Phát triển quy trình bất hoạt virus bằng formalin trong sản xuất vacxin cúm AH1N109

i


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ
sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và
giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt
thời gian học tập tại trường.
Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Lê Văn Bé - Viện trưởng
Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) Nha Trang, ThS. Dương Hữu Thái –
Trưởng Phòng Vacxin cúm, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang và ThS.
Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học
Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời
gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị Phòng vacxin cúm, Viện
Vắc xin và Sinh phẩm Y Nha Trang đã tạo mọi điều kiện tốt nhất có thể cho tôi thực
hiện tốt đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những
người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi
hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án
vừa qua.

Nha Trang, tháng 07 năm 2011
Sinh viên
Hà Thị Hoa




ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09 3
1.2. TỔNG QUAN VỀ VACXIN CÚM 5
1.2.1. Vacxin cúm mùa 5
1.2.2. Các dạng vacxin cúm mùa 5
1.2.2.1. Vacxin cúm bất hoạt (vacxin chết) 5
1.2.2.2. Vacxin sống giảm độc lực 7
1.2.3. Các công nghệ sản xuất vacxin cúm 8
1.2.3.1. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi 8
1.2.3.2. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào 9
1.2.3.3. Một số các phương pháp sản xuất vacxin cúm khác 10
1.2.4. Vacxin cúm A/H1N1/09 11
1.3. Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 14
1.3.2. Tiêu chuẩn của vacxin cúm 16
1.4. Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vacxin cúm 16
1.4.1. Beta- propiolactone (BPL) 16
1.4.2. Formalin (Formaldehyde) 17
1.5. Quy trình bất hoạt virus cúm 21
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22
2.1.1. Vật liệu 22

iii


2.1.2. Dung dịch kháng nguyên virus 22
2.1.3. Thiết bị 22
2.1.4. Dụng cụ và hóa chất 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1. Một số phương pháp kiểm định (test) 25
2.2.1.1. Phương pháp xác định hiệu giá HA (HAU) 25
2.2.1.2. Phương pháp xác định hiệu lực bất hoạt (RIV) 26
2.2.1.3. Phương pháp kiểm tra hàm lượng HA (phản ứng SRID) 27
2.2.1.4. Phương pháp xác định liều gây nhiễm trên trứng gà có phôi
(EID50) 28
2.2.2. Phương pháp lấy mẫu sau bất hoạt 29
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu chọn nồng độ formalin thích hợp 29
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu chọn nhiệt độ và thời gian bất hoạt 30
2.2.5. Xây dựng quy trình bất hoạt 32
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ formalin bất hoạt 33
3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian bất hoạt 36
3.2.1. Kết quả khảo sát hiệu giá HA 37
3.2.2. Kết quả khảo sát EID50 38
3.2.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 nhóm nhiệt độ 40
3.2.4. Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên (SRID) 41
3.3. Xây dựng quy trình bất hoạt 43
3.3.1. Khảo sát tính ổn định và hiệu quả của quy trình bất hoạt 44
3.3.2. Khảo sát tính an toàn của quy trình bất hoạt 45
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
4.1. KẾT LUẬN 47
4.2. KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
iv


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CAIV : Cold-adapted Attenuated Influenza Vaccine
DNA : Deoxyribonucleic Acid
DPT : Diptheria – Pertussis – Tetanus
(Vaccine bạch hầu – ho gà – uốn ván)
EID50 : Egg Infectious Dose 50
(Liều gây nhiễm 50 virus trên trứng gà)
EU : Endotoxin Unit (đơn vị nội độc tố)
HA : Haemagglutinin (Protein ngưng kết hồng cầu)
HAU : Haemagglutination Unit (Đơn vị Haemagglutinin)
HI : Haemagglutination Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu)
IVAC : Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế
NA : Neuraminidase (enzyme bề mặt virus cúm)
NIBSC : National Insitute for Biological Sandards and Control
(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và kiểm định Sinh học, Vương
quốc Anh)
PBS : Phosphat Buffer Saline (dung dịch đệm muối, Photphat)
RNA : Ribonucleic Acid
RIV : Residual Infectious Viruses (virus sống tồn lưu)
SA : Sialic Acid
SRID : Single Radial Immuno Diffusion
(Khuyếch tán miễn dịch vòng đơn)
TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới
TIV : Trivalent - inactivated Influenza Vaccine
(Vaccine cúm ba thành phần bất hoạt)

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin 7
Bảng 2.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến 96 giếng 26
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát HA của 3 lô thử nghiệm 33
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát RIV của 3 lô thử nghiệm 34
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát SRID của 3 lô thử nghiệm 35
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của các nhóm nhiệt độ trong các
khoảng thời gian khác nhau ở 3 lô thử nghiệm 37
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát EID50 của 3 lô thử nghiệm ở các nhóm nhiệt độ
trong các khoảng thời gian bất hoạt 39
Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 lô sản xuất 40
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) của 3 lô ở
các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian bất hoạt 41
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát HA, SRID, RIV và EID50 của 3 lô sản xuất ở
các thời gian khác nhau trong quy trình bất hoạt 44
Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng formalin tồn dư, Endotoxin và Ovalbumin
của 3 lô sau khi bất hoạt 45


vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A 3

Hình 1.2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt 6
Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi 14
Hình 1.4 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 21
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ formalin 30
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian bất hoạt 31
Hình 3.1 Hiệu suất bất hoạt trung bình của 3 lô 35
Hình 3.2 Hàm lượng trung bình kháng nguyên HA của 3 lô thử nghiệm (µg/ml) 42
Hình 3.3 Quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 43
1


MỞ ĐẦU
Dịch cúm A/H1N1/09 bùng phát đầu tiên tại Mehico vào cuối tháng 3/2009,
đến tháng 4 lan nhanh sang Mỹ và các quốc gia lân cận. Chỉ tính đến ngày
17/6/2009, dịch xảy ra trên 86 nước và vùng lãnh thổ ở tất cả các châu lục, với
339.620 người mắc và có 167 người chết, hai nước có số người chết nhiều nhất là
Mehico: 08 người và Mỹ: 44 người; Về sau dịch lan nhanh ra hầu hết các nước trên
thế giới với số người chết nhiều hơn. Điểm đặc biệt của đại dịch cúm này là tốc độ
lây lan từ người sang người rất nhanh và những trường hợp tử vong thường rơi vào
lứa tuổi từ 20 - 45 tuổi cho thấy tính chất nguy hiểm của dịch. Trước tình hình này,
WHO
(Tổ chức Y tế Thế giới)
đã phát triển mở rộng chương trình phòng chống
cúm toàn cầu nhằm tìm ra biện pháp kiểm soát và phòng ngừa nguy cơ bùng phát
đại dịch.
Vacxin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa, kiểm
soát và đẩy lùi dịch bệnh nói chung và bệnh cúm nói riêng. Tuy nhiên, việc sản xuất
ra một lượng vacxin đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng trên toàn thế giới còn gặp nhiều
khó khăn do năng lực sản xuất ở các quốc gia không đồng đều và những thách thức

về công nghệ. Để giải quyết vấn đề này, các nhà sản xuất vacxin tập chung đầu tư
nghiên cứu nhiều dạng vacxin cúm khác nhau: Vacxin cúm bất hoạt, vacxin sống và
vacxin tái tổ hợp.
Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) đã nghiên cứu sản xuất thành công
vacxin cúm A/H1N1/09 bất hoạt trên trứng gà có phôi trên quy mô thí nghiệm. Hiện
nay việc mở rộng sản xuất trên quy mô lớn, trong đó việc phát triển quy trình bất
hoạt virus cúm nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng là vấn đề được quan tâm
đầu tư.
Formalin là hóa chất được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để bất hoạt vi
sinh vật trong nhiều loại vacxin cho người. Tuy nhiên xác lập quy trình bất hoạt đối
với mỗi loại vacxin, sinh phẩm cần được xác định các thông số cụ thể như nồng độ
formalin thích hợp là bao nhiêu và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình bất hoạt để
2


đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình. Do đó, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tàì: “Phát triển quy trình bất hoạt virus bằng formalin trong sản xuất
vacxin cúm A/H1N1/09”.
Mục tiêu của đề tài
1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09
trong sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09.
2. Đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình bất hoạt virus cúm
A/H1N1/09.

3


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09
Virus cúm A có tên khoa học là Avian Influenza (AI), thuộc họ
Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung (Basic Taxomomy). Các hạt
virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 - 120 nm.
Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75%
là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản
gồm vỏ capsid, vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm [12].


Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A
Capsde là vỏ protein được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsome.
Capsome lại được cấu tạo từ các đơn vị cấu trúc gọi là protome. Vỏ capsid của virus
có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus.
Màng ngoài có bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế
bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có
khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14
nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất
4

cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các thành phần khác của
virus. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng
1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá
trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm. Vật liệu di truyền (còn gọi là hệ
gene) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn
riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, Pa, Pb1 và Pb2) nối với nhau thành một sợi duy
nhất bên trong vỏ virus. Bộ gen nhiều phân đoạn của virus là nguyên nhân dẫn đến
sự thay đổi kháng nguyên liên tục để trở thành chủng virus mới. Có hai kiểu thay
đổi kháng nguyên là hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) và biến thể kháng
nguyên (antigenic driff). Hoán vị kháng nguyên là sự thay đổi di truyền quan trọng
do sự tái tổ hợp gen giữa các chủng khác nhau tạo ra. Biến thể kháng nguyên là do
đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin dẫn đến sự thay đổi
một số acid amin trong protein haemagglutinin [14], [23], [25].
Tính chất kháng nguyên
Haemagglutinin và Neuraminidase là hai kháng nguyên quan trọng nhất, quyết
định độc tính của virus cúm.
* Haemagglutinin (HA)
HA là một glycoprotein, dạng hình nấm, nhô ra từ màng lipid của virus, phía
ngoài có tán hình cầu. HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của các động vật
máu nóng. HA mang tính chất kháng nguyên và là kháng nguyên quan trọng nhất
quyết định đến tính độc của virus cúm, có khả năng gắn vào thụ thể đặc hiệu của tế
bào chủ. Trong quá trình gây bệnh, virus cúm có 16 loại HA, được kí hiệu từ H1
đến H16.
* Neuraminidase (NA)
NA là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình cây trên bề mặt vỏ của virus
cúm. NA có hai phần: phần phía ngoài gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt
phẳng, vùng còn lại là vùng kỵ nước gắn vào màng virus. NA có chức năng phân
cắt sialic acid bằng cắt các liên kết glycoside nối nhóm keto với D-glactose hoặc D-

glactosesamine của acid sialic. Phản ứng này cho phép virus vượt qua lớp niêm dịch
5


để tới được các tế bào biểu mô của đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. Đồng
thời việc loại bỏ acid sialic của phân tử NA giúp các virion mới được tổng hợp
phóng thích ra ngoài tế bào và gia tăng khả năng gây nhiễm trùng. Virus cúm có 9
phân type NA, được kí hiệu từ N1 đến N9. Cho đến nay chỉ có N1, N2 được xác
định liên quan đến các vụ dịch ở người [14], [25].
1.2. TỔNG QUAN VỀ VACXIN CÚM
1.2.1. Vacxin cúm mùa
Năm 1931, kỹ thuật nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi được phát triển.
Năm 1941, vacxin cúm bất hoạt lần đầu tiên được sản xuất bằng kỹ thuật này và
được phép sử dụng cho quân đội Mỹ trong chiến tranh thế giới thứ 2.
Cho tới nay, vacxin cúm mùa chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi
cấy trên trứng gà có phôi. Có hai loại vacxin cúm truyền thống là vacxin bất hoạt và
vacxin sống.
Ngoài ra, vacxin cúm còn được phát triển để sản xuất trên các dòng tế bào,
bao gồm: MDCK, Vero và PER.C6. Các dòng tế bào này có thể nuôi cấy trong môi
trường không có huyết thanh và đã được chấp nhận để sản xuất vacxin cho người.
Nhờ những tiến bộ của khoa học công nghệ, thế giới đang tiến tới mực tiêu sản xuất
vacxin an toàn hơn và đại trà hơn [9], [25].
1.2.2. Các dạng vacxin cúm mùa
Vacxin cúm mùa chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên
trứng gà có phôi. Có hai loại vacxin cúm truyền thống là vacxin bất hoạt và vacxin
sống giảm độc lực.
1.2.2.1. Vacxin cúm bất hoạt (vacxin chết)
Hầu hết các loại vacxin cúm hiện nay trên thế giới là vacxin bất hoạt 3 thành
phần (kí hiệu TIV) gồm hai chủng cúm A là H1N1, H3N2 và một chủng virus cúm
B. Mỗi liều vacxin chứa 15µg kháng nguyên mỗi chủng virus thành phần.

6


TIV gồm các loại: Vacxin toàn thân, vacxin tiểu phần và vacxin kháng
nguyên tinh chế.
- Vacxin toàn phần virus (whole virus vaccine) là vacxin thế hệ thứ nhất được
sản xuất trên trứng gà có phôi, virus được bất hoạt bằng formalin hoặc β-
propiolactone. Đây là loại vacxin an toàn, dung nạp tốt, hiệu quả bảo vệ 75 – 90 %.
- Vacxin mảnh virus (split vaccine) là vacxin thế hệ thứ hai (1968), cũng được
sản xuất như vacxin toàn thân nhưng không nguyên vẹn hạt virus mà được tách ra
từng mảnh kháng nguyên bề mặt, nucleocapsid, các protein nhờ công đoạn dùng
hỗn hợp hóa chất tây rửa tách bớt các lipid vỏ.
- Vacxin kháng nguyên tinh chế (subunit vaccine) là thế hệ thứ ba (1976)
được sản xuất như vacxin tiểu phần nhưng quy trình tinh chế nghiêm ngặt hơn
vì thế thành phần chính là các protein HA và NA tinh chế, các thành phần khác
của virus bị loại bỏ. Các kháng nguyên tinh chế này được hoàn nguyên trong
các dung dịch lipid tổng hợp virosome. Công thức virosome hiện nay đã được
cấp phép tại Châu Âu.
Để tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch, hiện nay người ta thêm các tá chất trong
công thức sản xuất vacxin cúm: MF-59, hợp chất nhôm. Đây là hai loại tá chất được
cấp phép sử dụng cho vacxin cúm ở Mỹ và Châu Âu [7], [9].

Hình 1. 2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt
7


1.2.2.2. Vacxin sống giảm độc lực
Vacxin sống nhược độc thích ứng lạnh (kí hiệu CAIV) là vacxin khí dung,
miễn dịch bằng đường mũi, được sản xuất từ chủng virus có đặc tính thích ứng lạnh
do đột biến. Chủng mới sao chép thuận lợi ở 25

0
C nhưng trong cơ thể người (nhiệt
độ 35 - 37
0
C) virus sẽ bị nhược độc. Vacxin CAIV hiệu quả cao, miễn dịch liều đơn
0,5 ml và chỉ sử dụng cho người từ 5 - 49 tuổi. CAIV được sử dụng ở liên bang Xô
Viết cũ trong nhiều năm và tại Mỹ năm 2003 cũng được cấp phép xử dụng.
Những nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên cứu và sản xuất vacxin DNA từ
các mảnh gene của virus: gene HA, NA, NP, NS…Tuy nhiên vẫn chưa xác định
được loại vacxin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các virus cúm A [7], [21].
Bảng 1.1 Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin [7]
Loại vacxin Ưu điểm Nhược điểm
Vacxin sống
giảm độc lực
Đơn giản, dễ sản xuất.
Giá thành rẻ, tương đối ổn định.
Gây miễn dịch kéo dài.
Không cần tiêm nhiều lần.
Có thể gây ra bệnh nhẹ, có thể
lây nhiễm virus.
Cần bảo quản lạnh để virus
không chết.
Vacxin bất
hoạt
Đơn giản, dễ sản xuất.
Gía thành rẻ, ổn định.
Khả năng lây nhiễm virus sống
rất thấp.
Cần nuôi tạo lượng virus lớn, có
thể cần tá chất bổ trợ.

Tính miễn dịch có thể không cao.
Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần.
Có thể bị nhiễm bệnh.
Vacxin DNA
Gây đáp ứng miễn dịch hướng
tới từng phần của virus.
Không trở lại thành virus để lây
nhiễm, an toàn.
Khả năng lây nhiễm virus sống
rất thấp.
Ổn định, dễ bảo quản.
Nghiên cứu phức tạp hơn, chi
phí cao.
Cần tá chất bổ trợ.
Tính miễn dịch có thể không cao.
Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần.
8


1.2.3. Các công nghệ sản xuất vacxin cúm
Cả hai loại vacxin cúm bất hoạt và sống giảm độc lực đều có thể được sản
xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi và trên nuôi cấy tế bào.
1.2.3.1. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi
Nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi là phương pháp truyền thống, an toàn,
tin cậy và đã được sử dụng để sản xuất vacxin cúm với quy mô công nghiệp trong
hơn 60 năm qua, chưa có phương pháp nào thay thế được.
Trứng gà có phôi 9 - 12 ngày tuổi được sử dụng để cấy virus. Sau khi gây
nhiễm virus, ủ trứng ở nhiệt độ 33,5
0
C, có độ ẩm 60 - 70%. Sau 72 giờ chuyển

trứng vào buồng lạnh (4
0
C) để qua đêm nhằm diệt phôi và làm co mạch máu. Ngày
hôm sau thu hoạch dịch niệu nang rồi tiến hành các công đoạn tinh khiết virus và
bất hoạt [1], [5].
* Ưu điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi
- Đây là phương pháp sản xuất chuẩn thức được sử dụng rộng rãi hiện nay.
Với công nghệ này, hàng trăm triệu liều vacxin cúm đã được sản xuất và được sử
dụng an toàn trên thế giới.
- Những chủng virus dùng trong sản xuất vacxin cúm đã được tối ưu hóa để
phát triển trên trứng. Vấn đề giấy phép cũng như những phân tích cần thiết đã được
thiết lập và có những chứng cứ thuyết phục.
- Vốn đầu tư ban đầu để xây dựng nhà máy sản xuất ở qui mô vừa và nhỏ, giá
thành vacxin tương đối rẻ.
* Nhược điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi
- Đây là một dây chuyền riêng biệt cho việc sản xuất chỉ một loại vacxin cúm.
Nếu nhu cầu vacxin cúm đột ngột giảm xuống không tận dụng được cơ sở vật chất
đã được nâng cấp sang sản xuất loại vacxin khác vì thế phải tính toán chi tiết khi
đầu tư mở rộng sản xuất.
- Nguồn cung cấp trứng sẽ hạn chế đặc biệt khi dịch xảy ra trên gà.
9


- Chất thải rắn trong qui trình sản xuất sẽ chiếm 80% lượng nguyên liệu cung
cấp. Cần phải có hệ thống sử lý thích hợp.
- Năng suất vacxin sản xuất trên trứng: mỗi một chủng virus có những đặc tính
phát triển trên trứng khác nhau [1], [3], [5].
1.2.3.2. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào
Hiện nay có một số dòng tế bào đang được dùng trong nghiên cứu sản xuất
vacxin cúm: MDCK (tế bào thận chó Madin-Darby) được phân lập vào năm 1958

và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất vacxin cho súc vật; Vero (tế bào thận khỉ
xanh châu Phi) đã được dùng để sản xuất vacxin bại lệt trong hơn 20 năm; PER.C6
(tế bào võng mạc người) là dòng tế bào mới được sử dụng trong nuôi cấy tế bào.
Các dòng tế bào khác: Một vài dòng tế bào khác có thể phù hợp đối với việc
sản xuất vacxin cúm. Tế bào nguyên bào sợi phôi gà (đã được dùng để sản xuất
vacxin sởi) có năng suất tốt với virus cúm. Dòng tế bào Vivalis có nguồn gốc từ gà
(Nantes, Pháp), đang được nghiên cứu trong vài năm gần đây cũng cho thấy có
nhiều hứa hẹn [1], [3].
* Ưu điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào
Nuôi cấy virus cúm trên tế bào sẽ khắc phục được một số nhược điểm của
phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi. Những thuận lợi của phương pháp này
so với phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi bao gồm:
- Không cần phải dùng đến lượng trứng gà lớn. Nguồn cung cấp nguyên liệu
bảo đảm và có thể dự trữ.
- Quy trình này có thể tăng quy mô lên nhanh chóng do sử dụng được công
nghệ trong nhà máy sản xuất các vacxin khác trên tế bào.
- Nâng cao khả năng vô trùng trong quá trình sản xuất. Tránh được nguy cơ
trứng có phôi nhiễm retrovirus.
- Vacxin không có thành phần trứng nên tránh được nguy cơ dị ứng cho những
người có tiền sử dị ứng với protein của trứng.

10


* Nhược điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào
- Chi phí sản xuất vacxin cúm trên tế bào cao hơn so với phương pháp truyền
thống. Các quy trình kiểm định phức tạp hơn như phải phát hiện DNA của tế bào
chủ. Những kỹ thuật này đòi hỏi phương tiện và phải chuẩn thức.
- Tốn thời gian và chi phí để phát triển đủ lượng tế bào cho sản xuất từ ngân
hàng tế bào gốc.

- Các tế bào dùng để sản xuất vacxin thường yêu cầu phải có hồ sơ mô tả toàn
bộ đặc tính của tế bào và hồ sơ về ngân hàng tế bào gốc của nhà sản xuất, mà chúng
thường được cấp sở hữu trí tuệ nên đòi hỏi phải xin giấy phép [1], [3], [24].
1.2.3.3. Một số các phương pháp sản xuất vacxin cúm khác [5], [15]
- Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà
Đây có thể là phương pháp nhanh nhất để mở rộng quy mô sản xuất vacxin
cúm, áp dụng đối với các nhà sản xuất đã sử dụng phương pháp này trong sản xuất
các vacxin khác.
Phương pháp sản xuất này cần sự đầu tư vừa phải về kinh phí và thời gian.
Tuy nhiên phương pháp này cũng có những bất lợi như đòi hỏi phải có trứng sạch
SPF, huyết thanh bào thai bê …
- Vacxin DNA
Vacxin chứa DNA của HA và NA được tiêm trong da dưới dạng đạn bọc
DNA (hãng PowderMed, Oxford Anh). Vì DNA có thể được sản xuất nhanh chóng
cho nên vacxin này đang thu hút sự quan tâm của các nhà chuyên môn. Tuy nhiên
quy trình công nghệ phức tạp và quyền sở hữu trí tuệ gây khó khăn cho việc triển
khai rộng rãi loại vacxin này.
- Vacxin HA theo kiểu vector và tái tổ hợp
Kháng nguyên HA được sản xuất bởi hệ thống virus baculo (hãng Protein
Sciences Corporation, Mỹ) hoặc trong thực vật cấy DNA của virus (hãng Microbix,
Mỹ). Ưu điểm của dạng vacxin này là năng xuất kháng nguyên cao và sản xuất
nhanh. Tuy nhiên khả năng đáp ứng miễn dịch bị hạn chế.
11


1.2.4. Vacxin cúm A/H1N1/09
Người ta nhận thấy rằng vacxin phòng đại dịch cúm có công hiệu bảo vệ
mạnh khi được tiêm trước hoặc gần thời điểm dịch bùng phát. Vì vậy, cần chế tạo
và sản xuất vacxin đặc hiệu dành cho virus cúm A/H1N1/09 càng sớm càng tốt
cũng như có những chiến dịch tiêm phòng đúng lúc đúng chỗ khi đại dịch xảy ra.

Để đối phó hiệu quả với đại dịch, TCYTTG thúc đẩy việc sản xuất vacxin
cúm ở các nước đang phát triển bằng hàng loạt giải pháp: chuyển giao công
nghệ, cấp kinh phí trợ cấp xây dựng cơ sở sản xuất và đào tạo cán bộ, tổ chức
các hội nghị bàn về việc thúc đẩy năng lực sản xuất vacxin trên phạm vi toàn thế
giới [18], [19], [20].
Các chuyên gia đã tổng kết các công nghệ khả thi nhằm sớm đưa sản phẩm ra
thị trường. Tựu chung, nguyên lý công nghệ phải trải qua mấy công đoạn chính sau:
- Thống nhất các chủng giống (do những phòng thí nghiệm chuẩn của
TCYTTG cung cấp).
- Nuôi cấy virus (trên trứng gà có phôi hoặc tế bào).
- Thu kháng nguyên (toàn tế bào bất hoạt, mảnh kháng nguyên hoặc kháng
nguyên tinh chế, vacxin virus sống nhược độc).
- Tá dược: Phổ biến dùng muối nhôm, nhũ tương dầu trong nước (MF-59,
Squalence…).
- Công thức hỗn hợp: Hàm lượng kháng nguyên (từ 3,7 µg HA đến 15
µg/liều).
- Công ty CSL Biotherapies (Úc, Arkville) sản phẩm loại đơn giá - không
dạng split từ chủng NYMC X-179 (USA-New york Medical College) trên trứng gà
có phôi, bất hoạt bằng thiomersal (0,01% w/v), hàm lượng 15 µg/liều 0,25 ml thử
cho người từ 15 - 64 tuổi (240 người) chia 2 nhóm dưới 50 và trên 50 tuổi, liều 15 -
30 µg/ngẫu nhiên, tiêm bắp, lấy máu làm HI (Haemagglutination Inhibition) và
trung hoà vi lượng sau 21 ngày, mức kháng thể HI = 1/40 làm chuẩn. Phản ứng phụ
64,7% ở mức trung bình.
12



Những thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả vacxin cúm A/H1N1 đang
được thực hiện ở nhiều nơi, có 45 nghiên cứu đã được tiến hành tính đến ngày
30/9/2010 [17], [28].

Vacxin của hãng CSL sử dụng chủng NYMC X-179A đang được đánh giá
thực địa ở giai đoạn II. Vào ngày thứ 21 sau khi tiêm vacxin những người tình
nguyện được lấy máu nhằm xác định mức chuyển đổi huyết thanh (HI) kết quả cho
thấy: nhóm người được nhận liều 15 µg có 96,7% (khoảng tin cậy 95% là 91,7 -
98,7) đối tượng đạt HI 1: 40; nhóm người được nhận liều 30 µg có 93,3% (khoảng
tin cậy 95% là 87,4 - 96,5) đối tượng đạt HI 1: 40.
Chủng vacxin của hãng Novatis được tạo ra bằng phương pháp di truyền

ngược, những đoạn gen mã hoá cho Haemagglutinin, Neuraminidase và
Polymerase B1 có nguồn gốc từ chủng A/California/7/2009. Những gen còn lại
được lấy từ chủng virus cúm A/PR8/8/34. Vacxin chứa các kháng nguyên bề mặt
của virus cúm, chất bảo quản thiomersal được ly tâm loại bỏ còn lại rất ít (≤ 1 µg
thủy ngân/liều 0,5 ml, ovalbumin ≤ 1 µg, polymyxin ≤ 3,75 µg, neomyxin ≤ 2,5 µg,
ß-propiolactone < 0,5 µg và nonylphenol ethoxylate < 0,015%). Vacxin có hoặc
không kèm tá chất MF-59 một loại nhũ tương làm từ squalene [17]. Tá chất MF-59
tạo ra đáp ứng kháng thể trong vòng 14 ngày sau khi thực hiện 1 liều tiêm duy nhất.
Nghiên cứu được thiết kế để đánh giá thực địa giai đoạn 1 với 175 người tham gia
(18 - 50 tuổi). Các phác đồ tiêm như sau: 2 mũi vacxin không hấp phụ được tiêm
bắp (7,5 µg HA) vào 2 cánh tay hoặc 1 mũi tiêm vào ngày đầu, mũi còn lại cách
mũi đầu 7, 14 hoặc 21 ngày.
- 2 mũi tiêm vacxin hấp phụ tá chất MF-59 (3,75 µg HA /liều).
- 2 mũi tiêm 7,5 µg HA và 15 µg HA được tiêm cách nhau 21 ngày.
- Vacxin của hãng Sanofi-Aventis loại bất hoạt một thành phần dùng tiêm
bắp sản xuất từ trứng gà có phôi. Vacxin chứa 15 µg HA của chủng virus
A/California/07/2009 (H1N1) cho liều 0,5 ml. Chất ổn định được thêm vào là gelatin
0,05%. Mỗi liều vacxin 0,5 ml chứa một lượng formalin tồn dư không quá 100 µg,
13


polyethylene glycol ether (≤ 0,02%) và sucrose (≤ 2,0%). Chất bảo quản thimerosal

được phép có mặt trong vacxin đa liều, hàm lượng 25 µg.
Vacxin của hãng GSK (Bỉ) là loại mảnh kháng nguyên (split) một thành phần
(monovalent) được tạo ra từ chủng A/California/07/2009 (X-179A) cũng được sản
xuất trên trứng gà có phôi. Vacxin chứa 3,7 µg HA và có kèm tá chất ASO3, một
loại nhũ tương làm từ hợp chất squalene, trong thành phần vacxin có thiomersal.
Ở Việt Nam, hiện có 3 nơi được phép tiến hành nghiên cứu sản xuất vacxin
cúm A/H1N1/09. Tại Trung tâm Nghiên cứu sản xuất Vắcxin và Sinh phẩm Y Tế
(Polyvac) người ta đang tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin bất hoạt từ
chủng X-179 A bằng tế bào Vero hấp phụ trên hydroxit nhôm.
Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (Vabiotech - Hà nội) thực hiện đề tài cấp
nhà nước xây dựng qui trình sản xuất vacxin A/H1N1/09 trên tế bào thận khỉ cũng
đạt được những thành công bước đầu [1], [11].
Viện Vắcxin và Sinh Phẩm Y tế (IVAC) đã sản xuất thành công trên quy mô
thí nghiệm và đã phát triển sản xuất trên quy mô lớn.



14


1.3. Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 [5], [23]

Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi
Vacxin
Bất hoạt, ly giải, lọc vô trùng
Siêu ly tâm phân đoạn sucrose

Sản phẩm giai đoạn 1

S¶n phÈm giai ®äan

2

Tinh sạch

Gây nhi
ễm

Trứng gà có phôi

Thu gặt

Dịch niệu nang

Chủng Virus

15


1.3.1. Tiêu chuẩn của vacxin [8], [9]
Hai tiêu chuẩn quan trọng nhất của vacxin là an toàn và hiệu lực
* An toàn
Một vacxin lý tưởng khi sử dụng sẽ không gây bệnh, không gây độc và
không gây phản ứng nghiêm trọng. Sau khi sản xuất vacxin phải được cơ quan kiểm
định nhà nước kiểm tra chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết và không độc.
- Vô trùng: Vacxin không được nhiễm các vi sinh vật khác.
- Thuần khiết: Ngoài kháng nguyên đưa vào để kích thích cơ thể đáp ứng miễn
dịch chống vi sinh vật gây bệnh, không được lẫn các thành phần kháng nguyên khác
có thể gây ra các phản ứng phụ bất lợi.
- Không độc: Liều sử dụng phải thấp hơn rất nhiều so với liều gây độc.
Tuy nhiên, không có vacxin nào đạt được độ an toàn tuyệt đối. Về nguyên
tắc, vacxin phải đảm bảo đủ độ an toàn. Song trên thực tế không thể đạt được mức
độ an toàn tuyệt đối. Tất cả các vacxin đều có thể gây ra phản ứng phụ ở một số người.
* Hiệu lực
Vacxin có hiệu lực lớn là vacxin gây được miễn dịch ở mức độ cao và tồn tại
trong một thời gian dài. Hiệu lực gây miễn dịch của vacxin trước hết được đánh giá
trên động vật thí nghiệm, sau đó trên thực địa.

Trên động vật thí nghiệm:
Cách thứ nhất, đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch thông qua việc xác định
hiệu giá kháng thể hoặc xác định mức độ dương tính của phản ứng da. Cách đánh
giá này chưa cho biết hiệu lực bảo vệ, mới chỉ cho biết mức độ đáp ứng miễn dịch
của cơ thể động vật đối với loại vacxin thử nghiệm. Cách thứ hai, xác định tỷ lệ
động vật đã được tiêm chủng sống sót sau khi thử thách bằng vi sinh vật gây bệnh.
Trên thực địa:
Dù đã được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra và đã được đánh giá trên
động vật, trước khi đưa ra tiêm chủng rộng rãi, vacxin đều phải được thử nghiệm
trên thực địa: Vacxin được tiêm chủng cho một cộng đồng, theo dõi thống kê tất cả
các phản ứng phụ và đánh giá khả năng bảo vệ khi mùa dịch tới.
16


Ngoài 2 tiêu chuẩn trên, để chọn một vacxin tiêm chủng, người ta còn quan
tâm đến giá thành và tính thuận lợi trong việc tiến hành tiêm chủng.
1.3.2. Tiêu chuẩn của vacxin cúm
Cũng như các loại vacxin khác, vacxin cúm cũng cần đảm bảo được hai tiêu
chuẩn trên. Đối với giai đoạn bất hoạt thì tiêu chuẩn an toàn cần được đảm bảo hàng
đầu. Trong đó các chỉ tiêu, tiêu chuẩn như sau:
- Vô trùng.
- Endotoxin ≤ 200 EU/ml.
- Ovalbumin ≤ 1,0 µg/ml.
- Formalin tồn dư ≤ 0,02%.
- An toàn đặc hiệu: có ít nhất 8/10 trứng gà có phôi sống sau khi được cấy
truyền dịch virus bất hoat và không còn khả năng ngưng kết hồng cầu.
1.4. Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vacxin cúm
Yêu cầu khi sản xuất vacxin là phải an toàn cho người sử dụng. Do đó các
vi sinh vật sử dụng để chế tạo vacxin phải không còn khả năng gây bệnh nhưng
vẫn giữ được tính kháng nguyên, nghĩa là có khả năng kích thích hệ thống miễn

dịch của cơ thể.
Vi sinh vật có thể được bất hoạt bằng các tác nhân hóa học: formalin, beta
propiolactone… hay tác nhân lý học (tia cực tím, nhiệt độ…).
1.4.1. Beta - propiolactone (BPL) [22], [23]
Beta - propiolactone (C
3
H
4
O
2
) là hợp chất hữu cơ thuộc họ lactone, ở trạng
thái lỏng không màu có mùi hăng, vị ngọt. BPL hòa tan trong nước và có thể trộn
lẫn với rượu, axeton, ete, và hầu hết các dung môi phân cực và chất béo. BPL có
khả năng tự thủy phân thành acid hydracrylic trong nước, nhưng ổn định khi bảo
quản ở 5
0
C trong lọ thủy tinh. BPL có cấu trúc vòng bốn cạnh nên có thể thực hiện
phản ứng nở vòng ở cả hai vị trí alkyl và acyl làm cho nó dễ dàng phản ứng với
protein (chủ yếu là methionine, cysteine) và acid nucleic (phần lớn là guanine).
17


Ưu điểm của BPL
- Bất hoạt virus nhanh, hiệu quả.
- BPL có thể bị phân hủy ngay sau vài giờ sử dụng nên ít nguy hiểm.
Nhược điểm
- BPL ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người.
- BPL tan trong nước nên rất khó thao tác và nguy hiểm khi sử dụng.
- Giá thành cao.
Hiện nay BPL cũng đang được sử dụng để bất hoạt virus cúm tại Viện

Vắcxin Hà lan (NVI).
1.4.2. Formalin (Formaldehyde)
Formalin là tên thương phẩm của formaldehyde, một aldehyde đơn giản nhất
có công thức phân tử H
2
CO, có thể tồn tại dưới dạng C
3
H
6
O
3
(trioxane) và dạng
polymer paraformaldehyde. Trong nước, formalin ở dạng H
2
C(OH)
2
. Formalin là
sản phẩn trung gian khi đốt methane hay các hợp chất chứa carbon khác. Trong
không khí, formalin được tạo ra do phản ứng của oxy với methane hay các
hydrocarbon dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời.
Ở nhiệt độ phòng, formalin ở dạng khí, dễ hoà tan trong nước với nồng độ
khoảng 37%, bền vững với methanol 10 - 15%. Trong nước, đa phần formaldehyde
được chuyển thành dạng hydrate hoá CH
2
(OH)
2
hay methanediol [13], [26].
a, Cơ chế bất hoạt virus của formalin [13], [16]
Formalin đã được sử dụng để bất hoạt vi sinh vật trong nhiều năm qua. Cơ
chế tác động của formalin đối với các vi sinh vật như sau:

- Formalin có phản ứng rất mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và
protein và làm bất hoạt chúng, còn có thể làm bất hoạt thông qua việc liên kết
chéo (crosslinking) và alkyl hóa (alkylating) nhóm -NH2, -SH của protein và
vòng nitrogen trong các base purin.
- Formalin phản ứng với các nhóm amino tự do của phân tử protein độc (chủ
yếu là nhóm lysine và các phân tử hai đầu chứa nhóm NH
2
). Ngoài ra, formalin còn
18


phản ứng với các nhóm protein khác như là: nhóm imidazole của histidine, nhóm
hydroxyle của tyrosine và nhóm indole của trypthophane …Tuy nhiên, không phải
phản ứng xảy ra ở tất cả các nhóm, phản ứng còn phụ thuộc vào các yếu tố tác động
bên ngoài như pH môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng…
- Phản ứng giữa formalin với amine chính hay amine thứ cấp:
Amine chính: R-NH
2
+ OCH
2
R-NH-CH
2
OH R-N=CH
2
+ H
2
O
Amine thứ cấp: RR’-NH + OCH
2
RR’-N-CH

2
OH
- Phản ứng amino acid với formalin:
R-CH-NH
3
+ OCH
2
R-CH-NH-CH
2
OH R-CH-N=CH
2
+ H
2
O
COO
-
COO
-
+ H
+

Phản ứng làm thay đổi các mối liên kết trong phân tử protein dẫn đến bất hoạt chúng.
b, Ưu và nhược điểm của formalin
* Ưu điểm
- Bất hoạt virus nhanh do formalin phản ứng mạnh với protein, acid amin và
các acid nucleic.
- Ổn định, hiệu quả cao.
- Giá thành rẻ.
- Dễ sản xuất.
- Là hóa chất được dùng phổ biến trong tiêu độc và bất hoạt vi sinh vật trong

sản xuất nhiều loại vacxin.
* Nhược điểm
- Thời gian phân giải chậm nên quá trình bất hoạt kéo dài.
- Hàm lượng formalin cao ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người.
c, Tình hình sử dụng formalin [3], [16]
Formalin là một hóa chất bất hoạt truyền thống. Năm 1923 vacxin giải độc tố
bạch hầu do Gleumy - Ramon bất hoạt bằng formalin ra đời, tiếp sau đó là các
vacxin vi khuẩn bất hoạt bằng formalin (vacxin tả, ho gà, thương hàn…) và các
vacxin virus (bại liệt Salk, viêm não Nhật Bản, cúm…). Bởi tính an toàn, bất hoạt
19


hiệu quả nên formalin vẫn được các nhà sản xuất sử dụng, gần đây nhất là formalin
được sử dụng thành công trong bất hoạt virus cúm sản xuất vacxin cúm A/H5N1.
Theo khuyến cáo của WHO thì hóa chất bất hoạt virus là formalin hay beta-
propiolacton đều được phép sử dụng trong sản xuất vacxin, nhưng không được vượt
quá nồng độ cho phép (nồng độ theo thể tích không được vượt quá 0,1% bất kỳ lúc
nào trong quá trình bất hoạt). Hàm lượng formalin tồn dư không được vượt quá
0,02% [2], [23].
Dựa vào đó, IVAC đã tiến hành nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1
bất hoạt bằng formalin trên trứng gà có phôi ở quy mô phòng thí nghiệm.
Tuy nhiên, khi phát triển công nghệ sản xuất quy mô công nghiệp cần phải
xem xét các yếu tố:
- Thời gian bất hoạt.
- Hiệu giá HA trước và sau bất hoạt.
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả bất hoạt virus của formalin bao
gồm: nồng độ formalin, nhiệt độ, thời gian bất hoạt và các yếu tố khác (pH môi
trường, tốc độ khuấy đảo ).
- Nồng độ formalin là một trong số 3 yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất trong
quá trình bất hoạt. Ở nồng độ formalin cao khả năng bất hoạt virus càng tốt, song

đến một nồng độ nào đó formalin có thể phá hủy các kháng nguyên của virus, đồng
thời lượng formalin tồn dư trong quá trình bất hoạt nhiều ảnh hưởng không tốt tới
chất lượng vacxin. Ở nồng độ formalin thấp khả năng bất hoạt virus kém, kéo
dài thời gian bất hoạt hoặc virus không được bất hoạt hoàn toàn, hiệu lực bất
hoạt không đạt. Vì vậy, nồng độ formalin lựa chọn phải đảm bảo bất hoạt virus
hoàn toàn, không làm ảnh hưởng tới kháng nguyên của virus, lượng formalin tồn dư
sau bất hoạt thấp, thời gian bất hoạt thích hợp.
- Nhiệt độ bất hoạt không những ảnh hưởng tới khả năng bất hoạt của formalin
mà còn ảnh hưởng tới kháng nguyên của virus. Ở nhiệt độ cao, formalin có thể bị
biến đổi cấu trúc và giảm hoạt động, kháng nguyên của virus có thể bị ảnh hưởng vì
bản chất kháng nguyên là các protein. Nhiệt độ thấp có thể làm giảm hoạt động của