Báo cáo thực tập tại Viện Di truyền nông nghiệp

Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Lời cảm ơn
Trớc hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân
tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên trong
phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực
phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều
kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật.
1
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Lời mở đầu
Viện Di truyền nông nghiệp đợc thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của
Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện
nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Chức năng chính của Viện là :
-Nghiên cứu, ứng dúng các phơng pháp di truyền học hiện đại và công nghệ
sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống
chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trờng.
-Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lơng thực-
thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền
vững và bảo vệ môi trờng.
-Tăng cờng hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di truyền
và Công nghệ sinh học.
Để thực hiện đợc các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị
nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 ngời trong đó có 3
tiến sĩ , 6 phó giáo s, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ.
Trong những năm qua, Viện đã đạt đợc rất nhiều thành tựu, đã thực hiện và
chủ trì 18 đề tài nhà nớc, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo đợc nhiều
giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các quy trình
tiến bộ kỹ thuật đợc công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án hợp tác
quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO... Nhờ các thành tự trên mà Viện đã nhận đợc

nhiều giải thởng có giá trị cả trong và ngoài nớc: Giải thởng quốc tế về đóng góp
phát triển nông nghiêph Châu á Thái Bình Dơng, huân chơng lao động hạng 3 ...
giới thiệu chung về bệnh học thực vật
2
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
I. Quan niệm về bệnh hại thực vật
Việc chỉ ra đợc chính xác lúc nào cây bị bệnh luôn là một vấn đề khó khăn
và đợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Ngời ta cho rằng một cây đợc coi
là khoẻ mạnh và phát triển bình thờng khi nó biểu hiện các chức năng sinh lý ở
mức tối đa tiềm năng di truyền của nó. Các tế bào mô phân sinh của cây khoẻ
mạnh thực hiện chức năng phân chia và chuyên hoá khi cơ thể đòi hỏi là cần thiết.
Các kiểu tế bào chuyên hoá khác nhau hấp thụ nớc và dinh dỡng từ đất, đa nớc và
dinh dỡng đến tất cả các bộ phận của cây, tiến hành quá trình quang tổng hợp, các
quá trình chuyển hoá và trao đổi chất, hoặc lu giữ các sản phẩm của quá trình
quang tổng hợp và tạo hạt hoặc các cơ quan tái tạo khắc cho khả năng sinh tồn và
phát triển. Bất cứ khi nào các tế bào của một cây hay một bộ phận nào đó của cây
có khả năng thực hiện một hay nhiều chức năng đặc biệt bị can thiệp do các vi
sinh vật hoặc là yếu tố môt trờng bất lợi thì các hoạt động của các tế bào bị gián
đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế hoặc bị chết và cây trồng trở nên bị bệnh.
Đầu tiên bệnh mới chỉ xảy ra ở một vài tế bào và vẫn cha biểu hiện ra nhng
chỉ trong một thời gian ngắn, bệnh lan rộng và các bộ phận cây bị bệnh bắt đầu
thay đổi và biểu hiện ra ngoài các triệu chứng bệnh mà mắt thờng có thể thấy đợc.
Dựa vào những thay đổi mà cây thể hiện khi phản ứng lại sự xâm nhiễm của vi
sinh vật hay ảnh hởng của các yếu tố môi trờng bất lợi mà chúng ta có thể biết đợc
mức độ bệnh của cây. Từ đó bệnh của cây có thể đợc định nghĩa là : một chuỗi
các phản ứng của các tế bào và các mô thực vật với các vi sinh vật gây bệnh
hoặc với các yếu tố môi trờng mà ta có thể nhìn thấy đợc hoặc không nhìn thấy
đợc, dẫn đến những thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng, hoặc tình trạng
nguyên vẹn của cây trồng và có thể dẫn đến sự suy yếu hoặc có thể gây chết
toàn phần hoặc từng phần của cây.

Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thờng gây bệnh bằng cách can thiệp vào
quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, các
chất điều hoà sinh trởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc với cây
chủ, hoặc hấp thụ dinh dỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng của
3
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và phát triển,
sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tất yếu là
làm tắc nghẽn đờng vận chuyển lên xuống của nớc và của đờng. Ngoài ra, các yếu
tố môi trờng cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ngỡng chống
chịu của cây.
Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng đợc phân nhóm theo rất nhiều
tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bị
bệnh ... Hiện nay, phổ biến nhất là ngời ta phân loại bệnh cây dựa vào loại tác
nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm 2 loại: bệnh gây
ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo tiêu
chuẩn này, ta có thể chỉ ra đợc nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển và cách
lan truyền bệnh từ đó suy ra đợc biện pháp phòng trừ bệnh
4
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật
I. Khái niệm chung:
Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi
cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trờng dinh
dỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm:
- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật nh mẩu lá, mẩu rễ, một
đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả...
- Nuôi cấy phôi non (phôi cha phân hoá hoàn toàn), phôi trởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

- Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào
trần....
Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào
do Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào của cơ thể đa bào có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện phù hợp. Cơ sở vật
chất của tính toàn năng là mỗi tế bào trong cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vật chất
thông tin di truyền. Khi tạo đợc môi trờng nuôi cấy phù hợp, sử dụng các chất điều
khiển sinh trởng thực vật, ta có thể hoạt hoá gen cần thiết để bắt một tế bào bất kỳ
của cơ thể thực vật phát triển đợc thành cây hoàn chỉnh.
Phân hoá và phản phân hoá của tế bào cũng là cơ sở lý thuyết của công nghệ
này. Trong đó, sự phân hoá là việc chuyển những tế bào phôi sinh trở thành các tế
bào chuyên hoá để thực hiện những chức năng khác nhau về sinh lý, sinh hoá; còn
sự phản phân hoá là sự chuyển các tế bào đã chuyên hoá trở lại trạng thái phôi
sinh, có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới.
Điều kiện để tế bào thể hiện tính toàn năng qua con đờng phân hoá và phản
phân hoá là môi trờng nuôi cấy.
5
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
II.Môi trờng nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Môi trờng nuôi cấy là yếu tố quan trọng, nó quyết định cho sự thành công
của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời. Thành phần chính bao gồm:
1. Nguyên tố khoáng đa lợng: Là các nguyên tố nh N, P, K, Mg, S,
Ca...,chiếm nhiều trong môi trờng nuôi cấy với hàm lợng của mỗi nguyên tố
thờng lớn hơn 30mg/l. Chúng là nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây
dựng nên thành phần cấu trúc.
2. Các nguyên tố khoáng vi lợng: Là các nguyên tố nh Fe, Mn, Mo, B, I, Cu,
Zn, Co... với hàm lợng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30mg/l. Chúng là thành phần
của coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào sống.
3. Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, các mô và tế bào
chuyển sang phơng thức sống dị dỡng nên cần phải cung cấp cho chúng một

nguồn cacbon hữu cơ, thờng là đờng mía saccaroza (trong một số trờng hợp
còn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza...).
Ngoài ra, manitol, sorbitol đợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù
và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu.
4. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng
tổng hợp vitamin nhng lợng tổng hợp đợc không đủ nên phải bổ sung
vitamin ngoại sinh vào môi trờng cấy. Vitamin thờng dùng là nhóm B dễ
hoà tan vào trong nớc nh B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
....với hàm lợng từ một đến
một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúc
tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi trờng
nuôi cấy.
*Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (cha đợc xếp vào
vitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có
tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, đợc sử dụng với l-
ợng lớn ~ 100 mg/l.
6
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
5. Chất điều khiển sinh trởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi
trờng nuôi cấy, giúp điều khiển đợc quá trình phân hoá và phản phân hoá
tế bào, thể hiện đợc tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào và mô

thực vật tách rời. Ngời ta thờng sử dụng chủ yếu hai nhóm chất điều khiển
sinh trởng thực vật sau:
- Auxin: kích thích quá trình tăng trởng của tế bào, kích thích sự
hình thành mô sẹo và rễ bất định. Các loại thờng dùng là
IAA(axit indolaxetic), NAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit
indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic)....Hàm lợng
dùng nhỏ 10
-5
-10
-7
mol/l.
- Xytokinin: kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi bất định.
Các loại thờng dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin),
Zeatin, TDZ(Thidiazuron)....với hàm lợng 10
-5
-10
-7
mol/l.
Ngời ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lợng phù
hợp để đạt mục đích mong muốn. Quy luật tơng đối: tỷ lệ auxin trên
xytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì mẫu
cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi.
Ngoài ra hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ
nghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng tởng chiều dài thực vật, sử
dụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh; các hợp chất ức chế sinh tr-
ởng: axit absisic (ABA), CCC sử dụng trong bảo quản nguồn gen
invitro.
5. Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên: đây là thành phần thờng dùng
nhng không bắt buộc trong môi trờng nuôi cấy. Bao gồm nớc dừa, dịch
nghiền một số rau, củ, quả: khoai tây, chuối, táo, cà rốt....dịch chiết

nấm men, hợp chất cazein, pepton....để gia tăng các chất dinh dỡng,
các chất có hoạt tính điều khiển sinh trởng và sự phát triển của mẫu
cấy.
7
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
6. Chất làm đông cứng môi trờng: Là giá thể cho mẫu cấy. Thờng
dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với
nớc khi ở nhiệt độ lớn hơn 80
0
C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ
hơn 40
0
C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nớc cao, chỉ cần
6-12 g có thể làm đông đặc 1l nớc và khi ở trạng thái rắn thì tế bào và
mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu đợc các chất dinh dỡng từ môi trờng.
III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:
Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành
công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt đợc khi nó trải qua 5 bớc sau:
Bớc 0: Bớc chuẩn bị
Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:
- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần.
- Có khả năng sinh trởng và phát triển tốt.
- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus.
- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các
cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối u về điều kiện chăm
sóc, dinh dỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.
Bớc 1: Nuôi cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thờng sử
dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ
thuộc từng đối tợng nuôi cấy ngời ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy nh mẩu

lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non.
Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trớc khi tiến hành để đảm bảo mẫu
sạch vi sinh vật nhng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phơng pháp sát
trùng bề mặt bằng chất hoá học, thờng là HgCl
2
0,1% sát trùng trong 5-10 phút. ít
8
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit nh NaOCl, Ca(OCl)
2
5% trong 20-30
phút. Ngoài ra còn dùng H
2
O
2
15%,dung dịch Brom 5-10% nhng hiệu quả không
cao.
Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đa mẫu cấy vào môi trờng thích hợp để
mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính. Việc lựa chọn môi trờng thích hợp
là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lợng các chất điều khiển
sinh trởng trong môi trờng để làm cho mẫu cấy phát sinh đợc hình thái.
Bớc 2: Nhân nhanh mẫu
Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính
là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này đợc coi là giai đoạn
đánh giá tính u việt hay không u việt của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào.
ở giai đoạn này, môi trờng dinh dỡng nhân tạo để nuôi cấy thờng đợc đa
thêm vào chất điều khiển sinh trởng, các chất bổ sung khác nh nớc dừa, nớc chiết
nâm men, dịch thuỷ phân casein...kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm
đạt đợc hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có
thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau . Tuy nhiên,

tuỳ từng đối tợng nuôi cấy, ngời ta có thể đạt đợc hệ số nhân cao bằng việc kích
thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách
hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Bớc 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt đợc một kích thớc nhất định, các chồi đợc chuyển từ môi trờng trong
bớc 2 vào môi trờng tạo rễ. Thờng sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất
hiện rễ. ở giai đoạn này, ngời ta bổ sung vào môi trờng các auxin vì auxin là nhóm
hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở
một số loài nh chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt đợc trong môi
trờng không có chất điều hoà sinh trởng.
Bớc 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
9
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Giai đoạn đa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bớc cuối cùng của quy
trình nuôi cấy mô tế bào.
Cây lấy ra ống nghiệm phải đợc rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm
nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ
thành công hơn nếu trớc khi đa cây con ra đất ta ơm cây trên cát có độ ẩm 90% từ
10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đợcc sinh ra và bắt đầu
hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thờng.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế
bào.Đó là:
- Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra
hiện tợng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí,
sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận đợc ở ngay giai đoạn
invitro hoặc giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều
khiển và phát triển hình thái, giảm lợng chất điều khiển sinh trởng sử
dụng, từ đó giảm đợc ảnh hởng của chúng. Đồng thời, phải hạn chế

số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích luỹ, gia
tăng ảnh hởng của các chát điều khiển sinh trởng.
- Sự nhiễm mẫu cấy
+ Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu trong
hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu phát triển,
phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trờng sau 2-3 tuần nuôi
cấy.
+ Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây
mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu
- Sự tiết độc tố từ mẫu cấy
+ Sau 1-2 ngày đa vào môi trờng, mẫu cấy tiết ra những chất màu
đen, nâu làm hỏng môi trờng, chết mẫu. Các chất đó có thể là tanin,
polyphenol bị oxy hoá.
10
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
+ Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lợng tanin, polyphenol ;
gây vết thơng cơ giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy bằng cách ngâm
trong dung dịch axit hữu cơ có tính khử mạnh: axit ascorbic, axit
xitric; bổ sung vào môi trờng than hoạt tính để hấp phụ các chất nói
trên.
- Hiện tợng thuỷ tinh hoá mẫu cấy
+ Khi nuôi cấy trong môi trờng lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khả
năng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nớc, trở nên trong
suốt, có hình dạng không bình thờng
+ Khắc phục: Bổ sung vào môi trờng chất gây áp suất cao, chất ức
chế tổng hợp etilen, tăng cờng độ chiếu sáng và giảm nhiệt độ phòng
nuôi .
IV. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác giống cây trồng:
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong công tác giống cây trồng, nuôi cấy in vitro đợc ứng dụng để:

- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống.
- Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có
giá trị kinh tế cao.
- Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh.
Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phơng
pháp nuôi cấy in vitro đợc quan tâm hơn cả. Ngời ta ớc tính có khoảng 300 loại
cây có thể đợc nhân giống bằng phơng pháp này. Lợi ích của nó là ở chỗ: có thể
tạo ra một quần thể cây con với số lợng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ,
đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trởng tốt và cho năng suất
cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể trao đổi
quốc tế nguồn gen và lu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro. Chính nhờ kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào, ngời ta có thể tạo ra đợc hệ số nhân giống cao, sớm phát huy đợc
hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng
11
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
khắc phục đợc những điều kiện bất lợi. Phơng pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với
những loại cây khó nhân giống bằng con đờng hữu tính, các giống quý hiếm có số
lợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh.
ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nớc đã đợc
thành lập và cho đến nay đã thu đợc một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-
Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống
in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu nh lúa, thuốc lá, khoai
lang, dứa sợi... Tại trờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trình
nhân giống khoai tây chất lợng cao, bớc đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phía Nam
đã xây dựng đợc ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quy trình
nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào trong
cả nớc đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây ăn quả,
cây rừng, cây quý hiếm...có giá trị cao.
Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay đợc đa vào trong các chơng
trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinh học

cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hớng đi mới cho nghiên cứu di
truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật..., đặc biệt nó đem lại những ứng dụng to lớn
trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng.
V.Kết quả và thảo luận
Thực hiện nuôi cấy mô đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vờn của viện
Di truyền nông nghiệp.
- Mẫu cây đợc cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm.
- Rửa mẫu bằng nớc rửa bát loãng sau đó rửa lại bằng nớc sạch 3 lần.
- Rửa mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để sát trùng sơ bộ sau rửa lại bằng nớc
sạch 3 lần.
- Khử trùng mẫu bằng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sạch bằng
nớc cất.
- Cắt cành thành từng đoạn ngắn, mỗi đoạn có ít nhất một mắt ngủ.
12
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
- Cấy mẫu vào môi trờng nuôi cấy có nồng độ aucin-cytokinin thích hợp, sau 3
tuần các mắt ngủ sẽ phát triển thành chồi.
- Thờng sau quá trình này câty đợc nuôi cấy bằng phơng pháp cắt lát mỏng để có
đợc hệ số nhân nhanh lớn.
-Sau khi đã có đợc chồi tiến hành xử lý ra rễ bàng cách cắt chồi cấy vào môi tr-
ờng thích hợp,sau khoảng 2 tuần sẽ có rễ.
- Khi cây đã có rễ có thể tiến hành việc thích nghi cây với điều kiện sống tự
nhiên trong vờn ơm :có giả thể thờng là đất trộn trấu hun có bổ sung các nguồn
chất dinh owỡng trong điều kiện chiếu sáng 50%.
- Một thời gian sau,nếu tỷ lệ cây sống đạt hơn 85% có thể đem cây con trồng
trong điều kiện bình thờng.
13
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Phần ii: chẩn đoán bệnh
I.Khái niệm

1.Tình hình bệnh hại trên giống cây trồng thực vật ở Việt Nam.
Để đảm bảo an ninh lơng thực đồng thời phát triển nhanh nền kinh tế, trong
những năm gần đây Việt Nam đã nhập nhiều giống cây trồng và hoa cây cảnh từ
nhiều quốc gia trên thế giới. Điều này luôn kèm theo các nguy cơ xân nhập của vi
sinh vật gây hại, đặc biệt là các bệnh hại thực vật thuộc diện KDTV ở Việt Nam.
Trên thế giới cũng nh ở Việt Nam, bệnh hai thực vật gây nên những thiệt hại
vô cùng to lớn và chúng đang làm ảnh hởng đáng kể đến chất lợng sản phẩm cũng
nh năng suất cây trồng. Đặc biệt là bệnh hại do virus gây ra: Virus PVY là virus
gây bệnh thối củ khoai tây, làm giảm năng suất củ tới 80%, nó cũng gây thiệt hại
đáng kể trên cây cà chua, ớt, thuốc lá. Khi thuốc lá bị nhiễm virus này thì năng
suất giảm tới 30%. Trong lĩnh vực hoa cây cảnh còn trầm trọng hơn. Việc áp dụng
những thành tựu khoa học kỹ thuật của CNSH, đặc biệt là sinh học phân tử và
Miễn dịch liên kết gắn enzim vào sản xuất là rất cần thiết nhằm tăng năng suất cây
trồng, chẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân hại cây trồng, đáp ứng đợc đòi hỏi
cấp bách của KDTV.
Một số tác nhân gây bệnh thờng thấy trên cà chua, khoai tây, thuốc lá.
1.1Virus khảm da chuột Cucumber Mosaic Viruses (CMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và biến dạng lá khác nhau, điển hình
nhất là dạng biến dạng hình kim, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong
sản xuất cà chua và thuốc lá. Virus này đợc lan truyền qua Aphis gossyphii.
Nó thuộc nhóm Cucumovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Xuất hiện dịch
bệnh không có quy luật báo trớc.
1.2 Virus khảm thuốc lá - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và phồng lá khác nhau, điển hình nhất là
dạng khảm san hô gây nên những thiệt hại nghêim trọng trong sản xuất cà
chua, gây ảnh hởng đến chất lợng thuốc lá. Virus này đợc lan truyền bằng
14