp ngăn chặn, làm giảm tỷ lệ mắc và tử
vong do căn bệnh này.
Năm 1998 vacxin rota shieed ñã ñược cấp phép sử dụng tại Mỹ
nhưng năm 1999 ñã ngừng sử dụng do có thể tăng nguy cơ lồng ruột ở trẻ.
Sự lan rộng của các typ huyết thanh phức tạp khác nhau của RV ñã gây khó
khăn trong tiến trình phát triển vacxin. Tuy nhiên rất may mắn, vacxin
Rotarix và Rotateq ñược sử dụng trong trị liệu thử nghiệm hiện nay do
Mecrk và Glaxo Smith Kline tạo ra ñã ñịnh hình cho loại vacxin tổng hợp
trong tương lai [9].
Nghiên cứu giám sát tiêu chảy do RV giữ vai trò ñặc biệt quan trọng,
là tiền ñề cho nghiên cứu biện pháp phòng bệnh này tại Việt Nam, giúp bảo
vệ sức khỏe cho cộng ñồng ñặc biệt là ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Trước yêu
cầu ñòi hỏi của thực tiễn trên chúng tôi tiến hành ñề tài nghiên cứu:
“ðặc tính sinh học của virus rota gây bệnh tiêu chảy cho
trẻ em năm 2009 tại Bệnh Viện Nhi Thụy ðiển”
Mục ñích:
- Xác ñịnh tỷ lệ bệnh tiêu chảy cấp do virus rota tại Bệnh Viện Nhi
Thụy ðiển năm 2009 và các mối liên quan với các yếu tố tuổi, giới tính,
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
7

mùa. Tìm hiểu các triệu chứng phổ biến khi mắc bệnh và tình trạng phân
của bệnh nhân.
- Xác ñịnh các typ RV gây bệnh phổ biến ở Bệnh Viện Nhi Thủy
ðiển năm 2009.
Yêu cầu:
Tiến hành các thí nghiệm phân tích các mẫu phân của trẻ bị tiêu chảy
cấp ñược thu thập từ Bệnh Viện Nhi Thụy ðiển năm 2009.

Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
8


Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN RV
1.1.1 Tình hình thế giới
Từ những năm 1950, một số tác giả ñã ñề cập tới nguyên nhân tiêu

chảy cấp do virus mà trước ñó gọi là “tiêu chảy không rõ nguyên nhân”.
Vào năm 1974, Thomas Henry Flewett-nhà virus học người Anh ñã
ñặt tên cho virus này là “rotavirus” sau khi quan sát chúng dưới kính hiển
vi ñiện tử, virus rota trông giống như một cái bánh xe (Rota trong tiếng
Latin có nghĩa là vòng tròn). 4 năm sau ñó cái tên này mới chính thức ñược
ñặt cho loại virus này. Flewett và Bryden, Midleton cũng ñề cập tới vai trò
của rotavirus trong bệnh viêm dạ dày-ruột. Sau này, những nghiên cứu về
hình thái học bằng nhuộm âm bản những lát cắt cực mỏng các tổ chức
nhiễm virus Rota, quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử ñã cho phép xác ñịnh
virus Rota thuộc họ Reoviridae [3].
1.1.2 Tình hình tại Việt Nam
Tại Việt Nam, mãi ñến năm 1980 mới nghiên cứu và xác ñịnh virus
Rota là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em. ðó là một bệnh rất
phổ biến ñứng thứ hai sau nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em.
Tới năm 1982 ñã triển khai chương trình phòng chống tiêu chảy, ñến
nay tỷ lệ trẻ mắc bệnh tiêu hoá giảm dần hàng năm. Tuy nhiên, vào những
thời ñiểm thời tiết thay ñổi, nhất là mùa nắng nóng trẻ dễ mắc nhiều loại
bệnh trong ñó có tiêu chảy.
Tiêu chảy cấp thể nặng tiếp tục là một gánh nặng cho trẻ, mỗi gia
ñình và toàn xã hội ở Việt Nam.
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
9

1.2. PHÂN LOẠI
Virus rota là một chi thuộc họ Reoviridae, gồm một số nhóm và
nhiều typ huyết thanh. Hạt rotavirion là một cấu trúc capsid ba lớp, phức
tạp và không có vỏ, bao bọc xung quanh bộ gene chứa 11 ñoạn RNA. Có 6
protein cấu trúc và 6 protein không cấu trúc. Rotavirus ñược chia thành các
nhóm huyết thanh từ A ñến E. Các nhóm từ A ñến C gây nhiễm trùng ở

người và tất cả mọi nhóm ñều có thể gây nhiêm trùng ở ñộng vật có vú.

Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em.


Kích thước
(nm)
Số ñoạn
RNA
Khối lượng phân tử của
genome (Dal)
Vật chủ
75 11 12,2
Người và các ñộng
vật có xương sống
khác
1.3. HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÚC
1.3.1. Hình thái
Virus có hình khối tròn, ñường kính trung bình từ 65-70 nm [3].
Hình ảnh rota virus dưới kính hiển vi ñiện tử giống hệt như một cái bánh xe
có các gai ngắn và một cái vành rất nhẵn. Tên rota virus từ tiếng Latinh,
“Rota” có nghĩa là bánh xe bắt ñầu từ hình thái của nó [4].

Hình 1:Rotavirus ñược chụp dưới kính hiển vi ñiện tử [15]

Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
10

1.3.2. Cấu trúc

Dưới kính hiển vi ñiện tử, RV có dạng khối cầu 20 mặt, ñường kính
khoảng 75nm .Chuỗi nucleocapsid của virus ñược tạo thành bởi ba vòng
xoắn ñồng tâm gồm 11 ñoạn RNA kép. Hạt rotavirus có hai lớp áo protein
bao ngoài. Mỗi ñoạn dsRNA mã hóa cho một protein cần thiết cho sự tồn
tại và nhân lên của virus.










1.3.2.1. Cấu trúc capsit













Hình 2 : C

ấu trúc chung của
RV
[11
]



Hình 3. Ba lớp capsid của RV
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
11

Capsid của RV có dạng ñối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp ñối
xứng xoắn [7].
- Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7
- Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6
- Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3. Trong ñó VP2
là protein bao quanh RNA.
Các nghiên cứu bằng kĩ thuật ñiện di miễn dịch và kính hiển vi ñiện
tử ñã khẳng ñịnh : Capsid trong mang kháng nguyên ñặc hiệu nhóm.
Capsid ngoài mang kháng nguyên ñặc hiệu typ [4].

Hình 4. Capsid kép của virus (bên trái) và lớp capsid trong (bên phải)
Hình 5. L
ớp capsid trong của hạt virus

Hình 6. Lớp capsid ngoài
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
12

1.3.2.2. Genome
Genome của RV là RNA sợi ñôi có 11 ñoạn kí hiệu từ 1->11.Có ñộ
lớn khoảng 18.555 cặp base. Mỗi gen có trọng lượng phân tử từ 2.10
5
->
2,2.10
6
(Dalton), mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc không cấu trúc. Trừ
gen 9 và gen 11, mỗi chuỗi mã hóa hóa cho hai phân tử protein. Trọng

lượng 11 ñoạn ước tính khoảng 10.10
6
ñến 14.10
6
(Dalton) [4].
ðiện di trên gel acrylamid thấy 11 ñoạn gen của RV ñược chia ra
làm 4 khu vực. Những gen này ñược ñánh số theo thứ tự phân bố của
chúng trên bản gel, chẳng hạn gen nào di chuyển chậm nhất ñược ñánh số
1.
ðối với RV nhóm A :
- 4 gen có kích thước lớn : 1,2,3,4
- 2 gen trung bình : 5,6
- 3 gen nhỏ : 7,8,9
- 2 gen nhỏ nhất. : 10, 11
Bảng 1. ðộ lớn của các ñoạn gen của rota virus [6]
Vùng ko mã hóa
ðoạn gen Cặp base G+C (%)
5’ 3’
Amino acid

1 3302 34,6 18 17 1088
2 2690 32,9 16 28 881
3 2591 28,9 49 35 835
4 2362 34,7 9 2 776
5 1581 33,9 32 73 491
6 1356 38,6 23 139 397
7 1104 33,5 25 131 315
8 1059 35,5 46 59 317
9 1062 35,9 48 33 326
10 751 40,2 41 182 175

11 667 38,6 21 49 198
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
13

1.3.2.3. Protein
Protein cấu trúc
Hạt virus chứa ít nhất 6 protein cấu trúc:
- Các ñoạn 1, 2, 3 và 6 mã hóa cho các protein VP1, VP2, VP3 và
VP6.
- VP1 là enzyme RNA polymerase nằm trong lõi hạt virus, tham gia
vào quá trình phiên mã tạo ra các phân tử mRNA và tạo ra các bản sao
genome RNA cho các hạt virion mới.
- VP2 là lớp lõi của hạt virion và liên kết với genome RNA.
- VP3 là một phần của màng lõi trong của hạt virion và là enzyme
Guanylyl transferase, có vai trò gắn mũ vào ñầu 5’ trong quá trình cải
biến sau phiên mã phân tử mRNA, bảo vệ mRNA khỏi sự phân huỷ của
các nuclease.
- Ba protein mang tính ñặc hiệu kháng nguyên của virus là VP4,VP6
và VP7 [4].
- ðoạn gen 4 mã hóa cho protein capsit lớp ngoài VP4, là protein bề
mặt hạt virus nhô ra như những cái gai, liên kết với các phân tử receptor
bề mặt tế bào chủ ñể ñưa toàn bộ genome virus vào tế bào. VP4 là một
protein nhạy cảm với protease và ñịnh ra typ P của virus, là kháng
nguyên trung hòa có tính ngưng kết hồng cầu. VP4 bị enzyme protease
trong ruột phân hủy tách ra một cách ñặc hiệu tạo thành VP5* và VP8*
làm tăng hoạt tính gây nhiễm của virus vào tế bào chủ [7].
- ðoạn gen 9 mã hóa cho protein VP7. VP7 có bản chất là
glycoprotein là kháng nguyên trung hòa ñặc hiệu cho typ huyết thanh và
VP7 ñinh ra typ G của virus [4,7].

- VP6 là kháng nguyên chung cho dưới nhóm của RV [4].
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
14

- Các gai VP4 nhô ra từ lớp vỏ VP6. Phần VP4 trải dài hướng vào
trong và tương tác với VP7 và protein capsid trong VP6. Sự tương tác
VP4-VP7, VP4-VP6 bao hàm rằng VP4 có thể tham gia duy trì chính
xác hình dạng giữa hai lớp trong và ngoài vỏ capsit cũng như phạm vi
ảnh hưởng chức năng. VP7 là glycoprotein tạo ra lớp vỏ ngoài của virus
bao gồm 780 phân tử, VP7 tương tác với phần chop của VP6 [6].
Protein không cấu trúc
- Các ñoạn gen còn lại (5, 7, 8 hoặc 9 tùy chủng, 10 và 11) mã hóa
cho các protein không cấu trúc lần lượt là: NSP1 (NS53), NP2 (NS35),
NSP3 (NS34), NSP4 (NS28), NSP5 (NS26).
- NSP1 tạo ra từ gen 5 là một protein không cấu trúc liên kết RNA.
- NSP2 là một protein liên kết RNA tích lũy trong thể vùi tế bào chất
(viroplasma) cần thiết cho quá trình sao chép genome của virus.









Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
15

Bảng 2. Các gen và protein của RV [6]
ðoạn
gen
Protein

Trọng lượng
phân tử
(Dalton)
Vị trí trên
hạt virus
Chức năng
1 VP1 125.005 Lõi trong
RNA polymerase phụ
thuộc RNA
2 VP2 102.431 Lõi trong
Kích thích tái tạo RNA
của virus
3 VP3 98.120 Lõi trong
Enzyme Guanylyl
transferase gắn mũ RNA

4 VP4 86.782
Vỏ capsid
ngoài
Biệt hóa tế bào, tính ñộc
5
NSP1
(NS53)

58.654
Protein không
cấu trúc
Không có vai trò cho
sinh trưởng virus
6
VP6
(NS34)

44.816
Vỏ trong
capsid
Cấu trúc và là kháng
nguyên ñặc trưng loài
7
NSP3
(NS34)

34.600
Protein không
cấu trúc
Làm tăng hoạt tính
mRNA virus và ngừng
tổng hợp protein tế bào
8
NSP2
(NS35)

36.700
Protein không

cấu trúc
protein cấu
trúc
NTPase liên quan trong
việc ñóng gói RNA
9 VP7 37.368
Vỏ capsid
ngoài
Cấu trúc và kháng
nguyên trung hòa
10
NSP4
(NS28)

20.290
Protein không
cấu trúc
ðộc tố ruột
11
NSP5
(NS26)

21.725
Protein không
cấu trúc
ðộc tố ruột

- NSP3 thì liên kết mRNA của virus trong những tế bào nhiễm bệnh
có thể dừng qua trình tổng hợp protein tế bào.
- NSP4 là ñộc tố trong ruột người bệnh tiêu chảy và là ñộc tố ruột

của virus ñầu tiên ñược phát hiện.
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
16

- NSP5 ñược mã hóa bởi gen 11 của RV nhóm A và trong tế bào
nhiễm NSP5 ñược tích lũy trong thể vùi tế bào chất.
- NSP6 là protein liên kết axit nucleic và ñược mã hóa bởi gen 11.
Theo Roseto và cộng sự, bằng kĩ thuật ñông khô ñã xác ñịnh RV có 132
capsome ñược sắp xếp ñối xứng lệch. Họ cũng chỉ ra rằng lớp ngoài có các
lỗ nhỏ tương ứng với các lỗ của vỏ capsit trong. Sau này Ludert và các
cộng sự cũng khẳng ñịnh cấu trúc capsit trong của RV bằng kĩ thuật phá vỡ
hạt virus và kĩ thuật tương tự.
Quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử cho thấy cấu trúc 3 lớp, 2 lớp, 1
lớp lõi hạt virus ñiển hình. Cấu trúc lớp kép và lõi có thể là sản phẩm của
việc biến ñổi liên tục của hạt 3 lớp.
Nghiên cứu về Rota bằng kính hiển vi ñiện tử lạnh cho thấy : VP4
hiện diện trên vỏ ngoài capsit như một loại gai ngắn có kích thước 10 –
12nm. Trong lượng phân tử 88000 Dal chiếm 1,5% protein của hạt virus.
VP4 ñóng vai trò thứ yếu cấu tạo vỏ capsit ngoài và ñược mã hóa bởi gen 4
của các chủng Rota [12].
- VP7 có trọng lượng phân tử 34000 Dal nhưng lại cấu tạo nên 30%
protein hạt virus. VP7 nằm ở vỏ capit ngoài và ñịnh hình nên bề mặt nhẵn
của vỏ ngoài.

Hình 7. Genome và protein của RV

Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
17

1.4. PHÂN NHÓM VÀ CÁC TYP HUYẾT THANH
1.4.1. Phân nhóm
Theo Lambert J.P (1992) virus rota ñược chia thành năm nhóm A, B,
C, D và E Nhóm A có hai phân nhóm 1 và 2, phân nhóm 1 có typ huyết
thanh 2, phân nhóm hai có typ huyết thanh 1, 3 và 4.
Baoming (1995) chia virus rota thành 7 nhóm ; A, B, C, D, E, F và
G, trong ñó chỉ có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và ñộng vật. Nhóm
D, E, F, G chỉ thấy ở ñộng vật ở ñộng vật. Nhóm A hay gặp nhất, gây ra
hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em. Nhóm B, C thường gây ra
những cụ dịch lẻ tẻ, hay gặp ở trẻ lớn và người trưởng thành [4].
1.4.2. Các typ huyết thanh
Typ huyết thanh của rota virus ñược ñặc trưng bởi hai protein capsid
lớp ngoài là VP4 và VP7 ñược mã hóa bởi hai ñoạn gen khác nhau [14].
VP4 là một loại protein chống phân tách protease – protein P và VP7 là
một loại glycoprotein – protein G [4].
14 typ huyết thanh G ñã ñược nhận dạng ở rota virus nhóm A. Các
typ 1, 2, 3 và 4 là các typ huyết thanh chiếm ña số vòn lại các typ 6, 8, 9,
10 chiếm thiểu số trong các typ huyết thanh gây bệnh ở người [19].
20 typ huyết thanh P ñã ñược phát hiện, 9 trong số ñó phát hiện ở
người là P1, P2A, P3, P4, P5A, P7, P8, P11, P14 và P19.
Về mặt lý thuyết sẽ có rất nhiều chủng virus rota của người khác
nhau bởi sự kết hợp của các typ huyết thanh G và P. Nhưng thật may mắn

trên thế giới chỉ có bốn chủng RV chủ yếu phân bố G1P8, G3P8, G4P8,
G2P4. ðây là một thuận lợi cho mục ñích phát triển vaccine. Tuy nhiên sự
lưu hành của các chủng virus rota có khác nhau ñáng kể ở các vùng khí hậu
khác nhau, một số chủng không thông thường lại phân bố ở một vài quốc
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
18

gia ñang phát triển, chẳng hạn P6 kết hợp với typ huyết thanh G9 chiếm
9,5% tổng số các chủng RV ở Ấn ðộ.
Ở Việt Nam theo nghiên cứu năm 2000 – 2001 chủng G1P8 chiếm
ña số ngoài ra có một tỷ lệ nhỏ các chủng G1P4, G1P4, G4P8, G4P6,…



Hình 8: giám sát sự phân
bố của các chủng virus




1.5. TÍNH CHẤT LÝ HÓA [4]
1.5.1. Sức ñề kháng với nhiệt ñộ
Trong phân ở nhiệt ñộ thường, virus tồn tại nhiều ngày. Ở 4
0
C thậm
chí ở 20
0
C với sự có mặt của 1,5mM CaCl
2

, RV vẫn giữ ñược tính gây
nhiễm trùng tromg nhiều tháng. Ở -20
0
virus có thể tồn tại nhiều năm, virus
dễ bị bất hoạt ở nhiệt ñộ cao trên 45
0
. Nếu ñông tan băng nhiều lần thì virus
mất khả năng gây nhiễm trùng. Virus có khả năng tồn tại lâu trong buồng
bệnh nhân nên tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện khá cao.
1.5.2. Tính bền vững với pH
RV bền vững với pH ở diện tích rộng từ pH 3 ñến pH 10 nhờ ñó RV
có thể tồn tại và phát triển tốt trong ruột người.
1.5.3. Các tính chất khác
- Tính nhạy cảm: Khả năng gây nhiễm trùng của RV tùy thuộc vào
sự có mặt của lớp vỏ capsid. RV nhạy cảm với EDTA (ethylendiamintetra)
G1P8
G2P4
G3P8
G4P8
Hỗn hợp
Các loại khác
53%
14%
10,7%
5,4%
14,3%
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
19

EDTA có khả năng phá vỡ lớp vỏ capsit và làm mất khả năng nhiễm trùng
của virus.
Sodium thyocianate biến hạt virus có hai lớp thành hạt virus chỉ có
một lớp capsit. Sodium dodecyl 0,1%, phenol, formalin, betapropiolaction
và ñặc biệt là ethanol 95% là chất khử trùng hiệu quả nhất làm mất lớp vỏ
capsid virus.
- Tính ñề kháng : RV nói chung ñề kháng fluorocacbon, ete,
chloroform deoxycholate và ñung dịch không ion. RV không chụ tác dụng
của kháng sinh, chỉ dúng kháng sinh trong trường hợp bội nhiễm hay
nhiễm khuẩn phối hợp.
1.6. SỰ NHÂN LÊN CỦA RV TRONG TẾ BÀO
RV bám vào bề mặt tế bào lông nhung ruột non dẫn ñến sự thay ñổi
cấu trúc và chức năng của biểu mô. Nhờ 3 loại protein vỏ VP7, VP6, VP4
mà virus ñề kháng với pH dạ dày và một số enzyme tiêu hóa của ruột.Virus
xâm nhập vào tế bào theo lối nhập bào qua mối tương tác ñặc hiệu giữa
protein bề mặt VP4 với thụ thể tế bào, sau ñó tạo thành một bóng gọi là
endosome . Các phân tử protein ở lớp ngoài (gai VP4 và VP7 ) phá vỡ lớp
màng ngoài endosome tạo ra sự khác biệt về nồng ñộ canxi. ðó là nguyên
nhân phân giải phân tử trimer VP7 thành VP5 va VP8 , capsid trong không
bị phân hủy nên lúc này hạt virus ñược gọi là hạt cận virus hay dưới virus
(SVP – subviral particle). Việc tách vỏ ngoài của RV ở người phụ thuộc
trypin. Virus xử lý trước bằng trysin sẽ thâm nhập trực tiếp vào tế bào chất
qua màng tế bào [4].
- Quá trình sao chép xảy ra hoàn toàn trong tế bào chất.
- Tế bào không chứa các enzyme dùng cho sao chép sợi kép RNA vì
thế virus phải tự cung cấp các enzym cần thiết.
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
20

- RNA sợi (-) ñược dùng làm khuôn ñể sao chép sợi (+) nhờ enzym
RNA polymeraza phụ thuộc RNA. Sợi (+) này dùng ñể tổng hợp các
protein ñồng thời phiên mã tạo RNA sợi (-). Khi sợi (-) ñược tổng hợp hoàn
toàn nó duy trì việc liên kết với sợi (+).
- Các ñoạn RNA sợi kép ñược hình thành trong các hạt virus mới và
các RNA sợi kép hay các RNA ñơn sợi âm không bao giờ tồn tại tự do
trong các tế bào nhiễm.
- Các hạt virus chưa hoàn chỉnh hình thành trong quá trình liên kết
với nguyên sinh chất của virus sẽ ñược hoàn chỉnh nhờ sự nảy chồi qua
màng lưới nội chất tế bào. Trong quá trình này các hạt virus cần các protein
capsid lớp ngoài của chúng.
- Sự phân giải tế bào sẽ giải phóng các hạt virus khỏi các tế bào
nhiễm. Các giai ñoạn chi tiết của quá trình sao chép của RV ñược mô tả
dưới ñây :
Giai ñoạn hấp phụ xâm nhập và cởi vỏ
Các ñiểm tiếp nhận ñặc hiệu (receptor) trên bề mặt tế bào chưa hoàn
toàn ñược biết rõ. Nhưng các nghiên cứu về sự gắn của chủng SA11 lên các
tế bào MA104 cho thấy có khoảng 13 nghìn ñơn vị tiếp nhận trên một tế
bào. Sự gắn khởi ñầu phụ thuộc vào natri và axit sialic trên màng tế bào.
Sau khi gắn vào tế bào khoảng 60 ñến 90 phút, virus xâm nhập vào tế bào
nhờ enzyme phân giải protein. Enzym lysosome của tế bào có tác dụng phá
vỡ capsid lớp ngoài virus.
Sự xâm nhập của virus rota người phụ thuộc vào việc tách vỏ ngoài
của virus bằng trypsin. Virus ñã ñược xử lý trước bằng trypsin sẽ trực tiếp
xâm nhập qua màng tế bào vào trong bào tương tế bào.
Một giả thuyết khác cho rằng, những hạt virus ñã ñược hoạt hóa
bằng trysin dính vào màng tế bào sẽ bơm trực tiếp acid nucleic qua khe hở
Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH
21

hình thành giữa capsomer và lỗ trên màng tế bào. Cơ chế này tương tự như
phóng acid nucleic vào tế bào vi khuẩn của phage.
Những hạt virus chưa ñược xử lý bằng trysin sẽ vào tế bào bằng
con ñường thực bào, những virion này sau khi gắn vào màng tế bào khoảng
20 phút sẽ vào trong lysosome.
Giai ñoạn tổng hợp và sao chép
Khi RNA của virus ñã vào trong tế bào tương tế bào cảm thụ thì quá
trình sao chép sẽ ñược tiến hành. Quá trình dịch mã không ñồng ñều, các
bản sao là những sợi RNA dương sao chép từ sợi RNA âm. Sợi RNA
dương và sợi âm xuất hiện ở ba giờ ñầu sau nhiễm trùng. Sau ba giờ mức
ñộ phiên mã dần lên và kéo dài từ 9 ñến 12 giờ. Tại thời ñiểm này lượng
RNA sợi dương là tối ña. Tỷ lệ tổng hợp RNA dương và âm thay ñổi trong
suốt quá trình nhiễm trùng và mức ñộ tổng hợp tối ña sợi âm xuất hiện vài
giờ trước khi lượng RNA sợi dương ñược tổng hợp tối ña.
Các protein của virus ñược tổng hợp ñồng thời với sự sao chép RNA
của virus. Các protein cấu trúc bao gồm VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7
có tác dụng tạo capsid của virus. Các protein không cấu trúc bao gồm
NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
RNA.
Giai ñoạn lắp ráp và giải phóng
RNA sợi kép tạo thành sẽ ñược lắp ráp với các protein cấu trúc tạo
thành hạt virus hoàn chỉnh trong bào tương tế bào và ñược giải phóng ra
ngoài tế bào bằng cách ly giải tế bào chủ hoặc nảy chồi.




Vũ Văn Chính Khóa luận tốt nghiệp
K13_KS CNSH

22















1.7. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH [4]
1.7.1. Khả năng gây bệnh thực nghiệm
RV có khả năng gây viêm dạ dày ruột cấp ở ñộng vật mới sinh như
thỏ mèo, dê, khỉ, bê.
Một số chủng gây bệnh cho bò như RIT 4237 và WC3 có miễn
dịch chéo với chủng gây bệnh cho người, ñược sử dụng làm vaccine phòng
bệnh cho người.
Trên thực nghiệm một số chủng virus tỏa ở người gây bệnh tiêu
chảy hoặc nhiễm trùng không triệu chứng ở ñộng vật mới sinh như bê và
lợn con thực nghiệm, lợn con bình thường, khỉ Rhesus và Cynomolgus, cừu
thực nghiệm, chó con và chuột mới sinh.
Hình 9. Sự nhân lên của RV trong tế bào