Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học : MÁY ĐIỆN DI part 1 pps

321



Chỉång 15
MẠY ÂIÃÛN DI

Mạy âiãûn di dng âãø phạt hiãûn v xạc âënh ADN trong tãú bo vi sinh váût, thỉûc váût
v âäüng váût.
15.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) V NGUN TÀÕC XẠC ÂËNH
Gen l âån vë di truưn cå bn. Nọ l mäüt âoản ADN (âäi khi ARN) m hoạ thäng
tin cho viãûc täøng håüp sn pháøm sinh hc xạc âënh (ch úu l protein). Nhỉỵng nghiãn
cỉïu hiãûn âải vãư cáúu trục v chỉïc nàng ca ngun sinh cháút â måí ra nhỉỵng hiãøu biãút
måïi vãư cáúu tảo v chỉïc nàng hoảt âäüng ca tãú bo.
Cáúu trục ADN cho phẹp gii thêch tải sao lải cọ kh nàng tng trỉỵ v di truưn
thäng tin tỉì thãú hãû ny sang thãú hãû khạc mäüt cạch äøn âënh v bàòng cạch no nọ thäng tin
di tuưn åí dảng thỉï tỉû sàõp xãúp cạc gäúc nucleotit lải chuøn hoạ thnh phán tỉí protein
chỉïc nàng. Näüi dung nãu trãn liãn quan âãún giạo l trung tám ca di truưn phán tỉí gäưm
3 âiãøm chênh: sao chẹp thäng tin di truưn tỉì ADN bäú mẻ sang ADN con cại, chuøn
âäøi m di truưn tỉì ADN sang ARN - quạ trçnh phiãn m (transcription) v dëch m di
truưn (translation) - thäng tin di truưn tỉì mARN âỉåüc chuøn sang trçnh tỉû sàõp xãúp
âàûc hiãûu ca axit amin trong phán tỉí protein.
Cäng nghãû ADN tại täø håüp - hiãûn l nãưn tng cho sỉû phạt triãøn nhỉ v bo ca
ngnh cäng nghãû sinh hc hiãûn âải.
Cạc phỉång phạp phán têch v täøng håüp hiãûn âải l tạch DNA, xạc âënh thỉï tỉû,
täøng håüp, gàõn xen nọ vo vë trê nháút âënh bãn trong såüi ADN khạc âãø nhán lãn, v räưi lải
tạch ra.
Hiãûn nay hon ton cọ thãø nháûn biãút chênh xạc nhỉỵng âoản ADN âàûc hiãûu qua
cháøn âoạn cạc bãûnh âàûc biãût. Âäúi våïi cạc bãûnh khi cạc gel chỉa âỉåüc xạc âënh thç viãûc
cháøn âoạn kẹm chênh xạc.

Mäüt bäü d tçm âån gin chè l mäüt khục ADN (hồûc ARN) cọ thãø tçm khục bäø
sung våïi nọ bàòng cạch lai (hybridization). Cọ thãø phạt hiãûn sỉû bàõt càûp ny bàòng nhiãưu
cạch, nhỉng phäø biãún nháút l sỉí dủng phỉång phạp tỉû chủp phọng xả våïi bäü d tçm cọ
32p (hçnh 15.1).

322
Viãûc lai bäü d tçm ADN våïi âoản ADN tạch råìi gi l Southern Blotting âỉåüc mä
t trãn hçnh 15.1. Cạc âoản ADN hçnh thnh sau khi ADN bë endonucleaza restrictaza
càõt s âỉåüc tạch råìi ra bàòng phỉång phạp âiãûn di trãn gel agaroza. Khong cạch di
chuøn phủ thüc vo kêch thỉåïc âoản. Cng nh chảy cng nhanh. Sau khi â tạch råìi,
ngỉåìi ta dng kiãưm âãø lm biãún tênh cạc âoản âọ v chuøn chụng lãn mng nylon. Táúm
mng ny âỉåüc våïi dung dëch cọ cháút d tçm cháút phọng xả, nọ chè lai våïi cạc âoản
ADN no chỉïa thỉï tỉû bäø sung.
Viãûc xạc âënh thỉï tỉû ARN (vê dủ mARN) cng cọ thãø theo trçnh tỉû tạch bàòng âiãûn
di ARN trãn gel, chuøn lãn mng nylon v cho lai våïi ADN probe âàûc hiãûu.
Phỉång pha
ïp ny gi l Northern Blotting.

Hçnh 15.1. Lai “bäü d tçm” våïi âoản ADN, tạch ra bàòng âiãûn di
v chuøn sang táúm nylon (Southern blotting)

15.2. CÁÚU TRỤC CA MẠY ÂIÃÛN DI
Mạy âiãûn di gäưm ba bäü pháûn cå bn: khay váûn hnh (hçnh 15.2), nàõp cọ âiãûn thãú
cao v bưng gim xäúc.
N
hỉỵng âoản ADN
s
au khi càõt bàòng
endonucleasa
Tạch âiãûn
di trãn gel
agarosa
B
iãún tênh bàòng kiãưm âãø tạch såüi trung ho
Cạc âoản AD
N

tạch ra theo kêch
thỉåïc
Vë trê âoản ADN
chỉïa thỉ tỉû tỉång
âäưng probe nhán
dng
Â
ënh vë

A
DN
bàòng tia
UV
U
Í
vãût cọ ADN
nhán dng såüi
âån v cọ gàõn
p
họng xả
R
ỉía v
s
ỉû chủp
p
họng xảû
P
h bàòng
mng nylon

323
Khay váûn hnh bao gäưm
khn âục gel, khay di âäüng
trong sút v bt âãûm bàòng
caosu.
Chøn bë khn gel nhỉ
sau: lọt miãúng bt âãûm vo âạy
khay di âäüng v sau âọ áún mảnh
miãúng âãûm vo cảnh khay (ẹp

cho âạy khay di âäüng lt hon
ton vo khay khn trỉåïc khi
hn kên vo miãúng bt).
Trãn nàõp cọ âáưu ra ca m mu, âỉåüc näúi våïi ngưn âiãûn qua âiãûn cỉûc trãn âãú mạy
(hçnh 15.3). Bưng gim xäúc cọ äúng näúi âiãûn cỉûc, bủc di chuøn v läù nảp etylen glycol
/ nỉåïc våïi t lãû 50/50 (hçnh 15.4).


















Ä
Ú
ng näúi âiãûn cỉûc
B
ủc di chuøn
(häù tråü khay váûn hnh)

N
åi (läù) nảp 50/50 etylen
g
lycol / nỉåïc vo
H
çnh 15.4.
B
ưng gim xäúc
H
çnh 15.2. Khay váûn hnh
UV khay di
âäüng trong sút
Miãúng bt âãûm
K
hn âục ge
l
M mu âáưu ra näúi âiãûn cỉûc
trãn âãú mạy våïi ngưn âiãûn
N
àõp thiãút bë
H
çnh 15.3. Nàõp cọ âiãûn thãú cao

324
15.3. CU TRUẽC VN HAèNH
15.3.1. Chuỏứn bở dung dởch
- Chuỏứn bở 250 ml dung dởch õóỷm. Hai dung dởch õóỷm õổồỹc sổớ duỷng phọứ bióỳn cho
õióỷn di ADN õổồỹc chuỏứn bở theo cọng thổùc pha chóỳ dổồùi õỏy.
1. 10X Tris- borate-EDTA. Nguọửn cung cỏỳp chỏỳt õóỷm:

(0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml)
Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g
Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g
Dung dởch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml
Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 1000,0 ml
pH luọn luọn giổợ ồớ 8,2
Trổồùc khi sổớ duỷng vồùi dung dởch loaợng
0,5 X vồùi 45 mM base tris; 45 mM axit boric vaỡ 1 mM EDTA
thổồỡng duỡng pha loaợng bồới vỗ nổồùc coù nhióỷt õọỹ thỏỳp
1X vồùi 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaỡ 2 mM EDTA.
2. 10X Tris- acetate -EDTA Cung cỏỳp cho chỏỳt õóỷm
(0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml)
Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g
Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml
Dung dởch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml
Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 1000,0 ml
Khuỏỳy õóửu õổỡng laỡm giaớm pH. Pha loaợng tồùi 1X trổồùc khi sổớ duỷng tồùi 40 mM base
tris; 20 mM axit axetic vaỡ 1 mM EDTA.
3. Dung dởch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit):
(0,5M; pH 8,0; 100 ml)
Na
2
EDTA.2H
2
O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g
Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 70,0 ml
NaOH (10M) tồùi pH 8,0 5,0 ml
Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 100,0 ml
- Chuỏứn bở bọỹ õóỷm taới mỏựu.
óứ chuỏứn bở bọỹ õóỷm mỏựu cỏửn chuỏứn bở mỏựu õóỷm thổớ (dung dởch mỏựu) vaỡ bọỹ lổồỹc

coù dung tờch khaùc nhau.
Mỏựu õóỷm thổớ
Dung dởch mỏựu
(5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml)

325
Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 7,0 ml
Ficoll 400: 2,5 mg
Phenol bromua xanh (F 691,9): 25,0 mg
Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 10,0 ml
Chụ 1: Sucroza v glyxerol cọ thãø sỉí dủng âãø thay thãú cho ficoll 400.
Chụ 2: Xylen cyanol (0,25 %) m di chuøn cháûm hån phenol bromua xanh, thç
cọ thãø tàng thãm mäüt lỉåüng nãúu mong mún, sỉû cä cản dung dëch agaroza âỉåüc xạc âënh
khi thãm vo cọ liãn quan âãún polynucleotit.
Thãø têch bãøø
Bng 15.1. Nhỉỵng loải lỉåüc
M säú lỉåüc
Bãư dy,
mm
Âäü räüng,
mm
Dung têch
Âäü sáu
80 - 6051 - 88 1 prep/2 ref 1,0 44/6 44/6
*
80 - 6052 - 07 1 prep/2 ref 1,5 44/6 66/9
*
80 - 6051 - 50 8 1,0 6,5 6,5
80 - 6051 - 69 8 1,5 6,5 9,7
80 - 6050 - 74 12 1,0 3,9 3,9

80 - 6050 - 93 12 1,5 3,9 5,8
80 - 6051 - 12 16 1,0 2,6 2,6
80 - 6050 - 31 16 1,5 2,6 3,9
- Chøn bë khong 7 ml dung dëch agaroza ỉïng våïi mäùi mililit chiãưu dy gel (vê dủ
1 gel 3 mm cáưn 0,3×7×10 = 21 ml).
Ho tan agaroza trong dung dëch âãûm , âiãưu chènh nhiãût âäü häùn håüp. Cho phẹp lm
mạt dung dëch âãún 50
0
C trỉåïc khi rọt vo khn.
Âãø quan sạt sỉû phán ly trong hiãûn tỉåüng âiãûn chuøn thỉåìng thãm 0,5 mg/ml etydi
bromua vo dung dëch gel.
15.3.2. Âục gel
- Thiãút bë âàût khay di âäüng: Mäüt tay giỉỵ chàût khn âục, tay kia âàût âáưu khay di
âäüng ạp vo miãûng bt âãûm v sau âọ hả tháúp räưi âàût lãn âoản cúi ca khn âục. Âàût
âáưu cn lải ca khay ạp sạt miãûng bt âãûm.
- Chøn bë lỉåüc: Làõp hai rnh trong lỉåüc vo giỉỵa nhỉỵng âáưu äúc v màût sau lỉåüc.
Siãút chàût äúc. Âàût lỉåüc vo mẹp khn v chènh pháưn cúi ca lỉåüc âãø cạch khay di âäüng
khong 1 mm. Siãút chàût äúc âãø giỉỵ chàõc lỉåüc.
- Di chuøn lỉåüc: Âàût khn làõp rạp lãn màût phàóng nàòm ngang. Âàût äúng nivä lãn
khay di âäüng, nọ nhỉ thiãút bë kiãøm tra xem khn cọ âụng vë trê nàòm ngang khäng.

326

Hçnh 15.5. Màût sau lỉåüc, làõp
trãn vnh ca khn âục, vë trê
lỉåüc trong gel. Hai äúc hiãûu
chènh lỉåüc.
Âãø tảo hai rnh, âàût lỉåüc thỉï
hai vo giỉỵa gel

- Âäø dung dëch agaroza (âỉåüc lm lảnh âãún 50
0
C) vo khn âục. Âënh hỉåïng
lỉåüc âãø cạc bãư màût lỉåüc gáưn miãúng âãûm bt nháút v âàût nọ lãn cảnh khay. Lỉåüc ln
ln åí vo vë trê thàóng âỉïng âãø trạnh sỉû vàûn vẻo hçnh dảng. Âãø chảy lỉåüng máùu gáúp 2
láưn, âàût lỉåüc thỉï hai vo chênh giỉỵa khay. Cho phẹp thåìi gian täúi thiãøu âãø gel âàûc lải l
30 phụt.
- Khi gel â kãút lải, láưn lỉåüt thạo lỉåüc cáøn tháûn. Nháúc mäüt pháưn v nghiãng nhẻ
mäüt âáưu ca lỉåüc, sau âọ rụt tỉì tỉì ra khi gel (kẹo thàóng lỉåüc, tảo ra mäüt khong khäng
âãø cọ thãø nháúc gel ra khi khay).
- Thạo khay di âäüng v gel bàòng cạch nàõm láúy tay cáưm ca khay, áún âáưu ạp vo
miãúng bt âãûm. Khi khay â sảch âãûm thç nháúc ra. Chuøn khay v gel tåïi chäù mạt.
15.3.3. Váûn hnh âiãûn di
1. Lm lảnh nãưn trỉåïc khi tiãún hnh, âàûc biãût khi dng âiãûn ạp cao hån hồûc
khi sỉû phán ly quy âënh trãn 30 phụt.
Chụ ï: Âãø tiãún hnh phán ly, hồûc l thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vo dung dëch
âãûm hồûc thãm 50 mg/ml etydi bromua vo bäü âãûm máùu. Âãø quan sạt, hy càõt âiãûn, thạo
pháưn nàõp v giỉỵ ân cỉûc têm gáưn gel.
Thãm tỉì tỉì etydi bromua vo dung dëch âãûm hay âãûm máùu. Phạt hiãûn bàòng
phỉång phạp ny khäng nhảy bàòng cạch nhüm mu v nhçn qua thiãút bë soi.
2. Âäø dung dëch vo cạc khoang sao cho âãún khi âãûm cao hån gel khong 1 mm
(khong 220 ml).
3. Nảp máù
u. Thãm máùu vo 5X bäü âãûm ti máùu v träün (1/5 thãø têch l âãûm nảp
vo). Sỉí dủng micropipet âãø nảp máùu, chụ trạnh âám thng hồûc tảo nãn nhiãưu bong
bọng.
4. Âàût nàõp âãø catot (−, dáy âen) åí âoản cúi gáưn máùu nháút. (Máùu axit nucleic di
chuøn vãư phêa anät, +, dáy â). Näúi cạc dáy mu (â våïi â, âen våïi âen) tåïi cạc ngưn
âiãûn, nhỉ l ESP 2A200. Âàût mỉïc âiãûn ạp v thiãút bë báúm giåì (nãúu cọ sàơn) theo mỉïc âäü
phán ly.

Màût sau lỉåüc
ÄÚc (2)
L
ỉåüc