tóm tắt luận án tiến sĩ nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo dòng bông (gossypium hirsutum l.) kháng sâu xanh (helicoverpa armigera hübner)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
******



TRỊNH MINH HỢP



NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN
ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L.) KHÁNG
SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER)




TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP




Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62. 62. 05. 01




HÀ NỘI - 2012

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội


Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Lê Trần Bình
2. PGS. TS. Phan Hữu Tôn


Phản biện 1: PGS. TS. Đặng Trọng Lương
Viện Di truyền Nông nghiệp


Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Văn Hoan
Hội Giống cây trồng


Phản biện 3: TS. Nguyễn Thanh Thuỷ
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn


Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường
họp tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

vào hồi 8 giờ 30 phút ngày tháng năm


Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc gia Việt Nam
2. Thư viện Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
3. Thư viện Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống. Tuy nhiên, diện tích và sản
lượng rất thấp. Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích và tăng sản
lượng bông nước ta, nhưng quan trọng nhất vẫn là sâu hại. Trong số đó, sâu xanh
là loài nguy hiểm nhất, có mặt và gây hại nặng ở hầu hết các vùng trồng bông và
là đối tượng cần phòng trừ. Trong đó, biện pháp phòng trừ bằng giống kháng đã
được đặt ra. Tuy nhiên, đến nay, chúng ta vẫn chưa tạo ra giống kháng sâu tốt.
Theo Chương trình phát triển cây bông, Việt Nam cần phát triển theo
hướng tăng cường đầu tư thâm canh nâng cao năng suất, chất lượng, đảm bảo
hiệu quả kinh tế, nâng cao sức cạnh tranh của cây bông và bảo vệ môi trường
sinh thái; với chỉ tiêu đến năm 2015, đạt 20 nghìn tấn và đến 2020 là 60 nghìn
tấn bông xơ. Để thực hiện điều này, bên cạnh áp dụng các giải pháp quy hoạch,
đầu tư, tài chính…, thì giải pháp khoa học công nghệ mà trong đó ứng dụng
phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết.
Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương
pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) kháng sâu xanh
(Helicoverpa armigera Hübner)” được tiến hành.
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học và phương
pháp cơ bản về tái sinh và chuyển gen cây bông; sàng lọc, đánh giá và chọn lọc
cây bông chuyển gen kháng sâu xanh; và góp phần phát triển lĩnh vực khoa học
chọn tạo giống cây trồng kháng sâu.
- Đưa kỹ thuật chuyển gen cây bông trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực cho
công tác chọn tạo giống bông truyền thống và làm cơ sở áp dụng để chọn tạo các
loại giống cây trồng kháng sâu khác.
2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu

xanh để làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu, nhằm
cung cấp cho sản xuất bông hàng hóa trong nước.
- Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản xuất,
góp phần giảm thiểu rủi ro cho nông dân, giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành sản
phẩm, tăng thu nhập cho người trồng bông và bảo vệ môi trường sống.

2
3. Mục đích và yêu cầu của đề tài
3.1. Mục đích của đề tài
- Ứng dụng được phương pháp chuyển gen để chuyển thành công gen
CryIAc vào một số giống bông, đặc biệt là giống bông Việt Nam.
- Tạo ra một số dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh cao (tỷ lệ giết sâu
≥ 80%) làm vật liệu quý cho chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước.
3.2. Yêu cầu của đề tài
- Chuyển được gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp
chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn.
- Sàng lọc, đánh giá và chọn lọc được một số dòng bông chuyển gen
kháng sâu xanh cao.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài
Giống bông SSR60F, Coker310, Coker312, VN36P, C118, LRA5166,
MCU9 và TM1; Gen CryIAc, vector chuyển gen pC1300-Ubi-CryIAc và pIBT-
CryIAc, vi khuẩn E.coli chủng DH5 và A. tumefaciens chủng C58; Sâu xanh
(Helicoverpa armigera Hübner).
4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài
- Phạm vi nội dung nghiên cứu là chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng
phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua
đường ống phấn; và sàng lọc, đánh giá, chọn lọc cây chuyển gen bằng kháng
sinh, PCR và bio-test (nuôi sâu đánh giá tính kháng trong phòng).
- Phạm vi không gian và thời gian là phòng thí nghiệm, nhà kính và nhà

lưới của Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ
Thực vật - Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố - Nhơn
Sơn - Ninh Sơn - Ninh Thuận; từ năm 2005 đến 2011.
5. Đóng góp mới của luận án
Lần đầu tiên ở Việt Nam: (i) Tái sinh thành công một số giống bông bằng
phương pháp tái sinh thông qua tạo phôi soma và tạo đa chồi; (ii) Chuyển thành
công gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp chuyển gen thông
qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn; (iii) Tạo được
87 dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh. Đặc biệt, tạo được 50 dòng kháng sâu
cao làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước.

3
6. Cấu trúc của luận án
Luận án có 121 trang, gồm phần mở đầu, phần nội dung (3 chương), phần
kết luận và đề nghị; với 35 bảng số liệu, 22 hình, 12 phụ lục. Đã tham khảo 151
tài liệu, trong đó có 16 tài liệu tiếng Việt và 135 tài liệu tiếng Anh.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam
1.2. Sâu hại bông và tổn thất gây ra
1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu
1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu
1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt
1.6. Tái sinh cây bông
1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma
Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma được sử dụng nhiều hơn tái sinh
thông qua tạo đa chồi, vì cây tái sinh có nguồn gốc từ tế bào đơn, nên tránh được
cây chuyển gen dạng khảm. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy mô cây bông bắt đầu
sớm nhất vào năm 1972 bởi Schenk và Hildebrandt (1972) và quy trình này được
xây dựng trong báo cáo tái sinh đầu tiên từ mô nuôi cấy của Davidonis và Hamilton

(1983). Quy trình được thiết lập từ môi trường MS bổ sung 100 mg/l myo-inositol,
0,4 mg/l thiamine HCl, glucose và tổ hợp nồng độ auxin và cytokinin là 2 mg/l
NAA và 0,5 mg/l BA để cảm ứng tạo mô sẹo từ mô lá mầm và thân dưới lá mầm.
Khi mô sẹo lớn, chúng được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng phân hóa phôi
không chứa auxin và cytokinin. Sau 3-4 tháng, tiền phôi hình thành và lần lượt
phát triển thành phôi trưởng thành và cây tái sinh khi được cấy chuyển sang môi
trường có nồng độ muối thấp cùng với giảm hoặc không chứa NH
4
+
, tăng nồng độ
KNO
3
và bổ sung 5 g/l glucose. Quy trình trên tốn công lao động, thời gian tái sinh
dài, phát sinh nhiều biến dị soma. Hơn nữa, chỉ giống thuộc họ Coker dễ tái sinh.
Nhược điểm này, thúc đẩy nhiều nghiên cứu mới cải tiến quy trình tái sinh ban
đầu như của Chaudhary et al. (2003), Kumar et al. (1998), Kumria et al. (2003)…

1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi
Để khắc phục hạn chế của tái sinh thông qua tạo phôi soma, các nhà khoa
học thế giới đã nghiên cứu tái sinh thông qua tạo đa chồi từ đốt lá mầm, mô phân
sinh đỉnh chồi hoặc phôi hạt như của Banerjee et al. (2003), Morre et al. (1998)…

4
1.7. Chuyển gen cây bông
1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Chuyển gen vào cây bông
thông qua A. tumefaciens
được báo cáo đầu tiên
bởi Umbeck et al. (1987) và Firoozabady et al. (1987). Họ sử dụng phương pháp
nuôi cấy mô và chuyển gen như nhau. Umbeck et al. chuyển vào mẫu mô thân

mầm giống Coker312, còn Firoozabady et al. chuyển vào mẫu mô lá mầm giống
Coker210. Họ sử dụng A. tumefaciens chủng LBA4404 chứa vector mang gen
nptII. Họ nhiễm mẫu mô với dung dịch vi khuẩn trong vài giây (Firoozabady et
al.) hoặc qua đêm (Umbeck et al.), sau đó, đồng nuôi cấy vi khuẩn và mẫu mô 3
ngày trên môi trường không chứa kháng sinh để kích thích vi khuẩn sinh trưởng.
Sau đó, mẫu mô được đặt lên môi trường MS chứa 50 mg/l kanamycin, 500 mg/l
cefotaxime (Umbeck et al.) hoặc 500 mg/l carbenicillin (Firoozabady et al.), 0,1
mg/l kinetin + 0,1 mg/l 2,4D và nuôi 4-6 tuần (Umbeck et al.) hoặc 5 mg/l 2iP +
0,1 mg/l NAA và nuôi 2-3 tuần (Firoozabady et al.) để cảm ứng mô sẹo chuyển
gen. Họ cảm ứng phân hóa phôi trên môi trường không chứa chất điều hòa sinh
trưởng, trong khi vẫn duy trì kháng sinh kanamycin và cefotaxime hoặc carbencillin.
Cây chuyển gen được tái sinh và ra rễ trên môi trường có nồng độ muối thấp,
không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (Umbeck et al.) hoặc có bổ sung 0,1
mg/l NAA + 0,1 mg/l GA
3
(Firoozabady et al.). Phương pháp chuyển gen này
được sử dụng rất rộng rãi, vì không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, số bản sao gen
chuyển ít, di truyền ổn định, thao tác dễ dàng và chi phí thấp.
1.7.2. Chuyển gen
bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn (pollen
tube pathway - PTP): là chuyển trực tiếp gen vào tế bào mầm (germline cell).

Cơ chế của chuyển gen PTP: Sau khi hoàn thành quá trình thụ tinh kép,
một lượng lớn chất dinh dưỡng và năng lượng được yêu cầu cho sự phân chia
đầu tiên của hợp tử. Ở giai đoạn này, các tế bào có màng nhân, màng và thành tế
bào chưa hoàn chỉnh, nên trao đổi chất giữa các tế bào hợp tử và tế bào xung
quanh xảy ra thường xuyên. Vì vậy, có thể cho phép các đoạn DNA đi vào túi
phôi, hợp tử và kết hợp với genom theo một cơ chế chưa rõ ràng.
Tiến bộ của chuyển gen PTP ở cây bông: Từ năm 1993, Ni et al. (1996)
đã chuyển gen mã hóa Bt, Bt + CpTi, chitinase,


-glucanase, glucose oxidase,
protein kháng nấm bằng PTP vào các giống Zhongmiansuo 12, Zhongzhi 372,
Simian 3, Sumian 8, Siyang 167, Shiyuan 321, Xinluzao 4, Liaomian 15, 541,
916, C6524, Q010, Suyin A, B, C… Kết quả, nhiều giống bông chuyển gen
được tạo ra, có khả năng kháng với sâu xanh hoặc bệnh nấm.

5
Theo Ni et al. (2004) chuyển gen PTP có thuận lợi sau: (i) Tránh được
biến dị soma và sự phụ thuộc vào kiểu giống; (ii) Mở rộng phạm vi loài nhận
gen; (iii) Rút ngắn thời gian của quá trình chuyển gen; (iv) Tần suất chuyển gen
khá cao, 0,5-1%; (v) Thao tác bằng tay đơn giản và dễ dàng; và (vi) Thích hợp
với chuyển gen quy mô lớn để có quần thể lớn cây chuyển gen.
1.8. Sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen
1.8.1. Sàng lọc tế bào, mô hoặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị chọn lọc
Có thể tạo ra cấu trúc DNA plasmid, trong đó, ngoài gen khởi động, gen
của A. tumefaciens giúp cho DNA plasmid gắn vào genom thực vật, gen mục
tiêu cần chuyển…, còn có gen giúp sàng lọc tế bào, mô hoặc cây tiếp nhận gen.
Gen lắp ghép với mục đích như vậy gọi là gen chỉ thị. Có 2 loại gen chỉ thị là
gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gene) và gen báo cáo (reporter gene).
1.8.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chuyển gen
Cây được chuyển gen, sinh trưởng trên môi trường chọn lọc, thì chưa đủ
cơ sở khẳng định chuyển gen thành công, vì tính kháng có thể xuất hiện tự nhiên
do đột biến. Vì vậy, cần có phân tích bổ sung bằng PCR và Southern blot. Trong
chuyển gen, PCR được sử dụng để xác định nhanh sự có mặt của gen chuyển
trong tế bào, vì phương pháp rất nhạy và cho kết quả chính xác; còn Southern
blot được sử dụng để chứng minh gen chuyển gắn kết vào genom, vì phương
pháp rất nhạy, cho kết quả rất chính xác, ít bị ảnh hưởng bởi DNA lẫn tạp, đồng
thời có thể nhận được thông tin vị trí và số bản sao gen gắn kết.
1.8.3. Đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen

PCR và Southern blot xác định được sự có mặt, gắn kết và số bản sao gen
chuyển trong genom. Tuy nhiên, với thông tin này, chưa thể kết luận chuyển gen
thành công, vì gen chuyển cần phải hoạt động phiên mã và dịch mã. Ngày nay,
nhờ sự ra đời các phương pháp phân tích phân tử như
Northern blot và Western
blot
cho phép xác định các hoạt động này một cách nhanh chóng và chính xác.
1.8.4. Đánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt
Kết quả xác định sự có mặt và gắn kết gen dương tính chỉ là điều kiện cần,
tính kháng sâu trên đồng ruộng mới là điều kiện đủ. Do đó, phân tích sinh học cần
thực hiện để chọn dòng chuyển gen kháng sâu cao. Đánh giá tính kháng sâu của
cây chuyển gen Bt ở 3 mức (i) trong phòng: sử dụng lá cây trong nhà lưới, nhà
kính để nuôi sâu; (ii) trong lồng lưới: trồng cây trong lồng lưới, thả sâu, điều tra
nụ và quả bị hại; và (iii) trên đồng ruộng: trồng cây trên đồng, điều tra mật độ sâu,
đo đếm mức độ và tỷ lệ đỉnh ngọn, nụ, quả bị hại để xác định mức độ kháng.

6
Chương 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống bông: Có 8 giống được sử dụng trong nghiên cứu là SSR60F,
Coker310, Coker312, VN36P, C118, LRA5166, MCU9 và TM1.
2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn: Gen CryIAc được thiết kế
trong 2 vector chuyển gen pC1300-Ubi-CryIAc (cho chuyển gen thông qua A.
tumefaciens) và pIBT-CryIAc (cho vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn).
Hai vector được biến nạp vào E.coli chủng DH5 và A. tumefaciens chủng C58.
2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu: Sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu để PCR nhân gen hpt, nptII
và CryIAc. Trình tự 3 cặp mồi và kích thước 3 đoạn DNA nhân ở bảng 2.1.
2.1.4. Hoá chất: Ở phụ lục 1; 2.1.5. Máy móc, thiết bị: Ở phụ lục 2.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens
2.2.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma: Cho 6 giống SSR60F,
Coker310, Coker312, VN36P, C118 và TM1 theo phương pháp của Chaudhary
et al. (2003), Kumar et al. (1998), Kumria et al. (2003), Trolinder và Goodin
(1987) và Trolinder và Xhixian (1989). Gồm (a) Tạo nguyên liệu tái sinh bằng
khử trùng hạt, tách vỏ, đặt lên môi trường G gồm 1/2 MSB
5
(phụ lục 3) + 20 g/l
sucrose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 7 ngày; (b) Cảm ứng mô sẹo trên 9 môi trường CI
gồm MSB
5
+ 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite + 9 tổ hợp nồng độ 2,4D (0,05; 0,1;
0,3 mg/l) và kinetin (0,1; 0,3; 0,5 mg/l) (bảng 2.2), nuôi 4 tuần; (c) Nhân mô sẹo
trên môi trường CP gồm MSB
5
+ 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 8 tuần; (d)
Cảm ứng phân hoá phôi trên môi trường EI gồm MSB
5
+ 1,9 g/l KNO
3
+ 30 g/l
glucose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 8 tuần; (e) Phát triển và chín phôi trên môi trường
ED gồm MSB
5
+ 1 g/l glutamine + 0,5 g/l l-asparagine + 30 g/l glucose + 2,5 g/l
gelrite, nuôi 4 tuần; (f) Nảy mầm và tái sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường GR
gồm MSB
5
+ 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 3-4 tuần; và (g) Huấn luyện,
trồng cây tái sinh trong nhà kính và nhà lưới theo hai phương pháp 1 và 2.

2.2.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi:
Cho 4 giống LRA5166,
VN36P, C118 và TM1 theo phương pháp của Banerjee et al. (2003) và Morre et al.
(1998). Gồm (a) Tạo nguyên liệu tái sinh, gồm khử trùng hạt theo phương pháp
ở mục 2.2.1.1-a, tách vỏ và lá mầm, thu phôi hạt; (b) Cảm ứng đa chồi trên 12
môi trường MSI gồm MSB
5
+ 20 g/l sucrose + 2,5 g/l gelrite + 12 tổ hợp nồng

7
độ 2,4D (0,1; 0,2 mg/l), BA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l) và NAA (0,1 mg/l)
(bảng 2.4), nuôi 1 tuần; (c) Tạo cụm chồi trên 4 môi trường S gồm MSB
5
+ 30 g/l
sucrose + 8,5 g/l agar + 4 tổ hợp nồng độ BA (0,5; 1 mg/l) và NAA (0,05; 0,1
mg/l) (bảng 2.5), nuôi 4 tuần; (d) Kéo dài cụm chồi trên môi trường E gồm MSB
5

+ 30 g/l sucrose + 8,5 g/l agar, nuôi 9 tuần; (e) Tạo rễ - tái sinh cây hoàn chỉnh
trong ống nghiệm trên 4 môi trường R (bảng 2.6); (f) Huấn luyện, trồng cây tái
sinh trong nhà kính và nhà lưới theo phương pháp kết luận ở mục 2.2.1.1-g.
2.2.1.3. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens: cho 2 giống
Coker312 và SSR60F theo phương pháp của
Umbeck et al. (1987), gồm:

1) Xác định thông số chuyển gen: (a) Xác định nồng độ hygromycin chọn
lọc mô sẹo chuyển gen; (b) Xác định nồng độ cefotaxime ức chế A. tumefaciens;
(c) Xác định mật độ tế bào và thời gian nhiễm A. tumefaciens; và (d) Xác định
thời gian và nhiệt độ đồng nuôi cấy.
2) Thực hiện chuyển gen: (a) Cảm ứng mô sẹo chuyển gen trên môi trường

CI kết luận ở mục 2.2.1.1-b bổ sung hygromycin và cefotaxime ở nồng độ kết luận
ở mục 2.2.1.3-1-a và b; (b) Nhân và chọn lọc mô sẹo chuyển gen trên môi trường
CP bổ sung hygromycin và cefotaxime ở nồng độ đã kết luận ở mục 2.2.1.3-1-a
và b; (c) Cảm ứng phân hóa phôi chuyển gen trên môi trường EI; (d) Phát triển và
chín phôi chuyển gen trên môi trường ED; (e) Nảy mầm và tái sinh cây chuyển
gen trong ống nghiệm trên môi trường GR; và (f) Huấn luyện, trồng cây chuyển
gen trong nhà kính và nhà lưới theo phương pháp kết luận ở mục 2.2.1.1-g.
2.2.2. Chuyển gen vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống
phấn: cho 4 giống C118, LRA5166, MCU9 và TM1.
2.2.2.1. Xác định thông số vi tiêm:

Gồm: (i)
Xác định thời điểm vi tiêm trong
ngày; và (ii) Xác định độ sâu kim tiêm theo phương pháp của Ni et al. (2004).
2.2.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T
0

- DNA plasmid mang gen CryIAc sử dụng vi tiêm được tách chiết từ vi
khuẩn E. coli chủng DH5α theo kít “Aurum
TM
plasmid mini” của Hãng Bio-Rad.
- Vi tiêm chuyển gen theo quy trình của Ni et al. (2004) có sửa đổi (phụ lục
4), gồm (1) trồng và chăm sóc cây trước khi vi tiêm; (2) tự thụ phấn trước khi hoa
nở; (3) chọn hoa vi tiêm; (4) chuẩn bị ống tiêm và dung dịch DNA plasmid; (5)
loại bỏ cánh hoa và làm bằng vòi nhụy; (6) vi tiêm chuyển gen; (7) nhỏ dung dịch
GA
3
kích thích đậu quả và buộc biển đánh dấu; và (8) chăm sóc và thu hoạch.
- Tiến hành vi tiêm 10 µl dung dịch DNA plasmid nồng độ 10, 20, 30
µg/ml cho mỗi bầu nhụy của 4 giống bông để tạo hạt chuyển gen thế hệ T

0
.

8
2.2.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen
2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh: Gồm: (
1) Sàng lọc
cây bông chuyển gen bằng hygromycin: Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
và
T
2
bằng hygromycin; và (2) Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin:
Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
và T
2
bằng kanamycin.
2.2.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR: Đánh giá cây chuyển gen thế
hệ T
2
bằng PCR các gen hpt, nptII và CryIAc.
2.2.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen: Theo phương pháp
nuôi sâu đánh giá tính kháng trong phòng của Wang et al. (2004) có sửa đổi bởi
Phòng NC Bảo vệ Thực vật - Viện NC Bông và PTNN Nha Hố (phụ lục 10), gồm:
(1) Chuẩn bị sâu xanh; (2) Chuẩn bị lá bông; và (3) Nuôi thả cho sâu xanh ăn lá.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens
Để chuyển gen thông qua A. tumefaciens cần phải tái sinh được cây in

vitro. Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu tái sinh cây bông theo 2 phương pháp:
3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma: cho 6 giống SSR60F,
Coker310, Coker312, VN36P, TM1 và C118.
- Cảm ứng mô sẹo: Từ kết quả cảm ứng mô sẹo, đề tài rút ra (i) 3 giống có
cảm ứng mô sẹo tốt là SSR60F, Coker310 và Coker312; (ii) nồng độ 2,4D 0,1
mg/l và kinetin từ 0,1 đến 0,3 mg/l cho chất lượng mô sẹo cảm ứng tốt hơn; và
(iii) môi trường CI
4
cho chất lượng mô sẹo cảm ứng tốt nhất, nên được chọn để
cảm ứng mô sẹo cho 3 giống SSR60F, Coker310 và Coker312.
- Nhân mô sẹo: Kết quả sau 8 tuần, các dòng mô sẹo CI
4
, CI
5
và CI
6
của cả 3
giống đều lớn rất nhanh, từ ++++ (SSR60F) đến +++++ (Coker310 và Coker312);
các dòng mô sẹo CI còn lại lớn chậm hơn, từ + đến ++++ (bảng 3.2). Đa số mô
sẹo nhân mềm, hơi ướt, màu vàng nhạt, vàng xanh nhạt (hình 3.2.b và c); chúng
lớn rất nhanh và hầu hết thuộc các dòng mô sẹo CI
4
, CI
5
và CI
6
. Một số mô sẹo
nhân chuyển hóa thành màu xanh và trắng (hình 3.2.a); những mô sẹo này cứng,
chậm lớn và đều thuộc các dòng mô sẹo CI
1

, CI
2
và CI
3
; về sau chúng bị loại bỏ.
- Cảm ứng phân hóa phôi: Kết quả mô sẹo đã phân hóa thành tiền phôi,
với tỷ lệ 29,5-100%. Trong đó, Coker310 có tỷ lệ phân hóa phôi cao nhất (84,8-
100%), kế đến Coker312 (52,3-86,7%) và thấp nhất là SSR60F (29,5-61,4%).
Các dòng mô sẹo CI
4
, CI
5
và CI
6
có tỷ lệ phân hóa phôi cao hơn các dòng mô

9
sẹo còn lại (bảng 3.3). Tiền phôi màu kem, kem trắng, kem vàng nhạt và vàng
xanh nhạt. Chúng có dạng viên tròn, kết cấu tơi xốp và rời rạc (hình 3.3.a và b).
a
c
b
d
Hình 3.3. Tiền phôi và phôi chín - a: tiền phôi hình thành trên môi trường
EI; b: tiền phôi soi trên kính hiển vi soi nổi; c: phôi chín trên môi trường
ED; và d: phôi chín soi trên kính hiển vi soi nổi - Hình chụp trên
giống Coker312.

10
- Phát triển và chín phôi: Cấy chuyển tiền phôi sang môi trường ED để phát

triển thành phôi chín. Kết quả thấy, tiền phôi đã chín. Phôi chín kết cấu rời rạc,
hình dạng như quả thủy lôi và màu vàng hoặc vàng xanh (hình 3.3.c và 3.3.d).
- Nảy mầm và tái sinh cây hoàn chỉnh: Thu hoạch phôi chín và cấy chuyển
sang môi trường GR. Kết quả sau 4 tuần, phôi chín bắt đầu nảy mầm thành cây
tái sinh. Cây tái sinh màu xanh nhạt, có rễ, thân và 2 lá mầm hình ô van (hình
3.4.a). Tiếp tục cấy chuyển cây tái sinh sang môi trường GR mới để phát triển
thành cây tái sinh hoàn chỉnh (hình 3.4.b).
- Huấn luyện, trồng cây tái sinh trong nhà kính và nhà lưới: Kết quả ở bảng
3.5 cho thấy, phương pháp 1 có 66,7% số cây sống sót; phương pháp 2 cho tỷ lệ
cây sống rất cao, đạt 93,3%, nên được chọn để huấn luyện, trồng cây tái sinh.
Như vậy, đề tài tái sinh thành công 3 giống SSR60F, Coker310 và Coker312
bằng tái sinh thông qua tạo phôi soma, với thời gian 9-10 tháng.
3.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi: cho 4 giống LRA5166,
VN36P, C118 và TM1.
- Cảm ứng đa chồi: Kết quả đánh giá tỷ lệ và đặc điểm cảm ứng đa chồi ở
bảng 3.6 và phụ lục 12 cho thấy, môi trường MSI
4
(chứa 0,1 mg/l 2,4D, 2 mg/l
BA và 0,1 mg/l NAA) cho tỷ lệ cảm ứng đa chồi cao nhất trên cả 3 giống
Hình 3.4. Nảy mầm và tái sinh cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm - a: phôi
nảy mầm thành cây tái sinh; và b: cây tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường GR
- Hình chụp trên giống Coker312.
a
b

11
LRA5166 (80,0%), VN36P (85,3%) và C118 (81,7%); còn với TM1, môi trường
MSI
2
(chứa 0,1 mg/l 2,4D, 1 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA) cho tỷ lệ cảm ứng đa

chồi cao nhất (70,6%). Hai môi trường MSI này được chọn để cảm ứng đa chồi.
Hình 3.7. Tạo và phát triển cụm chồi - a: đỉnh phôi cảm ứng 3 mm; b: cụm
chồi tạo thành trên môi trường S; c và d: cụm chồi phát triển sau 6 và 9 tuần
nuôi trên môi trường E - Hình chụp trên giống LRA5166.

a
b
c
d
S
1

S
2

S
3

S
4


12
- Tạo cụm chồi: Kết quả, 3 giống LRA5166, VN36P và C118 hình thành
cụm chồi (hình 3.7.b - S
1
-S
4
), TM1 không tạo được cụm chồi. Trong số 3 giống,
LRA5166 cho tỷ lệ tạo cụm chồi (38,0-76,0%) và số chồi/cụm (4,5-6,7 chồi/cụm)

cao nhất; 2 giống VN36P và C118 cho tỷ lệ tạo cụm chồi (8,7-27,6%) và số
chồi/cụm thấp hơn (3,3-4,7 chồi/cụm) (bảng 3.7). Kết quả so sánh thấy, môi
trường S
1
cho tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi/cụm cao nhất trên cả 3 giống.
Bảng 3.7. Tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi/cụm trên các môi trường S
(tại Nha Hố, năm 2005)
Môi
trường
Tỷ lệ tạo cụm chồi (%)
Số chồi/cụm
LRA5166
VN36P
C118
TM1
LRA5156
VN36P
C118
S
1

76,0
26,7
27,6
0
6,7
4,1
4,7
S
2

59,3
17,4
19,9
0
5,4
3,6
3,9
S
3

58,4
23,2
11,1
0
5,1
3,5
4,2
S
4

38,0
24,8
8,7
0
4,5
3,4
3,3
- Kéo dài cụm chồi: Chồi con trên cụm chồi được phát triển kéo dài để có
chiều cao và số lá cần thiết bằng cách cấy chuyển sang môi trường kéo dài cụm

chồi (E). Kết quả, sau 9 tuần, thu được các cụm chồi với chồi con phát triển đầy
đủ, cao 2-4 cm, có 2-4 lá/chồi (hình 3.7.d).
- Tạo rễ - tái sinh cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm: Kết quả, 3 môi trường
không bổ sung NAA (R
1
, R
2
và R
3
) có tỷ lệ cây ra rễ cao hơn môi trường bổ
sung NAA (R
4
). Trong đó, môi trường R
1
cho tỷ lệ cây ra rễ cao nhất trên cả 3
giống (50-66,7%), đặc biệt là trên giống LRA5166 (66,7%) (bảng 3.8).
- Huấn luyện - trồng cây tái sinh trong nhà kính và nhà lưới: Sau 3 tuần
trong nhà kính, cây tái sinh đã sống, với tỷ lệ 60,0-95,0%. Trong đó, VN36P
(95,0%) có tỷ lệ sống cao nhất, tiếp theo là LRA5166 (90,0%), C118 có tỷ lệ
sống thấp nhất (60,0%) (bảng 3.9). Sau đó, chuyển trồng trong nhà lưới. Cây
trồng trong nhà lưới có tỷ lệ sống rất cao (94,7-100%), sinh trưởng, phát triển
tốt, ra hoa và đậu quả bình thường (hình 3.8.e).
Như vậy, đề tài tái sinh thành công 3 giống LRA5166, VN36P và C118
bằng tái sinh thông qua tạo đa chồi. Trong đó, LRA5166 dễ tái sinh nhất. Phương
pháp này đơn giản, hiệu quả, có thời gian ngắn (5-6 tháng) và có thể tái sinh cho
giống Việt Nam, thường không có khả năng tái sinh thông qua tạo phôi soma.
3.1.3. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens:

Đã chuyển
cho các giống tái sinh, nhưng mới chỉ thành công với 2 giống Coker312 và SSR60F.

13
3.1.3.1. Xác định thông số chuyển gen
- Xác định nồng độ hygromycin: Kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.9 cho thấy,
từ nồng độ 12,5 mg/l, đoạn thân không cảm ứng mô sẹo. Vì vậy, nồng độ này
được bổ sung vào môi trường CI
4
để cảm ứng mô sẹo chuyển gen. Kết quả cũng
cho thấy, ở nồng độ 10 mg/l, mô sẹo bị ức chế sinh trưởng hoàn toàn. Vì vậy, sử
dụng môi trường CP bổ sung 10 mg/l hygromycin để nhân mô sẹo chuyển gen.
Bảng 3.10. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo trên môi trường CI
4
và mô sẹo sống sót
trên môi trường CP bổ sung hygromycin ở 6 nồng độ (tại Nha Hố, năm 2006)
Nồng độ
(mg/l)
Số đoạn
thân
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo (%)
Tỷ lệ mô sẹo sống sót (%)
Coker312
SSR60F
Coker312
SSR60F
0-ĐC
90
100
100
100
100

5,0
90
100
100
66,7
55,6
7,5
90
23,3
16,7
16,7
11,1
10,0
90
12,2
3,3
0
0
12,5
90
0
0
-
-
15,0
90
0
0
-
-

- Xác định nồng độ cefotaxime: Số liệu ở bảng 3.11 cho thấy, nồng độ
500 mg/l cefotaxime không ảnh hưởng đến sự cảm ứng mô sẹo, tỷ lệ phân hóa
phôi giảm không đáng kể và ức chế hoàn toàn sinh trưởng của A. tumefaciens,
nên được chọn để chuyển gen.
- Xác định mật độ tế bào và thời gian nhiễm A. tumefaciens: Số liệu ở
bảng 3.12 cho thấy, mật độ OD
600
= 0,35 cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo chuyển gen
cao hơn và tỷ lệ nhiễm A. tumefaciens thấp hơn so với mật độ OD
600
= 0,7 ở cả 2
thời gian nhiễm 5 và 10 phút. Vì vậy, mật độ OD
600
= 0,35 và thời gian nhiễm
khuẩn 5-10 phút phù hợp nhất cho chuyển gen.
- Xác định thời gian và nhiệt độ đồng nuôi cấy: Kết quả ở bảng 3.13 cho
thấy, thời gian đồng nuôi cấy 48 giờ không bị nhiễm A. tumefaciens, có tỷ lệ cảm
ứng mô sẹo cao hơn, nên được chọn để chuyển gen. Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy,
đồng nuôi cấy ở 21
0
C cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo cao hơn. Ngoài ra, đồng nuôi cấy ở
nhiệt độ này, sinh trưởng của A. tumefaciens vừa phải, nên mẫu biến nạp không bị
nhiễm vi khuẩn. Vì vậy, chọn nhiệt độ đồng nuôi cấy 21
0
C là thích hợp nhất.
3.1.3.2. Thực hiện chuyển gen
- Cảm ứng mô sẹo chuyển gen: Sau khi nhiễm A. tumefaciens và đồng nuôi
cấy trên môi trường CI
4
, mẫu biến nạp được cảm ứng mô sẹo trên môi trường CI

4


14
bổ sung 12,5 mg/l hygromycin + 500 mg/l cefotaxime. Kết quả, mô sẹo hình thành
với tỷ lệ trên Coker312 là 25,4% và SSR60F là 24,9% (hình 3.10.a và bảng 3.15).
Bảng 3.15. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo, mô sẹo sống sót và phân hóa phôi ở 3 đợt
chuyển gen (tại Nha Hố, năm 2007 và 2008).
Đợt
chuyển
gen
Số mẫu
biến nạp
Tỷ lệ cảm ứng
mô sẹo (%)
Tỷ lệ mô sẹo sống
sót (%)
Tỷ lệ phân hóa
phôi (%)
Coker312
SSR60F
Coker312
SSR60F
Coker312
SSR60F
Coker312
SSR60F
Đợt 1
1.093
952

24,2
24,3
10,7
11,0
1,01
0,84
Đợt 2
1.834
2.075
25,3
25,0
12,1
11,3
1,09
1,11
Đợt 3
2.238
2.006
26,8
25,5
11,6
10,9
1,16
1,25
TB
-
-
25,4
24,9
11,5

11,1
1,09
1,06
- Nhân và chọn lọc mô sẹo chuyển gen: Cấy chuyển mô sẹo cảm ứng sang
môi trường CP bổ sung 10 mg/l hygromycin + 500 mg/l cefotaxime. Kết quả, chỉ
còn 11,5% (Coker312) và 11,1% (SSR60F) số mô sẹo sống sót (so với số mẫu biến
nạp), tương đương 60% số mô sẹo chết (so với số mô sẹo cảm ứng) (bảng 3.15).
- Cảm ứng phân hóa phôi chuyển gen: Cấy chuyển mô sẹo nhân sang môi
trường EI. Kết quả, tiền phôi chuyển gen đã hình thành (hình 3.11.c), nhưng tỷ
lệ phân hóa phôi rất thấp. So với số mô sẹo nhân và chọn lọc, chỉ có gần 10% số
mô sẹo phân hóa phôi; còn so với số đoạn thân nhiễm khuẩn, thì chỉ có 1,09%
(Coker312) và 1,06% (SSR60F) số đoạn thân phân hóa phôi (bảng 3.15).
- Phát triển và chín phôi chuyển gen: Sau 8 tuần nuôi trên môi trường EI,
tiền phôi chuyển gen được cấy chuyển sang môi trường ED. Kết quả, tiền phôi
đã phát triển thành phôi chuyển gen chín (hình 3.11.d).
- Nảy mầm và tái sinh cây chuyển gen trong ống nghiệm: Cấy chuyển phôi
chín sang môi trường GR. Kết quả, phôi chín nảy mầm thành cây tái sinh (hình
3.11.e). Cấy chuyển cây này sang môi trường GR mới để phát triển thành cây tái
sinh hoàn chỉnh (hình 3.11.f). Kết quả, tái sinh được 49 cây chuyển gen hoàn chỉnh
trong ống nghiệm, trong đó, Coker312 được 28 cây và SSR60F - 21 cây (bảng 3.16).
- Huấn luyện, trồng cây chuyển gen trong nhà kính và nhà lưới: Kết quả, có
40 cây chuyển gen trồng sống trong nhà kính (Coker312: 23 cây và SSR60F: 17
cây), với tỷ lệ cây sống 83,3% (bảng 3.16). Cây chuyển gen tiếp tục được chuyển
trồng trong nhà lưới. Kết quả, cả 40 cây chuyển gen đều sống (hình 3.12.a) và
được gọi là cây chuyển gen CryIAc thế hệ T
0
. Kết quả đánh giá cây chuyển gen
thế hệ T
0
ở bảng 3.16 và hình 3.12 thấy, chỉ có 12 cây (30%) sinh trưởng, phát

15
triển tốt, kiểu hình tương đồng giống gốc và hữu dục (hình 3.12.b). Tự thụ các cây
này để thu lấy hạt cung cấp cho sàng lọc, đánh giá cây chuyển gen ở thế hệ sau.
a
b
f
c
e
d
Hình 3.11. Nhân, chọn lọc mô sẹo; phân hóa, phát triển, chín phôi; nảy
mầm, tái sinh cây chuyển gen - Nhân mô sẹo chuyển gen lần 1 (a) và lần 2 (b);
phân hóa phôi chuyển gen (c); phôi chuyển gen chín (d); phôi chuyển gen nảy
mầm (e); và cây chuyển gen tái sinh (f) - Hình chụp trên giống Coker312.


16
3.2. Chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường
ống phấn: cho 4 giống C118, LRA5166, MCU9 và TM1.
3.2.1. Xác định thông số vi tiêm
- Xác định thời điểm vi tiêm trong ngày: Số liệu ở bảng 3.17 cho thấy, hoa
bắt đầu nở vào khoảng 6-7 giờ (12,2%), nở rộ vào 7-8 giờ (86,2%) và kết thúc nở
vào 8-9 giờ (1,6%). Từ kết quả này, đề tài kết luận, thời điểm vi tiêm thích hợp
nhất cho 4 giống bông là 6-8 giờ sáng của ngày sau ngày hoa nở.
- Xác định độ sâu kim tiêm: Dựa vào kích thước bầu nhụy, độ sâu kim tiêm
(bằng 3/4 chiều dài trụ noãn hoặc 2/3 chiều dài bầu nhụy) cho 4 giống là C118: 0,72-
0,73 cm, LRA5166: 0,62-0,64 cm, MCU9: 0,74-0,75 cm và TM1: 0,78-0,80 cm.
3.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T
0

Số liệu ở bảng 3.19 cho thấy, từ 2006 đến 2007, đề tài vi tiêm 3 dung dịch
chứa pIBT-CryIAc nồng độ 10, 20, 30 µg/ml cho 14.375 hoa, thu được 12.685
quả và 144.395 hạt chuyển gen thế hệ T
0
. Khi vi tiêm, tỷ lệ đậu quả đạt 88,24%,
số hạt/quả vi tiêm là 11,38 hạt, thấp hơn nhiều so với đậu quả bình thường.
Bảng 3.19. Số hoa vi tiêm, quả đậu và hạt chuyển gen thế hệ T
0
thu được của
4 giống bông trên 3 nồng độ DNA plasmid (tại Nha Hố, năm 2006 và 2007)
Giống
Nồng độ
(µg/ml)
Số hoa vi
tiêm
Số quả
đậu
Tỷ lệ đậu
quả (%)
Tổng số
hạt
Số hạt/
quả

C118
10
1.281
1.145
89,38
13.494

11,79
20
1.259
1.123
89,20
12.713
11,32
30
1.460
1.299
88,97
15.506
11,94
Tổng/trung bình
4.000
3.567
89,18
41.713
11,69

LRA5166
10
1.234
1.132
91,73
14.345
12,67
20
1.452
1.309

90,15
20.090
15,35
30
1.499
1.343
89,59
18.569
13,83
Tổng/trung bình
4.185
3.784
90,42
53.004
14,01

MCU9
10
757
647
85,47
6.947
10,74
20
595
504
84,71
5.865
11,64
30

643
503
78,23
5.295
10,53
Tổng/trung bình
1.995
1.654
82,91
18.107
10,95

TM1
10
1.356
1.157
85,32
11.794
10,19
20
1.439
1.260
87,56
9.095
7,22
30
1.400
1.263
90,21
10.682

8,46
Tổng/trung bình
4.195
3.680
87,72
31.571
8,58
Tổng/trung bình
14.375
12.685
88,24
144.395
11,38

17
Số liệu ở bảng 3.20 cho thấy, các giống có tỷ lệ đậu quả vi tiêm khá cao
(82,91-90,42%) so với đậu quả bình thường (98,36-99,03%). Trong đó, LRA5166
có tỷ lệ đậu quả cao nhất (90,42%), tiếp đến C118 (89,18%), TM1 (87,72%) và
thấp nhất là MCU9 (82,91%). Khi vi tiêm, quả có số hạt/quả (8,58-14,01 hạt/quả)
ít hơn so với đậu quả bình thường (24,02-29,85 hạt/quả). Trong đó, LRA5166 cho
nhiều hạt/quả nhất (14,01 hạt/quả), tiếp theo C118 (11,69 hạt/quả), MCU9 (10,95
hạt/quả), TM1 cho ít hạt/quả nhất (8,58 hạt/quả) (bảng 3.20).
Số liệu bảng 3.20 cho thấy, không có tương quan về tỷ lệ đậu quả giữa vi
tiêm và không vi tiêm, nhưng lại có tương quan thuận về số hạt/quả. Cụ thể,
giống có nhiều hạt/quả, khi vi tiêm cho nhiều hạt/quả và do đó thích hợp cho vi
tiêm. Số liệu ở bảng 3.21 cho thấy, không có sự chênh lệch đáng kể nào về tỷ lệ
đậu quả và số hạt/quả vi tiêm giữa các nồng độ DNA plasmid. Chứng tỏ, 3 nồng
độ DNA plasmid nghiên cứu chưa ảnh hưởng đến sự đậu quả và kết hạt vi tiêm.
3.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen
3.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh

3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin
- Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
bằng hygromycin: Gieo hạt 12 cây
chuyển gen thế hệ T
0
giống Coker312 và SSR60F trên môi trường G bổ sung 20
mg/l hygromycin. Kết quả, chọn được 7 dòng chuyển gen thế hệ T
1
(Coker312:
5 dòng và SSR60F: 2 dòng) kháng hygromycin, với tỷ lệ cây kháng 76,7-86,7%
(so với số hạt gieo) (bảng 3.23). Sau đó, trồng 7 dòng T
1
trong nhà lưới, chăm
sóc, thu hạt cho sàng lọc, đánh giá cây chuyển gen ở thế hệ T
2
.
Bảng 3.23. Số lượng (%) và tỷ lệ cây chuyển gen thế hệ T
1
kháng
hygromycin (tại Nha Hố, năm 2009)
Dòng/
giống
Số hạt
gieo
Số cây
kháng
Tỷ lệ
kháng
Dòng/

giống
Số hạt
gieo
Số cây
kháng
Tỷ lệ
kháng
C-T
1
/1
30
23
76,7
C-T
1
/8
30
24
80,0
C-T
1
/2
30
25
83,3
Coker312
30
0
0
C-T

1
/3
30
26
86,7
S-T
1
/1
30
25
83,3
C-T
1
/4
30
-
0
S-T
1
/2
30
24
80,0
C-T
1
/5
30
26
86,7
S-T

1
/3
30
-
0
C-T
1
/6
30
-
0
S-T
1
/4
30
-
0
C-T
1
/7
30
-
0
SSR60F
30
0
0
- Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
2
bằng hygromycin: Gieo 7 dòng chuyển

gen thế hệ T
1
thành 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
trong nhà lưới. Bôi dung dịch

18
hygromycin nồng độ 1.500 mg/l lên lá. Kết quả, lá của 7 dòng chuyển gen thế hệ
T
2
không bị tổn thương hay kháng hygromycin (hình 3.15.a), với tỷ lệ kháng
82,5-97,4% (bảng 3.24), trong khi, 2 ĐC (Coker312 và SSR60F) có 100% số
cây bị cháy lá. Tỷ lệ cây kháng hygromycin ở thế hệ T
2
cao hơn thế hệ T
1
.
3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin
Bảng 3.25. Số lượng và tỷ lệ cây chuyển gen thế hệ T
1
, dòng chuyển gen thế
hệ T
2
kháng kanamycin (tại Nha Hố, năm 2008-2010)
Giống
Nồng
độ
(µg/ml)
Số
hạt T

0

gieo
Số
cây T
1

mọc
Tỷ lệ
cây T
1

mọc
(%)
Số
cây T
1

kháng
Ka.
Tỷ lệ
cây T
1

kháng
Ka. (%)
Số
dòng T
2
kháng

Ka.
Tỷ lệ
dòng T
2

kháng
Ka. (%)

C118
10
13.494
9.695
71,85
108
1,11
0
0
20
12.713
7.687
60,47
133
1,73
0
0
30
15.506
9.671
62,37
426

4,40
0
0
Tổng/trung bình
41.713
27.053
64,86
667
2,47
0
0

LRA
5166
10
14.345
5.633
39,27
127
2,25
0
0
20
20.090
7.648
38,07
140
1,83
0
0

30
18.569
9.901
53,32
121
1,22
7
0,07
Tổng/trung bình
53.004
23.182
43,74
388
1,67
7
0,03

MCU9
10
6.947
4.910
70,68
0
0
0
0
20
5.865
3.463
59,05

76
2,19
64
1,85
30
5.295
3.410
64,40
1
0,03
0
0
Tổng/trung bình
18.107
11.783
65,07
77
0,65
64
0,54

TM1
10
11.794
5.408
45,85
116
2,14
0
0

20
9.095
5.564
61,18
55
0,99
0
0
30
10.682
6.331
59,27
121
1,91
9
0,14
Tổng/trung bình
31.571
17.303
54,81
292
1,69
9
0,05
Tổng/
trung
bình 4
giống
10
46.580

25.646
55,06
351
1,37
0
0
20
47.763
24.362
51,01
404
1,66
64
0,26
30
50.052
29.313
58,57
669
2,28
16
0,05
Tổng/trung bình
144.395
79.321
54,93
1.424
1,80
80
0,10

- Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
bằng kanamycin: Gieo 144.395 hạt
chuyển gen thế hệ T
0
trong nhà lưới và thu được 79.321 cây chuyển gen thế hệ

19
T
1
, với tỷ lệ cây mọc 54,93%. Phun dung dịch kanamycin nồng độ 5.000 mg/l
lên lá (hình 3.16.a). Kết quả thu được 1.424 cây chuyển gen thế hệ T
1
kháng
kanamycin, với tỷ lệ cây kháng 1,8% (so với số cây mọc). Trong đó, C118 được
nhiều cây kháng nhất (667 cây; 2,47%), tiếp đến là LRA5166 (388 cây; 1,67%),
TM1 (292 cây; 1,69%) và MCU9 thu được ít cây nhất (77 cây; 0,69%) (bảng
3.25). Sau đó, nhổ bỏ cây mẫn cảm, giữ lại cây kháng (hình 3.16.c) và tiếp tục
chăm sóc, thu hạt cho sàng lọc, đánh giá cây chuyển gen ở thế hệ T
2
.
- Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
2
bằng kanamycin:
Gieo 1.424 cây
chuyển gen thế hệ T
1
thành 1.424 dòng T
2
(hình 3.17.a).

P
hun dung dịch
kanamycin nồng độ 5.000 mg/l lên lá. Sau đó, nhổ bỏ dòng mẫn cảm, giữ lại
dòng kháng kanamycin (hình 3.17.b). Kết quả,
từ 1.424 dòng T
2
, loại bỏ 1.344
dòng có 100% số cây mẫn cảm và thu được 80 dòng
chuyển gen thế hệ
T
2
có
cây kháng kanamycin, tương đương tỷ lệ kháng 0,1% (so với tổng số cây T
1

mọc). Trong đó, C118 không thu được dòng
chuyển gen thế hệ
T
2
nào, MCU9
thu được nhiều dòng nhất - 64 dòng (tỷ lệ 0,54%), tiếp đến TM1 - 9 dòng
(0,05%) và cuối cùng là LRA5166 - 7 dòng (0,03%) (bảng 3.25).
Đến khi có kết quả sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
2
mới thấy có ảnh
hưởng của nồng độ DNA plasmid đến hiệu quả chuyển gen. Cụ thể, vi tiêm dung
dịch DNA plasmid ở nồng độ 10 µg/ml không thu được dòng chuyển gen T
2
, trong
khi, vi tiêm ở nồng độ 20 và 30 µg/ml thu được dòng chuyển gen T

2
, với tỷ lệ
tương ứng 0,26% và 0,05% (bảng 3.25). Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 80 dòng
chuyển gen T
2
rất khác nhau và biến động lớn, 20-100%. Trong đó, tỷ lệ cây kháng
kanamycin của 7 dòng chuyển gen T
2
giống LRA5166: 38,4-100%; 64 dòng T
2

giống MCU9: 20-100%; và 9 dòng T
2
giống TM1: 42,6-99,1% (bảng 3.26, 27, 28).
Như vậy, kết quả sàng lọc bằng kháng sinh, thu được 87 dòng chuyển gen
thế hệ T
2
kháng kháng sinh, gồm 7 dòng kháng hygromycin (của Coker312 và
SSR60F) và 80 dòng kháng kanamycin (của LRA5166, MCU9 và TM1). Các dòng
này tiếp tục được đánh giá sự có mặt và gắn kết gen chuyển trong genom cây.
3.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR
Kết quả PCR nhân gen hpt cho 70 cây của 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2

kháng hygromycin (hình 3.18) cho thấy, trên các giếng ứng với cây chuyển gen
đều xuất hiện 1 băng duy nhất có kích thước 0,98 kb, tương đương kích thước
băng trên giếng ĐC+ (pC1300-Ubi-CryIAc), trong khi, trên giếng ĐC- (Coker312
không chuyển gen) không xuất hiện băng vạch nào. Kết quả khẳng định, có sự
hiện diện gen hpt trong tế bào 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2

kháng hygromycin.

20
Tương tự kết quả PCR gen hpt, trên điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR
nhân gen nptII cho 678 cây của 80 dòng chuyển gen thế hệ T
2
kháng kanamycin
nhận thấy, các giếng ứng với cây chuyển gen đều xuất hiện 1 băng duy nhất có
kích thước 0,8 kb, tương đương kích thước băng xuất hiện trên giếng ĐC+
(pIBT-CryIAc), trong khi, trên giếng ĐC- (LRA5166 không chuyển gen) không
xuất hiện băng vạch nào (hình 3.19). Kết quả cho thấy, có sự hiện diện gen nptII
trong tế bào 80 dòng chuyển gen thế hệ T
2
kháng kanamycin.
Tiếp tục PCR xác định sự có mặt của gen CryIAc. Kết quả ở hình 3.20
cho thấy, trên điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CryIAc cho 748 cây
của 87 dòng chuyển gen thế hệ T
2
kháng kháng sinh, các giếng ứng với cây
chuyển gen đều xuất hiện 1 băng duy nhất có kích thước 1,1 kp, tương đương
kích thước băng xuất hiện trên giếng ĐC+ (pIBT-CryIAc), trong khi, trên giếng
ĐC- (LRA5166 không chuyển gen) không xuất hiện băng vạch nào. Kết quả này
chứng tỏ, có sự hiện diện gen CryIAc trong 87 dòng chuyển gen thế hệ T
2
.
Như vậy, kết quả PCR khẳng định, có mặt đồng thời 2 gen hpt, CryIAc
trong tế bào 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
kháng hygromycin; và 2 gen nptII,
CryIAc trong tế bào của 80 dòng chuyển gen thế hệ T

2
kháng kanamycin. Kết
quả PCR cùng với kết quả xác định tính kháng kháng sinh và sự di truyền tính
kháng kháng sinh duy trì liên tục từ thế hệ T
0
, T
1
đến T
2
cho thấy, gen chuyển đã
gắn kết vào genom cây bông và di truyền bền vững cho thế hệ sau.
0,1 kb
0,6 kb
1,5 kb
Hình 3.20. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CryIAc - 1: thang DNA 100
bp; 2: pIBT-CryIAc (ĐC+); 3: giống LRA5166 không chuyển gen (ĐC-); và
4-15: cây chuyển gen thế hệ T
2
.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1,1 kb

21
3.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen
Thu lá của 748 cây chuyển gen thế hệ T
2
nuôi sâu xanh đánh giá tính
kháng trong phòng. Kết quả thu được ở bảng 3.29, 30, 31 và 32 cho thấy, 87
dòng chuyển gen thế hệ T

2
đều có tính kháng sâu xanh, với tỷ lệ sâu chết dao
động 40-100%, tương đương biến động mức độ kháng sâu từ yếu đến cao, trong
khi, tỷ lệ sâu chết trên các giống ĐC chỉ 0-3,3%.
3.3.3.1. Kết quả đánh giá tính kháng sâu xanh của 7 dòng chuyển gen thế hệ
T
2
giống Coker312 và SSR60F
Số liệu ở bảng 3.29 cho thấy, 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
đều kháng sâu
xanh, với tỷ lệ sâu chết 48-70%, trong khi, tỷ lệ sâu chết trên 2 ĐC (Coker312
và SSR60F) rất thấp, chỉ 3,3% số sâu chết (Coker312) hoặc sâu không chết
(SSR60F). Tuy nhiên, mức độ kháng sâu của 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
này
không cao, chỉ từ mức yếu đến trung bình. Trong đó, 3 dòng C-T
2
/1, S-T
2
/1 và
S-T
2
/2 kháng yếu; 4 dòng C-T
2
/2, C-T
2
/3, C-T
2
/5 và C-T

2
/8 kháng trung bình.
3.3.3.2. Kết quả đánh giá tính kháng sâu xanh của 80 dòng chuyển gen thế
hệ T
2
giống LRA5166, MCU9 và TM1
- Tính kháng sâu của 7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống LRA5166
: Kết
quả ở bảng 3.30 cho thấy,
7 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống LRA5166
đều
kháng sâu xanh cao, với tỷ lệ sâu chết 81,4-100%, trong khi, trên ĐC (LRA5166)
sâu không chết. Trong số đó, nổi bật nhất là dòng L-T
2
/21, L-T
2
/26 và L-T
2
/81
kháng sâu xanh rất cao, với tỷ lệ sâu chết lần lượt là 100%, 98% và 96,7%.
- Tính kháng sâu của 64 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống MCU9
: Số
liệu ở bảng 3.31 cho thấy, tỷ lệ sâu chết của
64 dòng chuyển gen thế hệ T

2

giống MCU9
biến động rất lớn (40-100%), tương ứng với biến động mức độ
kháng sâu từ yếu đến cao, trong khi, trên ĐC (MCU9) chỉ 3% số sâu chết. Kết
quả đánh giá cũng cho thấy, có tới 38 dòng kháng sâu cao, 17 dòng kháng trung
bình và chỉ có 9 dòng kháng yếu. Trong đó, có tới 11 dòng (M-T
2
/40, M-T
2
/44,
M-T
2
/59, M-T
2
/60, M-T
2
/62, M-T
2
/64, M-T
2
/65, M-T
2
/66, M-T
2
/67, M-T
2
/70,
M-T
2

/73) kháng sâu rất cao, với tỷ lệ gây chết sâu xanh 95-100%.
- Tính kháng sâu của 9 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống TM1
: Tương
tự kết quả đánh giá tính kháng sâu của 64 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống
MCU9, tỷ lệ sâu chết của 9 dòng chuyển gen thế hệ T
2
giống TM1 cũng biến
động rất lớn, 50,0-93,3%, tương ứng với biến động mức độ kháng từ yếu đến cao,
trong khi, trên giống ĐC (TM1) sâu không chết. Trong số đó, có 5 dòng kháng
sâu cao là T-T
2
/19 và T-T
2
/34 (80,0%), T-T
2
/35 (87,5%), T-T
2
/46 (82,0%) và T-

22
T
2
/76 (93,3%); 3 dòng kháng trung bình là T-T
2
/26 (73,3%), T-T
2

/37 (66,7%) và
T-T
2
/114 (77,7%); và 1 dòng kháng yếu là T-T
2
/16 (50%) (bảng 3.32).
Cũng như tỷ lệ kháng kháng sinh, tỷ lệ sâu chết trên các dòng chuyển gen
thế hệ T
2
rất khác nhau. Sự khác nhau này, ngoài nguyên nhân do giống, vector
chuyển gen khác nhau, thì cũng có thể do số bản sao gen và đặc biệt là vị trí gắn
kết của gen chuyển trong genom khác nhau, như kết luận của Tian et al. (1991).
Từ kết quả đánh giá tính kháng sâu xanh, đề tài chọn được 50 dòng
chuyển gen thế hệ T
2
kháng sâu cao (LRA5166: 7 dòng, MCU9: 38 dòng và
TM1: 5 dòng) (bảng 3.33). Các dòng kháng sâu cao này tiếp tục được đánh giá
tính kháng sâu bằng phương pháp nuôi thả sâu trong lồng lưới, đánh giá đặc
điểm nông sinh học ở thế hệ sau để chọn dòng kháng sâu cao và ổn định, có
năng suất cao và chất lượng xơ tốt.
3.3.3.3. Đặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuyển gen thế hệ T
2

- Đặc tính gây chết sâu: Đặc tính quan trọng nhất của các dòng chuyển
gen thế hệ T
2
là khả năng gây chết sâu. Tuy nhiên, sâu tuổi khác nhau, tỷ lệ gây
chết khác nhau. Cụ thể, các dòng chuyển gen thế hệ T
2
chủ yếu gây chết sâu

tuổi 1 (53,4%) và tuổi 2 (17,1%); gây chết rất ít sâu tuổi 3 (2,0%) và tuổi 4
(0,04%); và không gây chết sâu tuổi 5. Trong khi, tỷ lệ sâu chết trên ĐC rất
thấp (tỷ lệ sâu chết tuổi 1 là 0,9%, tuổi 2: 0,2%, tuổi 3: 0,2% và không có sâu
tuổi 4-5 chết) (bảng 3.34).
Bảng 3.34. Tỷ lệ sâu chết và sống sót ở các tuổi khi ăn lá của 87 dòng
chuyển gen thế hệ T
2
(tại Nha Hố, năm 2009 và 2010)
Giống
Tỷ lệ sâu chết (%)
Tỷ lệ sâu sống (%)
T
1

T
2

T
3

T
4

Tổng
cộng
T
2

T
3

T
4

T
5

Tổng
cộng
Coker312
37,0
12,0
1,0
0
50,0
6,0
16,0
26,0
2,0
50,0
SSR60F
32,8
29,6
2,0
0
64,4
6,4
16,4
12,4
0,4

35,6
LRA5166
74,8
13,5
3,3
0,2
91,8
0,6
4,1
2,3
1,2
8,2
MCU9
64,9
12,7
2,1
0
79,7
3,6
10,4
5,8
0,5
20,3
TM1
57,7
17,5
1,5
0
76,7
10,8

12,3
0,2
0
23,3
Trung bình
53,4
17,1
2,0
0,04
72,5
5,5
11,8
9,3
0,8
27,5
ĐC

0,9
0,2
0,2
0
1,3
0
0
17,6
81,1
98,7
Ghi chú: ĐC là số liệu trung bình của 5 giống Coker312, SSR60F, LRA5166,
MCU9 và TM1 không chuyển gen

23
Từ đặc tính gây chết sâu xanh, đề tài đề nghị, khi trên đồng ruộng tồn tại
sâu xanh tuổi 1-2, thì không cần phải sử dụng biện pháp phòng trừ, còn nếu tồn tại
sâu xanh tuổi 3-4, thì có thể cần phải phòng trừ bổ sung bằng thuốc hóa học để
bảo vệ cây bông chuyển gen Bt.
- Đặc
tính
ức chế sinh trưởng sâu: Ngoài đặc tính gây chết sâu, các dòng
chuyển gen thế hệ T
2
còn biểu hiện tính kháng sâu ở khả năng ức chế sinh
trưởng sâu. Kết quả số liệu thu được ở bảng 3.34 cho thấy, vẫn có sâu sống sót
khi ăn lá các dòng chuyển gen thế hệ T
2
, với tỷ lệ sâu sống trung bình là 27,5%.
Tuy nhiên, sâu sống sót chủ yếu ở tuổi 3 (11,8%), tuổi 4 (9,3%) và tuổi 2
(5,5%), rất ít sâu tuổi 5 sống sót (0,8%). Trong khi, trên ĐC, tất cả sâu sống qua
tuổi 4 (17,6%) và tuổi 5 (81,1%).
Kết quả nghiên cứu đặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuyển gen
thế hệ T
2
tương tự kết quả của
Wang et al. (2004), cụ thể là “cây bông chuyển
gen Bt có độc tính cao với sâu tuổi nhỏ, ức chế sinh trưởng và phát triển sâu
sống sót” và “tỷ lệ chết của sâu mới nở và sâu tuổi 1 cao hơn, tỷ lệ chết của sâu
tuổi 2 và tuổi lớn hơn giảm đáng kể”.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1) Tái sinh thành công (i) 3 giống bông SSR60F, Coker310 và Coker312

bằng phương pháp tái sinh thông qua tạo phôi soma, với tỷ lệ tạo phôi soma
29,5-61,4% (SSR60F), 84,8-100% (Coker310) và 52,3-86,7% (Coker312); và
(ii) 3 giống bông LRA5166, VN36P và C118 bằng phương pháp tái sinh thông
qua tạo đa chồi, trong đó, giống LRA5166 dễ tái sinh hơn, với tỷ lệ tạo cụm
chồi 76% và số chồi/cụm 6,7 chồi. Phương pháp tái sinh thông qua tạo đa chồi
đơn giản, hiệu quả, có thời gian (5-6 tháng) ngắn hơn so với tái sinh thông qua
tạo phôi soma (9-10 tháng).
2) Xác định được một số thông số thích hợp cho chuyển gen thông qua A.
tumefaciens vào 2 giống bông Coker312 và SSR60F, gồm: (i) nồng độ hygromycin
để cảm ứng mô sẹo là 12,5 mg/l và để nhân mô sẹo chuyển gen là 10 mg/l; (ii)
nồng độ cefotaxime để ức chế A. tumefaciens là 500 mg/l; (iii) mật độ tế bào
OD
600
= 0,35 và thời gian nhiễm A. tumefaciens 5-10 phút; (iv) thời gian đồng
nuôi cấy 48 giờ; và (v) nhiệt độ đồng nuôi cấy 21
0
C.