SO SÁNH TÁC DỤNG THỦY PHÂN ĐẬU HŨ BẰNG PHỨC HỆ ENZYME CỦA Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp. ĐỂ CHẾ BIẾN THỨC UỐNG CHỨC NĂNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
-------    -------



TRƯƠNG THỊ NHƯ HIẾU



SO SÁNH TÁC DỤNG THỦY PHÂN
ĐẬU HŨ BẰNG PHỨC HỆ ENZYME
CỦA Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp.
ĐỂ CHẾ BIẾN THỨC UỐNG CHỨC NĂNG



LUẬN VĂN THẠC SĨ VI SINH VẬT HỌC







Thành phố Hồ Chí Minh – 2010

LỜI CẢM ƠN

Có được thành quả như ngày hôm nay, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

 Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Chiến Phương đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn
cũng như những kinh nghiệm sống quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
 Ban giám hiệu trường ĐHSP TP HCM, quý thầy cô bộ môn Vi sinh vật đã giảng dạy, hướng dẫn để
tôi có được nền kiến thức như ngày hôm nay.
 Các anh chị em phòng thí nghiệm Biến đổi sinh học - Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
 Các bạn học viên cao học niên khóa 2007- 2010 ngành Vi sinh vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho
tôi trong thời gian thực hiện luận văn.
 Cuối cùng tôi xin cảm ơn ba mẹ và những người thân yêu đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
TP.HCM, tháng 08 năm 2010
Trương Thị Như Hiếu














LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực, kết quả thí nghiệm được lặp lại tối thiểu 3
lần và chưa ai công bố.


Tác giả luận văn
Trương Thị Như Hiếu
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bs
TC
Bacillus subtilis sp. phân lập từ chao
Bn Bacillus natto phân lập từ sản phẩm nattospes
CP Môi trường cá peptone
ĐC Đối chứng
ĐVHT Đơn vị hoạt tính
MT Môi trường
NB Nutrient Broth
NA Nutrent agar
PGA Potato glucose agar
OD Trị số mật độ quang
TCA Trichloroacetic
TK
m
Lactobacillus sp. phân lập từ mẻ cơm lên men
PTHQ Phương trình hồi quy

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Đậu nành là một trong những loại cây trồng phổ biến trên thế giới, nó được xem là nguồn
dinh dưỡng tuyệt hảo của nhân loại bởi nó chứa đầy đủ các dưỡng chất cần thiết như protein, lipid,
cacbohydrat và các hoạt chất hữu cơ khác. Đặc biệt, nó được xem là dạng thực phẩm đứng đầu về
hàm lượng protein có nguồn gốc thực vật. Không chỉ vậy, trong nhiều nghiên cứu đã chứng minh
đậu nành còn có tác dụng giảm chlolesterol trong máu, giúp ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, ngăn
ngừa bệnh ung thư, bệnh tiểu đường và các rối loạn tiền mãn kinh phụ nữ …[23]
Tháng 10 năm 1999, cơ quan kiểm tra dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã đưa ra kết
luận: “Sử dụng 25 gam protein đậu nành (có trong 65-70 gam đậu nành) trong khẩu phần ăn hàng
ngày có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch”. [25]
Tuy có giá trị dinh dưỡng và chức năng cao nhưng trên thực tế ở nước ta hiện nay đậu nành
lại xếp vào nhóm có sức cạnh tranh yếu trong nền kinh tế quốc dân. [24]
Một trong những lý do chính là hiện nay các sản phẩm từ đậu nành phần lớn là các sản phẩm
truyền thống, thường mặn (tương chứa 18-20% NaCl, chao có 7-9% NaCl) không dùng được một
lượng lớn trong một khẩu phần; ít có sản phẩm mới có giá trị công nghệ sinh học và thực phẩm
chức năng (dùng vi sinh vật có vai trò probiotic) để chế biến thực phẩm. [23]
Trong thời gian gần đây, trên thị trường trong nước có xuất hiện một số sản phẩm như
Biosubtil, Bioascimil, Anti-bio, …dạng bột, đóng gói nhỏ, mỗi gói từ 1-3 gam, có chứa khoảng 10
8
-
10
9
vi khuẩn Bacillus subtilis và vi khuẩn lactic, có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa. Từ năm 2007 có sản
phẩm Nattospes chứa enzyme nattokinase từ vi khuẩn Bacillus natto, theo quảng cáo là enzyme duy
nhất có khả năng làm tan sợi huyết (fibrin) ngăn cản sự tạo huyết khối gây chứng tai biến mạch máu
não, nhồi máu cơ tim. Ở nước ta có sản phẩm chao, theo TS. Lê Chiến Phương [20] có chứa vi
khuẩn Bacillus subtilis có tác dụng tượng tự và có thể so sánh được với Bacillus natto. Vì vậy,
chúng tôi tiến hành đề tài “So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của Bacillus
subtilis sp. và Bacillus natto sp. để chế biến thức uống chức năng”.
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
- Xác định được chủng vi khuẩn nào có phức hệ enzyme thủy phân đậu hũ tốt hơn để chế biến thức

uống chức năng có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa và có vai trò probiotic.
- Xây dựng được quy trình sản xuất thức uống chức năng từ đậu hũ.
- Đáp ứng xu hướng giảm tiêu thụ chất đạm và chất béo động vật thay bằng đậu nành có nguồn gốc
thực vật.
- Góp phần đưa đậu nành ra khỏi nhóm có cạnh tranh yếu trong nền kinh tế quốc dân.
3. NÉT MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis sp. (sau khi so sánh với Bacillus natto sp.) thủy phân đậu hũ để
chế biến thực phẩm chức năng, là tác nhân probiotic thứ nhất.
- Dùng vi khuẩn lactic (là tác nhân probiotic thứ 2) ức chế hoạt động vi khuẩn Bacillus vừa đủ để
bảo quản thực phẩm mà không dùng hóa chất.
- Bước đầu tạo sản phẩm mới: thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic.





CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐẬU NÀNH
1.1.1. Lịch sử phát triển
Đậu nành được xem là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại. Nhiều nghiên cứu
chứng minh rằng đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc. Nó được trồng trên nhiều loại đất khác
nhau và có phạm vi khí hậu rộng khắp, trải dài từ vùng nhiệt đới Brazil đến hòn đảo Hokkaido đầy
tuyết nằm ở phía Bắc Nhật Bản. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã tìm thấy vai
trò của đậu nành trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm. Vì vậy, đậu nành ngày
càng lan rộng khắp thế giới. [36]
1.1.2. Cây đậu nành
Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, thuộc:

Hình 1.1. Cây đậu nành

Đậu nành là cây bụi nhỏ, cao trung bình dưới 1m, có lông toàn thân, có 3 chét hình bầu dục,
bông trắng hoặc tím, trái có nhiều lông vàng có từ 3-5 hạt.
Cây đậu nành là cây ngắn ngày, phát triển tốt ở vùng nhiệt đới, ưa sáng, ưa nhiệt, chịu hạn,
trồng vào cuối mùa xuân, đầu mùa hè. [6]
Là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế, dễ trồng, sản phẩm từ nó rất đa dạng.
Ngoài ra, cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác nhờ
hoạt động cố định N
2
của Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu.
1.1.3. Hạt đậu nành
1.1.3.1. Hình thái, cấu trúc [10]
* Hình dạng: hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau như hình tròn, bầu dục, tròn dài,
tròn dẹt, chùy dài.
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp Magnoliopsida
Bộ Fabales

Họ Fabaceae
Phân họ:
Faboideae
Chi Glycine
Loài
G. max

* Màu sắc: vàng, xanh, nâu hoặc đen và các màu trung gian nhưng màu vàng là tốt nhất nên
được trồng và sử dụng nhiều.
* Cấu trúc hạt: gồm 3 phần chính là vỏ hạt, phôi và tử diệp.
- Vỏ: là lớp ngoài cùng của hạt đậu nành, có nhiều loại màu sắc và là yếu tố cho việc xác
định giống đậu nành, có tác dụng bảo vệ phôi mầm.
- Phôi: là rễ mầm, là phần sinh trưởng của hạt khi nảy mầm.
- Tử diệp: gồm hai lá mầm tích trữ dinh dưỡng cho hạt.
Bảng 1.1. Thành phần các chất có trong hạt đậu nành (% khối lượng) [15]







1.1.3.2. Thành phần hóa học
So với các nguyên liệu thực phẩm chính hiện nay, đậu nành thực sự giàu dinh dưỡng, vừa có
nguồn protein cao nhất trong các loại đậu vừa là dược liệu quý.
Đậu nành có hàm lượng dinh dưỡng thay đổi rộng phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng
trọt nhưng nhìn chung chúng chứa 35-40% protein, 15-25% chất béo, 15-30% carbohydrate; các
muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa,
cellulose và khoảng 5% tro. [29]
Theo số liệu phân tích của công ty Ajinomoto, Thái Lan 1994, hàm lượng dinh dưỡng của

hạt đậu nành Việt Nam như bảng 1.2.
Bảng 1.2. Hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam [20]

Chỉ tiêu

Đơn vị

Hạt đậu
nành ở
Đồng Nai
Hạt đậu
nành ở
An Giang
Khô đậu
nành ép
công
nghiệp
Khô đậu
nành ép
thủ công
Protein thô
Lipid thô
Acid linoleic
Lysin
Methionin
%
%
%
%
%

35,56
17,10
8,00
2,05
0,54
38,06
18,00
8,45
0,39
0,59
47,81
1,50
0,60
2,66
0,61
42,94
3,00
1,40
2,72
0,57
Thành phần
% khối lượng
toàn hạt
Protein
(%)
Lipid
(%)
Carbohydrate
(%)
Tro

(%)
Hạt đậu nành
Tử diệp
Vỏ hạt
Phôi
100
90
8,0
2,0
40,0
43,0
8,8
41,1
20,0
23,0
1,0
11,0
35,0
29,0
86,0
43,0
4,9
5,0
4,3
4,4
Systine
Treonin
Arginin
Phenilalanin
Valin

Leucin
Isoleucin
Serin
%
%
%
%
%
%
%
%
0,61
1,35
2,11
1,49
1,62
2,68
1,51
1,73
0,72
1,53
2,62
1,76
1,74
3,03
1,67
2,05
0,72
1,69
3,03

1,83
1,85
3,39
1,65
2,34
0,75
1,67
2,85
1,95
1,84
3,32
1,77
2,27

Isoflavones trong đậu nành dao động từ 4.39 mg/g đến 15.58 mg/g, có khả năng phòng chống
nhiều loại bệnh ung thư và bệnh tim mạch.
Ngoài ra, đậu nành cũng rất giàu chất khoáng và nhiều chất xơ.
Bảng 1.3. Thành phần khoáng trong đậu nành
Thành phần Tỷ lệ (%)
Calci 0.16 – 0.47
Phospho 0.41 – 0.82
Mangan 0.22 – 0.24
Kẽm 0.37 g/kg
Sắt 90 – 150 mg/kg
Bảng 1.4. Thành phần vitamin của đậu nành
Thành phần Tỷ lệ (%) Thành phần Tỷ lệ (%)
Thiamin 11 – 17.5 % Inositoe 2300 mg%
Riboflavin 3.4 – 3.6 % Vitamin A 0.18 – 2.43 %
Niacin 21.4 – 23 mg/g Vitamin E 1.4 mg%
Pyridoxin 7.1 – 12 mg/g Vitamin K 1.9 mg%

Biotin 0.8 mg/g Vitamin B
1
0.54 mg%
Pantothenic acid 13 – 21.5 mg/g Vitamin B
2
0.29 mg%
Folic acid 1.9 mg/g Vitamin PP 2.3 mg%

Enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase, được biết đến là lipoxydase xúc tác phản ứng
oxy hóa acid béo không bão hòa bởi O
2
, gây mùi đậu nành.
Enzyme urease có nhiều ở đậu nành sống, phân hủy ure thành amoniac, là một hợp chất độc
với cơ thể người do đó không nên ăn đậu nành sống. [15]
1.1.4. Công dụng của đậu nành [37]
Đậu nành có chứa rất nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu và là nguồn cung cấp calci,
chất xơ, sắt và vitamin nhóm B. Các hợp chất isoflavon và hóa thảo (phytochemicals) khác trong
đậu nành có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau tim, tai biến mạch máu não, ung
thư vú, ung thư kết tràng… (Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại
học Alabama. Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần Lan). Những hóa thảo đậu nành gồm:
- Protease inhibitors: ngăn ngừa sự tác động của một số gene di truyền gây nên chứng ung
thư, bảo vệ tế bào cơ thể khỏi tác hại của môi trường sống.
- Phytates: ngăn cản tiến trình gây bệnh ung thư kết tràng và ung thư vú, có khả năng tiêu
diệt chất làm tế bào bị ung thư và phục hồi những tế bào bị hư hại.
- Phytosterols: ngừa các bệnh tim mạch bằng cách kiểm soát lượng cholesterol máu, giảm sự
phát triển các bướu ung thư kết tràng và chống ung thư da.
- Saponins: hoạt động như chất chống oxy hóa bảo vệ tế bào cơ thể, trực tiếp ngăn cản sự
phát triển ung thư kết tràng và làm giảm lượng cholesterol trong máu.
- Phenolic acid: là một hóa thảo chống oxy hóa và phòng ngừa các DNA bị tế bào ung thư
tấn công.

- Lecithin: là một hóa thảo làm tăng trí nhớ bằng cách nuôi dưỡng tốt các tế bào thần kinh,
làm chắc các tuyến, tái tạo các mô tế bào cơ thể, cải thiện hệ thống tuần hoàn, bổ xương và tăng
cường sức đề kháng.
- Omega-3 fatty acid: là chất béo không bão hòa có khả năng làm giảm lượng cholesterol xấu
đồng thời làm tăng lượng cholesterol tốt trong máu.
- Isoflavones (phytoestrogens): là một hóa thảo hoạt động giống estrogen, có khả năng chống
lại các tác nhân gây nên chứng ung thư liên hệ đến hormon.
1.1.5. Một số sản phẩm từ đậu nành trên thế giới
1.1.5.1. Những sản phẩm đậu nành ở phương Tây






Hình 1.2. Một số sản phẩm đậu nành ở phương tây
Những sản phẩm này, được phát triển tại Tây phương trong nhiều thập niên qua bởi những kỹ
thuật cao cấp bao gồm:
Defatted soy flour and grits chứa từ 50 đến 52 % protein, được tách dầu trong quá trình xay
nghiền hạt đậu thành bột, nhiều xơ.
Soy protein concentratres chứa khoảng 70 % protein, thường được dùng để làm giả thịt bằm,
thức ăn sáng và thức ăn cho trẻ sơ sinh.
Soy protein isolates có chứa từ 90 đến 95% protein, khoảng 19% methionine bị mất trong tiến
trình biến chế.
Textured soy proteins chứa khoảng 52% protein, được tạo sợi dưới áp suất và nhiệt độ cao từ
sản phẩm defatted soy flour, sau đó thêm màu và gia vị để giống như mùi vị thực phẩm có nguồn
gốc thịt.
Soy flour là loại protein đậu nành đơn giản nhất, nó được xay, sàng lọc và không có chất tinh
bột nên được dùng như là một loại thực phẩm ăn kiêng.
Dầu đậu nành không có protein nhưng rất giàu chất béo không bão hòa và linoleic acid,

lecithin có trong loại dầu đậu nành chưa lọc rất tốt cho não.
Thực phẩm đậu nành ăn nhanh (Fast food)
Số người ăn chay bằng thực phẩm đậu nành càng ngày càng gia tăng tại Hoa Kỳ nên các nhà
chế tạo thực phẩm đã biến chế thực phẩm đậu nành thành những loại thức ăn nhanh, tiện nghi và bổ
dưỡng như Vons, Lucky, Hughs v.v…
1.1.5.2. Những sản phẩm đậu nành ở phương Ðông

Những sự hiểu biết về đậu nành thực sự bắt đầu ở Ðông phương và đã trở thành một phần của
nền văn hóa Châu Á. Họ đã chế biến thành những thức ăn như là một nghệ thuật của gia đình và
từng địa phương. Những thực phẩm này bao gồm đậu hũ, sữa, nước tương, mì căn, tàu hũ ky,
tempeh, miso, natto..v..v..
* Tempeh là bánh làm từ đậu nành và bột gạo lên men, nổi tiếng tại Indonesia, chứa 9%
protein đậu nành, nhiều chất xơ và ít chất béo hơn đậu hũ và sữa đậu nành.






Hình 1.3. Sản phẩm tempeh
* Miso là hỗn hợp lên men gồm đậu nành, bột gạo, muối
và nước, rất phổ thông tại Nhật Bản và Trung Hoa.
Có sáu loại miso khác nhau nhưng mỗi thứ đều có chứa
khoảng 13% protein, 13% muối, bảo quản trong tủ lạnh.


Hình 1.4. Các loại miso
* Nước tương (soy sauce) rất phổ thông ở Châu Á.
Làm từ hỗn hợp đậu nành, gạo nếp, muối, nấm mốc và
nước; ủ từ 3 đến 12 tháng tùy theo loại.

Ở Việt nam, có nhiều loại tương như tương Tàu, tàu vị
yểu, tương Bần Hưng Yên, tương Cự Ðà hay tương Nam
Ðàn. Tương Việt Nam không khử trùng theo phương pháp
Pasteur. Hình 1.5. Sản phẩm tương

* Chao (soya cheese) là sản phẩm được lên men từ đậu phụ nhờ
các loài nấm mốc: Actinormucor elegans, M.hiemalis, M.sivticus,
M.subtilis thủy phân đậu hũ thành các chất dinh dưỡng đơn giản,
dễ hấp thu. [15]

Hình 1.6. Sản phẩm chao
* Natto là một loại thực phẩm lên men truyền thống của người Nhật Bản, có hai loại: natto sợi
(sử dụng vi khuẩn để lên men) và natto muối (sử dụng nấm mốc để lên men). Đậu nành luộc chín ủ
với Bacillus natto ở 40
o
C từ 14 – 18 giờ thành những hạt đậu có màu nâu, độ nhớt cao và có mùi
nồng. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất, độ nhớt càng cao thì chất lượng natto càng tốt và vị càng
ngọt. [15]







Hình 1.7. Hình sản phẩm natto
* Đậu hũ và thành phần dinh dưỡng [3]
Ðậu hũ rất phổ thông ở các nước Châu Á. Được làm
từ đậu nành, dễ ăn, dễ chế biến và còn được xem như
dược phẩm, có tác dụng ngăn ngừa nhiều bệnh tật.

Có ba loại là loại loại cứng (firm tofu), loại mềm
(soft tofu) và loại đậu hũ lụa (silken tofu).
Hình 1.8. Sản phẩm đậu hũ
Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng đậu hũ
Thành phần dinh dưỡng Đậu hũ cứng Đậu hũ mềm Đậu hũ lụa
Calories 120 86 72
Protein (g) 13 9 9,6
Chất béo (g) 6 5 2,4
Chất béo bão hòa (g) 1 1 0
Carbohydrates (g) 3 2 3,2
Calci (mg) 120 130 40
Natri (mg) 9 8 76
Cholesterol (mg) 0 0 0
Sắt (mg) 8 7 1
Xơ (mg) 1 0 0
% calories từ protein 43 39 53
% calories từ carbohydrate 10 9 17
% calories từ chất béo 45 52 30
Nguồn: Composition of Foods: Legumes and Legume Products. United States Department of
Agriculture, Human Nutrition Information Service, Agriculture Handbook 8-16. Revised 12-1986.
1.2. KHÁI QUÁT VỀ THỨC UỐNG CHỨC NĂNG
1.2.1. Định nghĩa [41]
* Thực phẩm: tất cả các chất đã hoặc chưa chế biến nhằm sử dụng cho con người gồm đồ
ăn, uống, nhai, ngậm, hút và tất cả các chất được sử dụng để sản xuất, chế biến hoặc xử lý thực
phẩm, nhưng không bao gồm mỹ phẩm hoặc những chất chỉ được dùng như dược phẩm.
* Thực phẩm chức năng
Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về thực phẩm chức
năng, mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về thực phẩm chức năng. Gần đây các định
nghĩa về thực phẩm chức năng được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau.
+ Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC), định nghĩa: “ Thực phẩm chức năng là thực

phẩm mang đến những lợi ích cho sức khoẻ vượt xa hơn dinh dưỡng cơ bản”.
+ Hiệp Hội nghiên cứu thực phẩm Leatherhead (châu Âu): “Thực phẩm chức năng là thực
phẩm được chế biến từ thức ăn thiên nhiên, được sử dụng như một phần của chế độ ăn hàng ngày và
có khả năng cho một tác dụng sinh lý nào đó khi được sử dụng”.
+ Bộ Y tế Việt Nam: Thông thư số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 về việc “Hướng dẫn việc
quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa ra định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực
phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo
cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”.
Khái quát lại có thể đưa ra một định nghĩa như sau: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm
(hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận
trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm
bớt nguy cơ bệnh tật”.
Như vậy, khái niệm thức uống chức năng nằm trong khái niệm thực phẩm chức năng.
1.2.2. Khái quát về probiotic
1.2.2.1. Khái niệm
Probiotic là các vi khuẩn sống khi được cung cấp với liều lượng thích hợp sẽ đem lại lợi ích
sức khỏe cho vật chủ. (Theo định nghĩa của FAO và WHO 2001)
1.2.2.2. Vai trò [26]
- Tăng “thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích miễn dịch đặc hiệu và không
đặc hiệu.
- Ngăn cản sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong đường ruột như: Staphylococcus,
Salmonella, Yersinia, Clostridia.
- Có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột.
- Có khả năng chịu được acid dạ dày, chịu được muối mật.
- Phòng và chữa một số bệnh tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày, …
- Hạn chế sự hình thành các khối u nhờ làm giảm hoạt động enzyme tiết ra từ vi khuẩn có hại
góp phần tạo ra các chất gây ung thư và giảm nguy cơ ung thư ruột.
- Probiotic có khả năng sản xuất ra lactase giúp tiêu hóa lactose.
- Tái thiết lập hệ vi sinh có ích nhanh chóng sau khi dùng kháng sinh.
1.2.2.3. Các yêu cầu đối với vi sinh vật probiotic [33]

Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic muốn đạt hiệu quả mong muốn cần phải đáp ứng đúng
một số yêu cầu:
- Phải được định danh chính xác, đúng tên chủng loài vi sinh vật.
- Cư trú ở người, không độc, không gây bệnh.
- Đủ số lượng để trị liệu: khoảng 10
8
-10
9
tế bào trong một ngày.
- Có khả năng tồn tại khi đi qua dạ dày, nơi có môi trường acid, pH từ 1-4 .
- Chịu đựng được khi qua ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra cao nhất.
- Sinh ra một số chất kháng sinh, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể.
- Di truyền ổn định.
- Không chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi sinh vật khác.
- Không được mang vào cơ thể những vi sinh vật gây bệnh.
- Có khả năng cạnh tranh và lấn át với những vi sinh vật gây bệnh và bám vào niêm mạc
đường tiêu hóa.
1.2.2.4. Các chủng vi sinh vật thường dùng làm probiotic
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc
Lactobacillus và Bifidobacterium, còn Enterococus và Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít
hơn. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là
probiotic.
Bảng 1.6. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người

(Taylor & Francis, 2004)
1.2.2.5. Một số loại sản phẩm mới từ đậu nành hiện nay trên thị trường
* Sữa chua đậu nành (soy yogurt)
Sữa chua đậu nành được làm giống như sữa chua từ sữa bò. Sữa đã tiệt trùng được lên men
với Acidophilus, Bifida hoặc với các canh trường phù hợp và được lên men cho tới khi canh trường
chuyển từ sữa đậu nành sang dạng sữa chua, có vị tương tự như sữa chua từ sữa bò. [30]
Năm 1981, tại Nhật lần đầu tiên sản xuất soy yogurt số lượng lớn. [28]
* Nước mắm chay đậu nành
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu để sản xuất nước mắm chay, như theo Lê Minh Hoàng -
Trường ĐH An Giang, sử dụng Bacillus subtilis sp. để lên men đậu hũ tạo sản phẩm nước mắm
chay, …
Ngoài việc sử dụng đậu nành trong thực phẩm, còn có một số chế phẩm đặc biệt đáng chú ý
được bán tại các Health Food Store gồm:
Chủng Lactobacillus Chủng Bifidobacterium Các vi sinh vật khác
L. acidophilus
L. amylovocus
L. casei
L. crispatus
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracaseii
L. plantarum
L. reuteri

B. adolescentis
B. laimalis
B. bifidum
B. brevis
B. infantis
B. lactis
B. longum
Propionibacterium
freudenreichii
Enterococcus faecalis
Lactococus lactis
Leuconostoc mesenteroides
Streptococus thermophilus
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces boulardii

- Soy Biotic trị các triệu chứng khó chịu của phụ nữ vào thời kỳ tắt kinh.
- Magic 851 giúp tăng sự hoạt động của hệ miễn nhiễm và ngăn ngừa ung thư với các chất cô
đặc từ đậu nành . [37]
1.3. CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SỬ DỤNG
1.3.1. Bacillus subtilis và Bacillus natto
1.3.1.1. Hệ thống phân loại [40]
Giới: Prokaryota
Ngành: Protophyta
Lớp: Schyzomycetales
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Bacillus natto

1.3.1.2. Phân bố [20]
B.subtilis và B.natto có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ nên
còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được
chế biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì, B.subtilis chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo bào tử.
Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… cũng
có mặt của chúng và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học.
1.3.1.3. Hình thái [8],[31]
Bacillus là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0.5-2.5 x 1.2-10m, thường xếp thành cặp
đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0.9 –
0.6m, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không
chính tâm.
Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiên mao, về già, tiên mao
rụng nên mất khả năng di động.
Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch.









Hình 1.9. Vi khuẩn B.subtilis Hình 1.10. Vi khuẩn B.natto
1.3.1.4. Cấu trúc [37]
Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có
các đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao. Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các
lớp giác mạc, lớp bề mặt có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lót peptidoglycan và các protein
trên mặt ngoài của màng tế bào.

Hình 1.11. Bề mặt vi khuẩn Bacillus

(C=Capsule, S=S-layer, P=Peptidoglycan)
S-layer
Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus. Chức năng chưa được xác định rõ ràng
nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vi khuẩn.
Giáp mạc (capsules)
Thành phần hóa học của lớp vỏ nhầy ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau, thường là
được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cả polypeptide nhưng thành
phần chủ yếu là nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống lại
quá trình khô.
Vách tế bào
Vách tế bào rất mỏng (100-200A
0
), trong suốt không màu. Vách tế bào có tính chất đàn hồi
và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao. Thành phần hóa học chủ yếu là glucid, một số
chất béo, protide, các acid amin và chúng thay đổi tùy loại vi khuẩn, tùy môi trường sống.
Tiên mao (flagella)
Hầu hết các vi khuẩn tạo bào tử hiếu khí đều di động nhờ vào các tiên mao là các sợi lông rất
mảnh mọc trên những phần xác định của tế bào vi khuẩn, có cấu trúc là protid. Chiều dài tiên mao
thường bằng chiều dài tế bào nhưng cũng có thể dài hơn tùy loại vi khuẩn. Số lượng và vị trí tiên
mao ở các tế bào vi khuẩn khác nhau ở mỗi loài. Chúng có thể mọc ở một đầu, hai đầu hoặc mọc
xung quanh, …
1.3.1.5. Sự hình thành bào tử [5]
Một trong những đặc điểm quan trọng của B.subtilis và B.natto là khả năng tạo bào tử trong
những điều kiện nhất định. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng áp suất

thẩm thấu. Trong thời kỳ nghỉ, bào tử vi khuẩn ở trạng thái sống ẩn (cryptobiosis). Đã có những
chứng cứ về việc duy trì sức sống 200-300 năm của bào tử vi khuẩn Bacillus.
Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất
có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử. Về mặt hình thái, có thể chia quá trình hình
thành bào tử ra thành các giai đoạn:
- Hình thành những búi chất nhiễm sắc.
- Tế bào phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử.
- Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.
- Kết thúc việc hình thành áo bào tử.
- Kết thúc tạo vỏ bào tử, bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt.
- Bào nang vỡ ra; bào tử thoát ra ngoài.
1.3.1.6. Hệ enzyme [13], [27]
* Hệ enzyme protease
- Các enzyme protease (peptid – hydrolase) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid
trong các peptid hoặc protein.

- B. subtilis và B.natto có khả năng tổng hợp protease trung tính và kiềm.
- Chúng tổng hợp protease ngoại phân (exoprotease) phân giải protein và các cơ chất cao
phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ hấp thụ.
Đây là chức năng rõ nhất của protease ngoại bào.

- Theo Otrosko và tập thể (1977) thì glucose, saccharose, mantose, fructose, socbit là
nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình tổng hợp protease ở B.natto var.amylolyquefaciens 795.
* Hệ enzyme amylase
- B. subtilis, B.natto có khả năng tạo một lượng lớn

- amylase.
- Amylase của B. subtilis và B.natto không có các liên kết sulfihidril và có khả năng phân
giải tinh bột nhanh gấp 2÷2,5 lần so với


- amylase nấm mốc.
-

- amylase của vi khuẩn B. subtilis cũng như của B.natto thủy phân tinh bột tạo ra các
dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc glucose. Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ:
G
6
→ G
1
+ G
5
G
7
→ G
1
+ G
6
hay G
2
+ G
5
(ít)
G
8
→ G
2
+ G
6
hay G
3

+ G
5
(ít)
- Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân cơ chất bởi amylase là glucose và maltose. Ở vi
khuẩn tỉ lệ này là 1: 5.
- pH tối thích cho dextrin hóa và đường hóa của

- amylase là từ 5,6÷6,2.
1.3.1.7. Công dụng [19],[27]
- Tạo kháng sinh: subtilin, eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại vi trùng gây
bệnh.
- Người ta cũng thường thu

- amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp dệt để tách
hồ tinh bột trên vải từ B. subtilis.
- Chế phẩm amylase từ B. subtilis được thay thế đại mạch nảy mầm (malt) làm tác nhân
đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột.
- B.subtilis và B.natto có khả năng tạo một lượng lớn -amylase ngoại bào. -amylase của
chúng bền nhiệt hơn và phân giải tinh bột nhanh hơn 2 – 2.5 lần so với enzyme của nấm mốc.
1.3.2. Vi khuẩn lactic
1.3.2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic [5],[3]
Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí tuỳ ý, hầu hết không di động. Tế bào ở
dạng cầu khuẩn (đường kính 1µm) hay trực khuẩn (kích thước 1 x 2-3µm). Tồn tại ở dạng tế bào
đơn, kết đôi, kết tư (tetracoccus) hay kết thành chuỗi. * Theo khóa phân loại Bergey, vi khuẩn
lactic thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Lactobacillaceae

Giống: Lactobacillus
Pesiococcus
Họ: Enterococcaceae
Giống: Enterococcus
Họ: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Họ: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus
Lactococcus
* Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm [8]:
- Vi khuẩn lactic đồng hình
Tham gia vào quá trình lên men lactic đồng hình mà sản phẩm chính tạo thành là acid
lactic (90-98% tổng sản phẩm lên men), có thể có một ít các sản phẩm phụ như: ethanol, acid acetic,
acetoin, CO
2
.
Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghiệp thực
phẩm, đặc biệt là trong công nghiệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Chúng đóng vai trò quan
trọng cùng với vi khuẩn propionic trong việc tạo hương cho các loại phomai rắn.
- Vi khuẩn lactic dị hình
Tham gia vào quá trình lên men lactic dị hình mà sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn
có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như sau: acid lactic 40%, acid acetic 10%, các chất
khí 20%.
Nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém nhưng cũng
có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm. Vi khuẩn lactic lên men dị hình có thể làm cho sản
phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn.
1.3.2.2. Lactobacillus [31]
Tế bào hình que ngắn, kích thước 0.5 – 1.2 x 1 – 10µm, đôi khi có
dạng hình cầu kết chuỗi ngắn.
Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm khi di động

bằng lông roi, kị khí không bắt buộc.
Khuẩn lạc có kích thước 2-5mm, lồi, mờ đục, không nhuộm màu.
Hình thức dinh dưỡng là hóa dưỡng hữu cơ, không khử được
nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome.
Hình 1.12. Lactobacillus
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30 – 40
o
C.
1.3.2.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic [5], [32]

* Bacteriocin
Lên men thực phẩm bằng vi khuẩn lactic là phương pháp bảo quản thực phẩm cổ xưa nhất
dựa vào sự đối kháng của các vi sinh vật khác nhau. Tuy nhiên, phương pháp này mới nhận được sự
chú ý của các nhà khoa học, đặc biệt là việc sử dụng các vi khuẩn lactic khác nhau.
Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn lactic là khả năng tạo các hoạt chất
kháng khuẩn - bacteriocin có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hay gây hư
hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp., Enterococcus spp..
Bảng 1.7. Đặc tính của một vài loại bacteriocin
Bacteriocin Vi sinh vật sản xuất Đặc điểm
Nisin
Lactococcus lactis subsp.
lactis ATCC 11454
Phổ kháng khuẩn rộng, được sinh ra vào
cuối chu kỳ tăng trưởng.
Pediocin A
Pediococcus pentosaceus
FBB61, L-7230
Phổ kháng khuẩn rộng.
Pediocin AcH Pediococcus acidilactici H Phổ kháng khuẩn rộng.
Leucocin

Leuconostoc gelidum Phổ kháng khuẩn rộng, được sinh ra vào
đầu chu kỳ tăng trưởng.
Helveticin L.helveticus 481 Phổ kháng khuẩn hẹp.
Carnobacteriocin
Carnobacterium piscicola
LV17
Phổ kháng khuẩn hẹp, được sinh ra vào
đầu chu kỳ tăng trưởng.

* Probiotic
Vi khuẩn lactic được chú ý sử dụng nhiều trong vai trò probiotic, có nhiều loài được sử dụng
như đã trình bày ở phần 1.2.2 của luận văn này.
* Một số ứng dụng khác
- Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai, koumis…
- Ứng dụng trong muối chua rau quả: bắp cải muối, dưa chuột muối, …
- Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi.
- Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate.
- Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, công
nghiệp thực phẩm.
- Lactate calci là loại dược phẩm bổ sung calci dưới dạng dễ hấp thu, lactate sắt dùng để chữa
bệnh thiếu máu, lactate đồng dùng làm dung môi, …


CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu
* Đậu hũ: đậu hũ Vina Tofu

Hình 2.1. Đậu hũ Vina Tofu
* Sữa đậu nành không đường Vfresh
Nguồn: công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk.
Dùng làm môi trường tăng sinh các chủng giống vi sinh vật trong đề tài.
* Đường aspartam
Nguồn: công ty cổ phần dược phẩm dược liệu Pharmedic - TP.HCM.
Dùng bổ sung vào sản phẩm tạo vị ngọt.
* Hươmg liệu (hương phomai)
Nguồn: do công ty FRAGRANCE OILS (International) LMD. của Anh sản xuất, được mua
tại cửa hàng Toàn Hưng, số 451 An Dương Vương, Phường 14 - Quận 5, chuyên cung cấp tinh dầu,
hương liệu và bột màu thực phẩm.

2.1.2. Giống vi sinh vật
Do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung
cấp.
- Bacillus subtilis sp. được phân lập từ chao, kí hiệu Bs
TC
.
- Bacillus natto sp. phân lập từ sản phẩm Nattospes của Nhật Bản, được kí hiệu là Bn.
- Lactobacillus sp. phân lập từ mẻ cơm lên men, kí hiệu là TK
m
.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Do Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp.

- Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa Petri, buret,
phễu lọc, giấy lọc, ….
- Thiết bị thí nghiệm như tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân điện tử, bể ổn nhiệt, máy
Kjeldahl bán tự động, máy Soxhlet, máy đo quang phổ, …
2.1.4. Môi trường dùng trong thực nghiệm
- Môi trường giữ giống Bs
TC
và Bn.:
Môi trường thạch nước mắm (CP: cá peptone).

- Môi trường nhân giống Bs
TC
và Bn.
Môi trường dịch nước mắm (CP: cá peptone).
Môi trường sữa đậu nành.
- Môi trường giữ giống Lactobacillus sp.: môi trường cà chua (N
2
)
- Môi trường định tính enzyme.
Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% tinh bột định tính enzyme amylase.
Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% casein để định tính enzyme protease.
Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% fibrin để định tính enzyme protease.
(Thành phần các môi trường được trình bày rõ ở phần phụ lục của luận văn này).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính hệ enzyme (amylase, protease) của
Bs
TC
và Bn trong điều kiện khác nhau của các yếu tố ảnh hưởng như thời gian, nhiệt độ, pH. Sau đó,
tối ưu hóa điều kiện các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính các enzyme của hai chủng giống vi khuẩn

trên. Từ kết quả thu được, sẽ chọn ra một chủng giống tối ưu hơn để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm
thức uống chức năng. Nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài được trình bày ở sơ đồ sau:

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái các chủng vi sinh vật có trong đề tài (vi khuẩn
Bacillus subtilis sp., Bacillus natto sp., Lactobacillus sp.)
2.2.2.1. Phương pháp nhuộm Gram [14]
* Nguyên tắc
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi
khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là:
Xác định thành phần hóa học trong nguyên liệu đậu hũ
Xây dựng đường cong sinh trưởng. Xác định sinh khối tối đa của
Bs
TC
, Bn trong môi trường CP và trong môi trường sữa đậu nành.
Khảo sát hoạt tính enzyme amylase, protease trên cơ chất đậu của Bs
TC
và
Bn từng yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH rồi tối ưu hóa thực nghiệm.
Từ đó chọn chủng tối ưu.
Khảo sát quá trình lên men
Xác định tỷ lệ giống (Bs
TC

hoặc Bn)
Thời gian thủy phân đậu hũ.

Xác định các chỉ số dinh dưỡng
(đạm, đường, lipid, …)
Khảo sát quá trình bảo quản
Xác định tỷ lệ giống TK
m
Hàm lượng đường saccharose
Thời gian bảo quản
Hoàn thiện sản phẩm
Khảo sát phụ gia: đường aspartam,
hương
Đánh giá cảm quan sản phẩm
Xác định các chỉ số dinh dưỡng
(đạm, đường tổng, lipid, …)
Xây dựng quy trình chế biến
thức uống chức năng từ đậu hũ
Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng
cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương.
Loại thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do ít peptidoglycan hơn) và được bao bọc bởi một
màng mỏng nên có màu hồng. Vi sinh vật nhóm này là Gram âm.
* Cách tiến hành
-
Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn.
-
Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lam để đánh dấu vết khuẩn phía
trên lame.
-
Nhỏ dung dịch NaCl 9 ‰ lên giữa vòng tròn.

-
Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl 9 ‰
trên lame.
-
Dàn mỏng thành vết bôi, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
-
Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa.
-
Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính.
-
Nhỏ dung dịch crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa trôi
thuốc nhuộm dư với nước.
-
Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước.
-
Tẩy màu bằng cồn 96
o
từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ
giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy
theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời gian khử màu trong bước này đóng vai
trò quyết định kết quả của quá trình nhuộm.
-
Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin, để yên trong 30 giây, rửa với nước.
-
Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính
hiển vi với vật kính dầu x100.
2.2.2.2. Phương pháp nhuộm bào tử [14]
Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H
2
SO

4
1% và xanh methylen
- Làm vết bôi trên một phiến kính sạch và để khô tự nhiên.
- Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong
hai phút rồi rửa với nước.
- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến bốc hơi
trong vòng 5 phút.
- Rửa vết bôi bằng nước
- Tẩy màu bằng dung dịch H
2
SO
4
1% trong 2 phút.
- Rửa vết bôi bằng nước.
- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút
- Rửa lại với nước và để khô tự nhiên.