Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của hạt và cao bìm bìm biếc

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, những tiến bộ vượt bậc trong khoa học tự nhiên và những hiểu biết
ngày càng sâu sắc của nền y học hiện đại làm cho sự phân tách giữa nền y học phương
Đông và y học phương Tây ngày càng trở nên rõ rệt. Tuy nhiên, những hạn chế rõ ràng
của các loại thuốc có nguồn gốc từ tổng hợp hóa dược như có nhiều tác dụng phụ hoặc
phản ứng có hại, dễ gây tương tác đang ngày càng làm cho con người hướng sự quan
tâm của mình vào các loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu.
Việt Nam là một trong những nước trên thế giới có nguồn dược liệu phong phú
và đa dạng nhất. Đồng thời, Việt Nam cũng là một nước có kinh nghiệm sử dụng thuốc
cổ truyền lâu đời. Với những đặc điểm như vậy, việc phát triển các loại thuốc có nguồn
gốc từ dược liệu là phù hợp với điều kiện thực tiễn của nước ta cũng như xu hướng
phát triển của nền y học hiện đại.
Bìm bìm biếc là một cây thuốc được dùng phổ biến theo kinh nghiệm dân gian ở
nước ta. Hạt của cõy Bỡm bìm biếc có giá trị sử dụng cao. Theo kinh nghiêm dân gian,
nó thường được sử dụng trong các bài thuốc thông đại và tiểu tiện, thông mật, đôi khi
dùng để trị giun [10], [23]. Bộ phận này của cây hiện nay được dùng nhiều dưới dạng
cao mềm, cao đặc hoặc cao khô trong nhiều sản phẩm như: sản phẩm Boganic
đ
(công
ty Traphaco), sản phẩm Bổ gan thông mật
đ
(công ty Sohaco), sản phẩm Nagatec
đ
(công
ty Nam Dược) với công dụng chủ yếu điều trị viêm gan, vàng da, mụn nhọt, lở
ngứa
Với những giá trị sử dụng như vậy, việc nghiên cứu và xây dựng tiêu chuẩn của
hạt và cao Bìm bìm biếc là một việc làm hết sức cần thiết. Chính vì vậy, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của hạt và cao Bìm bìm biếc”
với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn của hạt và cao khô Bìm bìm biếc nhằm góp phần
nâng cao chất lượng của hạt và cao khô Bìm bìm biếc.

1
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI IPOMOEA
1.1.1. Vị trí phân loại chi Ipomoea
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987 [3], [6], chi Ipomoea có vị trí như
sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp hoa môi (Lamiidae)
Liên bộ Cà (Solananae)
Bộ Khoai lang (Convolvulales)
Họ Khoai lang (Convolvulaceae)
Chi Ipomoea
1.1.2. Đặc điểm chung của chi Ipomoea
Theo Thực vật chí Đông Dương [16], chi Ipomoea mang những đặc điểm sau:
- Dạng cõy: Cây thảo hoặc dõy leo, có dây cuốn, bò sát đất, hiếm khi đứng
thẳng đứng.
- Lá: mọc so le, nguyên, chia thùy hoặc bị xẻ, gốc hình tim.
- Hoa:
+ Cụm hoa xim, có chồi nỏch, cú một hoặc nhiều hoa, có lá bắc, sớm rụng hoặc
vĩnh viễn.
+ Hoa có màu tía, trắng hoặc vàng, thường rất đẹp.
+ Lá đài ở bên ngoài thường lớn hơn, hiếm khi nhỏ, hoặc tất cả gần bằng nhau.
+ Tràng hoa hình chuông, hình phễu, hoặc hình ống hẹp hoặc không hẹp.
+ Phiến hoa có 5 nếp, chia thùy ngắn.
+ Nhị hoa thường đính ở phớa đỏy ống, gần như luôn thụt vào. Bao phấn thẳng
hoặc cong, hoặc cuộn lại thành hình xoắn ốc sau khi mở. Chỉ nhị luụn nhỳ, đớnh
với đầu nhụy ở bên trên.
+ Đĩa mật có hình ống, ngắn, nằm ở đáy bầu. Nhụy có bầu chia thành 2 ô, mỗi ụ
cú 2 noãn, hiếm khi 3-4 ụ, vũi nhụy mảnh như sợi chỉ.

+ Quả nang, hình cầu hoặc ovan.
+ Hạt hình tròn nhẵn hoặc có nhiều lông.
2
1.1.3. Phân bố của chi Ipomoea
Họ Bìm bìm hay họ Khoai lang hoặc họ Rau muống (Convolvulaceae), là một
nhóm của 55-60 chi và khoảng 1.625-1.650 loài, chủ yếu là cõy thõn thảo dạng dây
leo, nhưng cũng có một số loài ở dạng cây gỗ hay cây bụi, phân bố rộng khắp thế giới.
Ở Việt Nam, họ Bìm bìm có 20 chi với khoảng 100 loài: Aniseia, Argyreia, Bonamia,
Cordisepalum, Dichondra, Erycibe, Evolvulus, Hewitia, Ipomoea, Jacquemontia,
Lepistemon, Merremia, Mina, Neuropeltis, Operculina, Phabitis, Porana, Stictocardia,
Tridynamia, Xenostegia.
Chi Ipomoea là một chi lớn của họ này, gồm khoảng 500 loài, phân bố rộng
khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao gồm các loài dõy bũ, dây leo, và cõy
thõn bụi . Ở Việt Nam, chi Ipomoea có khoảng 35 loài. Một số loài là cây trồng như
rau muống, khoai lang, còn lại đều là cây mọc tự nhiên, phân bố rộng khắp các vùng
miền trong cả nước [22].
1.1.4. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Ipomoea
1.1.4.1. Ipomoea aquatica Forsk
- Tên thường gọi: Rau muống, bìm bìm nước.
- Đặc điểm thực vật: Cây mọc bò, ở nước hay trên cạn. Thân rỗng, dày, có
những đốt, mặt ngoài nhẵn. Lỏ hỡnh 3 cạnh, đầu nhọn, cũng có khi hẹp và dài, không
có lông. Phiến lá dài 7-9 cm, rộng 3,5-7 cm; cuống lá nhẵn, dài 3-6 cm. Hoa to, màu
trắng hoặc hồng tím, ống hoa tím nhạt, mọc từng 1-2 hoa trên một cuống dài 1-2 cm;
đài hình chén, 5 răng nhọn không đều; tràng hợp hình phễu, 5 cánh hoa hàn liền. Nhị
không bằng nhau, đính ở gốc tràng; bầu nhẵn. Quả nang, hình cầu, đường kính 7-9 cm.
Hạt 4, có lông màu hung, đường kính 4 mm.
- Thành phần hóa học:
+ 92% nước; 3,2% protit; 2,5% glucid; 1% cenluloza; 1,3% tro.
+ Hàm lượng muối khoáng rất cao: 100 mg% Ca, 37 mg% P; 1,4 mg% Fe.
+ Hàm lượng vitamin: 23 mg% vitamin C; 0,1 mg% vitamin B1; 0,09 mg%

vitamin B2; 0,7 mg% vitamin PP; 2,9% caroten.
+ Ngoài ra còn chứa nhiều chất nhầy.
- Công dụng: Ngoài công dụng dùng làm rau ăn tươi, nấu hoặc xào; trong nhân
dân, rau muống được coi như là một thứ rau làm mất tác dụng của những thuốc đã
3
uống, nhất là dùng để giải các chất độc: rau muống rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước
uống.
Theo Garcia F., tại Philippin, người ta phát hiện trong ngọn một loại rau muống
có một chất giống như insulin, do đó được dùng để chữa đái tháo đường.
Theo kinh nghiệm dân gian, ngọn rau muống giã nát với lá cây Vũi vòi
(Heliotropium indicum) đắp lên những vết loét do bệnh zona nhằm giảm loột. Thõn lỏ
rau muống giã nát với mướp đắng và lá xoan dùng đắp lên ngực hoặc trán những người
bị sốt, khó thở [7],[9],[10],[13].
Ngoài ra, cũng đó cú cỏc nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của cây này
[17].
1.1.4.2. Ipomoea batatas (L.) Poir
- Tên thường gọi: Khoai lang.
- Đặc điểm thực vật: Cây thảo, sống lâu năm, thân mọc bò, dài 2-3m, rễ mầm
thành củ màu đỏ, trắng hoặc vàng. Lá có nhiều hình, thường hình tim xẻ 3 thùy, không
có lông, có cuống dài, mộp nguyờn, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, bấm lá thấy nhựa
trắng chảy ra. Hoa màu tím nhạt hoặc trắng, mọc thành xim ít hoa ở đầu cành; đài 5
răng, hình chén; tràng hợp, hình phễu; nhị 5 phồng ở gốc và không thò ra ngoài tràng;
bầu nhẵn. Rất ít khi thấy quả và hạt.
- Thành phần hóa học:
+ Củ : 24,6% tinh bột; 4,17% glucoza. Khi còn tươi chứa 1,3% protein; 0,1%
chất béo; các diattaza; tro có Mn, Ca, Cu: các vitamin A, B, C; 4,24% tanin; 1,375%
pentozan. Khi phơi khô chứa inozit, acid clorogenic, phytosterol, carotin, adenin,
betain, cholin.
+ Dây : adenin, betain, cholin.
+ Lá: chất nhựa tẩy (1,95-1,97 %).

- Công dụng: Ngoài công dụng thực phẩm, làm nguyên liệu chế tinh bột khoai,
có thể dùng khoai lang làm thuốc nhuận tràng sẽ cho phân mềm, không lỏng, không
đau bụng [7],[9],[10],[13].
Ngoài ra, cũng đó có nghiên cứu chứng minh khả năng làm tăng tính nhạy cảm
của Insulin, tăng khả năng kiểm soát đường huyết của lá và củ khoai lang ở bệnh nhân
đái tháo đường type II [15],[19].
4
1.1.4.3. Ipomoea turpethum R.Br.
- Tên thường gọi: chỡa vôi.
- Đặc điểm thực vật: Dây leo bằng thân quấn, sống dai. Cành hình trụ. Lá hình
trứng hoặc thuôn dài, đôi khi 3 cạnh; phía dưới có hình tim, dài 5-12 cm, rộng 2,5-7,5
cm; cuống lá dài 1-7 cm. Hoa to màu trắng hoặc vàng nhạt mọc ở nách lá, cuống hoa
dài 1-7 cm. Quả nang, đường kính 15-16 cm, 4 cạnh, mở theo đường nứt ngang. Hạt 3-
4, hình thấu kính, màu đen nhạt, đường kính 6-7 mm.
- Thành phần hóa học: Hoạt chất chủ yếu là gluco-nhựa 7-8%. Gluco-nhựa của
chỡa vụi phân tích sâu hơn sẽ được hai phần: một phần không tan trong ether là
turpethin, chiếm khoảng 90%; phần còn lại tan trong ether là turpethin α và β.
- Công dụng: Theo kinh nghiệm dân của nhân dân Việt Nam, củ chỡa vụi
thường được dùng chữa thấp khớp, đau nhức các khớp xương. Thân cây chỡa vụi hơ
hoặc xào núng dựng đắp lên phụ nữ sau khi sinh để chữa đau bụng.
Theo kinh nghiệm của các nước phương Tây, thân rễ chỡa vụi dùng làm thuốc
tẩy mạnh với liều 4-8g dưới dạng thuốc sắc hoặc với liều 1-4g bột [10].
1.1.4.4.Ipomoea digitata Lin.
- Tên thường gọi: Tầm sét, Bìm bìm xẻ ngón.
- Đặc điểm thực vật: Cây leo bằng thân quấn, mảnh, không có lông. Cành hình
trụ. Lá chia thành 5-7 thùy sõu, đường kính lá 8-20 cm, hình chân vịt, nhẵn, có
cuống dài 4-8 cm. Cụm hoa ở nách lá, hỡnh chựy lưỡng phân, trông hơi gù. Hoa
màu hồng, hình ống rộng, lá đài bị xé rách, bầu 2 ô, đựng 2 noãn. Quả nang hình
cầu, mở bằng 4 mảnh vỏ, chứa 4 hạt có lông màu hung đỏ.
- Thành phần hóa học: nhiều chất nhầy.

- Công dụng: Trong nhân dân người ta dùng rễ củ Tầm sét làm thuốc bổ, tăng
dục: Rễ củ Tầm sét cạo sạch vỏ, thái mỏng, giã nát, trộn với mật ong mà ăn.
Theo kinh nghiệm dân gian, củ Tầm sét nấu với đường ăn thường xuyên có tác
dụng điều kinh, tránh béo bệu.
Tại Ấn Độ và Philippin, người ta dùng củ Tầm sét làm thuốc nhuận tẩy nhẹ.
Còn dùng làm thuốc chữa suy yếu, rong kinh. Ngoài ra, củ Tầm sét còn được dùng làm
thuốc lợi sữa, thông mật [9],[10].
5
1.1.4.5. Ipomoea purpurea (L.) Roth
- Tên thường gọi: Bìm bìm tía.
- Đặc điểm thực vật: Cây mọc hàng năm có thân leo quấn; dài 1,5-3 cm; có
lông. Lá nguyên dạng tim, dài 5-12 cm, ít khi chia thùy, có mũi nhọn, có lông mềm;
cuống lá dài 4-9 cm. Hoa hợp 2-3 cái thành xim nhỏ ở nách lá; tràng 3-6 cm, màu
trắng, tía hay tía hồng; nhị 5; bầu 3 ô. Quả nang chứa 5-6 hạt màu đen (hắc sửu) hay
màu vàng trắng nhạt (bạch sửu) dài 4-8 mm, rộng 3-5 mm.
- Thành phần hóa học: Trong hạt có pharbitin, acid pharbitic, acid tiglic, acid
nilic. Trong thõn cú 4-8% chất nhựa mềm. Nó chứa Ipuranol tương đương với
sitosterol glucosid, acid ipuralic.
- Công dụng: Vị đắng tính hàn, có độc, có tác dụng trừ thấp nhiệt, thông đại
tràng, thông tiểu, sát trùng. Thường dùng trị thủy thũng, đại tiểu tiện khụng thụng;
suyễn, khó thở, bụng đầy tức; giun đũa, sán xơ mít [7],[9],[12].
1.2. CÂY BÌM BÌM BIẾC
1.2.1. Tên khoa học
Ipomoea nil (L.) Roth, họ Khoai lang (Convolvulaceae)
1.2.2. Đặc điểm thực vật
Dây leo quấn. Thân mảnh, có điểm những lông hình sao. Lá mọc so le, hình tim,
có phiến nguyên hay xẻ 3 thùy, nhẵn và xanh ở mặt trên, xanh nhạt và có lông ở mặt
dưới, dài 14 cm, rộng 12 cm; cuống dài 5-9 cm, gầy, nhẵn. Hoa màu hồng tím hoặc
lam nhạt, lớn, mọc thành xim 1 đến 3 hoa ở kẽ lá. Đài có 5 răng đều, hẹp nhọn. Tràng
hình phễu, ống màu trắng, 4 cánh mỏng hàn liền. Nhị 5 không đều đính ở gốc tràng,

không thò ra ngoài. Chỉ nhị phồng, có lông ở gốc. Bao phấn hình mũi tên. Bầu giữa, 3
ô, mỗi ô đựng 2 noón. Vũi nhụy mảnh như sợi chỉ, đớnh noón trung tâm. Quả nang,
hình cầu, nhẵn, đường kính 8 mm, có 3 ngăn. Hạt 2-4, hình 3 cạnh, lưng khum, hai bên
dẹt, nhẵn, màu đen hoặc trắng tùy loài, dài 5-8 mm, rộng 3-5 mm [9],[10].
6
Hình 1.1. Cây Bìm bìm biếc (Ipomoea nil)
1.2.3. Phân bố, thu hái
Cây Bìm bìm biếc mọc hoang ở nhiều tỉnh nước ta; ngoài ra còn mọc ở Ấn Độ,
Indonesia, Thái Lan, Philippin, Trung quốc
Vào cỏc thỏng 7-10, quả chín, hái về đập lấy hạt phơi khô [10].
1.2.4. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng làm thuốc của cây Bìm bìm biếc là hạt.
Trong Đông y, hạt Bìm bìm được gọi là “Khiờn ngưu tử”. “Khiờn” là dắt,
“ngưu” là trâu, “tử” là hạt; tương truyền thời xưa có người dùng hạt Bìm bìm mà khỏi
bệnh, đã dắt trâu đến tạ ơn người mách thuốc, nên vị thuốc từ hạt Bỡm bỡm mới có tên
là “Khiờn ngưu tử” [10],[20].
1.2.5. Thành phần hóa học
Hạt Bìm bìm biếc chứa khoảng 2% chất glucozit gọi là phacbitin, khoảng 11%
chất béo, 2% sắc tố cũng là glucozit.
Phacbitin được cấu tạo bởi các chất sau: acid phacbitic, acid tiglic, methyl
ethylacetic, acid nilic. Acid phacbitic cấu tạo bởi acid ipurolic, glucoza và ramnoza [9].
1.2.6. Tác dụng – Công dụng
1.2.6.1. Tác dụng
Phacbitin có tác dụng tẩy mạnh, tăng sức co bóp của ruột. Ngoài ra, cũn cú tỏc
dụng diệt giun (in vivo).
7
Theo Đông y, Khiên ngưu tử có vị cay, tớnh núng, hơi có độc, vào 3 kinh phế,
thận, đại tràng. Có tác dụng tả khí phận thấp nhiệt, trục đờm, tiêu ẩm lợi nhị tiện (đại
tiểu tiện), là thuốc chữa tiện bĩ, cước khí, chủ trị hạ khí; lợi tiểu tiện chữa cước thũng
(phù), sát trùng.

1.2.6.2.Công dụng – cách dùng
Trong thực tế, hạt Bìm bìm biếc thường được dùng làm thuốc thông đại tiểu
tiện, thông mật, đôi khi có tác dụng cho ra giun.
Liều dùng: Mỗi ngày 2-3g tán bột, dùng nước chiêu thuốc [10].
Một số đơn thuốc có hạt Bìm bìm biếc:
• Chữa các chứng thũng trướng:
Bài 1: Khiên ngưu 10g, Nước 300ml. Sắc còn 150ml, chia 2 lần uống trong
ngày, nếu tiểu tiện nhiều được thì khỏi. Có thể tăng liều uống cao hơn tùy theo bệnh,
có thể uống tới 40g. Bài thuốc này có tác dụng chữa phù thũng, nằm ngồi không được.
Bài 2: Cũng chỉ dùng một vị thuốc Khiên ngưu, đem tán mịn, mỗi lần uống 4g,
dùng nước chiêu thuốc. Có tác dụng chữa phù thũng, đại tiểu tiện khụng thông .
Bài 3 (Châu xa hoàn): Khiên ngưu 40g, Đại hoàng 20g, Cam toại 10g, Đại kích
10g, Nguyên hoa 10g, Thanh bì 10g, Trần bì 10g, Mộc hương 5g, Khinh phấn 1g. Tất
cả tán mịn, trộn đều, hoàn thành viên, ngày uống 1 lần, mỗi lần 3g. Có tác dụng lợi
thủy, hành khí. Dùng trong trường hợp bụng trướng, chân tay phù nề, ngực bụng đầy
tức, khó thở, đại tiện bí, tiểu tiện ít.
Bài 4: Trướng bụng do xơ gan hoặc viêm thận mạn tính: Khiên ngưu tử 80g,
Hồi hương 40g. Tất cả nghiền mịn, trộn đều. Mỗi ngày uống 1 lần, mỗi lần 8g, uống
khi đói bụng, chiêu thuốc bằng nước sôi, uống liên tục trong 2 - 3 ngày.
• Chữa phù do viêm thận:
Khiên ngưu tử 100g, nghiền mịn; Tồng tỏo (Tỏo tàu) 80g, hấp chín, bỏ hột, giã
nát; gừng tươi 500g, giã nát vắt lấy nước, bỏ bã; tất cả đem trộn đều thành một thứ bột
nhão, cho vào nồi hấp 30 phút, trộn đều, lại hấp thêm 30 phút nữa là được. Lượng
thuốc trên chia đều thành 8 phần, ngày uống 3 lần: Sáng - trưa - chiều, mỗi lần uống 1
phần, sau 2 - 5 ngày thì hết; kiêng muối trong 3 tháng .
8
• Thuốc trị giun đũa
Bài 1: Khiên ngưu tử (sao) 20g, Tân lang (hạt Quả cau) 4g, Sử quân tử (Quả
giun) 25g. Tất cả đem nghiền mịn, trộn đều, mỗi lần uống 6g, trẻ nhỏ giảm bớt liều.
Bài 2: Sát trùng chỉ thống (làm hết đau) dùng trong trường hợp đau bụng do

giun đũa, cũng có thể dùng cho cả trường hợp giun tóc: Khiên ngưu tử 8g, Tân lang (vỏ
Quả cau) 8g, Đại hoàng 4g. Tất cả đem nghiền mịn, trộn đều, ngày uống 2 lần, vào
sáng sớm và buổi chiều khi đói bụng, mỗi lần uống 3 - 4g, dùng nước sôi chiêu thuốc,
trẻ nhỏ tùy theo tuổi cần giảm bớt liều [10],[20].

9
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là hạt và cao khô của cõy Bìm bìm biếc (Ipomoea nil (L.)
Roth), họ Khoai lang (Convolvulaceae). Cây do chúng tôi tự trồng và thu hái vào tháng
9/2009.
Xử lý nguyên liệu: Hạt được phơi sấy khô, tán nhỏ. Các nguyên liệu nghiên cứu
(hạt và cao khô) bảo quản nơi thoáng mát.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Thuốc thử, dung môi, hóa chất
- Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Dung môi, thuốc thử đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
2.1.2.2. Dụng cụ
- Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh, buret, bình chiết, nồi cách thủy.
- Cân kỹ thuật, cân phân tích Precisa.
- Kính hiển vi.
- Máy đo độ ẩm Sartorius.
- Máy đo tro toàn phần Nabertherm.
- Máy chụp ảnh Canon 8.0
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu về hạt Bìm bìm biếc
- Nghiờn cứu đặc điểm hình thái hạt và đặc điểm bột.
- Định tính cỏc nhúm chất có trong hạt.
- Xác định độ ẩm, tro toàn phần, lượng tạp chất có trong hạt.

- Định lượng chất béo trong hạt.
- Xác định các chỉ số iod, acid, xà phòng hóa, ester của chất béo có trong hạt.
- Xác định các acid bộo cú trong chất béo của hạt.
- Xác định lượng chất chiết được trong hạt bằng nước.
2.2.2. Nghiên cứu về cao khô Bìm bìm biếc
- Công thức của cao.
- Phương pháp điều chế cao.
10
- Nghiên cứu tính chất của cao.
- Định tính cỏc nhúm chất hóa học có trong cao.
- Xác định mất khối lượng do làm khô của cao.
- Định lượng chất béo có trong cao.
- Xác định các acid bộo cú trong chất béo của cao.
- Xác định lượng chất chiết được trong cao bằng cồn.
- Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu về hạt Bìm bìm biếc
2.3.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm hình thái của hạt và bột hạt
• Nghiên cứu đặc điểm hình thái của hạt bằng phương pháp mô tả phân tích.
• Xác định đặc điểm bột hạt: soi bột dưới kính hiển vi
Cách tiến hành: Lấy một lượng nhỏ bột (qua rây cú kích thước mắt rây khoảng
250 àm), cho vào một giọt dung dịch soi (nước, glycerin, ) đã có sẵn trên lam kớnh.
Dựng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm dung dịch, đậy lam kính, di nhẹ lam kính rồi
quan sát dưới kính [2].
2.3.1.2. Định tính cỏc nhúm chất bằng các phản ứng hóa học trong ống nghiệm
• Định tính nhóm alcaloid
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 5ml, thêm 10ml dung dịch
H
2
SO

4
1N, đun sôi, để nguội, lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac đặc, sau đó lắc với
CHCl
3
2-3 lần, mỗi lần 5ml, gạn lấy lớp dung môi hữu cơ rồi cho bốc hơi cách thủy
đến khô thu được cắn.
Hòa tan cắn bằng 2-3ml H
2
SO
4
1N, chia vào 3 ống nghiệm, tiến hành 3 phản
ứng, phản ứng dương tính nếu xuất hiện các hiện tượng sau:
- Phản ứng với TT Mayer: Thêm 1-2 giọt TT Mayer, xuất hiện tủa trắng hoặc
vàng nhạt.
- Phản ứng với TT Bouchardat: Thêm 1-2 giọt TT Bouchardat, xuất hiện tủa
nâu.
- Phản ứng với TT Dragendorff: Thêm 1-2 giọt TT Dragendorff, xuất hiện tủa
đỏ cam [1].
• Định tính nhóm saponin
11
Cân khoảng 5g dược liệu vào bỡnh nún dung tích 50ml, thêm 20ml EtOH 90
0
,
đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc nóng thu dịch lọc. Cho vài giọt dịch lọc vào ống
nghiệm có sẵn 5ml nước cất, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút rồi để
yên. Sau 15 phút, quan sát, phản ứng dương tính nếu thấy cột bọt bền và cao [1].
• Định tính nhóm flavonoid
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml EtOH
90
0

, đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc nóng thu dịch lọc, tiến hành các phản ứng
sau:
- Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ vài giọt dịch lọc lên giấy lọc, để khô, hơ lên
miệng lọ amoniac đặc, phản ứng dương tính nếu màu của vết chất có sự thay đổi.
- Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống
nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính nếu dung dịch
trong ống nghiệm chuyển màu vàng hoặc xuất hiện tủa màu vàng.
- Phản ứng với dung dịch FeCl
3
: Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm,
thêm vài giọt dung dịch FeCl
3
5%, phản ứng dương tính nếu dung dịch trong ống
nghiệm có màu xanh lục, xanh đen, nâu hoặc nâu đen.
- Phản ứng cyanidin: Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thờm ớt bột
magie kim loại và vài giọt dung dịch HCl đặc, phản ứng dương tính nếu dung dịch đổi
màu [1].
• Định tính nhóm tanin
Cân khoảng 2g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 10ml nước cất,
đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc thu dịch lọc, tiến hành các phản ứng sau:
- Phản ứng với dung dịch FeCl
3
5%: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch
FeCl
3
5%, phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh
nâu nhạt.
- Phản ứng với chì acetat 10%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch chì
acetat 10%, phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông.
- Phản ứng với gelatin 1%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%,

phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng [1].
12
• Định tớnh nhúm chất béo
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bỡnh nón dung tích 50ml. Thêm 10ml CHCl
3
vào, đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc lấy dịch. Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên trên giấy
lọc, sấy nhẹ để bay hết dung môi. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vết mờ trên giấy
lọc [1].
• Định tính nhóm caroten
Lấy một ít dịch lọc ở trên cho vào ống nghiệm, bốc hơi trên cách thủy đến cắn.
Thêm 1-2 giọt dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc vào cắn. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện
màu xanh [1].
• Định tính nhựa
Cân khoảng 10g dược liệu, chiết hồi lưu bằng cồn 90
0
trong khoảng 2-3 giờ.
Bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Rửa cắn vài lần bằng nước sôi, mỗi lần
10ml. Cắn sau khi rửa được sấy khô, tán nhỏ để làm các phản ứng sau:
- Hiện tượng huỳnh quang: Lấy 0,5g cắn, thêm 5ml dung dịch amoniac loãng.
Lắc kỹ 15 phút, phản ứng dương tính nếu dịch trên không có màu vàng nhưng soi dưới
ánh sáng tử ngoại lại xuất hiện huỳnh quang màu.
- Hiện tượng đốt cháy: Lấy một ít cắn đốt cháy, phản ứng dương tính nếu có
mùi đặc trưng của nhựa [1].
2.3.1.3. Xác định độ ẩm, tro toàn phần và lượng tạp chất có trong hạt
• Xác định độ ẩm bằng phương pháp nhiệt độ: sử dụng máy đo độ ẩm Sartorius
Cách xác định: Khởi động máy đo độ ẩm Sartorius. Lấy một lượng dược liệu

nhất định, nghiền nhỏ, dàn mỏng trên đĩa cân của máy, đặt nhiệt độ là 100
0
C. Đậy nắp
lại, đọc kết quả sau khi máy báo kết thúc [5].
• Xác định tro toàn phần
Tro toàn phần là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược
liệu.
Cỏch xác định: Cân chính xác khoảng 2-3g dược liệu, cho vào một chén sứ đã
nung và cõn bỡ. Nung chén ở nhiệt độ không quá 450
0
C đến khi không còn carbon,
làm nguội rồi cân. Nếu tro vẫn chưa loại được hết carbon, cho vào khối chất đã than
hóa một ít nước nóng, khuấy đều bằng đũa thủy tinh rồi lọc qua giấy lọc không tro.
Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào
13
chén nung, nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Cho dịch lọc vào
cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450
0
C đến
khối lượng không đổi [5].
Tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần được tính theo công thức:
X (%) = . 100
Trong đó:
a: Khối lượng tro (g).
P: Khối lượng dược liệu (g).
X: Độ tro toàn phần của dược liệu (%).
• Xác định phần trăm tạp chất lẫn trong dược liệu
Tạp chất lẫn trong dược liệu bao gồm tất cả các chất ngoài quy định của dược
liệu đó như: Đất, đá, rơm rạ, cây cỏ khỏc, cỏc bộ phận khác của cõy khụng quy định
làm dược liệu, xác côn trùng

Cách xác định: Cân một lượng mẫu vừa đủ đã được chỉ dẫn trong chuyên luận,
dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp; khi cần có thể dựng
rây để phân tách tạp chất và dược liệu.Cõn phần tạp chất đó [5].
Lượng tạp chất lẫn trong dược liệu được tính theo công thức sau:
X (%) = . 100
Trong đó:
a: Khối lượng tạp chất (g).
P: Khối lượng dược liệu (g).
X: Phần trăm tạp chất có trong dược liệu (%).
2.3.1.4. Định lượng chất béo trong dược liệu theo chuyên luận DĐVN IV
Nguyên tắc: Chiết xuất chất béo trong dược liệu bằng dung môi hữu cơ. Dung
môi thường dùng là chloroform, ether ethylic hoặc ether dầu hỏa. Cất thu hồi dung môi
và sấy cắn đến khối lượng không đổi.
Cách xác định: Nghiền nhỏ dược liệu, xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác
định độ ẩm. Cân chính xác khoảng 20g bột dược liệu, cho vào cối sứ nghiền cùng với
2–3g Natri sulphat khan. Đựng dược liệu đã nghiền trong túi giấy lọc, dùng bông lau
14
sạch cối rồi cho bông vào túi, gập miệng túi. Đặt túi vào bình Soxhlet, chiết chất béo
có trong bột hạt bằng CHCl
3
đến kiệt (cách thử: nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ
nóng, nếu không để lại vết bóng mờ trên giấy là đạt yêu cầu). Chuyển dịch chiết trong
bình cầu sang một cốc sạch khụ đó cõn trước bì, cho bay hơi đến kiệt dung môi trên
nồi cách thủy rồi đem cân xác định khối lượng của cắn. Cắn được bảo quản trong tủ
lạnh [1],[5].
Hàm lượng chất béo trong dược liệu được tính theo công thức:
X(%) =
Trong đó:
a: Khối lượng cắn (g).
P: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g).

h: Độ ẩm dược liệu (%).
2.3.1.5. Xác định các chỉ số acid, xà phòng hóa, ester của chất béo
• Xác định chỉ số acid
Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do chứa trong 1g
chất thử.
Cách xác định: Nếu không có chỉ dẫn đặc biệt thỡ cõn chớnh xác một lượng
mẫu thử cho vào một bình thủy tinh nút mài dung tích 250ml. Thêm 50ml hỗn hợp có
thể tích bằng nhau của EtOH 96% và ether ethylic. Dung môi phải vừa mới được trung
tính bằng dung dịch KOH 0,1N trong EtOH 96% với chỉ thị là 0,5ml phenolphtalein
trong EtOH 96%. Lắc để hòa tan mẫu thử, nếu khó tan có thế đun hồi lưu trên cách
thủy đến khi tan hoàn toàn. Chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N trong EtOH cho đến
khi xuất hiện màu hồng bền vững trong 15 giây. Ghi số ml dung dịch KOH 0,1N trong
EtOH đã dùng [5].
Chỉ số acid được tính theo công thức:
Chỉ số acid =
Trong đó:
P: lượng mẫu đem thử (g).
a: số ml dung dịch KOH 0,1N trong EtOH đó dựng chuẩn độ.
15
• Xác định chỉ số xà phòng hóa
Chỉ số xà phòng hóa là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do và để
xà phòng hóa cỏc ester chứa trong 1g chất thử.
Cách xác định: Nếu không có chỉ dẫn đặc biệt thỡ cõn chính xác 2g mẫu thử,
chuyển vào một bỡnh nún nỳt mài có dung tích 200 – 250 ml. Thêm chính xác 25,0 ml
dung dịch KOH 0,5N trong EtOH và vài viên bi thủy tinh. Đun hồi lưu trên cách thủy
sôi trong 30 phút, hay trong một khoảng thời gian quy định trong chuyên luận, thỉnh
thoảng lắc theo chuyển động trũn. Thờm 1ml dung dịch phenolphtalein và chuẩn độ
ngay KOH dư bằng dung dịch HCl 0,5N. Ghi số ml dung dịch HCl 0,5N đã dùng cho
mẫu thử.
Tiến hành thử với mẫu trắng trong cùng điều kiện như trên. Ghi số ml dung dịch

HCl 0,5N đã dùng cho mẫu trắng [5].
Chỉ số xà phòng hóa được tính theo công thức:
Chỉ số xà phòng hóa =
Trong đó:
a: Số ml dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu thử (ml).
b: Số ml dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu trắng (ml).
P: Lượng mẫu thử (g).
• Xác định chỉ số ester
Chỉ số ester là số mg KOH cần thiết để xà phòng hóa cỏc ester chứa trong 1g
mẫu thử.
Chỉ số ester được tính theo công thức:
Chỉ số ester = Chỉ số xà phòng hóa – chỉ số acid
2.3.1.6. Xác định acid bộo cú trong chất béo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ
Sắc ký khí khối phổ là một thiết bị ghép nối giữa sắc ký khí – một thiết bị tách
với khối phổ ký – cũng là một thiết bị hoàn hảo trong việc nhận biết các chất.
• Sắc ký khí
Là kỹ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân tích phân bố giữa
hai pha: pha tĩnh với diện tích tiếp xúc rất lớn, pha động có bản chất khí thấm qua pha
tĩnh. Mẫu được làm bay hơi và được mang bởi pha động khớ (khớ mang) đi qua cột.
16
Mẫu phân bố trên pha tĩnh lỏng dựa vào độ hòa tan ở nhiệt độ nhất định. Các thành
phần của mẫu phân tách ra khỏi nhau dựa trên áp suất hơi tương đối và ái lực khác
nhau của chúng đối với pha tĩnh.
• Detector chọn lọc khối phổ (MSD: Mass Selective Detector)
Nguyên tắc hoạt động: Dựa trên nguyên tắc bẻ gãy phân tử chất phân tích thành
các mảnh ion có tỷ số giữa khối lượng và điện tích m/z xác định và đặc trưng cho chất
phân tích.
Quá trình ion hóa: Có nhiều kỹ thuật ion hóa, nhưng kỹ thuật ion hóa bằng va
chạm điện tử EI (electric impact) là phổ biến hơn cả. Quá trình ion hóa được thực hiện
bởi sự va chạm phân tử chất phân tích với dũng điện tử có năng lượng cao (70eV). Quá

trình này hầu như chỉ tạo ra các ion dương (M + e
-
→ M
+
+ 2e
-
), sau đó M
+
sẽ bị bẻ gãy
thành các mảnh ion có khối lượng nhỏ hơn.
Phân tích dữ liệu: Sau khi ion hóa, các ion được thu bởi một lăng kính mang
điện dẫn vào trong bộ phân tích khối. Ở đây, các ion khác nhau được phõn tỏch do sự
khác nhau về tỷ số khối lượng hạt trên điện tích (m/z) trong từ trường hoặc điện
trường. Thiết bị phân tích khối điển hình trong GC – MSD là bộ tứ cực.
Sau khi các ion tạo thành đã được tách detector, thường là bộ nhân điện tử loại
dynod liên tục, được sử dụng để “đếm” các ion, hình thành phổ khối. Ion từ bộ phân
tích khối va chạm vào bề mặt bán dẫn của detector giải phóng các điện tử, cứ như thế
sẽ nhân lên thành dũng thỏc điện tử, dẫn tới hệ số khuếch đại có thể tới 1 triệu lần. Dữ
liệu có thể thu được ở hai cách, quét toàn bộ các ion (TIC) hoặc chỉ lựa chọn một số
ion cơ bản hay đặc trưng để quét (SIM).
• Áp dụng
Sắc ký khí (GC) là một phương pháp rất hiệu quả trong việc tách rất nhiều cấu
tử nhưng lại khó khăn trong việc định tính các chất có trong hỗn hợp phức tạp đó.
Ngược lại, khối phổ (MS) không có khả năng tách chất nhưng lại cho phép ta định tính,
dự đoán và làm sáng tỏ cấu trúc của các chất lạ từ những thông tin thu được của phổ
đó. Như vậy, hệ liên hợp GC/MS là một kỹ thuật ghép nối nhằm mục đích đạt được
những chức năng ưu việt của cả sắc ký khí và khối phổ [14],[18],[21].
17
2.3.1.7. Xác định các chất chiết được trong dược liệu bằng nước theo phương pháp
chiết lạnh

Cách xác định: Nếu không có chỉ dẫn đặc biệt trong chuyên luận riờng, cõn
chính xác khoảng 4,000 g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào trong bỡnh nún 250
- 300 ml. Thêm chính xác 100,0 ml nước, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6
giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp.
Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đó cõn bỡ trước, cô trong cách
thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105
0
C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30
phỳt, cõn nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất
chiết được bằng nước theo dược liệu khô [5].
Lượng chất chiết được bằng nước trong dược liệu được tính theo công thức:
X(%) =
Trong đó:
P: Khối lượng dược liệu đem cân (g).
a: Khối lượng cắn (g).
h: Độ ẩm dược liệu (%).
2.3.2. Nghiên cứu về cao khô Bìm bìm biếc
2.3.2.1. Phương pháp điều chế cao khô
Quá trình điều chế gồm hai giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp.
- Giai đoạn 2: Sau khi thu được dịch chiết dược liệu, tiến hành lọc, cô đặc dịch
chiết bằng các phương pháp khác nhau để độ ẩm còn lại không quá 5 %.
Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thu được
thường được tiến hành trong các thiết bị dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60
0
C.
Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy
và sấy ở nhiệt độ không quá 80
0
C. Tuyệt đối không được cô trực tiếp trên lửa [5].

2.3.2.2. Xác định tính chất của cao bằng phương pháp mô tả cảm quan.
2.3.2.3. Định tính cỏc nhúm chất có trong cao bằng các phản ứng hóa học
18
• Định tính chất béo
Cân khoảng 5g cao đã nghiền nhỏ cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 10
ml CHCl
3
vào, đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc lấy dịch. Nhỏ 1 giọt dịch lọc
lên trên giấy lọc, sấy nhẹ để bay hết dung môi. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện
vết mờ trên giấy lọc [1].
• Định tính nhóm caroten
Lấy một ít dịch lọc ở trên cho vào ống nghiệm, bốc hơi trên cách thủy đến cắn.
Thêm 1-2 giọt dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc vào cắn. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện
màu xanh [1].
• Định tính nhựa
Cân khoảng 10g cao đã nghiền nhỏ, chiết hồi lưu bằng cồn 90
0
trong khoảng 2-3
giờ. Bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Rửa cắn vài lần bằng nước sôi, mỗi lần
10ml. Cắn sau khi rửa được sấy khô, tán nhỏ để làm các phản ứng sau:
- Hiện tượng huỳnh quang: Lấy 0,5g cắn, thêm 5ml dung dịch amoniac loãng.
Lắc kỹ 15 phút, phản ứng dương tính nếu dịch trên không có màu vàng nhưng soi dưới
ánh sáng tử ngoại lại xuất hiện huỳnh quang màu.
- Hiện tượng đốt cháy: Lấy một ít cắn đốt cháy, phản ứng dương tính nếu có
mùi đặc trưng của nhựa [1].
2.3.2.4. Xác định mất khối lượng do làm khô

Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng
phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định ở mỗi chuyên luận.
Việc xác định mất khối lượng do làm khô không được làm thay đổi tính chất lý
hóa cơ bản của mẫu thử.
Cách xác định: Dùng một chộn cõn có nắp mài làm bì đựng mẫu thử. Sấy bì
trong thời gian 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân xác định khối lượng bì.
Làm nhỏ cao, cho vào bỡ cõn chính xác khoảng 5 g cao. Đem cao vào sấy trong tủ sấy
ở áp suất thường đến khối lượng không đổi. Sau đó làm nguội cao đến nhiệt độ phòng
trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay [5].
Mất khối lượng do làm khô của cao được tính theo công thức:
X (%) =
19
Trong đó:
m1: Khối lượng cao trước khi sấy (g)
m2: Khối lượng cao sau khi sấy (g)
X: Mất khối lượng do làm khô của cao (%).
2.3.2.5. Định lượng chất béo có trong cao theo chuyên luận DĐVN IV
Phương pháp tiến hành tương tự như định lượng chất bộo cú trong hạt.
2.3.2.6. Xác định acid bộo cú trong chất béo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp tiến hành tương tự như xác định acid bộo cú trong chất béo của
hạt.
2.3.2.7. Xác định lượng chất chiết được trong cao bằng cồn theo phương pháp chiết
lạnh
Cỏch xác định: Cân chính xác khoảng 4,000g cao đã làm nhỏ cho vào trong
bỡnh nún 250 - 300 ml. Thêm chính xác 100,0 ml cồn, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh
thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình
hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đó cõn bỡ
trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105
0
C trong 3 giờ, lấy ra để nguội

trong bình hút ẩm 30 phỳt, cõn nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính
phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô [5].
Lượng chất chiết được bằng cồn trong cao được tính theo công thức:
X(%) =
Trong đó:
P: Khối lượng dược liệu đem cân (g).
a: Khối lượng cắn (g).
h: Độ ẩm dược liệu (%).
2.3.2.8. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn
a. Mục đích
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có
khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh có trong dược
phẩm.Vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh gồm có những vi khuẩn gây bệnh: Streptococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và các loài Salmonella.
20
b. Nguyên tắc
Vi sinh vật có trong dược phẩm phát triển thành các khuẩn lạc đặc trưng trên
môi trường thạch dinh dưỡng. Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn, vi nấm ở các nồng độ
thích hợp, từ đó tính ra số lượng vi sinh vật trong 1g hoặc 1ml chế phẩm chất thử.
Đồng thời dựa vào đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa riờng của từng loại vi khuẩn để
xác định vi khuẩn gây bệnh.
c. Môi trường
Môi trường nuôi cấy có thể pha theo các công thức (trong Phụ lục 1) hoặc có thể
dùng môi trường khô do cỏc hóng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp. Các môi
trường tự pha chế thường phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 121°C trong 15
phút trừ khi có những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trường đặc biệt.
Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15%. Nước dùng trong các
công thức môi trường phải tinh khiết.
d.Tiến hành
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm,

chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử.Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các
dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong
quá trình sản xuất.
• Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí
Đối với chế phẩm hòa tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phương
pháp đĩa thạch. Hòa tan 10 g chế phẩm vừa đủ trong 100 ml NaCl 0,9% để được dung
dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10.
Hòa loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trong
một hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch có độ
pha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp Petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15 ml đến
20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đã đun chảy
và để nguội đến 45°C. Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại. Sau đó để yên
cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng. Lật ngược hộp, mang ủ ở 30 - 35°C từ 48 giờ
đến 72 giờ. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc. Lấy
giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớn hơn
300 và tính ra số lượng vi khuẩn trong 1 g hoặc 1 ml chế phẩm. Nếu thấy không có
21
khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 vi khuẩn
trong 1g hoặc 1ml.
• Đếm tổng số nấm mốc, và nấm men
Dùng phương pháp đĩa thạch tương tự như đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí,
nhưng sử dụng môi trường thạch Sabouraud ủ các đĩa ở nhiệt độ ở 20°C đến 25°C, theo
dõi trong 5 ngày.
Công thức tính:
X =
Trong đó:
X: Tổng số vi khuẩn hiếu khí hoặc vi nấm trong 1g/1ml mẫu thử
A1/A2: Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở độ pha loãng K1/K2.
• Thử nghiệm tỡm cỏc vi khuẩn gây bệnh
- Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa

Cho một lượng chế phẩm đã pha loãng tương ứng với 1g hoặc 1ml chế phẩm
vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 30°C đến 35°C trong 18 đến 72 giờ,
kiểm tra vi khuẩn mọc ở môi trường. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường, cấy
lên thạch manitol - muối và môi trường thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri,
mang ủ 30°C đến 35°C trong 18 đến 72 giờ. Sau khi ủ kiểm tra nếu không thấy có
những khuẩn lạc màu vàng trong môi trường thạch muối manitol và khuẩn lạc màu
xanh trên môi trường cetrimid là phản ứng âm tính (chế phẩm không có
Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa). Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ
thì tiếp tục làm các phản ứng sinh hóa của Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas
aeruginosa như sau:
+ Phản ứng tan huyết (đối với Staphylococcus aureus)
Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ thạch manitol - muối lên
môi trường thạch máu, sau thời gian nuôi cấy xung quanh khuẩn lạc neus có vòng
trong suốt là phản ứung dương tính - chế phẩm có Staphylococcus aureus.
+ Phản ứng oxydase và sinh sắc tố (đối với Pseudomonas aeruginosa)
Phát hiện Pseudomonas aeruginosa bằng phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên
khuẩn lạc hoặc chuyển khuẩn lạc lên một khoanh giấy đã tẩm trước dung dịch N,N-
22
dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid 1%. Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển
sang màu tím, chế phẩm có Pseudomonas aeruginosa.
- Tìm Salmonella và Escherichia coli
Cho một lượng chế phẩm đã pha loãng tương ứng với 1g hoặc 1ml chế phẩm
vào khoảng 100 ml môi trường lỏng lactose, ủ ở 30°C đến 35°C trong 18 đến 72 giờ.
Kiểm tra nếu có vi khuẩn mọc, lắc nhẹ nhàng. Lấy 1 ml cho vào một ống chứa sẵn 10
ml môi trường lỏng tetrathionat, trộn đều, ủ trong 18 giờ đến 24 giờ. Phần còn lại của
môi trường lactose sẽ dùng để tìm Escherichia coli.
+ Tìm Salmonella: Lấy một quai cấy từ môi trường tetrathionat ria lên mặt môi
trường thạch xanh brilliant, , môi trường thạch bismuth sulfit trong các đĩa Petri. Đậy
đĩa, lật ngược, ủ ở 35°C đến 37°C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra, nếu không thấy
khuẩn lạc không màu hoặc màu hồng nhạt tới trắng đục, nhỏ, rõ nét (thường bao quanh

bằng một vùng màu hồng tới đỏ) trên môi trường Thạch xanh brilliant và Khuẩn lạc
màu đen hoặc màu xanh trên môi trường Thạch bismuth sulfit chế phẩm không chứa
Salmonella.
Nếu thấy có khuẩn lạc như trên trong 2 môi trường đó, đem nhuộm soi thấy
gồm những trực khuẩn hình gậy, Gram âm, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc
nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trường thạch - sắt - ba đường (nghiêng). Trước tiên
cấy ria trên mặt thạch nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng của thạch, ủ ở 35°C đến
37°C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu không thấy môi trường bị kiềm hóa (màu đỏ)
ở phần nghiêng và acid hóa (màu vàng) phần dựng đứng, có hoặc không có kèm theo
màu đen ở phần dựng đứng do sinh H
2
S, chế phẩm không chứa Salmonella.
+ Tìm Escherichia coli: Cấy ria một quai cấy từ môi trường lactose đó cú vi
khuẩn mọc lên trên bề mặt môi trường thạch Mac - Conkey. Đậy nắp, lật ngược hộp, ủ
ở 35°C đến 37°C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu không có khuẩn lạc màu đỏ gạch,
có thể có vùng mật kết tủa bao quanh trong môi trường thì chế phẩm không có
Escherichia coli. Nếu có khuẩn lạc như vậy thì chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt
thạch Endo. Đậy đĩa, lật ngược, ủ ở 43 đến 45°C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu
không có những khuẩn lạc màu đỏ sinh ánh kim thì chế phẩm không có Escherichia
coli. Kết hợp các phản ứng thử nghiệm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy để kết luận sự có
mặt của Escherichia coli trong chế phẩm.
23
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
3.1.1. Nghiên cứu về hạt Bìm bìm biếc
3.1.1.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hạt Bìm bìm biếc
• Đặc điểm bên ngoài:
Hạt gần giống một phần năm khối cầu, mặt lưng lồi hình cung, có một rónh
nụng ở giữa. Mặt bụng hẹp, gần như một đường thẳng tạo thành do hai mặt bên. Rốn
nằm ở cuối mặt bụng và lõm xuống. Hạt dài 4-7 mm, rộng 3-4,5 mm. Mặt ngoài hơi lồi

lõm, màu nâu đen (hắc sửu) hoặc nâu nhạt (bạch sửu). Vỏ cứng, mặt cắt ngang màu lá
mạ đến nâu nhạt.

Hình 3.1. Hạt Bìm bìm biếc (Semen ipomoea)
• Đặc điểm bột:
Bột hạt có màu xám. Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì ở lớp vỏ ngoài,
mảnh mô mềm gồm nhiều tế bào hình nhiều cạnh, nhiều tinh bột nằm rải rác và các
mảnh nội nhũ hóa sừng.

24


Hình 3.2. Đặc điểm của bột hạt Bìm bìm biếc:
a.Tinh bột; b.Mụ mềm; c.Mảnh biểu bì; d.Mảnh nội nhũ
3.1.1.2. Định tính cỏc nhúm chất có trong hạt bằng các phản ứng hóa học
Kết quả định tính cỏc nhúm chất hóa học được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính cỏc nhúm chất hóa học có trong hạt Bìm bìm biếc
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Alcaloid - Phản ứng với TT Mayer -
Không
- Phản ứng với TT Bouchardat -
- Phản ứng với TT Dragendorff -
2 Saponin - Hiện tượng tạo bọt - Không
3 Flavonoid - Phản ứng với hơi amoniac -
Không
- Phản ứng với dd kiềm loãng -
- Phản ứng với dd FeCl
3
-
- Phản ứng cyanidin -

4 Tanin - Phản ứng với dd FeCl
3
-
Không
- Phản ứng với chì acetat 10% -
- Phản ứng với gelatin 1% -
25
a
b
b
c
c
d