nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây ngưu tất (achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM





PHÓ THỊ THUÝ HẰNG





NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT
(ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI
CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT








LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM




PHÓ THỊ THUÝ HẰNG




NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT
(ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI
CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT



Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC






Hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ TÂM





Thái Nguyên, 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hƣớng dẫn,
chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin trân thành cảm ơn Th.S. Vũ Anh Tuấn, KTV Lƣơng Thị Hồng Vân
- bộ môn Hoá hữu cơ - Khoa Hoá học trƣờng Đại học Sƣ phạm đã tận tình
hƣớng dẫn tôi thực hiện một số thí nghiệm trong luận văn. Tôi xin cảm ơn KTV
Đào Thu Thuỷ (PTN Công nghệ Tế bào thực vật), KTV Trần Thị Hồng (PTN Di
truyền học), đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành các thí nghiệm.
Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh -

KTNN, Khoa Hoá học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này.

Tác giả

Phó Thị Thuý Hằng









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu
trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.



Tác giả


Phó Thị Thúy Hằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC

Trang
Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Những chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

MỞ ĐẦU
1
1. Đặt vấn đề
1
2. Mục tiêu nghiên cứu
3
3. Nội dung nghiên cứu
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất
4
1.1.1. Đặc điểm phân loại
4
1.1.2. Một số đặc điểm nông sinh học của cây Ngƣu tất
4
1.1.3. Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch
5
1.2.Tình hình sản xuất Ngưu tất trên thế giới và ở Việt Nam
6
1.3. Ứng dụng cây Ngưu tất trong y học
8
1.3.1. Cơ sở hoá học tính chữa bệnh của cây Ngƣu tất
8
1.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng cây Ngƣu tất trong y học
10
1.4. Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực trong
công tác nhân giống cây trồng

12

1.4.1. Ƣu thế của nhân giống in vitro
12
1.4.2. Các phƣơng thức nhân giống in vitro
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.4.3. Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật
nuôi cấy in vitro

15
1.5. Ứng dụng kĩ thuật PCR - RAPD trong phân tích sự đa dạng
di truyền

19
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
23
2.1. Vật liệu………………………………
23
2.1.1. Vật liệu thực vật
23
2.1.2. `Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
23
2.2. Phương pháp nghiên cứu
24
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
24
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu hợp chất saponin trong rễ cây Ngƣu
tất

28

2.2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử
29
2.2.4. Phƣơng pháp xử lí và tính toán số liệu
33
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
34
3.1. Nghiên cứu nhân giống cây Ngƣu tất và trồng thử nghiệm ngoài
đồng ruộng

34
3.1.1. Nghiên cứu khử trùng hạt
34
3.1.2. Ảnh hƣởng riêng rẽ của chất KTST đến khả năng nhân chồi và
sự sinh trƣởng của chồi Ngƣu tất trong ống nghiệm

36
3.1.3. Ảnh hƣởng của α-NAA tới sự tạo rễ của cây Ngƣu tất trong
ống nghiệm

42
3.1.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi và
sự sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm

44
3.1.5. Kết quả đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên

49
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.2. Hàm lƣợng saponin tổng số trong rễ cây Ngƣu tất in vitro trồng

ngoài đồng ruộng và cây trồng bằng hạt

51
3.3. Sử dụng kĩ thuật RAPD đánh giá hệ gen cây Ngƣu tất in vitro và
cây trồng bằng hạt

53
3.3.1.Kết quả tách chiết ADN tổng số
53
3.3.2. Kết quả phản ứng RAPD
54
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
60
PHỤ LỤC
64

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT


ĐC: Đối chứng
HS: Hệ số
IBA: Axit 3-indolebutiric
KLK: Khối lƣợng khô
KTST: Kích thích sinh trƣởng
PCR: Polimease Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polimease)
TĐST: Tốc độ sinh trƣởng
TN: Thí nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG


trang
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trƣờng MS
23
Bảng 2.2. Trình tự nucleotit của 5 đoạn mồi ngẫu nhiên…………
32
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Ngƣu tất
34
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng
nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm ……………………

38
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến tốc độ sinh
trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm ………………………

40
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến hình thành rễ của cây Ngƣu
tất trong ống nghiệm (sau 30 ngày)

42
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân
chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm

44
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ sinh trƣởng

của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm…………………………………

46
Bảng 3.7. Kết quả đƣa cây Ngƣu tất ra môi trƣờng tự nhiên
49
Bảng 3.8
.
Theo dõi một số chỉ tiêu sau 30 ngày đƣa cây ra vƣờn ƣơm…

50
Bảng 3.9. Một số chỉ tiêu theo dõi rễ cây in vitro và rễ cây trồng
bằng hạt khi thu hoạch

50
Bảng 3.10. Hàm lƣợng hợp chất saponin trong rễ cây in vitro và
cây trồng bằng hạt

52
Bảng 3.11. Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện của 5 mẫu ngƣu tất
khi phân tích với 5 mồi ngẫu nhiên…………………………………

55
Bảng 3.12. Số phân đoạn ADN đa hình thu đƣợc từ 5 mẫu Ngƣu
tất với tƣờng mồi nghiên cứu………………………………………

56
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 3.1. Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến
tỷ lệ bình không nhiễm và tỷ lệ hạt nảy mầm của hạt Ngƣu tất

35
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm
và sự phát triển của chồi mầm Ngƣu tất

36
Hình 3.3.
Biểu đồ so sánh khả năng nhân chồi giữa BAP và kinetin
39
Hình 3.4.
Biểu đồ so sánh tốc độ sinh trƣởng giữa BAP và kinetin…
41
Hình 3.5.
Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng
nhân chồi và tốc độ sinh trƣởng của chồi Ngƣu tất trong ống nghiệm

41
Hình 3.6. Hình ảnh rễ Ngƣu tất trong môi trƣờng có α-NAA
43
Hình 3.7. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả
năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm………

45
Hình 3.8. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ
sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm…………

47
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi
và tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm

48
Hình 3.10. Một số hình ảnh đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên……
51
Hình 3.11. Một số phản ứng định tính hợp chất saponin………
53
Hình 3.12. Hình ảnh một số giai đoạn tách chiết hợp chất saponin
53
Hình 3.13. Hình ảnh điện di kiểm tra độ tinh sạch ADN…………
54
Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8%
mồi OPP15 và OPP19…………………………………………….

57
Hình 3.15. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8%
mồi OPH04 và OPN05……………………………………………

57
Hình 3.16.
Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPF10
58
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Theo báo cáo của Tổng Công ty Dược Việt Nam (năm 2000) cho thấy,
Tổng công ty đã nhập khẩu 182 loại dược liệu với tổng khối lượng 18.300
tấn, trong đó có 81 loại nhập với khối lượng trên 100 tấn/loại. Trong đó, có 13
loại thuốc đi từ động vật và khoáng vật; 169 loại từ cây thuốc, nhiều loại là
thuốc bắc đầu vị, một số không có ở Việt Nam [33].
Hiện nay, dược liệu tự sản xuất trong nước (bao gồm thu hái trong tự
nhiên và trồng trọt) không đáp ứng đủ nhu cầu, 60% phải nhập khẩu, có hơn
20 loài cây thuốc đã nhập nội thành công ở nước ta, đã từng sản xuất đạt sản
lượng lớn, nay cũng phải nhập khẩu trở lại trong đó có cây Ngưu tất. Có
nhiều loài vốn là những cây trồng thế mạnh của Việt Nam cũng phải nhập từ
nước khác như: Bạch biển đậu, Binh lang (hạt cau), Hoắc hương, Xạ can, Địa
liền, Hồng hoa, Xuyên tâm liên, Ý dĩ [32].
Như vậy, trong khi thường xuyên xuất khẩu gần 100 loại dược liệu, bán
thành phẩm và thành phẩm, doanh thu khoảng 30-50 triệu USD/năm, thì Việt
Nam vẫn phải nhập khẩu dược liệu, chủ yếu từ Trung Quốc. Không những
thế, còn xuất hiện tình trạng xuất khẩu tiểu ngạch dược liệu qua các cửa khẩu
vùng biên dẫn đến nguy cơ tuyệt mẫu nhiều loài cây thuốc quý hiếm [33].
Trước thực trạng trên, để thực hiện được phương châm lấy dược liệu làm
nền tảng trong chiến lược phát triển của ngành Y tế, cần phải có những chính
sách mạnh mẽ, thích hợp, đồng bộ và khoa học dựa trên những điểm chính
sau: song song với việc quy hoạch vùng dược liệu, bảo vệ nguồn tài nguyên
dược liệu, đẩy mạnh công tác thông tin và nghiên cứu dược liệu. Một trong
những trọng điểm của định hướng là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc
trên quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều
trị trong nước và xuất khẩu. Tuy nhiên, để thực hiện tốt điều đó, bên cạnh
việc đẩy mạnh các nghiên cứu cơ bản như thành phần hoá học, tác dụng dược
lí của cây thuốc, các nghiên cứu ứng dụng cũng cần được xem trọng [30].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
Ngưu tất có tên khoa học là Radix Achyranthis Bidentatae, là cây thuốc
Bắc có nguồn gốc từ Trung Quốc di thực vào nước ta từ năm 1960. Sang thập
kỷ 70 của thế kỷ XX, cây Ngưu tất được phát triển đại trà, đáp ứng được nhu
cầu trong nước và một phần xuất khẩu. Ngoài Ngưu tất chính danh (Ngưu tất
Bắc), ngày nay y học dân gian nước ta còn sử dụng khá phổ biến cây Ngưu tất
nam, tên thông dụng là cỏ xước (Achyranthes aspera L.) với công dụng như
Ngưu tất [32].
Cây Ngưu tất được sử dụng rộng rãi, trong y học cổ truyền phương
Đông, rễ cây Ngưu tất có tác dụng làm tan máu ứ, bớt sưng tấy, đau nhức,
chống co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt. Ngày này, y học hiện đại còn sử
dụng Ngưu tất để hạ huyết áp và giảm cholesterol trong máu [12].
Từ rễ cây Ngưu tất, các nhà khoa học đã tách chiết và xác định được cấu
trúc hoá học của 6 saponin với thành phần aglycon là axit oleanolic. Các
saponin phân lập đã được xác định lần lượt là dimetyl ester của prosapogenin
chikusetru – saponin-va, prosapogenin của chikusetru – saponin – Ib, metyl
ester của chiksetru-saponin-IVa, ester của chiksetru-saponin-V, meyl ester
của Achyrantosid B và trimetyl ester của saponin5. Thành phần saponin của
Ngưu tất gồm các glycosid có aglycon là axit oleanolic phù hợp với công
dụng của dược liệu này là chống viêm, sưng, trị đau nhức [38].
Hiện nay, ở nước ta Ngưu tất được trồng ở một số tỉnh như: Lạng Sơn,
Bắc Ninh, Nghệ An nhưng số lượng rất ít, không đáp ứng đủ nhu cầu dược
liệu trong nước. Mặc dù đã dùng cây cỏ xước để thay thế nhưng nhu cầu về
Ngưu tất vẫn rất lớn.
Xuất phát từ giá trị to lớn đó của cây Ngưu tất, nhằm bảo vệ nguồn gen
và tạo ra được một số lượng lớn giống cây Ngưu tất cung cấp cho gieo trồng.
Chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây Ngưu tất
(Achyranthes Bidentata Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm nhằm
bảo tồn nguồn gen và tạo ra số lượng nhất định cây con đồng đều cung cấp
cho sản xuất và trồng thử ngoài đồng ruộng.
- Khẳng định tính ổn định của cây nuôi cấy in vitro thông qua đánh giá
sự ổn định về hàm lượng hợp chất saponin và genome cây Ngưu tất trồng tự
nhiên và cây nuôi cấy trong ống nghiệm.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm
- Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên sự phát
sinh hình thái cây Ngưu tất trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của nồng
độ NAA hoặc IBA.
- Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên
2. Định lượng hợp chất saponin trong rễ cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây
nuôi cấy in vitro
3. Sử dụng kĩ thuật RAPD để đánh giá sự ổn định di truyền giữa cây Ngưu tất
trồng tự nhiên và cây Ngưu tất nuôi cấy in vitro.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Ngƣu tất
1.1.1. Đặc điểm phân loại
Ngưu tất có tên khoa học là (Radix Achyranthis Bidentatae).Tên thường
gọi: Cyathula officinalis Kuan, Cyathula root, Achyranthes root. Ngưu tất
gồm nhiều loài, thường gặp là Hoài Ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume),
Ma Ngưu tất (Cyathula capitata (Wall Moq) và Xuyên Ngưu tất (C.officinalis
Kuan) [37].
Ngưu tất thuộc Chi Cúc bách nhật (Gomphrera Globosa L.).
Họ rau Dền (Amaranthaceae).
Bộ Cẩm Chướng (Caryophyllales).
Phân lớp Cẩm Chướng (Caryophyllidae).
Lớp 2 lá mầm hay lớp Ngọc Lan (Dicotyledoneae) [20].
1.1.2. Một số đặc điểm nông sinh học của cây Ngƣu tất
Ngưu tất có thân thảo mảnh, hơi vuông, phân thành đốt, phình ra ở hai
đầu trông giống như đầu gối con trâu nên có tên là Ngưu tất. Cây thường chỉ
cao 1m, cũng có khi tới 2m, lá mọc đối, có cuống, dài 5 – 12cm, rộng 2 –
4cm, phiến lá hình trứng, đầu nhọn, mép lá nguyên [12].
Hoa dài 2 – 5cm, mọc thành bông ở đầu cành hoặc kẽ lá. Hoa thường gập
xuống, sát vào cuống của cụm hoa. Hoa không có cánh. Đài hoa gồm 5 lá khô
xác, dài gần bằng nhau. Bộ nhị gồm 5 nhị, chỉ nhị dính với nhau và dính cả
với nhị lép. Nhị lép có răng rất nhỏ. Đầu chỉ nhị mang các bao phấn hình mắt

chim. Bầu nhụy hình trứng. Quả hình bầu dục, có một hạt [38].
Rễ hình trụ tương đối thẳng, dài 20-30 cm, đường kính 0,5-1cm. Ðầu
trên mang vết tích của cổ rễ, đầu dưới hơi thuộn nhỏ. Mặt ngoài màu vàng đất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
hay nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con. Rễ gồm 1
hoặc 2 hoặc 3 rễ cái, chung quanh có các rễ con. Rễ cái nạc, lúc đầu hơi giòn,
màu trắng ngà, sau khi chế biến có màu hồng, trong và mềm dẻo.
Ở nước ta có cây cỏ xước mọc hoang dại, trông rất giống cây Ngưu tất,
được các vị lương y dùng thay cho Ngưu tất với tên thông dụng nam Ngưu
tất, tên khoa học Achyranthes Aspera L. cùng họ Dền. Nhìn bề ngoài, cỏ xước
trông rất giống Ngưu tất tuy nhiên phiến lá Ngưu tất to và tù hơn, còn lá cỏ
xước gầy và nhọn hơn. Rễ cỏ xước có nhiều rễ con hơn, rễ cái bị hoá gỗ. Còn
rễ Ngưu tất ít rễ con hơn, rễ cái nạc và dài như chiếc đũa [12].
1.1.3. Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch
Kỹ thuật trồng cây Ngưu tất
Chọn đất và làm đất: Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn.
Đất phù sa, cao ráo, thoát nước rất hợp với Ngưu tất. Đất nhiều cát sỏi, bạc
màu, đất chua mặn không trồng được Ngưu tất.
Ruộng trồng Ngưu tất phải được cày bừa, đập đất kỹ. Cày hoặc cuốc sâu
có tác dụng làm cho rễ Ngưu tất dài, ăn sâu, cho năng suất cao. Khi lên luống
thường bón lót phân chuồng vào lưng chừng luống. Lượng phân chuồng, theo
tài liệu Trung Quốc phải bón tới 50 hoặc 60 tấn/ha, nghĩa là 2 - 3 tạ một sào
Bắc bộ. Nhưng ở nước ta ít khi dùng lượng phân nhiều như thế. Tuy nhiên
không nên trồng chay, năng suất sẽ thấp. Luống làm rộng 70 - 80cm cao 30 -
40cm. ở Trung Quốc người ta còn cày sâu, đập đất nhỏ và lên luống cao tới
70cm. Theo chuyên gia Trung Quốc, làm như vậy sẽ cho củ Ngưu tất dài 70 -
80cm [9].
Khi lên luống đã hoàn chỉnh, rạch 2 hàng dọc trên mặt luống cách nhau

20cm. Rắc phân chuồng bột trộn với tro khô.
Gieo hạt: Trồng Ngưu tất bằng cách gieo hạt. Hạt được ngâm nước ấm
vài giờ, xong trộn với cát khô và tro khô để dễ gieo. Gieo rất thưa trên rạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
luống. Gieo xong đậy rơm hoặc rạ. Nếu có nhiều rạ thì đậy cả mặt luống nếu
không, ít nhất cũng phải đậy ở rạch luống.
Thời vụ gieo: ở miền núi tháng 2 và 3, ở đồng bằng tháng 10 và 11 (cuối
thu đầu đông).
Chăm sóc: Gieo hạt xong, quan trọng nhất là tưới ẩm hàng ngày cho hạt
mau nẩy mầm. Khi hạt đã mọc thì bỏ rạ và tưới bằng thùng tưới có hoa sen để
cho cây khỏi bết xuống đất. Khi cây có 4 - 5 đôi lá thật thì tưới thêm phân
đạm pha loãng hoặc nước tiểu pha loãng để cho cây mau kín luống. Tuyệt đối
không được tưới bằng nước phân chuồng tươi sẽ không đảm bảo về an toàn
dược liệu. Nếu có cỏ phải làm cỏ, xới xáo, phá váng. Khi cây đã giao tán, kín
luống, nhổ tỉa bớt những chỗ quá mau, để cây cách cây 15cm. Có thể tưới
bằng cách tát nước vào ruộng, ngập rãnh luống rồi té nước lên mặt luống, làm
như vậy sẽ giữ được độ ẩm cho cây. Tiếp đó tháo nước cho rút hết khỏi
ruộng.
Thu hoạch và chế biến sơ bộ: Thời gian thu hoạch ở miền núi vào cuối
năm từ cuối tháng 10 đến tháng 12, ở đồng bằng vào tháng 4 đến tháng 5 năm
sau [9].
Khi cây đã xuất hiện nhiều lá vàng, ở gốc lá đã rụng dần, đào thử thấy rễ
Ngưu tất mập, dài 20 - 30cm là có thể thu hoạch. Trước hết cắt bỏ phần lá, thu
gọn vào một chỗ. Dùng thuổng hoặc sà beng đào sâu bẩy đất lên để rễ khỏi bị
đứt. Rũ sạch đất ở rễ, đem về rửa sạch, phơi ráo nước. Cắt bỏ rễ con, xông lưu
huỳnh từ một đến hai đêm. Phơi âm can, hay nắng nhẹ, không nên phơi nắng
to trên sân gạch, Ngưu tất sẽ bị khô xác [21].
1.2. Tình hình sản xuất Ngƣu tất trên thế giới và ở Việt Nam

Từ thời nguyên thuỷ, con người trong lúc tìm kiếm thức ăn, có khi ăn
phải chất độc phát sinh nôn mửa hoặc đi ỉa lỏng, hoặc hôn mê có khi chết
người, do đó dần dần có nhận thức phân biệt được vị nào ăn được, vị nào có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
độc. Kinh nghiệm dần được tích luỹ không những giúp cho loài người biết lợi
dụng tính chất của cỏ cây làm thức ăn mà còn biết dùng làm thuốc chữa bệnh,
hay dùng các vị có chất độc làm tên thuốc độc dùng trong săn bắn và chống
ngoại sâm. Cây thuốc Ngưu tất cũng được tìm ra bằng con đường đó [12].
Ngưu tất là một loại cây dược liệu thu hoạch củ được trồng rộng rãi ở
một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Ấn Độ, Campuchia, Lào Trong
đó Trung Quốc là nước có diện tích cũng như sản lượng Ngưu tất nhiều nhất
thế giới.
Năm 1960, cây Ngưu tất bắt đầu được trồng ở nước ta, trong những năm
của thập kỉ 70 được phát triển đại trà, đáp ứng nhu cầu trong nước và một
phần xuất khẩu. Thời gian sau đó, diện tích cây Ngưu tất giảm trầm trọng, chỉ
còn trồng rải rác ở một số tỉnh chuyên canh về dược liệu như Lào Cai, Lai
Châu, Hưng Yên, Thanh Hoá và một số vườn dược liệu của các bệnh viện,
Viện Nghiên cứu hoặc còn mọc hoang ở thung lũng các tỉnh miền núi phía
Bắc như Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang Hiện nay, sản lượng Ngưu tất
trong nước rất ít, chỉ đáp ứng được 60% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu
chủ yếu từ Trung Quốc [31].
Theo tinh thần “Định hướng chiến lược ngành y tế” và “Chính sách quốc
gia về thuốc của Việt Nam” Chính phủ đã có những chính sách cũng như
những quy định pháp luật cụ thể cho việc phát triển dược liệu. Hiện nay, các
vùng dược liệu mới đang được quy hoạch ở các tỉnh như: Lào Cai, Mèo Vạc-
Hà Giang, Chí Linh-Hải Dương, Hương Sơn – Hà Tĩnh. Viện Dược Liệu
được chọn làm cơ quan tham gia chương trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng
miền núi, chương trình trồng rừng phủ xanh đất trống, đồi núi trọc, góp phần

xoá đói giảm nghèo cho nhân dân miền núi. Viện đang xây dựng dự án trồng
khảo nghiệm một số cây thuốc quý tại Quản Bạ, Đồng Văn – Hà Giang như
Đương quy, Bạch truật, Ngưu tất [30]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Bên cạnh việc mở rộng diện tích gieo trồng, các nghiên cứu khoa học
cũng được đẩy mạnh. Năm 2005, Phạm Văn Hiển và CS đã xây dựng thành
công quy trình nhân nhanh in vitro cây Ngưu tất từ đốt thân và ngọn chồi với
tỷ lệ ra bầu 70% – 90% tuỳ thời vụ, tỷ lệ ra rễ in vitro đạt 90%. Đã tạo được
mô sẹo cây Ngưu tất từ gốc thân và trục dưới lá mầm [8]. Năm 2000, Ngô Thị
Xuyên đã tiến hành đề tài nghiên cứu tuyến trùng nốt sưng gây hại cây Ngưu
tất ở một số tỉnh như: Thanh Trì, Gia Lâm – Hà Nội; Bình Minh, Nghĩa Trai –
Hưng Yên, Hà Trung – Thanh Hoá; Tam Đảo – Vĩnh Yên và Sa Pa – Lào Cai.
Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ nhiễm tuyến trùng nốt sưng khác nhau.
Bệnh hại nặng ở vụ mùa xuân và đất trồng cây dược liệu liên tục quanh năm
[29]. Năm 2005, Mai Đăng Đẩu đã nghiên cứu thiết kế, chế tạo hệ thống thiết
bị chiết xuất dược liệu và hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất saponin
từ Ngưu tất. Thành công của đề tài đã góp phần quan trọng trong việc tạo ra
các thuốc mới từ Ngưu tất [5];[36].
1.3. Ứng dụng cây Ngƣu tất trong y học
1.3.1. Cơ sở hoá học tính chữa bệnh của cây Ngƣu tất
Rễ Ngưu tất có chứa axit oleanolic 0,096%, saponin toàn phần 4,04% và
axit oleanolic α -L-rhamnopyranosyl - β - D- galactopyranoxit. Rễ còn chứa
ecdysteron, inokosteron và muối kali. Hàm lượng ecdysteron khoảng 0,037%.
Rễ Ngưu tất chứa một xaccarit là fructan mạch ngắn với mức độ trùng
hợp trung bình là 8. Chất này có tác dụng cải thiện hệ miễn dịch. Rễ Ngưu tất
còn có một peptitpolyxaccarit trong đó 24,1% là peptit bao gồm glycin, serin,
axit glutamic và axit aspartic. Chất peptitpolyxaccarit có tác dụng miễn dịch.
Betain có trong rễ với hàm lượng 0,93-1,029% đã được chứng minh là ổn

định trong quá trình chế biến. Rễ khô còn có emodin và physcion [38].
Saponin là một glicozit tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật.
Tiền tố sapo có nghĩa là xà phòng; và thực tế thường gặp từ "saponification"
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp. Chất saponin
của Ngưu tất có tác dụng phá huyết và làm vón albumin. Ecdysteron và
inokostenon có tác dụng kìm hãm sự phát triển của một số sâu bọ [34].
Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm
sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối
với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị
hắc và làm hắt hơi mạnh. Một vài động vật cũng có saponin như các loài hải
sâm, cá sao. Các saponin đều là các chất hoạt quang. Thường các steroit
saponin thì tả truyền, còn triterpenoit saponin thì hữu truyền. Điểm nóng chảy
của các sapogenin thường rất cao. Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật
hay vi khuẩn hoặc do axit loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm
genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường.
Các đường phổ biến là D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, axit galactunoic,
axit D-glucuronic Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi
hoặc sapogenintritecpen dạng β-amirin (axit olenoic), dạng α-amirin (axit
asiatic), dạng lupol (axit buletinic) hoặc tritecpen bốn vòng [35].
Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người ta chia saponin ra làm 3
nhóm lớn là triterpenoit saponin, steroit saponin và glicoancaloit dạng steroit.
Saponin có loại axit, trung tính hoặc kiềm. Trong đó, triterpenoit saponin
thường là trung tính hoặc axit (phân tử có nhóm –COOH). Steroit saponin
nhóm spirostan và furostan thuộc loại trung tính còn nhóm glicoancaloit thuộc
loại kiềm [35].
Theo Đông y, Ngưu tất có vị chua, hơi đắng, tính bình không độc, vào 2
kinh can và thận, có tác dụng làm tan máu ứ đọng, bớt sưng tấy, đau nhức,

chống co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt. Trong nhân dân, Ngưu tất được
dùng trong bệnh viêm khớp, đau người, sau khi đẻ máu hôi tanh không sạch,
đau bụng, kinh nguyệt khó khăn. Nghiên cứu của các nhà khoa học gần đây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
cho thấy Ngưu tất có tác dụng làm hạ mỡ máu tốt. Đã được áp dụng tại Việt
Nam dưới dạng cao lỏng Ngưu tất để chữa bệnh mỡ máu cao [12].
1.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng cây Ngƣu tất trong y học
Ngưu tất có tác dụng chống viêm rõ rệt đối với giai đoạn cấp tính và mạn
tính của phản ứng viêm thực nghiệm. Rễ Ngưu tất có tác dụng mạnh hơn
khoảng 4 lần so với rễ cỏ xước. Dịch chiết rễ Ngưu tất có khả năng gây thu
teo tuyến ức chuột cống đực non. Tác dụng gây thu teo tuyến ức là một trong
những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch. Rễ Ngưu tất có tác dụng làm
giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây tăng cholesterol từ ngoài vào và gây ức
chế sự tổng hợp cholesterol trong cơ thể thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt trên mèo,
mức độ hạ áp từ từ, thời gian tác dụng kéo dài [33].
Ngưu tất tươi chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt, đái ra máu
hoặc sỏi, bế kinh, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thai không
ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu gối nhức
mỏi. Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân co
quắp hoặc bại liệt [31].
Trong y học Trung Quốc, rễ Ngưu tất với liều 5 - 12g dưới dạng nước
sắc được sử dụng làm thuốc phục hồi sức lực, lợi tiểu, chữa bế kinh, đau kinh,
tăng huyết áp, thấp khớp, sỏi đường tiết niệu, viêm họng, viêm amidan. Ngoài
ra, nó còn được dùng làm thuốc kích thích tình dục, tráng dương, chữa liệt
dương, gây sảy thai. Hạt Ngưu tất phối hợp với một số dược liệu khác được
dùng làm thuốc chống độc, chữa thấp khớp, hen phế quản. Ngoài ra, nước sắc
20% Ngưu tất chữa các bệnh về da và móng (bệnh nấm biểu bì) [37].
Trương Diệu Đức, Trương Phát Sơ và Lưu Thiện Quang (1935, Trung

Hoa tạp chí) đã dùng cao lỏng Ngưu tất tiến hành 90 thí nghiệm trên tử cung
cô lập của thỏ, chuột bạch, mèo và chó đã đi tới một số kết luận sau: cao lỏng
Ngưu tất có tác dụng làm dịu sức căng của tử cung chuột bạch, làm phát sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
tác dụng co bóp ở tử cung của thỏ, có tác dụng co bóp mạnh đối với tử cung
của mèo có chửa, có tác dụng làm dịu tử cung mèo không có chửa.
Theo Kinh Lợi Bân (Viện nghiên cứu Quốc lập Bắc Kinh - sở nghiên
cứu sinh lí học (1937) thì Ngưu tất có tác dụng như sau: đối với động vật đã
gây mê, Ngưu tất có thể gây giảm huyết áp tạm thời, làm yếu sức bóp của tim
ếch, ức chế sự co bóp của khúc tá tràng, ngoài ra Ngưu tất có tác dụng lợi tiểu
[12].
Lương y Lê Trần Đức đã thử nghiệm và có hiệu quả tốt 4 bài thuốc sử
dụng Ngưu tất như sau: (1) Ngưu tất dùng vị độc ngày 40 – 60 g sắc uống
nhiều lần chống co giật, bại liệt, phong thấp, teo cơ, xơ vữa mạch máu. (2)
Rượu thuốc Ngưu tất (100g) và một số dược liệu khác uống 1-2 lần/ngày,
trong 10 ngày chữa các chứng bị thương máu tụ ở ngoài hay máu ứ ở trong.
(3) Thang an thần: Ngưu tất 30g và hạt muồng sao 20g uống mỗi ngày chữa
nhức đầu, chóng mặt, ù tai, rối loạn tiền đình. (4) Thang tiết niệu: Ngưu tất
30g và một số dược liệu sắc uống chữa bệnh phù thũng, viêm cầu thận cấp,
viêm gan virut, viêm bàng quang, đái ra máu [32].
Những năm gần đây, Giáo sư Đoàn Thị Nhu - Viện dược liệu đã nghiên
cứu về dược lí thấy cao toàn phần của Ngưu tất có tác dụng làm hạ huyết áp
và giảm cholesterol trong máu. Viện dược liệu cũng sản xuất thử thuốc
Bidentind chiết xuất từ Ngưu tất Bắc. Bidentind được đưa ra thử lâm sàng
rộng rãi và có kết quả rất tốt. Nhiều xí nghiệp dược phẩm TW và địa phương
sản xuất Bidentin. Bidentin đã trở thành thuốc thông dụng, quen thuộc và
được dùng nhiều trong khoa tim mạch hiện nay [31].
Phan Hải Nam (2005), nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc hạ huyết áp

Ngưu tất, Hoè hoa, Linh Chi (NHL) trên chỉ số cholesterol và triglycerit máu
ở bệnh nhân tăng huyết áp có rối loạn lipit máu. Tác giả nghiên cứu sự thay
đổi nồng độ cholesterol toàn phần, triglicerit huyết tương ở 39 bệnh nhân có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
rối loạn lipit máu được điều trị bằng thuốc hạ huyết áp NHL. Kết quả điều trị
cho thấy, thuốc NHL có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần
(8,6%), triglicerit huyết tương giảm 9,94% (p<0,001) [19]. Nguyễn Thị Sơn,
Nguyễn Thị Bay (2007) đã tiến hành nghiên cứu tác dụng của trà hạ mỡ Ngưu
tất trên bệnh nhân rối loạn lipit máu. Kết quả nghiên cứu cho thấy trà hạ mỡ
Ngưu tất có tác dụng làm giảm Cholesterol toàn phần và LDL-C sau thời gian
8 tuần điều trị liên tục với liều 20g/ngày [22].
Chế phẩm Solamin trong thành phần có Ngưu tất và một số dược liệu
khác đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụng chống
viêm và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng. Kết quả tốt nhất và tương đối nhanh
đối với đau lưng cấp do lạnh và sang chấn. Ðối với viêm đa khớp dạng thấp,
chưa có biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn thuần, tác dụng
điều trị tương đối tốt. Khi đã có biến dạng về xương, cơ, khớp, kết quả kém.
Thuốc không gây tác dụng phụ đáng kể. Ngày nay, rất nhiều loại thuốc có
thành phần chiết xuất từ Ngưu tất được bán trên thị trường như thuốc
Dentonin chữa viêm lợi, viêm quanh răng. Thuốc Rumatin chữa thấp khớp.
Thuốc tăng tuần hoàn não Ligustan [34].
1.4. Ứng dụng của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công
tác nhân giống cây trồng
1.4.1. Ƣu thế của nhân giống in vitro
Kĩ thuật nhân giống in vitro (vi nhân giống) phát triển và mở rộng trong
những năm gần đây, do yêu cầu về lượng giống cây trồng tăng lên nhanh
chóng nhằm phục vụ dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm,
thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường. Vi nhân giống in vitro có

những ưu điểm lớn mà không một loại hình nhân giống nào có được, đó là:
(1) Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
Từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Tốc độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
nhân của phương pháp vi nhân giống khoảng 3
6
– 10
12
lần/năm, chẳng hạn
khoai tây từ 50 ống giống của ngân hàng giống thế giới sau 6 tháng nhân
giống được 10 vạn cây khoai tây.
(2) Tiết kiệm không gian, phương pháp này nhân được một số lượng
lớn trong một diện tích nhỏ, trong 1m
2
diện tích có thể được 18000 cây.
(3) Sản phẩm cây giống đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công
nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây
mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
(4) Nâng cao chất lượng giống cây trồng: nuôi cấy mô là một
phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã bị
nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thường
tăng năng suất 15 – 30% so với giống gốc.
(5) Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển: một thùng 40000 cây dâu
tây chỉ nặng 15kg), việc bảo quản cây giống cũng được thuận tiện, các cây
giống giữ ở nhiệt độ 4
0
C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống trên 95%.
Các dạng sản phẩm của vi nhân giống như cây con in vitro hoặc trong

bầu đất. Các cây giống có thể bán ở dạng củ bi hoặc cây hoặc thân củ.
(6) Sản xuất quanh năm không lệ thuộc vào mùa vụ. Quá trình sản
xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào
trong năm và bất cứ tình hình thời tiết có thuận lợi hay không.
Nhân nhanh trong nuôi cấy mô cho phép thu được một số lượng lớn
các cá thể trong thời gian ngắn, bảo đảm giữ được các đặc điểm di truyền
tốt và gữ được tính trẻ hoá. Đây là phương pháp tốt nhất để giải quyết nhu
cầu cây con cho sản xuất đặc biệt phục vụ trồng rừng trên quy mô lớn với
độ đồng đều cao [27].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
1.4.2. Các phƣơng thức nhân giống in vitro
* Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Theo Đỗ Năng Vịnh (2005), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy
được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,1mm tính từ chóp của chóp
đỉnh sinh trưởng. Nhưng trong thực tế việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy rất
khó thành công, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng với mục
đích làm sạch virus cho cây trồng. Trong thực tế đỉnh sinh trưởng thường
được tách với kích thước từ 5mm – 10mm [27].
Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương
quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của
chồi. Thông thường khi độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống của chồi tăng và
tính ổn định tăng và ngược lại. Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ
lớn của chồi tăng hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu
quả kinh tế sẽ tăng. Do vậy phải kết hợp các yếu tố để tìm ra phương thức lấy
mẫu tối ưu.
Căn cứ về nguồn gốc của các cây tái sinh từ mô phân sinh hoặc đỉnh sinh

trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát
triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi nách mới phát sinh. Tuy
nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh.
Có hai phương thức hình thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh
hoặc đỉnh sinh trưởng.
Cây tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách phá ngủ. Phương thức
này chủ yếu gặp ở các đối tượng 2 lá mầm như khoai tây, thuốc lá, chanh,
cam, hoa cúc, và một số cây 1 lá mầm như dứa, sợi, mía Cây tái sinh qua
giai đoạn hình thành dẻ hành (protocom), chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá
mầm như phong lan, hoa huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo thành hàng
loạt protocom và các protocom này có thể tiếp tục phân chia thành các