phân lập acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất (achyranthes bidentata blume) và tinh chế làm chất chuẩn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





HỒ THỊ THU HƯƠNG






PHÂN LẬP ACID OLEANOLIC TỪ RỄ CÂY NGƯU TẤT
(Achyranthes Bidentata Blume) VÀ TINH CHẾ LÀM CHẤT CHUẨN







Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
Mã số chuyên ngành: 604429



LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ XUÂN MAI








Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2012
LỜI CẢM ƠN

Vô cùng bố mẹ và các anh chị trong gia đình, những người đã nuôi dạy cho tôi
thành người hôm nay.
Chân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Mai,
người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu; chân thành cảm ơn
các thầy cô bộ môn Hóa phân tích nói riêng và khoa hóa nói chung, đã truyền đạt
nền tảng kiến thức sâu rộng trong những năm được học dưới mái trường Đại học
Khoa học tự nhiên này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Ths. Dược sĩ Phạm Thị Hồng Nhung, trưởng
phòng khoa Kiểm nghiệm Mỹ Phẩm, cảm ơn chị đã giúp tôi trong quá trình thực
hiện luận văn.
Và tôi xin chân thành cảm ơn các chị, các bạn đồng nghiệp viện Kiểm nghiệm
thuốc Tp. Hồ Chí Minh, và các bạn trong khoa Hóa đã nhiệt tình ủng hộ, động viên
tôi trong suốt thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người.

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
MS: Mass Spectroscopy
IR: Infrared Spectroscopy
NMR: Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
DEPT: Distortionless Enhancement By Polarization Transfer
HMBC: Heteronuclear Multiple – Bond Correlation Spectroscopy
HSQC: Heteronuclear Single – Quantum Correlation Spectroscopy
COSY: Correlation Spectroscopy
TLC: Thin Layer Chromatography
HPLC: High Performance of Liquid Chromatography
UFLC: Ultra Fast of Liquid Chromatography
DMSO: Dimethyl Sulfoxid
m: multies
s: single
d: douplet
dd: douplet-douplet
HCl: acid hydrochloric
H
2
SO
4
: acid sulfuric
C: chuẩn đối chiếu
NL: chuẩn nguyên liệu thu được
T: mẫu thử
DĐVN: dược điển Việt Nam.

Danh mục các bảng
Bảng 1. Hàm lượng Oleanolic acid (OA) trong từng bộ phận khác nhau của cây
ngưu tất thay đổi theo thời gian
Bảng 2. Hiệu suất chiết acid oleanolic từ cao và dược liệu rễ cây ngưu tất
Bảng 3. Dữ liệu phổ của hợp chất 5 và acid oleanolic trong dung môi DMSO-
d
6

Bảng 4. Kết quả định lượng acid oleanolic nguyên liệu bằng phương pháp
HPLC
Bảng 5. Kết quả định lượng acid oleanolic nguyên liệu bằng phương pháp đo
quang UV-VIS
Bảng 6. Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống của phương pháp với 6 lần
tiếm chuẩn đối chiếu và 6 lần tiêm chuẩn nguyên liệu.
Bảng 7. Kết quả độ lặp của phương pháp với 6 mẫu thử tính toán dựa trên
phương trình tuyến tính của dung dịch chuẩn đối chiếu
Bảng 8. Kết quả độ lặp của phương pháp với 6 mẫu thử tính toán dựa trên
phương trình tuyến tính của dung dịch chuẩn nguyên liệu
Bảng 9. Kết quả độ đúng của phương pháp với dung dịch thêm vào là chuẩn đối
chiếu
Bảng 10. Kết quả độ đúng của phương pháp với dung dịch thêm vào là chuẩn
nguyên liệu
Bảng 11. Kết quả xác định hàm lượng acid oleanolic trong thuốc thử dựa trên

phương trình hồi quy của chất đối chiếu.
Bảng 12. Kết quả xác định hàm lượng acid oleanolic trong thuốc thử dựa trên
phương trình hồi quy của chất chuẩn nguyên liệu.







MỤC LỤC
Trang
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Mở đầu 1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN
1.1 Mô tả thực vật về cây ngƣu tất 3
1.1.1 Phân loại và mô tả hình thái 3
1.1.2 Nơi sống và thu hái 4
1.1.3 Bộ phận dùng 4
1.1.4 Thành phần hóa học 5
1.1.5 Công dụng và tính vị 6
1.2 Sơ lƣợc về saponin 9
1.3 Phản ứng thủy phân saponin 11
1.4 Acid oleanolic 12
1.5 Tình hình nghiên cứu 13
Chƣơng 2-NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17
2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị 19

2.3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.3.1 Chuẩn bị mẫu dƣợc liệu 20
2.3.2 Tối ƣu quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất …21
2.3.3 Tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu
đƣợc song song với chuẩn đối chiếu 23
2.3.4 Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng xác định acid oleanolic
trong mẫu thử bằng chuẩn oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn đối
chiếu bằng phƣơng pháp UV-VIS và HPLC 24
Chƣơng 3-KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Kết quả chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất 26
3.2 Kết quả tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu
đƣợc song song với chuẩn đối chiếu 30
3.3 Xây dựng phƣơng pháp và thẩm định qui trình xác định acid oleanolic
bằng phƣơng pháp HPLC/PDA 39
3.4 Định lƣợng mẫu thử bằng phƣơng pháp HPLC, với chuẩn nguyên liệu
song song với chuẩn đối chiếu 45
Chƣơng 4-KẾT LUẬN 50
Tài liệu tham khảo 51
Phụ lục

Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1. Cây và bộ phận rễ của ngưu tất
Hình 2. Hình vi phẫu rễ cây ngưu tất
Hình 3. Sơ đồ chung về quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất
Hình 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Hình 5. Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần
Hình 6. Kết quả khảo sát nồng độ acid
Hình 7. Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân
Hình 8: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân
Hình 9. Kết quả kiểm tra các phân đoạn thu được
Hình 10. Quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất

Hình 11. Kết quả chấm sắc kí của NL1 với chuẩn acid oleanolic.
Hình 12. Cấu trúc của hợp chất NL1
Hình 13. Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (đường kẻ đậm) của hợp
chất NL1














1
MỞ ĐẦU

Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đã có từ rất lâu đời…, cây cỏ vừa gần
gũi, thân thiện và dễ sử dụng, nên rất được người dân ưa dùng. Có những loại
thảo dược được xem là những cống phẩm quý hiếm như linh chi, nhân sâm
ngàn năm…
Có rất nhiều vị danh y nổi tiếng như Hoa Đà ở Trung Hoa, Hải Thượng
Lãn Ông ở Việt Nam thời phong kiến,… , họ đã nghiên cứu, và tìm ra những
phương pháp chữa bệnh bằng những loài cây cỏ dại sống xung quanh chúng ta.
Cho đến ngày nay, tiếp nối những gì người xưa để lại, khoa học nghiên
cứu những thảo dược ngày càng mở rộng, kho thảo dược ngày càng đa dạng và

phong phú.
Khoa học hiện đại không chỉ quan tâm các tính năng dược lí, mà còn
nghiên cứu chuyên sâu các thành phần hợp chất có trong từng bộ phận của cây,
phân lập các hợp chất, mang lại nhiều giá trị to lớn.
Nói đến ngưu tất, ít người biết cây dược liệu này có tác dụng hạ
cholesterol máu và hạ huyết áp, một trong những căn bệnh phổ biến, xuất hiện
ở nhiều lứa tuổi, và là căn bệnh khó chữa hiện nay. Loài cây này được du nhập
từ Trung Quốc, và hiện nay đã trồng thành công ở nước ta.
[1,3]
Acid oleanolic là sản phẩm thủy phân từ saponin có trong phần lớn thực
vật như cây cỏ xước, hạt gấc, hoa tỳ bà,… và trong cây ngưu tất, đặc biệt có
nhiều trong phần rễ của cây ngưu tất. Nó có tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống
oxi hóa, chống tác nhân gây khối u.
[4,5]
Trên thị trường đã đưa ra nhiều chế phẩm mà thành phần có saponin của
rễ cây ngưu tất, trong đó có chế phẩm dùng để làm thuốc hạ cholesterol máu
cao.
Điều đó thật đáng mừng, tuy nhiên, thuốc chữa bệnh phải ở hàm lượng
cho phép, nếu hàm lượng quá cao sẽ ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe của
người sử dụng.
2
Do đó, để kiểm tra cũng như giám sát chất lượng của các thành phẩm
này, chúng tôi đã nghiên cứu chiết xuất acid oleanolic trong rễ cây ngưu tất
dùng làm chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm.
Vì vậy, cần tìm ra phương pháp chiết đơn giản để có thể phân lập được
acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và sử dụng như chất chuẩn để đánh giá những
sản phẩm bán thành phẩm. Nên tên đề tài của chúng tôi là “Phân lập acid
oleanolic từ rễ cây ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) và tinh chế làm
chất chuẩn”.
Với hai mục tiêu chính:

1. Phân lập chất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và tinh chế, đánh giá
chuẩn, để:
- Phục vụ nguồn chất chuẩn trong phân tích kiểm nghiệm.
- Bổ sung nguồn thư viện tài liệu về ngưu tất.
2. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích xác định acid oleanolic
bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.









3
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1 Mô tả thực vật về cây ngƣu tất [1,2,3]
1.1.1 Phân loại và mô tả hình thái
Ngưu tất - Achyranthes bidentata Blume, thuộc họ Rau dền -
Amaranthaceae.
Mô tả: Cây thảo, sống nhiều năm, cao 60 – 80 cm hoặc hơn. Rễ hình
trụ dài, có nhiều rễ phụ to. Thân mảnh, có cạnh, phình lên ở những đốt, màu
lục hoặc nâu tía. Cành thường mọc hướng lên gần như thẳng đứng. Lá mọc
đối, hình bầu dục hoặc hình mác, dài 5-10 cm, rộng 1-4 cm, gốc thuôn hẹp,
đầu rất nhọn, hai mặt nhẵn, mép nguyên đôi khi uốn lượn, gân lá mặt trên
thường có màu nâu tía. Cuống lá dài 1-1,5 cm. Cụm hoa mọc ở nhọn thân và
kẽ lá đầu cành thành bông, dài 2-5 cm. Hoa thường gập xuống, sát vào cuống
của cụm hoa. Lá bắc dài 3mm. Lá dài 5 mm, gần bằng nhau. Nhị, chỉ nhị dính
với nhau vào dính cả với nhị lép. Nhị lép có răng rất nhỏ, bao phấn hình mắt

chim. Bầu hình trứng. Quả hình bầu dục, có một hạt. Cây cho hoa vào khoảng
từ tháng 5-9 và cho quả tháng 10-11.

Hình 1. Cây và bộ phận rễ của ngưu tất.
1.1.2 Nơi sống và thu hái
Cây ngưu tất hiện nay được trồng thành công ở nước ta, dược liệu
đủ dùng trong cả nước và xuất khẩu.
4
Ngưu tất là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong Y học cổ
truyền với nhu cầu ngày càng tăng, được nhập trồng vào nước ta từ những
năm 1960. Hiện nay đã thích hợp với điều kiện nước ta và phát triển tốt,
được trồng ở nhiều nơi nhất là đồng bằng Bắc bộ như: xã Tân Quang,
huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên; thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu, tỉnh
Hưng Yên; xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm; Trung tâm nghiên cứu cây trồng
và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác.
Cây trồng được cả ở trên núi cao lẫn đồng bằng. Thu hái vào mùa
đông xuân, phơi tái rồi ủ đến khi nhăn da (6-7 ngày), xông diêm sinh, sấy
khô. Dùng sống hoặc sao tẩm rượu.
Trong các bộ phận của cây ngưu tất, thì rễ ngưu tất có tác dụng y
học lớn, và ngày nay, các sản phẩm bắt nguồn từ rễ ngưu tất khá nhiều. Do
đó, những nghiên cứu về rễ ngưu tất rất cần thiết. Ngoài ra, trong rễ ngưu
tất có các hoạt chất có chức năng trị bệnh.
1.1.3 Bộ phận dùng
Bộ phận dùng: Rễ - Radix Achyranthis Bidentatae.
Rễ hình trụ tương đối thẳng, dài 20-30 cm, đường kính 0,5-1 cm. Ðầu
trên mang vết tích của cổ rễ, đầu dưới hơi thuôn nhỏ. Mặt ngoài màu vàng đất
hay nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con.
Vi học
 Ðặc điểm vi phẫu
Mặt cắt rễ gần tròn. Từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm các tế bào

nhỏ, dẹt, xếp thành dãy đồng tâm và xuyên tâm, phần ngoài có nhiều chỗ bị
bong ra. Mô mềm vỏ cấu tạo từ những tế bào đa giác thành mỏng xếp lộn xộn.
Libe-gỗ xếp thành từng bó, mỗi bó có libe phía ngoài, mạch gỗ ở phía trong.
Các bó libe-gỗ xếp rải rác thành bốn vòng đồng tâm, ở tâm các bó libe-gỗ có
hình tam giác xếp sát nhau tạo thành những hình quạt.
 Ðặc điểm bột dược liệu
5
Bột màu nâu nhạt, mùi hơi hắc, vị ngọt sau đắng. Soi dưới kính hiển vi
thấy: Mảnh bần, mảnh mô mềm thành mỏng, nhiều mảnh mạch điểm, tinh thể
calci oxalat hình cầu gai kích thước 0,03-0,04mm và những mảnh vỡ hình
khối của các tinh thể này
1.1.4 Thành phần hóa học [2]

Rễ chứa saponin triterpen, khi thủy phân cho ra genin là acid
oleanolic, các sterol ecdysteron, inokosteron. Với acid oleanolic chiếm
0,096%, saponin toàn phần 4,04% và acid oleanolic α -L-
rhamnopyranosyl- β -D- galactopyranosid. Rễ còn chứa ecdysteron
và inokosteron. Hàm lượng ecdysteron khoảng 0,037%.
Rễ ngưu tất chứa một saccharid là fructan mạch ngắn với mức độ trùng
hợp trung bình là 8. Chất saccharid này có tác dụng cải thiện hệ miễn dịch.
Rễ còn có một peptidpolysaccharid trong đó 24,1% là peptid bao gồm
glycin, serin, acid glutamic và acid aspartic. Chất peptidpolysaccharid này có
tác dụng miễn dịch.
Betain có trong rễ với hàm lượng 0,93-1,029% đã được chứng minh là
ổn định trong quá trình chế biến. Rễ khô còn có emodin và physcion.
Theo một nghiên cứu sự phân bố Saponin Triterpenoid trên các bộ
phận của cây ngưu tất của Jinting Li và Zhenghai Hu, “ Accumulation and
Dynamic Trends of Triterpenoid Saponin in Vegetative Organs of
Achyranthus bidentata”, thì hàm lượng acid oleanolic có trong các bộ phận
nghiên cứu trên cùng một cây có sự khác nhau như sau:

6
Bảng 1. Hàm lượng Oleanolic acid (OA) trong từng bộ phận khác nhau của
cây ngưu tất thay đổi theo thời gian [8]
Thời gian thu hoạch mẫu Hàm lượng của OA (%)
Rễ Thân Lá
Tháng tám 7.76 4.09 4.13
Tháng chín 1.03 2.76 3.37
Tháng mười 2.95 1.17 0.25
Tháng mười một 2.90 1.09 0.06
Tháng mười hai 2.59 1.47
1.1.5 Công dụng và tính vị
Tác dụng dƣợc lý:
- Kháng viêm rõ rệt đối với giai đoạn cấp tính và mạn tính của phản ứng
viêm thực nghiệm. Rễ ngưu tất có tác dụng mạnh hơn khoảng 4 lần so với rễ
cỏ xước.
- Gây thu teo tuyến ức chuột cống đực non. Tác dụng gây thu teo tuyến ức
là một trong những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch. Rễ ngưu tất có tác
dụng mạnh hơn khoảng 8 lần so với rễ cỏ xước. Có mối tương quan song song
giữa tác dụng kháng viêm và tác dụng gây thu teo tuyến ức của rễ Ngưu tất.
- Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây tăng
cholesterol từ ngoài vào và gây ức chế sự tổng hợp cholesterol trong cơ thể
thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt trên mèo, mức độ hạ áp từ từ, thời gian tác dụng
kéo dài. Có độc tính thấp.
- Chế phẩm Solamin trong thành phần có ngưu tất và một số dược liệu khác
đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụng chống viêm
và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng. Kết quả tốt nhất và tương đối nhanh đối với
đau lưng cấp do lạnh và sang chấn. Ðối với viêm đa khớp dạng thấp, chưa có
biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn thuần, tác dụng điều trị
tương đối tốt. Khi đã có biến dạng về xương, cơ, khớp, kết quả kém. Thuốc
không gây tác dụng phụ đáng kể.

Công dụng
7
Ngưu tất dạng sống chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đi tiểu rát buốt,
tiểu ra máu hoặc sỏi, bế kinh, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau
thai không ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu
gối nhức mỏi.
Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân
co quắp hoặc bại liệt.
Ngày dùng 6-12 g dạng thuốc sắc hoặc bột.
- Kiêng kị: phụ nữ có thai, băng huyết không nên dùng ngưu tất.
Trong y học Trung Quốc, rễ ngưu tất với liều 5-12 g dưới dạng nước sắc
được sử dụng làm thuốc phục hồi sức lực, lợi tiểu, chữa bế kinh, đau
kinh, tăng huyết áp, thấp khớp, sỏi đường tiết niệu, viêm họng, viêm
amidan. Ngoài ra, nó còn được dùng làm thuốc kích thích tình dục, tráng
dương, chữa liệt dương, gây sảy thai. Dùng ngoài, nước sắc 20% ngưu
tất chữa các bệnh về da chân và các móng (bệnh nấm biểu bì). Hạt được
dùng làm thuốc chống độc, chữa thấp khớp, hen phế quản (phối hợp với
một số dược liệu khác). Phụ nữ có thai không được dùng.
Theo Đông y, ngưu tất có vị chua, hơi đắng, tính bình không độc, vào 2
kinh can và thận, có tác dụng làm tan máu ứ, bớt sưng tấy, đau nhức, chống
co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt.
Sau đây là bốn bài thuốc của cố Lương y Lê Trần Đức đã được thử
nghiệm, có hiệu quả tốt.
1. Ngưu tất dùng độc vị ngày 40 – 60g sắc uống nhiều lần chống co
giật, bại liệt, phong thấp teo cơ, xơ vữa mạch máu.
2. Rượu thuốc: Ngưu tất 100g, huyết giác 50g, sâm đại hành 30g. Ngâm
trong rượu 30 – 400 ml. Từ 10 ngày trở lên, mỗi ngày uống 1 – 2 lần,
mỗi lần 1 chén (10 – 15ml). Chữa các chứng bị thương máu tụ ở
ngoài, hoặc bị ngã máu ứ ở trong hoặc đi xa về chân tay nhức mỏi.
3. Thang an thần: Ngưu tất 30g, hạt muồng sao 20g. Sắc uống mỗi ngày

1 thang, chữa các chứng bốc nóng, nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, ù
tai, tăng huyết áp cao, rối loạn tiền đình, khó ngủ, đau nhức dây thần
kinh, rút gân, co giật, táo bón.
8
4. Thang tiết niệu: Ngưu tất 30g, rễ cỏ tranh, mã đề, mộc thông, huyết
dụ, lá móng tay, huyết sâm đều 15g sắc uống.
Chữa các chứng viêm cầu thận cấp, phù thũng, đái đỏ, đái són, viêm gan
vi rút, đái vàng thẫm, da vàng, viêm bàng quang, đái ra máu.
Rễ ngưu tất đã được GS Đoàn Thị Nhu và cộng sự chứng minh có tác
dụng hạ cholesterol máu và có tác dụng hạ huyết áp. Viện Dược liệu (Bộ Y
tế Việt Nam) đã sản xuất cao toàn phần bào chế dưới dạng viên được đem
thử tại Viện Bảo vệ sức khỏe người cao tuổi do GS Phạm Khuê và các
cộng sự thực hiện và đã đi đến kết luận sau:
- Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu trên 65% số bệnh
nhân có cholesterol máu cao được điều trị.
- Ngưu tất có tác dụng làm giảm tỉ lệ β/α lipoprotein máu ở 82% số
bệnh nhân có tỉ lệ β/α lipoprotein máu cao điều trị.
- So sánh với Clofibrat (một loại thuốc hóa học được dùng phổ biến
điều trị các bệnh nhân trên) thì tác dụng hạ cholesterol máu cao hơi
yếu hơn, còn tác dụng hạ tỉ lệ β/α lipoprotein thì gần tương đương.
Phạm Kim Mãn (luận án phó tiến sĩ 1992) đã nghiên cứu đưa ra chế
phẩm “Bidentin” mà thành phần có saponin của rễ ngưu tất cộng với chất phụ
gia để làm thuốc hạ cholesterol. Thuốc đã được thử lâm sàng có kết quả tốt,
thuốc ổn định và không gây tác dụng phụ.
Gần đây, một nam dược mới được nghiên cứu là có tác dụng điều hòa
huyết áp, với ba dược liệu gồm ngưu tất, sơn tra, nhân trần, với tên gọi an
mạch ích nhân, đang được bán rộng rãi trong khắp cả nước.
Tính vị: Ngưu tất có vị đắng, chua mặn, tính bình; có tác dụng bổ can thận,
mạnh gân cốt, phá ứ huyết, tiêu ung độc.
Ngưu tất đã được chính thức đưa vào Dược điển II Việt Nam tập 3

năm 1994.
Khi nghiên cứu về rễ cây ngưu tất, người ta nghiên cứu thành phần
hóa học có trong rễ. Trong rễ ngưu tất có chứa saponin triterpenoid.
9
1.2 Sơ lƣợc về saponin [2]
Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi
trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao.
Saponin có một số tính chất đặc biệt:
- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng
nhũ hoá và tẩy sạch.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
- Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên
làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân
mềm như giun, sán, ốc sên.
- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu;
liều cao gây nôn mửa, đi lỏng.
- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b-hydroxysteroid
khác.
Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ:
sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với
cholesterol.
Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam
thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium
vulgare có vị ngọt.
Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do
đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì
acetat, bari hydroxyd, ammoni sulfat.
Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh
hơn saponin.
Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin

triterpenoid và saponin steroid. Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và
loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm.
Saponin triterpenoid:
Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen.
Người ta chia làm 2 loại:
Saponin triterpenoid pentacyclic: loại này chia ra các
nhóm: olean, ursan, lupan, hopan.
a - Nhóm olean (I) : Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên
đều thuộc nhóm này. Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn
10
chất của 3-b-hydroxy olean 12- ene, tức là b-amyrin. Một vài aglycon
làm ví dụ (công thức A):
o Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH
3
, R3 = -COOH.
o Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH
3
, R1 = -CH
2
OH , R3 = -
COOH
o Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = -CH
3
, R1 = -CHO , R3 = -
COOH.
Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch
đường nối vào C-28 theo dây nối ester. Gần đây người ta phân lập
được các saponin có đến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng
một mạch có thể đến 6 đơn vị đường.
b - Nhóm ursan (II): Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm

olean chỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà
lại đính ở vị trí C-19.
c - Nhóm lupan (III): Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D
giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở
ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí 20-29
d - Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D
giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở
ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17.
Saponin triterpenoid tetracyclic: có 3 nhóm chính là Dammaran,
Lanostan và Cucurbitan
a - Nhóm dammaran(V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm. Phần
aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh. Khi tác dụng bởi acid thì
mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran. Hai genin
chính là:protopanaxadiol và protopanaxatriol.
Phần đường nối vào OH ở carbon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch
nữa nối vào OH ở mạch nhánh.
Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong
hạt táo (Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.)
Wettst.
b - Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, một trong những saponin có
trong các loài hải sâm - Holothuria spp. là một ví dụ của nhóm này.
11
c/ Nhóm cucurbitan (VII). Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp
trong họ Cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH
3
góc thay vì ở vị trí C10 lại
đính ở C9.
Saponin steroid:
Nhóm spirostan: sarsasapogenin, smilagenin, tigogenin
Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu

quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai sapogenin quan trọng nhất
là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu
trong các loài Agave).
Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan
chỉ khác là vòng F bị biến đổi.
Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp
sarsaparillosid nói ở trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH
2
.
Nhóm spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy
của vòng F được thay bằng NH.
Nhóm solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này.
Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có
chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những
chất glycoalcaloid.
Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin
steroid có cấu trúc mạch nhánh khác
1.3 Phản ứng thủy phân saponin
Saponin là một glycosid. Sự thủy phân các glycosid để cho ra phần
đường và phần aglycon dễ hay khó tùy thuộc vào nối glycosid (C-glycosid
hay O-glycosid), loại đường (-uronic hay ose), kiểu mạch đường (biose nối
1-2 hay biose nối 1-6) hay vị trí gắn đường với khung.
Các tác nhân thủy phân thường là kiềm, acid hoặc enzym
Trong việc nghiên cứu saponin, nhất là đối với những hợp chất mới,
người ta hay chiết xuất sapogenin. Vì saponin thường khó phân lập, khó
kết tinh, và việc phân tích cấu trúc phần đường cũng khó. Hơn nữa, quá
trình phân tích cấu trúc saponin cũng cần phải tách sapogenin để xác định.
Vậy, muốn có sapogenin toàn phần, người ta phải thủy phân saponin toàn
12
phần, loại bỏ phần ose bằng phương pháp thích hợp sau đó phân lập các

sapogenin riêng biệt từ hỗn hợp sapogenin toàn phần bằng các phương
pháp như sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng điều chế. Tùy theo độ bền của liên kết
glycosid mà sự thủy phân có thể thay đổi tác nhân :
-
Thủy phân bằng acid: nếu phần aglycon bền vững với tác nhân thủy
phân, dùng tác nhân thủy phân mạnh như: HCl 5% - HCl 18% trong 5 giờ
đến 6 giờ ở 100
o
C, hoặc H
2
SO
4
10%, 25% đun trong cồn, HClO
4
70%
trong methanol với tỷ lệ 1:10, hỗn hợp Kiliani gồm (HCl đậm đặc: acetic:
nước) (10: 35:55) ở 100
o
C trong 1 giờ, [2]

- Thủy phân bằng enzym: nếu phần aglycon dễ bị biến đổi trong quá
trình thủy phân, dùng tác nhân thủy phân nhẹ nhàng như phương pháp
Shibata dùng acid acetic 50% đun ở 70
o
C trong 6 giờ, hoặc dùng enzym
(ß-glucosidase, glucuronidase) trong môi trường acid acetic hoặc môi
trường đệm phosphat.
Sản phẩm của phản ứng thủy phân, chiết tách lỏng-lỏng với dung
môi methylen chloric để thu được acid oleanolic.
1.4 Acid oleanolic

Acid oleanolic là một aglycon phổ biến trong các loại thực vật, thuộc phân
nhóm olean triterpen
Tác dụng dược lý:
+ Bảo vệ tế bào gan do ức chế emzym gan Cyp P450 [9]
+ Tác dụng chống tác nhân gây khối u: acid ursolic và acid oleanolic
ức chế TPA một chất hoạt hóa thể EBV tại tế bào Raij [15]
+ Tác dụng chống một số tác nhân gây độc cho gan và được dùng
trong điều trị viêm gan ở Trung Quốc: thử nghiệm trên chuột nhắt với acid
oleanolic chống lại tác nhân gây độc là Cadmium bằng cách kích thích sản
xuất metallothionein [11], và giảm tác dụng độc của acetaminophen bằng
cách tăng hoạt tính alanin aminotrsferase và sorbitol dehyrogenase [10]
13
+ Tác dụng chống HIV invitro trên tế bào đơn nhân ở người đã được
gây nhiễm [13]
+ Tác dụng ức chế α- glucosidase của acid oleanolic và dẫn chất tổng
hợp của acid oleanolic[16]
Một số dược liệu có thành phần là acid oleanolic: trái bồ kết, cây ngưu
tất, cây ngưu tất nam ( cỏ xước), hạt gấc,
1.5 Tình hình nghiên cứu về acid oleanolic
- Qui trình chiết xuất
Trong Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Dược liệu, trang 847 giới
thiệu sơ lược về cây ngưu tất, chiết xuất acid oleanolic và định tính bằng
sắc ký lớp mỏng trong dược liệu. Quy trình chiết xuất oleanolic như sau:
2g ngưu tất chiết với ethanol 96 %, lấy dịch lọc đem thủy phân
bằng acid HCl 10 %, cách thủy 80
o
C, thêm một ít nước pha loãng dịch
chiết rồi chiết với chloroform, thu gom phần dịch chiết cloroform cho
bay hơi tới cắn. Hòa tan cắn trong ethanol 96
o

, định tính bằng sắc kí lớp
mỏng [2]
Trong một báo cáo luận văn dược sĩ đại học, đề tài nghiên cứu và đánh
giá cao ngưu tất, chúng tôi tham khảo được quy trình chiết xuất và đánh giá
cao ngưu tất dựa trên định lượng acid oleanolic như sau:
Rễ ngưu tất + methanol 80 %, nhiệt độ 80
o
C trong 4 giờ, bay
hơi dịch chiết tới cắn rồi hòa tan bằng một ít nước nóng, sau đó chiết với
n-buthanol bão hòa nước. Đem cô cạn dịch chiết, và thủy phân bằng
acid sulfuric 20 %, dịch thủy phân đem chiết với methylen chloric. Sau
đó, hòa tan cắn trong methanol và tiến hành định lượng bằng phương
pháp HPLC.
Luận văn dược sĩ đại học của Nguyễn Kim Ngọc Duyên, nghiên cứu
phương pháp chiết xuất và sơ bộ định lượng acid oleanolic trong cao cồn
14
gấc. Quy trình chiết xuất oleanolic và phương pháp định lượng tham khảo
được từ bài viết:
Hạt gấc xay thô ngấm kiệt với xăng công nghiệp loại béo, sau đó
chiết ngấm kiệt với cồn 90 %. Cao cồn được đem thủy phân bằng acid
sulfuric 10 %, trong 3 giờ, lấy dịch thủy phân chiết với cloroform, thu
gom phần tan trong cloroform cho bay hơi tới cắn. Hòa tan cắn
cloroform cho chạy qua cột rồi định lương bằng phương pháp HPLC.
Các nghiên cứu đề cập đến phương pháp chiết cũng như định lượng acid
oleanolic từ nhiều loại cây khác nhau, trong đó có bài viết chiết tách và xác
định cây ngưu tất nam (cỏ xước), với quy trình chiết như sau:
Cỏ xước được chiết với methanol, thủy phân cao methanol bằng
HCl 2M, trong 2 giờ, cách thủy 100
o
C, sau đó chiết qua methanol.[14]

- Định tính bằng sắc ký bản mỏng [2]
- Dung môi chạy sắc ký: (chloroform: Methanol) (40:1)
- Bản mỏng silicagel 60 GF 254.
- Thuốc thử phun màu: dung dịch acid phosphomolybdic 5% trong
ethanol
- Nhiệt độ lên màu: 120
o
C
- Dung dịch chuẩn: 1mg/ 5ml.
o Qui trình định lƣợng
Định lượng acid oleanolic trong đối tượng thực vật thường được thực
hiện bằng phương pháp HPLC
Điều kiện HPLC định lượng acid oleanolic trong cao ngưu tất
- Cột: prontosil LC8 ( 150 x 4,6 mm; 3 µm)
- Pha động: (acetonitril: nước) ( 72 : 28)
- Đầu dò : PDA 203 nm
- Tốc độ dòng : 0,785 ml/ phút
15
- Thể tích tiêm : 20 µl
Điều kiện HPLC định lượng acid oleanolic trong đối tượng cao gấc
[5]:
- Cột: Lichrosorb RP8 ( 150 x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động : [acetonitril : nước (pH 3_ chỉnh bằng H
3
PO
4

1%)] ( 60: 40)
- Đầu dò : DAD 206 nm
- Tốc độ dòng : 1,2 ml/ phút

- Thể tích tiêm : 20 µl
Điều kiện HPLC định lượng acid oleanolic trong đối tượng hoa tỳ bà diệp,
họ hoa hồng [21]:
- Cột: RP C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động : [methanol : đệm phosphat 0,03 mol/l (pH 2,8_
chỉnh bằng H
3
PO
4
1%)] ( 88: 12)
- Đầu dò : UV 210 nm
- Tốc độ dòng : 1,0 ml/ phút
- Thể tích tiêm : 10 µl
Một số công trình nghiên cứu về định lượng acid oleanolic khác như:
- Định lượng nhanh acid oleanollic trong viên nén bằng HPLC dùng cột
ultrasphere-ODS, pha động methanol:nước [12]
- Định lượng đồng thời acid oleanolic và acid ilrolic bằng HPLC dùng
cột Shim-pack CLC-ODS, pha động MeOH: H
2
O: AcOH: TEA [20]
- Định lượng acid oleanolic bằng HPLC sử dụng cột tách RP 18, pha
động acetonitril: nước ( 60:40 ), bước sóng 210 nm [16]
- Định lượng acid oleanolic trong rễ ngưu tất bằng phương pháp sắc kí
mao quản SFC ( sắc kí lỏng siêu tới hạn)[19]
16
- Định lượng acid oleanolic bằng phương pháp đo quang ở vùng 230
nm đến 350 nm với cả hai dung môi cho acid oleanolic trong acetic
băng ( λ max = 256 nm) và trong ethanol (λ max = 277 nm)[18].
 Tóm lại, từ những nguồn tài liệu tham khảo dẫn ra ở mục trên, chúng tôi
lựa chọn một số qui trình sau sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu:

Định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với các điều kiện theo
chuyên luận DĐVN IV [2]
- Dung môi chạy sắc ký: (chloroform: Methanol) (40:1)
- Bản mỏng silicagel 60 GF 254.
- Thuốc thử phun màu: dung dịch acid phosphomolybdic 5% trong
ethanol
- Nhiệt độ lên màu: 120
o
C
- Dung dịch chuẩn: 1mg/ 5ml.
Qui trình định lượng bằng phương pháp đo quang UV-VIS:
Định lượng acid oleanolic bằng phương pháp đo quang ở vùng 230
nm đến 350 nm cho cả hai dung môi là acid oleanolic trong acetic băng ( λ
max = 256 nm) và trong ethanol (λ max = 277 nm) [18].
 Tuy nhiên, trong trường hợp này, chúng tôi sử dụng dung môi là
methanol, áp dụng phương pháp đo quang ở vùng 190 nm đến 350 nm,
và định lượng ở bước sóng 215 nm.
Điều kiện HPLC định lượng acid oleanolic dựa theo tài liệu [21] và có
điều chỉnh cho phù hợp:
- Cột: RP C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động: [methanol : đệm phosphat 0,03 mol/l (pH 2,8_ chỉnh bằng
H
3
PO
4
1%)] ( 86: 14)
- Đầu dò : UV 215 nm
- Tốc độ dòng : 1,0 ml/ phút
- Thể tích tiêm : 10 µl
17

Chƣơng 2 – NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu_acid oleanolic
Dược liệu: bộ phận sử dụng là rễ cây ngưu tất, vì so với các bộ phận
khác thì rễ ngưu tất có chứa 0.096% hàm lượng acid oleanolic, nhiều
hơn so với hàm lượng acid oleanolic trong thân và lá [8]; và quá trình
chiết tách acid oleanolic từ bộ phận rễ khá thuận lợi và rất sạch, còn với
bộ phận thân và lá chúng tôi phải thêm các giai đoạn loại màu xanh sinh
học tự nhiên.
Rễ ngưu tất có các saponin, khi thủy phân cho các sapogenin là acid
oleanolic; ngoài ra còn có ecdysteron và inokosteron.
Hoạt chất: oleanolic acid
Công thức cấu tạo
[4]


Công thức phân tử: C
30
H
48
O
3
, khối lượng phân tử: 456.70
Danh pháp: (4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy-
2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-
tetradecahydropicene-4a-carboxylic acid
Hay 3 beta- Hydroxyolean-12-en-28-oic acid
Cảm quan: bột trắng
Tính chất: tan trong ethanol, methanol, nhiệt độ nóng chảy: 310
o
C

2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị
Hóa chất


18
ST
T
Hóa chất
Xuất xứ
Độ tinh
khiết
Ghi chú
1
Ethanol (PA)
Malaysia
99.9 %

2
N-hexane
USA
95 %

3
Methylen cloric
(PA)
USA
99.9 %

4
Cloroform (PA)

USA
99.9 %

5
Methanol (HPLC)
USA
100 %

6
Acid clohydrid
EC
37 %

7
Acid sulfurid
EC
98 %

8
Natri sulfurid



9
TLC Silicagel
60 F
254

Merck

20x20 cm
10
Bột silicagel 60 F
254

Merck

0.063-0.2
mm
11
Potassium
dihydrophosphat
Merck
99.5 %

12
Acid phosphor
molybdic



Nguyên liệu
Rễ cây ngưu tất khô được mua ở Dược liệu trung ương III, quận
nhất, thành phố Hồ Chí Minh.